專利名稱：一種快速檢測抗草甘膦g2-epsps蛋白的金標(biāo)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種生物樣品的檢測裝置，尤其是快速檢測抗草甘膦G2-EPSPS 蛋白的金標(biāo)試劑盒。
背景技術(shù)：
在轉(zhuǎn)基因植物的研制開發(fā)或在對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行篩選或安全性評價時，往往需 要對轉(zhuǎn)入的外源性基因進(jìn)行定性或半定量測定。G2-EPSPS蛋白編碼基因克隆自熒光假單胞菌G2基因組文庫，該菌篩選自草甘 膦污染土壤，具有高草甘膦耐受性。該基因編碼的蛋白經(jīng)分析屬于Class I類型，酶活測 定顯示該蛋白具有高底物親和能力和低草甘膦親和力，因此能賦予宿主高草甘膦除草劑 耐受力?，F(xiàn)有的檢測裝置，如采用酶免、放免等方法的裝置，受儀器(酶標(biāo)儀、放免閃 爍儀、離心機(jī)等)、場地等因素的限制，而且檢測時間長(酶免檢測時間需20hr、放免檢 測需30min Ihr)，檢測成本較高，很難推廣應(yīng)用。因此，實踐中需要有一種可快速檢 測轉(zhuǎn)基因植物中G2-EPSPS蛋白，且操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、快速的裝置。發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有裝置操作復(fù)雜、檢測時間長的不足，本實用新型提供了一種快速 檢測轉(zhuǎn)基因成分(G2-EPSPS)的免疫檢測試劑盒，不僅操作簡便，而且結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本實用新型解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種快速檢測G2-EPSPS蛋白的金標(biāo)試劑盒，包括盒體、測試帶和上蓋，盒體 蓋入上蓋后組成試劑盒，其特征在于所述上蓋設(shè)置有一個觀測窗和一個加樣孔，所述盒 體和上蓋的形狀是六邊形。所述盒體的深度不限，其上表面可以設(shè)置一條可以嵌入所述測試帶的凹槽。所述盒體或上蓋可具有卡槽，以保證盒體與上蓋扣緊。所述觀測窗優(yōu)選是長方形，觀測窗分為測試區(qū)(T)和質(zhì)控區(qū)(C)兩部分，可在 上蓋上用字母C、T標(biāo)示出。所述測試帶形狀為長方形片狀，用于檢測G2-EPSPS蛋白。所述測試帶是一 種具有檢測系統(tǒng)主體膜反應(yīng)體系功能的檢測材料，由高分子纖維膜、塑料等多層材料制 成。測試帶分為質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)，質(zhì)控區(qū)可包被羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG多克隆抗體； G2-EPSPS蛋白測試帶的樣品檢測區(qū)包被特異功能性EPSPS單克隆抗體或多克隆抗體。外源基因轉(zhuǎn)入植物表達(dá)后，將產(chǎn)生目的蛋白(EPSPS)，可通過免疫反應(yīng)檢測樣 品中是否含有該蛋白來確定該基因是否存在。如果外源基因轉(zhuǎn)入植物，發(fā)生基因沉默， 無目的蛋白產(chǎn)生，將不能達(dá)到預(yù)期目的(抗草甘膦)。本實用新型的目的是這樣實現(xiàn)的當(dāng)盒體蓋入上蓋后，觀測窗和加樣孔對應(yīng)測 試帶，通過盒蓋上的加樣孔和觀測窗可進(jìn)行加樣和觀察檢測結(jié)果。檢測時，將送檢物品的提取液滴加在試劑盒的加樣孔中，5-10分鐘后，通過肉 眼就可以通過上蓋的觀測窗直接觀察到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。[0017]對于每個觀測窗來說，用以下方式判斷檢測結(jié)果1、陰性(-)反應(yīng)狀況觀測窗質(zhì)控區(qū)(C)出現(xiàn)一條紫紅色條帶。檢測結(jié)果待檢樣品中不含待檢基因或其含量在其閾值以下。2、陽性(+)反應(yīng)狀況觀測窗質(zhì)控區(qū)(C)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在測試區(qū)(T)內(nèi)同時出現(xiàn) 紫紅色條帶。檢測結(jié)果待檢基因含量在閾值以上。3、無效反應(yīng)狀況質(zhì)控區(qū)(C)未出現(xiàn)紫紅色條帶，檢測結(jié)果表明不正確的操作過程或試劑盒已變質(zhì)損壞。本實用新型所述試劑盒的優(yōu)點在于經(jīng)濟(jì)高效使用成本低廉，保存方便；簡便快速檢測轉(zhuǎn)基因成份一步法操作，不需任何附加設(shè)備。直接將待測樣品 液滴加在加樣孔中，5-10分鐘可出結(jié)果；結(jié)果直觀不借助任何儀器對抗原進(jìn)行檢測，用肉眼可觀察到結(jié)果；準(zhǔn)確可靠靈敏度高、特異性強(qiáng)；應(yīng)用廣泛可檢測玉米、棉花、水稻、小麥、煙草、大豆等各類農(nóng)作物的葉 片、種子及加工產(chǎn)品。本實用新型可對植物樣品進(jìn)行EPSPS分析，檢測快速、特異、敏感、方便， 特別適用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的研制開發(fā)和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的快速篩選，可用于實驗室、田間、邊 防、海關(guān)植物檢驗、檢驗檢疫局、食品安全檢測及種子經(jīng)營銷售等部門對可疑樣本現(xiàn) 場、快速篩查。


以下結(jié)合附圖和實施例對本實用新型進(jìn)一步說明。圖1和圖2是本實用新型一種試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖，其中圖1是盒體的俯視圖， 圖2是試劑盒上蓋的俯視圖；圖中1是加樣孔，2是觀測窗，3是測試帶，C是質(zhì)控區(qū)，T是測試區(qū)。
具體實施方式
實施例1試劑盒的制備一、制備測試帶EPSPS單抗腹水的制備小鼠腹腔注射液體石蠟0.5mL。1周后，將EPSPS單抗雜交瘤細(xì)胞注射于以上 預(yù)先處理過的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射雜交瘤細(xì)胞1 3X106。10天后收獲腹 水，以上過程皆在無菌條件下完成。1 .EPSPS單克隆抗體的純化 1)以DEAE離子交換層析及Sephacryl S-300分子篩對單抗進(jìn)行純化； SDS-PAGE平板電泳檢測純化單抗的純度；ELISA法測定單抗活性；[0042]2)純化過程取小鼠單抗腹水一3,000 Xg離心15分鐘一上清液加50%硫酸銨 沉淀，過夜一3,000 Xg離心20分鐘一沉淀溶于0.0IM磷酸鹽緩沖液(pH 7.2) — S-300凝 膠柱一DEAE Blue層析柱一0-800mM NaCl梯度洗脫一超濾離心，濃縮單抗；3)單抗純度測定常規(guī)SDS-PAGE電泳，上述方法所純化的單抗的純度皆在 95%以上；4)蛋白濃度測定紫外分光光度計測定279nm處的OD值，按以下公式計算蛋 白含量OD279/1.4 = mg/mL(純化單抗)。將單抗?jié)舛日{(diào)節(jié)為約lmg/mL ；5)單抗活性測定選用EPSPS抗原包被ELISA板(lyg/孔)，及羊抗鼠 IgG-HRP復(fù)合物，測定各單抗效價(大于1 5000)。2.羊抗DOAt高效價免疫抗血清的制備和純化1)純化好的上述單抗+完全佐劑一免疫山羊一加強(qiáng)免疫二次，每次間隔一月一 第二次加強(qiáng)后10天左右取血一離心取血清一硫酸銨沉淀一DEAE離子交換層析純化；2)效價測定ELISA夾心法，抗體效價稀釋度應(yīng)大于1 256;3)蛋白濃度測定紫外分光法測定OD279，計算蛋白濃度。3.膠體金及金標(biāo)抗體制備1)膠體金的制備以檸檬酸鹽還原法制備40-60nm的膠體金。將0.01 ^HauCl4 加熱至沸，加入一定量的檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7 ·2Η20)，繼續(xù)加熱煮沸5分鐘，待 膠體金溶液顏色由蘭一紫一紅，穩(wěn)定后，冷卻即可。膠體金溶液應(yīng)清亮透明，如需長期 保存，可加入0.02% NaN3O2)將膠體金液500mL用0.IMNaOH調(diào)pH8.4，磁力攪拌下緩慢加入單抗2mL， 攪拌20分鐘。5,500Xg離心30Min，除去上清液中未結(jié)合的蛋白質(zhì)。離心后吸取膠體 金標(biāo)記抗體沉淀，沉淀溶于IOmL保存液中，用0.45 μ m微孔濾膜過濾。取樣進(jìn)行檢定， 其余置4°C保存。4.膜反應(yīng)體系Ml的制備1)將EPSPS抗體及純化的羊抗鼠IgG以0.1M磷酸鹽緩沖液稀釋，終濃度為約 0.2-2mg/mL。2)純化的羊抗鼠IgG溶于0.1M磷酸鹽緩沖液中，濃度為2.0mg/mL ；3)硝酸纖維素膜大小10CmX27Cm，每張膜可噴長25cm的檢測及控制帶各4 條；4)將以上兩種溶液分別加入Biodot XYZ3000噴涂機(jī)的二個噴頭儲存瓶中；5)設(shè)置噴速為2 μ L/cm，NC膜的移行速度為50mm/s。以單抗EPSPAD2 (2mg/ mL)在NC膜上包被反應(yīng)檢測線，以l.Omg/mL兔抗鼠IgG包被反應(yīng)對照線，對照線與檢 測線的距離為4-4.5mm;6)完成包被后，置37°C干燥箱24小時，用BB封閉液封閉處理半小時，用WB 洗液抽洗一次；7) 37 °C干燥箱干燥備用；8)切制備好的硝酸纖維素膜1.8CmX27Cm/條，放入鋁薄袋中密封干燥保存。
置室溫保存?zhèn)溆谩?.膜反應(yīng)體系M2a、M2b及M3的制備[0063]將吸水纖維膜分別浸泡于M2a、M2b、M3溶液中，浸透后，取出晾干，裝入塑
料袋中，室溫保存。l)M2a制備將制好的玻璃纖維切27cmX 1.2cm/條；2)M2b制備將制好的玻璃纖維切27cmX 1.8cm/條；3)M3制備將制好的玻璃纖維切27cmX 1.2cm/條。6.膜反應(yīng)體系M4的制備1)取膠體金-單抗復(fù)合物加稀釋液，混勻配成工作濃度；2)將溶液加入噴涂機(jī)Biodot的Airjet噴頭儲存瓶中；3)設(shè)定壓力為15PSI，玻璃纖維膜的移動速度為50mm/s ；4)噴制規(guī)格為0.5-1.5cmX 25cm/條，每條噴2遍；5)于37°C烘干12小時，放入鋁薄袋中，加入干燥劑，熱合封口，室溫保存。7.反應(yīng)體組裝1)在M6塑料基板上貼雙面膠帶M7 二條；2)在M7中間貼反應(yīng)膜Ml (18mm)，離M6上緣約22mm ；3)在M7上貼M5 (22mm)，與M6上緣對齊并與Ml上緣交Imm ；4)在M7上貼M2a(12mm)，與Ml下緣相接；5)在 M2 上貼 M4 (IOmm)，壓住 Ml 下緣 0.5mm ；6)在 M7 上貼 M3 (12mm)，上緣壓住 M4 約 2/3 ；7)在M7上貼M2b (18mm)，上緣壓住M4約2/3，下緣與M7的下緣對齊；8)在M4和M7上貼透明保護(hù)膠帶M8，上緣完全壓住M4，并壓住Ml約 1.5mm ；9)在M5上貼彩色標(biāo)記膠帶M9，與Ml上緣交1mm，另一端翻過M6上緣，貼 于M6背面；10)將組裝成型的反應(yīng)體用全自動切條機(jī)切成3.5_規(guī)格。二、試劑盒裝配將上述制備好的檢測G2-EPSPS蛋白的測試帶3嵌入圖1盒體的凹槽中，然后將 上蓋與盒體扣緊，即成試劑盒。將試劑盒、滴管和使用說明書裝塑料袋封裝后，即可。實施例2試劑盒使用過程1.檢測樣本處理及準(zhǔn)備植物種子、葉子、籽苗等樣本在檢測前需經(jīng)研磨，并以蒸餾水抽提和稀釋。為 獲得最佳檢測效果，各不同樣品應(yīng)根據(jù)下表中的比例稀釋，在完成研磨和稀釋后，將樣 本混勻，靜置，取上清液作為檢測樣品。植物種類葉子及籽苗種子葉子/蒸餾水(g/mL )種子/蒸餾水(g/mL )水稻1 201 2小麥1 101 4其余雙子葉植物1 101 4其余單子葉植物1 201 22.檢測及結(jié)果將檢測盒平放，用所配塑料吸管吸取樣品液，滴加4-5滴于檢測盒的加樣孔 中，吸水材料使待檢樣品緩慢移動，膜反應(yīng)體系被啟動。無論待測基因是否存在于植物 樣品中，一條紫紅色條帶都會出現(xiàn)在質(zhì)控區(qū)內(nèi)(C)。質(zhì)控區(qū)內(nèi)(C)所顯現(xiàn)的紫紅色條帶 是判定是否有足夠的植物樣品液，層析過程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)，同時也作為試劑的內(nèi)控標(biāo) 準(zhǔn)。3.結(jié)果判定觀測窗檢測待檢基因是否存在。1)若待測植物樣本中不含特定G2-EPSPS蛋白，或其濃度低于檢測靈敏度，膠 體金抗體在層析過程中不會被固定在膜上檢測帶內(nèi)的單抗免疫，因而測試區(qū)內(nèi)(T)不會 出現(xiàn)一條紫紅色檢測帶，顯示陰性(-)結(jié)果，即僅在質(zhì)控區(qū)(C)內(nèi)出現(xiàn)一條紫紅色條帶。2)若待測植物樣本中G2-EPSPS蛋白濃度高于其檢測閾值時，抗原免疫金與檢 測帶上的另一單抗結(jié)合，在測試區(qū)內(nèi)(T)還將出現(xiàn)另一紫紅色檢測帶，顯示陽性(+)結(jié) 果，即在質(zhì)控區(qū)(C)和檢測區(qū)(T)內(nèi)各出現(xiàn)一條紫紅色條帶。注意測試區(qū)(T)內(nèi)的 紫紅色條帶可顯現(xiàn)出顏色深淺的現(xiàn)象。但是，在規(guī)定的觀察時間內(nèi)，不論該色帶顏色深 淺，都應(yīng)判定為陽性結(jié)果。3)若試劑盒質(zhì)控區(qū)(C)未出現(xiàn)紫紅色條帶，則檢測結(jié)果無效，表明不正確的操 作過程或試劑盒已變質(zhì)損壞。
權(quán)利要求1.一種快速檢測抗草甘膦G2-EPSPS蛋白的金標(biāo)試劑盒，包括盒體、測試帶和上蓋， 盒體蓋入上蓋后組成試劑盒，其特征在于所述測試帶置于所述盒體內(nèi)表面，所述上蓋設(shè) 置有一個觀測窗和一個加樣孔；所述盒體和上蓋的形狀是六邊形。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測抗草甘膦G2-EPSPS蛋白的試劑盒，其特征在于所 述盒體內(nèi)表面設(shè)置有可以嵌入所述測試帶的凹槽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測抗草甘膦G2-EPSPS蛋白的試劑盒，其特征在于所 述盒體或上蓋具有卡槽。
專利摘要本實用新型涉及一種快速檢測抗草甘膦G2-EPSPS蛋白的金標(biāo)試劑盒，包括盒體、測試帶和上蓋，盒體蓋入上蓋后組成試劑盒，其特征在于所述測試帶置于所述盒體內(nèi)表面，所述上蓋設(shè)置有一個觀測窗和一個加樣孔。本試劑盒可為快速檢測植物種子、葉片及加工產(chǎn)品中是否含有抗草甘膦G2-EPSPS蛋白基因成份提供直接證據(jù)，不需其它任何附加儀器設(shè)備。本試劑盒操作簡便、檢測結(jié)果形象、準(zhǔn)確、快速只要將送檢物品的提取液滴加在試劑盒的加樣孔中，5-10分鐘后，不借助任何儀器可直接觀察到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。
文檔編號G01N33/577GK201796033SQ20102010724
公開日2011年4月13日 申請日期2010年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月2日
發(fā)明者劉奇, 張維, 李亮, 林敏 , 鄭建, 陸偉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所