專利名稱：一種土拉弗朗西斯菌檢測試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種土拉弗朗西斯菌檢測試紙。
背景技術(shù)：
土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis，Tula)簡稱土拉菌，該菌能引起“土拉 熱”的人畜共患病，感染者會(huì)出現(xiàn)皮膚潰爛、淋巴腺腫大、肺部感染和傷寒樣癥狀，病情嚴(yán)重 甚至死亡。該菌具有分布廣泛，傳播途徑多樣，感染劑量低、致病性強(qiáng)等特點(diǎn)。注射lOcfu、 與皮膚接觸10-50cfu、或攝入IO2-IO8Cfu該細(xì)菌都能導(dǎo)致土拉菌病感染。因此該細(xì)菌被列 為與鼠疫、炭疽等同列的A類恐怖源，已引起全世界的高度重視?！督够瘜W(xué)武器公約》也將 土拉熱也被列為最為嚴(yán)格的控制對(duì)象。生物安全問題已引起全球關(guān)注，美國疾病預(yù)防控制中心將土拉菌列為最有可能用 于生物武器的病原體。從國家生物安全戰(zhàn)略高度看，我國境內(nèi)，尤其是出入境口岸應(yīng)加強(qiáng)對(duì) 土拉菌的反生物恐怖的研究。反生物恐怖的首要任務(wù)是迅速作出診斷，明確病原，以便及時(shí) 正確救治病人，減少繼發(fā)性傳播，迅速有效地控制和防治疫情的蔓延。膠體金標(biāo)記的免疫層 析方法具有快速、簡便、不需要依賴重要裝備、能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場檢測等特點(diǎn)，成為目前傳染病 快速診斷中研究的熱點(diǎn)。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型的目的在于提供一種土拉弗朗西斯菌檢測試紙，其能快速、靈敏、特 異、準(zhǔn)確地檢測樣品中的土拉弗朗西斯菌，適用于現(xiàn)場快速檢測。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型一種土拉弗朗西斯菌檢測試紙，包括反應(yīng)支撐物、緊 密連接于反應(yīng)支撐物上表面中部的硝酸纖維膜，硝酸纖維膜起始端的上表面與吸水墊部分 重疊連接、硝酸纖維膜末端的上表面與含有膠體金標(biāo)記的i^opA-S多克隆抗體的金標(biāo)抗體 保護(hù)膜部分重疊連接，金標(biāo)抗體保護(hù)膜的上表面部分重疊連接有樣品墊，其中，硝酸纖維膜 上靠近其起始端處設(shè)置有質(zhì)控抗體包被的質(zhì)控條帶、靠近其末端處設(shè)置有兔抗重組i^opA-L 多克隆抗體檢測條帶。進(jìn)一步，所述反應(yīng)支持物為PVC板，吸水墊為濾油紙。進(jìn)一步，所述金標(biāo)抗體保護(hù)膜為玻璃纖維膜、聚酯膜或?yàn)V紙纖維。進(jìn)一步，所述樣品墊為玻璃纖維膜、聚酯膜或?yàn)V紙纖維。進(jìn)一步，所述試紙整體的外部包裹有外殼，該外殼上對(duì)應(yīng)于所述樣品墊處設(shè)置有 樣品孔，外殼上對(duì)應(yīng)于所述質(zhì)控條帶、檢測條帶處設(shè)置有觀察窗。本實(shí)用新型的土拉弗朗西斯菌檢測試紙，基于純化的R)PA多抗標(biāo)記膠體金，構(gòu)建 雙抗體夾心法檢測抗原，具有操作簡單，檢測時(shí)間短，無需專業(yè)人員，適合快速現(xiàn)場檢測等 優(yōu)點(diǎn)。
圖1為土拉弗朗西斯菌膠體金免疫層析試紙條的目測敏感性圖；[0013]圖2為特異性檢測試驗(yàn)圖；圖3為土拉弗朗西斯菌膠體金免疫層析試紙條模擬樣品檢測圖；圖4為本實(shí)用新型檢測試紙的擬合直線圖；圖5A為本實(shí)用新型檢測試紙的正面示意圖；圖5B為本實(shí)用新型檢測試紙的側(cè)面示意圖；圖6A為本實(shí)用新型檢測試紙的陽性檢測結(jié)果示意圖；圖6B為本實(shí)用新型檢測試紙的陰性檢測結(jié)果示意圖；圖6C為本實(shí)用新型檢測試紙的無效檢測結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施方式
如圖1至圖4，圖5A、圖5B、圖6A、圖6B、圖6C所示，圖1是土拉弗朗西斯菌膠體 金免疫層析試紙條的目測敏感性圖，1-5分別表示檢測的樣品濃度依次為空白對(duì)照、75ug/ mL、7. 5ug/mL、750ng/mL、375ng/mL。如圖 1 所示，75ug/mL、7. 5ug/mL、750ng/mL 為陽性反應(yīng)； 375ng/mL無陽性反應(yīng)；即肉眼可觀察到的最低濃度為750ng/mL。圖2為特異性檢測試驗(yàn)圖，1表示檢測750ng/mL的馬秋波GP2蛋白，2表示天花MlR 蛋白，3表示禽流感NP蛋白，4表示登革病毒Deng-E-D3蛋白，5表示普氏立克次體120N蛋 白。圖3為土拉弗朗西斯菌膠體金免疫層析試紙條模擬樣品檢測；測試條1 陰性對(duì) 照、2 5 分別為含R)PA蛋白750ng/mL梨汁、面粉、餅干、果凍。圖5A、圖5B中，1 吸水墊；2 硝酸纖維膜，T 包被兔抗重組R)PA_L多克隆抗體檢 測條帶；C 包被羊抗兔IgG的質(zhì)控條帶；3 含有膠體金標(biāo)記R)pA-S多克隆抗體的玻璃纖維 膜；4 樣品墊；5 反應(yīng)支持物。圖6A、圖6B、圖6C是本實(shí)用新型的檢測結(jié)果示意圖；出現(xiàn)T、C兩條線表示陽性； 只出現(xiàn)C 一條線表示陰性；T、C兩條線均不出現(xiàn)表示無效。本實(shí)用新型采用膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)是抗體蛋白等生物大分子被吸附到膠體金顆粒 表面的包被過程。膠體金對(duì)蛋白質(zhì)的吸附主要取決于PH值和蛋白質(zhì)的最小穩(wěn)定濃度，離子 濃度和蛋白質(zhì)分子量等也影響二者之間的吸附。本實(shí)用新型發(fā)現(xiàn)在膠體金檢測試紙條的制 備過程中PH值和離子濃度條件是關(guān)鍵，膠體金是一種很不穩(wěn)定的膠體，通常認(rèn)為，在pH值 等于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)或較高于等電點(diǎn)時(shí)吸附效果最好，而且易形成牢固的復(fù)合物來穩(wěn)定膠體 金。此時(shí)蛋白質(zhì)分子主要呈電中性，與膠體金顆粒相互靜電吸引力較小，而蛋白質(zhì)分子的表 面張力卻最大，處于一種微弱的水化狀態(tài)，因此較易吸附于金顆粒的表面形成一個(gè)蛋白質(zhì) 層，阻止了膠體金顆粒的相互接觸，使膠體金處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)PH值低于蛋白質(zhì) 的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)主要帶正電荷，膠體金帶負(fù)電荷，二者極易結(jié)合形成大的聚合物而失去 結(jié)合蛋白質(zhì)的能力。PH值高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，與金顆粒的負(fù)電荷相互 排斥而不能互相結(jié)合。因此常用牛血清白蛋白，卵白蛋白，聚乙二醇或明膠作為穩(wěn)定劑來防 止蛋白質(zhì)與膠體金的聚合與沉淀。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)證明本系統(tǒng)采用牛血清白蛋白作為穩(wěn)定劑，其 特異性、敏感性都很好。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過多次條件摸索得出K+對(duì)整個(gè)膠體金檢測系統(tǒng)的影響較 大，所以在選擇抗體稀釋液、樣品處理液等都要避免引進(jìn)Κ+，也可以采用透析去除K+。本實(shí)用新型提供一種方便、快捷地檢測土拉弗朗西斯菌檢測試紙，同時(shí)可利用金 標(biāo)免疫分析儀進(jìn)行的半定量檢測方法。該檢測試紙的工作原理是利用特異性抗原-抗體的結(jié)合，用膠體金標(biāo)記抗體，與待檢抗原結(jié)合后，使與試紙上結(jié)合的捕獲抗體顯色。本實(shí)用新 型還涉及制備上述檢測試紙的制備方法。本實(shí)用新型能夠基于一份標(biāo)本和一個(gè)試紙，快速方便地檢測出標(biāo)本中的土拉弗朗 西斯菌，節(jié)省了大量人力物力，方便、快速、簡捷。一種方便、快捷地檢測土拉弗朗西斯菌的方法，其中包括將待測標(biāo)本與樣品稀釋 液混勻，再將樣品混合液加入試紙樣品孔處，樣品中的液體依靠虹吸作用上行，10-15分鐘 判讀結(jié)果；所述檢測試紙包括(1)反應(yīng)支持物；(2)吸水墊；(3)硝酸纖維膜，該膜包被有兔抗重組R)pA-L多克隆抗體和質(zhì)控抗體的檢測條帶 和質(zhì)控條帶；(4)金標(biāo)抗體保護(hù)膜，其中含有膠體金標(biāo)記的R)pA-S多克隆抗體；(5)樣品墊，采用含有吐溫20的磷酸鹽緩沖液對(duì)玻璃纖維素膜進(jìn)行預(yù)處理；其中反應(yīng)支持物為PVC板，吸水墊為濾油紙，硝酸纖維膜依次包被羊抗兔IgG、兔 抗重組R)pA-L多克隆抗體lmg/ml，金標(biāo)抗體保護(hù)膜為含有膠體金標(biāo)記的R)pA-S多克隆抗 體的玻璃纖維膜或聚酯膜或?yàn)V紙纖維，樣品墊選用玻璃纖維膜或聚酯膜或?yàn)V紙纖維。本實(shí)用新型土拉弗朗西斯菌檢測試紙，其中吸水墊、硝酸纖維膜、金標(biāo)抗體保護(hù) 膜、樣品墊和反應(yīng)支持物按照附圖5A所示方式構(gòu)成；反應(yīng)支持物5位于底層，硝酸纖維膜2 位于反應(yīng)支持物5上的中部，該膜的T處是兔抗重組R)pA-L多克隆抗體檢測條帶，并且C 處是羊抗兔IgG包被的質(zhì)控條帶；玻璃纖維膜3位于硝酸纖維膜上部的一側(cè)并與之部分重 疊，該膜含有膠體金標(biāo)記的i^opA-S多克隆抗體；吸水墊1位于硝酸纖維膜2上部的相對(duì)于 玻璃纖維膜3而言的另一側(cè)并與2部分重疊。樣品墊4位于2上與1相反的一側(cè)并與3部 分重疊。本實(shí)用新型土拉弗朗西斯菌檢測試紙，以吸水墊一側(cè)為末端，樣品墊一側(cè)為末端， 兔抗重組！^叩々-!^多克隆抗體檢測條帶位于接近起始端，羊抗兔IgG包被的質(zhì)控條帶接近于 起始端。本實(shí)用新型土拉弗朗西斯菌檢測試紙的制備方法，該制備方法包括以下步驟膠 體金探針的制備，金標(biāo)墊的制備，硝酸纖維膜的噴涂包被，樣品墊的預(yù)處理。1、膠體金探針的制備(1)將HAuC14先配制為0. 01%水溶液。磁力攪拌下準(zhǔn)確加入Iml 的HAuC14， 同時(shí)加入1. 5-3ml 的檸檬酸三鈉水溶液。顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱，冷卻至室溫后加純水補(bǔ) 足至100ml，4 °C避光保存。(2)用K2CO3調(diào)PH值為約6-8，優(yōu)選為約7. 0-8. 0，更優(yōu)選約7. 0-7. 5后。(3)將膠體金調(diào)至pH 7. 0-7. 5，用PBS稀釋抗體至0. 2mg/ml。(4)保持膠體金穩(wěn)定。本實(shí)用新型還提供一種獲得維持膠體金穩(wěn)定的抗體最佳標(biāo)記劑量的方法，該方法 包括a.取10支潔凈的1. 5ml離心管，分別加入膠體金溶液Iml。b.在 1-10 號(hào)管內(nèi)分別加入 10ml、20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml、IOOml的PB,再依次加入稀釋好的0. 2mg/ml的待標(biāo)記抗體90ml、80ml、70ml、60ml、50ml、 40ml、30ml、20ml、10ml、0ml，混勻，靜置 2 分鐘。c.在10個(gè)管內(nèi)分別加入10% NaCl溶液100ml，混勻后室溫靜置2小時(shí)，觀察顏色變化。未加抗體及加入量不足以穩(wěn)定膠體金的試管中的液體顏色呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的變化， 而加入抗體量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定劑量的試管則保持紅色不變。與對(duì)照管(1號(hào)管)相 比，顏色最接近、含抗體劑量最低的試管所含的抗體劑量，即為Iml膠體金所必須的抗體穩(wěn) 定劑量，在此基礎(chǔ)上再加20%抗體，即為抗體最佳標(biāo)記劑量。本實(shí)用新型經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)和 分析，得出的結(jié)果表明維持膠體金溶液適宜抗體量為2-lOug，優(yōu)選抗體量2-8ug，更優(yōu)選 3-6ug，最優(yōu)選為3-5ug。2、金標(biāo)墊的制備取上述pH的膠體金以Iml/管分裝于1.5ml的離心管中。每支管中為2_10ug， 優(yōu)選抗體量2-8ug，更優(yōu)選3-6ug，最優(yōu)選為3-5ug，輕搖混勻后放置。每管中加入10%的 BSAlOOul，混勻放置。將上面初步制得的膠體金探針在12000rpm、4°C下離心30分鐘，棄上 清液。每支離心管中加入Iml重懸液懸浮沉淀后同上離心。棄上清液，管底得到暗紅色的 疏松狀沉淀，加入500ul重懸液重懸后于4°C，lOOOrpm，離心10分鐘；取上清液，均勻滴加 在Icm寬的玻璃纖維上，37°C干燥。3、硝酸纖維膜的噴涂(1)利用隔流噴金劃線機(jī)以50mm/s的噴膜速度包被檢測兔抗重組R)pA_L多克隆 抗體和質(zhì)控羊抗兔IgG兩個(gè)條帶的硝酸纖維膜；在該噴涂包被膜的步驟中，噴膜速度優(yōu)選是lO-lOOmm/s，更優(yōu)選是45-55mm/s，最 優(yōu)選是50mm/s ；所述兔抗重組R)pA-L多克隆抗體，其加入量為l_5mg/ml，該多克隆抗體的 稀釋液可以為PB ；質(zhì)控羊抗兔IgG可以購自鼎國生物技術(shù)公司，其濃度為0. l-5mg/ml更優(yōu) 選是 0. 5-2. 5mg/ml，最優(yōu)選為 lmg/ml ；(2)制備一種含有膠體金標(biāo)記的R)pA-S多克隆抗體的玻璃纖維膜，將膠體金標(biāo)記 的R)pA-S多克隆抗體均勻涂布在玻璃纖維膜上。抗體用PBS稀釋，pH為6-8，優(yōu)選7_8，最 適 PH 值為 7. 0-7.5。本實(shí)用新型還公開了所述試紙?jiān)跈z測土拉弗朗西斯菌中的應(yīng)用，參見附圖3。在本實(shí)用新型檢測土拉弗朗西斯菌的方法中，先將待測標(biāo)本放入裝有稀釋液的小 瓶內(nèi)，再用移液器將樣品混合液加入試紙的樣品墊4處(即末端)，樣品中的液體依靠虹吸 作用上行，一般需10-15分鐘判讀結(jié)果如標(biāo)本中含有土拉弗朗西斯菌，則它將與試紙上膠體金標(biāo)記的R)pA-S多克隆抗 體形成相應(yīng)的復(fù)合物，液體展開上行并與硝酸纖維膜上的兔抗重組i^opA-L多克隆抗體結(jié) 合，形成紅色線條，即在“T”處形成紅色條帶。無論是否含有相對(duì)應(yīng)的抗原，膠體金標(biāo)記多克隆抗體繼續(xù)隨液體繼續(xù)上行并與該 膜上的羊抗兔IgG形成紅色沉淀線，即在“C”處形成紅色條帶。此線是質(zhì)控線，如膠體金失 效，此線就不會(huì)出現(xiàn)，說明試紙失效。如圖6所示。陽性結(jié)果會(huì)出現(xiàn)2條紅色沉淀線，陰性結(jié)果出現(xiàn)1條紅色沉淀線，如不出現(xiàn)線條說 明試紙失效。如若肉眼無法辨別T處紅色條帶，可利用金標(biāo)免疫分析儀進(jìn)行半定量檢測。[0061]本實(shí)用新型的技術(shù)方案是采用兔抗重組R)pA-L多克隆抗體和羊抗兔IgG分別固 相于硝酸纖維膜上，結(jié)合膠體金標(biāo)記的i^opA-S多克隆抗體，應(yīng)用膜層析雙抗體夾心法的原 理檢測標(biāo)本中的土拉弗朗西斯菌。本實(shí)用新型還提供一種將膠體金測試條與膠體金生物傳感器有機(jī)整合的定量檢 測土拉弗朗西斯菌的檢測系統(tǒng)。運(yùn)用膠體金測試條判讀儀的優(yōu)勢在于，判讀儀能夠在人眼 無法正確識(shí)別可疑物檢測是否存在陽性的情況下，正確判讀該試紙條檢測結(jié)果。減少了因 人為主觀判讀帶來的錯(cuò)誤率，增加了客觀性、準(zhǔn)確性；并且可實(shí)現(xiàn)定量檢測。此外，膠體金判 讀儀攜帶方便、使用簡單、判定準(zhǔn)確、結(jié)果客觀、易保留，為檢驗(yàn)檢驗(yàn)工作帶來了方便。本實(shí)用新型涉及的上述土拉弗朗西斯菌檢測試紙，它還包含金標(biāo)抗體保護(hù)膜。本實(shí)用新型涉及的上述土拉弗朗西斯菌檢測試紙，其中反應(yīng)支持物選用PVC板。本實(shí)用新型涉及的上述土拉弗朗西斯菌檢測試紙，其中吸水墊選用濾紙。本實(shí)用新型涉及的上述土拉弗朗西斯菌檢測試紙，其中金標(biāo)抗體保護(hù)膜選用聚酯 膜、玻璃纖維或?yàn)V紙纖維。實(shí)施例1 膠體金免疫層析試紙條的制備材料和方法1、抗原及抗體兔抗重組R)pA-L多克隆抗體、FopA-S多克隆抗體由中國檢科院衛(wèi)生檢疫所提供。 羊抗兔IgG(購自鼎國生物技術(shù)公司)2、層析測試條耗材結(jié)合墊(玻璃纖維)、硝酸纖維素膜(NC膜，SHF 1350225)、樣品墊及吸水墊、濾紙 購自Minipore公司。3、實(shí)驗(yàn)儀器金標(biāo)免疫分析儀可購自中國科學(xué)院上海光學(xué)精密機(jī)械研究所、中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué) 研究院聯(lián)合研制的分析儀。4、膠體金免疫層析試紙條的制備4. 1膠體金結(jié)合墊將pH值7. 0 7. 5、濃度0. 2mg/ml的R)PA_S多克隆抗體標(biāo)記于檸檬酸鈉法制備 25nm的膠體金顆粒的膠體金顆粒，37 °C干燥。4. 2硝酸纖維素膜檢測帶兔抗重組R)pA-L多克隆抗體lmg/ml ；質(zhì)控帶羊抗兔IgG :lmg/ml，37°C干燥。4. 3 組裝將樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊依次貼在帶有豁合劑的底襯卡，切成0. 4cm的條，干燥， 裝殼，室溫貯存?zhèn)溆?。?shí)施例2 樣品的定性和定量檢測的判定1、樣品的處理(1)液體一梨汁首先用緩沖液分別以適當(dāng)?shù)谋壤♂尰靹颍?2)固體/半固 體一稱取白色粉末(面粉、餅干)和半固態(tài)果凍加入緩沖液溶解后，取溶解后的上清溶液 將重組土拉菌R)pA蛋白分別加入其中使R)PA蛋白的終濃度達(dá)750ng/mL。
7[0085]表1 土拉菌樣品檢測及靈敏度
權(quán)利要求1.一種土拉弗朗西斯菌檢測試紙，其特征在于，該檢測試紙包括反應(yīng)支撐物、緊密連接 于反應(yīng)支撐物上表面中部的硝酸纖維膜，硝酸纖維膜起始端的上表面與吸水墊部分重疊連 接、硝酸纖維膜末端的上表面與金標(biāo)抗體保護(hù)膜部分重疊連接，金標(biāo)抗體保護(hù)膜的上表面 部分重疊連接有樣品墊，其中，硝酸纖維膜上靠近其起始端處設(shè)置有質(zhì)控抗體包被的質(zhì)控 條帶、靠近其末端處設(shè)置有兔抗重組i^opA-L多克隆抗體檢測條帶。
2.如權(quán)利要求1所述的土拉弗朗西斯菌檢測試紙，其特征在于，所述反應(yīng)支持物為PVC 板，吸水墊為濾油紙。
3.如權(quán)利要求1所述的土拉弗朗西斯菌檢測試紙，其特征在于，所述金標(biāo)抗體保護(hù)膜 為玻璃纖維膜、聚酯膜或?yàn)V紙纖維。
4.如權(quán)利要求1所述的土拉弗朗西斯菌檢測試紙，其特征在于，所述樣品墊為玻璃纖 維膜、聚酯膜或?yàn)V紙纖維。
5.如權(quán)利要求1所述的土拉弗朗西斯菌檢測試紙，其特征在于，所述試紙整體的外部 包裹有外殼，該外殼上對(duì)應(yīng)于所述樣品墊處設(shè)置有樣品孔，外殼上對(duì)應(yīng)于所述質(zhì)控條帶、檢 測條帶處設(shè)置有觀察窗。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種土拉弗朗西斯菌檢測試紙，包括反應(yīng)支撐物、緊密連接于反應(yīng)支撐物上表面中部的硝酸纖維膜，硝酸纖維膜起始端的上表面與吸水墊部分重疊連接、硝酸纖維膜末端的上表面與含有膠體金標(biāo)記的FopA-S多克隆抗體的金標(biāo)抗體保護(hù)膜部分重疊連接，金標(biāo)抗體保護(hù)膜的上表面部分重疊連接有樣品墊，其中，硝酸纖維膜上靠近其起始端處設(shè)置有質(zhì)控抗體包被的質(zhì)控條帶、靠近其末端處設(shè)置有兔抗重組FopA-L多克隆抗體檢測條帶。本實(shí)用新型利用膠體金標(biāo)記和雙抗體夾心免疫層析技術(shù)，能快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確地檢測樣品中的土拉弗朗西斯菌，并可實(shí)現(xiàn)定量，適用于現(xiàn)場快速檢測。
文檔編號(hào)G01N33/52GK201903545SQ20102028702
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月10日
發(fā)明者景瀅瀅, 楊宇, 王振東, 王靜 申請(qǐng)人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院