專利名稱：A+生物標(biāo)志物的試驗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明簡言之是關(guān)于抗體加(A+)生物標(biāo)志物(biomarker)的試驗，該試驗用于檢測和診斷受試者的癌癥。
背景技術(shù)：
腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)的分子鑒定已經(jīng)清楚地證實人類的免疫系統(tǒng)能夠與內(nèi)源性產(chǎn)生的癌癥細(xì)胞反應(yīng)。參見van der Bruggen等(1991) Science254 1643-7。人類免疫系統(tǒng)中的胞內(nèi)和體液手臂(humoral arms)均識別癌癥細(xì)胞衍生出的TAA。參見Rosenberg SA (2001) Nature 411 :380-4 ；以及 Old 等(1998) J Exp Med 187 :1163-7。出于對人類癌癥的血清學(xué)分析的特別興趣，就要鑒定被存在于癌癥患者血清中的抗體(Ab)識別的TAA。參見Sahin等.(1997) Curr Opin Immunol 9:709-16。抗體定義的TAA提供了體液免疫對自體腫瘤應(yīng)答的分子細(xì)節(jié)。為了研究覆蓋廣泛的患有任何特定癌癥患者中的抗體應(yīng)答，需要大量的TAA。目前，表征循環(huán)的抗體主要應(yīng)用兩個策略(1)利用編碼特異性TAA的噬菌體裂解物的傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測；和(2)用純化的重組蛋白作為抗原靶標(biāo)的，基于酶聯(lián)免疫法(ELISA)的方法。參見 Stone 等(2003) Int J Cancerl04 :73-84 ；以及 Tan 等(2005) N Engl J Med 353 觀15-7。前一種方法需要大量的單獨(dú)預(yù)先吸附有大腸桿菌噬菌體裂解物的血清，來降低背景；后一種方法是強(qiáng)有力的方法，但卻需要純化的由單獨(dú)的TAA編碼的蛋白。參見^iang等 (2003) Cancer Epidemiol Biomarker Prev 12 136—43 ；以及 Lagarkova 等(2003) Immunol Lett 85 :71-4o

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種試驗方法，該方法針對樣品中至少一種抗體和至少一種第二生物標(biāo)志物，所述抗體特異性結(jié)合第一生物標(biāo)志物或者其抗原表位，該方法包括單一反應(yīng)步驟，通過該步驟，針對所述抗體的第一捕獲試劑和針對所述第二生物標(biāo)志物的第二捕獲試劑共同與樣品接觸，檢測所述抗體的存在與否或數(shù)量；以及檢測所述第二生物標(biāo)志物的存在與否或數(shù)量。本發(fā)明的這項試驗可以用于診斷或指示受試者為患有疾病(affliction)或者可能患有疾病，該試驗包括，當(dāng)所述抗體的存與否或數(shù)量和所述第二生物標(biāo)志物的存在與否或數(shù)量的組合表明疾病，則診斷或指示該受試者為患有該疾病或可能患有該疾病。在一些實施方式中，所述抗體的存在與否或數(shù)量被設(shè)定為第一值，而所述第二生物標(biāo)志物的存在與否或數(shù)量被設(shè)定為第二值，第一值和第二值相結(jié)合從而給出指標(biāo)值 (index value)，然后，該指標(biāo)值被用作診斷和指示該受試者為患有該疾病或可能患有該疾病。在一些實施方式中，所述第一值被設(shè)為0，表示不存在所述抗體，被設(shè)為1表示存在所述抗體；所述第二值被設(shè)為0，表示正常數(shù)量的所述第二生物標(biāo)志物，被設(shè)為1，表示非正常的高數(shù)量的所述第二生物標(biāo)志物，或被設(shè)為0與1之間的數(shù)字，表示正常數(shù)量和非正常的高數(shù)量之間的所述第二生物標(biāo)志物。在一些實施方式中，當(dāng)所述第一值和所述第二值的加權(quán)值之和等于或大于給定數(shù)值，則該受試者被指示為患有該疾病。在一些實施方式中，邏輯回歸分析用于計算基于所述第一值和所述第二值的指標(biāo)值。在這些實施方式中，當(dāng)所述指標(biāo)值等于或大于給定數(shù)值，該受試者被確定為患有該疾病。在一些實施方式中，所述疾病是癌癥，例如前列腺癌，肝癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，胃癌，甲狀腺癌，膀胱癌，尿路上皮細(xì)胞癌，以及包括本領(lǐng)域已知的其它上皮癌等等。在一些實施方式中，所述癌癥為前列腺癌，所述第一生物標(biāo)志物是前列腺癌相關(guān)抗原，例如NY-ES0-1，MAGE-I, XAGE-Ib, SSX2，4，P53, MUC-I, CEA, S0X2, AMACR, p90 自身抗原(autoantigen)，LEDGFp75, HIP-I, p62 自身抗原，GRP78, TMPRSS2-ERG 融合物，等等， 以及它們的抗原決定表位，所述第二生物標(biāo)志物為前列腺特異性抗原(prostate specific antigen)。在一些實施方式中，所述抗原決定表位選自以下物質(zhì)組成的組:AMACR 341-371 ；p90 :796-827 ；LEDGFp75 :310-342 ；HIP-I :150-180 ；HIP-I :338-378 ；SSX2，4 110-139 ；NY-ES0-1 :1_40 ；XAGE-Ib :1_25 ；以及 XAGE-Ib :57_81。在一些實施方式中，可以試驗一種或多種類型的自身抗體(autoantibody)，例如一組六個不同的“第一”生物標(biāo)志物與試驗至少一種第二生物標(biāo)志物相結(jié)合，用來檢測和/或測量六種不同類型的自身抗體。在一些實施方式中，所述第一生物標(biāo)志物是第一腫瘤抗原，所述第二生物標(biāo)志物是第二腫瘤抗原。在一些實施方式中，所述第一腫瘤抗原和/或所述第二腫瘤抗原是腫瘤的標(biāo)志物，該標(biāo)志物可能是腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原。在一些實施方式中，所述第一腫瘤抗原和/或所述第二腫瘤抗原是癌癥特異性標(biāo)志物或者組織特異性標(biāo)志物。在一些實施方式中，所述第二腫瘤抗原選自由以下物質(zhì)組成的組阿爾法胚胎蛋白(AFP)，癌抗原 125 (CA-125)，癌胚抗原(CEA)，人表皮生長因子受體2 (Her2/neu)，腫瘤相關(guān)抗原CA 15-3, 腫瘤相關(guān)抗原CA 19. 9，人天門冬氨酸(aspartyl)(門冬酰)貝塔羥基化酶(HAAH)，甲狀腺球蛋白，膀胱腫瘤抗原等等。在一些實施方式中，第一腫瘤抗原是NY-ES0-1，XAGE-Ib,或者SSX2，4，第二腫瘤抗原是前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)，阿爾法胚胎蛋白(AFP)，腫瘤抗原125 (CA-125)，癌胚抗原(CEA)，人表皮生長因子受體2 (Her2/ neu)，腫瘤相關(guān)抗原CA 15-3，腫瘤相關(guān)抗原CA 19. 9，人天門冬氨酸(門冬酰)貝塔羥基化酶(HAAH)，甲狀腺球蛋白，膀胱腫瘤抗原，等等。在一些實施方式中，可試驗多于一個的數(shù)量的第二腫瘤抗原。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了一種純化的或分離的肽。這種肽選自由以下物質(zhì)組成的組AMACR :341-371 ；p90 :796-827 ；LEDGFp75 :313-345 ；HIP-1 :150-180 ；SSX2, 4 :110-139 ；XAGE-Ib 1-25 ；NY-ES0-1 1-40 ；XAGE-lb :57-81 ；AMACR :251-282 ；HIP-I 338-378 以及 p62 :156_184。在一些實施方式中，本發(fā)明提供可以進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的試驗的試劑盒，其中包括共同包裝而成的對于所述第一生物標(biāo)志物的捕獲試劑以及針對所述第二生物標(biāo)志物的捕獲試劑。例如用于進(jìn)行自身抗體加前列腺特異性抗原(autoAb+PSA)試驗的試劑盒，包括共同包裝而成的至少一種特異性結(jié)合針對前列腺癌相關(guān)抗原(不是前列腺特異性抗原)的 autoAb的捕獲試劑，以及至少一種特異性結(jié)合PSA的抗體。本發(fā)明的試驗可以用作疾病的早期發(fā)現(xiàn)(例如在可觀察的臨床癥狀出現(xiàn)之前)， 例如受試者的癌癥，確定受試者是否可能患有周期性復(fù)發(fā)的癌癥，確定患有癌癥的受試者的預(yù)后。(例如通過所述第一值和所述第二值的加和高于或者低于給定數(shù)值來指示受試者是否對一定的治療具有較好的或較差的恢復(fù)或響應(yīng))。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了一種診斷或指示受試者為患有或可能患有前列腺癌的方法，該方法包括試驗來自受試者的樣本，與前列腺癌相關(guān)抗原或其抗原決定表位特異性結(jié)合的自身抗體的存在與否或數(shù)量，以及前列腺特異性抗原的存在與否或數(shù)量，其中，所述前列腺癌相關(guān)抗原不是前列腺特異性抗原，當(dāng)所述自身抗體的存在與否或數(shù)量與所述前列腺特異性抗原的存在與否或數(shù)量的結(jié)合表明前列腺癌，則診斷或指示該受試者為患有或可能患有前列腺癌。在一些實施方式中，樣品的試驗僅通過單一反應(yīng)步驟進(jìn)行，通過該步驟，針對所述自身抗體的第一捕獲試劑和針對所述前列腺特異性抗原的第二捕獲試劑共同與所述樣品接觸。前面的概述和接下來的細(xì)節(jié)描述僅為示例性和說明性的，意在對要求保護(hù)的發(fā)明提供進(jìn)一步的解釋。所包括的附圖提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，在此引入并組成本說明書的一部分，闡述本發(fā)明的一些實施方式，并與說明書一起用于闡釋本發(fā)明的原理。


通過參考附圖進(jìn)一步理解本發(fā)明，其中圖IA示出了對36個患者(20人患有前列腺癌，16人患有前列腺良性增生(BPH)) 進(jìn)行PSA和antoAb+PSA試驗的受試者工作特性(ROC)曲線。PSA水平由商品化的ELISA試劑盒所測定。針對6種肽抗原決定表位的所述自身抗體用ELISA測定。圖IB示出了比較對于特定的病人群的autoAb+PSA試驗的組合指標(biāo)和單獨(dú)使用 PSA的區(qū)分能力的表格。圖2是通過基于ELISA的試驗和MAP的試驗，比較隨機(jī)抽取的受試者(包括健康受試者，患有BPH的受試者以及活體檢查驗證患有前列腺癌的受試者)血清中的PSA水平 (ng/ml)的圖。用MAP試驗與基于商品化的ELISA試驗所得到的PSA水平是類似的，范圍為 0.l-25ng/ml。圖3是autoAb+PSA試驗板的示意圖。具體地，示例了用于基于MAP試驗的96 孔板(密理博)。放大的孔顯示了十種不同顏色的試驗珠子，1個包被了作為對照的貝塔-半乳糖苷酶(β-gal)肽，8個包被了獨(dú)立的PCAA肽用來檢量自身抗體，1個包被了抗 PSA (anti-PSA)抗體用來測量PSA。PSA標(biāo)準(zhǔn)品(n = 8)，和健康捐贈者(n = 8)的血清的每個樣品加兩個平行孔，目的分別是確定PSA裝置(PSA units)以及血清陽性。已知的針對給定的抗原決定表位或者蛋白的陽性血清，例如NY-ES0-1能被用作對照。所述珠子的底紋和尺寸僅為說明。圖4A用圖表顯示了單獨(dú)使用基于MAP的試驗，而不檢測自身抗體，確定總PSA水平的線性范圍的比較。線性回歸方程顯示在圖的上方。而圖4B顯示了，存在針對8種抗原決定表位的自身抗體檢測，線性范圍同樣能夠達(dá)到0-30ng/ml的總PSA。圖4B用圖表顯示了用基于MAP的autoAb+PSA的多重試驗確定總PSA水平的線性范圍的比較(即，與針對8個肽抗原決定表位的自身抗體的相同反應(yīng)步驟的相同樣品中測定的PSA水平)。線性回歸方程顯示在圖的上方。圖5顯示的是在最小稀釋濃度下，從252個患者(131人患有前列腺癌，121人患有 BPH)的PSA和autoAb+PSA試驗得到的ROC曲線。PSA水平以及自身抗體根據(jù)本文描述的 autoAb+PSA的多重試驗測出。圖6顯示的是在最大稀釋濃度下，從252個患者(131人患有前列腺癌，121人患有 BPH)的PSA和autoAb+PSA試驗得到的ROC曲線。PSA水平以及自身抗體根據(jù)本文描述的 autoAb+PSA的多重試驗測出。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種用于診斷受試者為存在癌癥患病可能或患有癌癥的試驗，其中，至少一種特異性結(jié)合第一腫瘤抗原決定表位(TA)的自身抗體(autoAb)以及至少一種生物標(biāo)志物，例如前列腺癌生物標(biāo)志物，前列腺特異性抗原(PSA)，均能夠在來自受試者的樣本中被檢測和/或測量到。在一些實施方式中，所述自身抗體和所述生物標(biāo)志物在同一樣品中被檢測或測量到。在一些實施方式中，所述自身抗體和生物標(biāo)志物在同一樣品中同時被檢測或測量到。如本文所用的，“抗原決定表位”是被給定的抗體所識別的分子的部分。如本文所用的，“自身抗體”指的是受試者產(chǎn)生的一種抗體，其直接針對一種或多種受試者自身的抗原(例如腫瘤抗原)。如本文所用的，“抗體”指的是免疫球蛋白分子及其中的免疫激活部分(即，含有抗原結(jié)合位點(diǎn)、特異性結(jié)合抗體直接針對的分子的分子)。 如此，抗體這個術(shù)語不僅僅包括全部的抗體分子，也包括抗體的多聚體、抗體的片段以及抗體的變體(包括衍生物)，抗體的多聚體和抗體的片段。本文中，被術(shù)語抗體所定義的分子的例子包括但不限于單鏈FVS(ScFVS)，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)ab'片段，F(xiàn)(ab' )2，二硫鍵連接的 Fvs (sdFvs)，F(xiàn)vs,以及含有VL或VH結(jié)構(gòu)域，或可選擇的由VL或VH結(jié)構(gòu)域組成的片段。本文中所用術(shù)語“單鏈Fv”或“scFv”指的是含有抗體的VH結(jié)構(gòu)域與抗體的VL結(jié)構(gòu)域連接而成的多肽。本發(fā)明中的抗體也可包括抗體的多聚體形式。例如，本發(fā)明的抗體也可以為免疫球蛋白單體分子的二聚體、三聚體或更高級的聚合體。本發(fā)明的所述抗體可以為天然的或合成的，多克隆或者單克隆，或嵌合分子，并且可以為免疫球蛋白分子的任何形式(如， IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和 IgY)，任何類(如，IgG1, IgG2, IgG3、IgG4, IgA1 和 IgA2)，或任何亞類。
如本文所用的，分子，例如抗體，“特異性結(jié)合”另一分子，意思是這種相互作用依賴于被結(jié)合的分子上特異性結(jié)構(gòu)的存在，例如，抗原決定表位。例如，特異性結(jié)合蛋白的抗體，識別和結(jié)合蛋白上的特異性結(jié)構(gòu)，而不是無差別地結(jié)合從而引起非特異性結(jié)合和/或背景結(jié)合。如本文所用的，“非特異性結(jié)合”以及“背景結(jié)合”指的是不依賴特異性結(jié)構(gòu)(例如，具體的抗原決定表位)存在的相互作用。如本文所用的，“生物標(biāo)志物”指的是用作過程，事件或者狀態(tài)表征物的物質(zhì)。生物標(biāo)志物可以是生物分子，例如核酸分子(例如微小RNA，基因組DNA等等)，蛋白，多糖，等等。生物標(biāo)志物包括腫瘤抗原以及腫瘤標(biāo)志物。如本文所用的，“腫瘤抗原”指的是腫瘤特異性抗原(TSAs)，通常可分為只存在于腫瘤細(xì)胞上的抗原和腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)，而腫瘤相關(guān)抗原又通常分為存在于一些腫瘤細(xì)胞上的抗原以及存在于一些正常細(xì)胞上的抗原。如本文所用的，“腫瘤標(biāo)志物”是指在機(jī)體組織或體液中可以找到的，由腫瘤細(xì)胞或非腫瘤細(xì)胞應(yīng)答癌細(xì)胞(cancerous cells)的存在而產(chǎn)生的物質(zhì)。腫瘤標(biāo)志物的實例包括AFP (在肝癌中)，CA 125(在卵巢癌中)，CA 15_3 (在乳腺癌中)，CEA (在卵巢癌，肺癌， 乳腺癌，胰腺癌，胃腸道癌癥中)，以及PSA(在前列腺癌中)。腫瘤標(biāo)志物可以被分為兩類 癌癥特異性標(biāo)志物以及組織特異性標(biāo)志物。腫瘤標(biāo)志物包括腫瘤抗原。但腫瘤標(biāo)志物可不引發(fā)免疫應(yīng)答。如本文所用的，“可能患有癌癥的受試者”指的是受試者顯示出一種或多種表明癌癥的癥狀(例如，可檢測到的腫塊或腫團(tuán)(mass))?？赡芑加邪┌Y的受試者通常沒有被檢測到患有癌癥。然而，可能患有癌癥的受試者可包括接受初期診斷(例如顯示腫團(tuán)的CT掃描或者X射線)的人，但它們對癌癥的類型或階段并不知情?？赡芑加邪┌Y的受試者也可包括曾經(jīng)患過癌癥的人(例如，病情緩解的個體)?？赡芑加邪┌Y的受試者也可為具有患癌癥風(fēng)險的受試者。如本文所用的，“具有患癌癥風(fēng)險的受試者”指的是受試者存在著一種或多種的發(fā)展為特定癌癥的風(fēng)險因子。風(fēng)險因子包括基因易染病體質(zhì)，環(huán)境暴露，先前存在的非癌癥疾病，先前的癌癥，以及生活方式。如本文所用的，“受試者”可以與“患者”相互替換，指的是例如人類的哺乳動物。如本文所用的，“癌癥的階段”指的是能夠被本領(lǐng)域技術(shù)人員識別的給定癌癥的發(fā)展水平。用于確定癌癥的階段的標(biāo)準(zhǔn)包括但不限于腫瘤的尺寸，腫瘤是否擴(kuò)散到身體的其它部位，腫瘤擴(kuò)散到哪些部位(例如，在身體相同的器官或區(qū)域還是擴(kuò)散到其它器官)。如本文所用的，“檢測受試者是否患有癌癥”指的是檢測表明癌癥的腫瘤抗原或自身抗體存在與否。如本文所用的，“被診斷為患有癌癥的受試者”指的是具有癌細(xì)胞的受試者?？梢酝ㄟ^任何合適的方法對癌癥進(jìn)行診斷，包括但不限于本發(fā)明的診斷方法。當(dāng)涉及到核酸分子或肽，多肽時，術(shù)語“分離的”指的是通常從自然界相關(guān)的組分或雜質(zhì)中分離所得到的給定生物分子。如本文所用的，“純化的”成分，指的是從該成分中去除了其它組分(例如，污染物)。如本文所用的，術(shù)語“樣品”具有其廣泛的含義。一方面，它表示包括從任何來源獲得的樣本或培養(yǎng)物，也包括生物和環(huán)境樣本。生物樣品可從動物(包括人類)中得到，包括液體，固體，組織和氣體。生物樣品包括血液制品，例如血漿，血清等等。如本文所用的，“捕獲試劑”指的是用來特異性結(jié)合感興趣的分析物的分子。所述捕獲試劑可被固定在基質(zhì)上。例如，若所述感興趣的分析物是抗原，所述捕獲試劑可能是特異性結(jié)合該抗原的抗體；而若所述感興趣的分析物是抗體，所述捕獲試劑可能是該抗體特異性結(jié)合的抗原決定表位。如本文所用的，“A+生物標(biāo)志物試驗”或者“A+B試驗”指的是本發(fā)明的試驗其中， 至少一種抗體(A)加上至少一種生物標(biāo)志物(B)在樣品中被檢測和/或測量到。如本文所用的，“autoAb+生物標(biāo)志物試驗”或“autoAb+B試驗”指的是本發(fā)明的試驗其中，至少一種特異性結(jié)合到第一生物標(biāo)志物的抗原決定表位上的自身抗體(autoAb)加上至少一種第二生物標(biāo)志物⑶在樣品中被檢測和/或測量到。如本文所用的，“autoAb+TA試驗”指的是本發(fā)明的試驗其中，至少一種特異性結(jié)合第一生物標(biāo)志物的抗原決定表位上的自身抗體(autoAb)加上至少一種作為腫瘤抗原(TA)的第二生物標(biāo)志物在樣品中被檢測和/或測量到。如本文所用的，“A+抗原試驗”指的是本發(fā)明的試驗其中，至少一種抗體(A)加上至少一種抗原在樣品中被檢測和/或測量到。A+生物標(biāo)志物試驗包括A+抗原試驗，autoAb+ 生物標(biāo)志物試驗，以及autoAb+TA試驗。根據(jù)本發(fā)明中的A+生物標(biāo)志物試驗，得到針對第一生物標(biāo)志物的抗體指數(shù) (indices)，然后用本領(lǐng)域已知的邏輯回歸方法，將其與第二生物標(biāo)志物的數(shù)值相結(jié)合，其中，二進(jìn)制因變量為1表示存在給定癌癥、疾病或感染，而為0表示不存在給定癌癥、疾病或感染。而自變量為給定生物標(biāo)志物以及總抗體指數(shù)。這種分析可以通過SAS統(tǒng)計學(xué)文庫 (8. 2或9.1版本，SAS研究所，Cary，NC)完成?；跀M合模型，使用由受試者樣本計算得到的指標(biāo)值(index value)可以計算出給定受試者的預(yù)測可能性。大體上說，如果預(yù)測可能性超過截止值(cutoffvalue)，例如，0. 50，個體將被歸類為陽性。優(yōu)化的截止值可以由ROC 曲線確定，將在下面進(jìn)行討論。對于給定的癌癥、疾病或者感染，A+生物標(biāo)志物試驗的指標(biāo)的診斷能力可以通過研究它的ROC曲線來得到，ROC曲線是由靈敏度對1-特異性構(gòu)成的圖， 截止值在它的整個取值范圍內(nèi)變化。對于任意給定特異性的A+生物標(biāo)志物試驗而言，使用 ROC曲線可以評價指標(biāo)的靈敏度。另外，可以通過ROC曲線與連接左上角和右下角的直線的交叉點(diǎn)來確定最優(yōu)的截止值。對于給定的截止值，靈敏度和特異性的置信區(qū)間可以通過普通的理論方法或計算機(jī)輔助程序的方法得到。具有統(tǒng)計學(xué)意義的檢測也可以通過使用ROC 曲線下的面積(AUC)或部分面積比較ROC曲線來進(jìn)行。為了舉例說明本發(fā)明中的autoAb+生物標(biāo)志物試驗，對前列腺癌相關(guān)抗原 (PCAAs)的不同B細(xì)胞抗原決定表位進(jìn)行研究，使其具有補(bǔ)充傳統(tǒng)的前列腺特異性抗原 (PSA)測試的能力。如本文所用的“傳統(tǒng)的PSA測試”指的是那些被美國食品與藥物管理局所許可的當(dāng)時的發(fā)明。這種傳統(tǒng)的PSA測試具有假陽性(10人中的7人被檢出可疑的PSA 水平，但卻沒有患前列腺癌)和假陰性(10人中的2. 5人患有前列腺癌但PSA水平卻沒有升高)的傾向。參見Thompson等(2004)N Engl J Med 350(22) :2239_46，在此引入作為參考。如本文公開的，AMACR,p90 自身抗原，LEDGFp75，HIP-I, SSX2，4，NY-ESO-1,以及 XAGE-Ib潛在的B細(xì)胞抗原決定表位的候選肽可通過本領(lǐng)域的已知方法預(yù)測。參見蛋白鑒定Rost等(2004)蛋白預(yù)測服務(wù)器。核酸研究32 (網(wǎng)頁發(fā)行)W321_W326 ；Zeng ^ (2005) Int J Cancer 114 :268_73，以及美國專利號7，420，032，在此引入作為參考。AMACR, p90 自身抗原，LEDGFp75, HIP-I, SSX2，4，NY-ESO-1,以及 XAGE-lb 的序列， 已被它們的基因庫(GenBank)登記號和GI號碼驗證，在此將它們的全部引入作為參考，如下AMACR = AAD10205. 1，GI :4204097，序列截止于 2009 年 11 月 30 日。p90 自身抗原=NP_065941. 2，GI :190194355,序列截止于 2010 年 1 月 17 日。LEDGFp75 = AAC25167. 1，GI :3283352,序列截止于 2009 年 11 月 30 日。HIP-I = NP_005329. 3，GI :38045919,序列截止于 2010 年 2 月 7 日。SSX2，4 = CAD90570. 1，GI :30519359，序列截止于 2008 年 10 月 15 日。NY-ES0-1 = CAA05908. 1，GI :3255991，序列截止于 2008 年 10 月 11 日。XAGE-lb = CAC38108. 1，GI 13992558，序列截止于 2006 年 11 月 15 日。關(guān)于以上被登記號確認(rèn)的序列，所提供的日期是最后更新的日期。需要注意的是當(dāng)序列被修改時，就會被賦予一個新的GeneBank登記號以及一個新的GI號碼。在網(wǎng)絡(luò)的NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中可以查找修訂歷史(例如萬維網(wǎng)網(wǎng)址ncbi. nlm. nih. gov/ sviewer/girevhist. cgi ？)。因此，以上所指的日期并不說明在該所指的日期之前，序列與給定日期提交的不同。例如，對于GI 190194355，該序列從2008年6月12日至2010年 1月17日之間是相同的，但是，在2008年6月12日之前，這個序列是不同的，公布為GI 24308239。因此，闡明如下AMACR :341-371 = KRDPFIGEHTEEILEEFGFSREEIYQLNSDK(SEQ ID No 1)；p90 :796-827 = DREHKLANLHQKTKVQEEKIKTLQKEREDKEE(SEQ ID No :2)；LEDGFp75 :313-345 = DRKRKQEEQMETEQQNKDEGKKPEVKKVEKK RE(SEQ ID No :3)；HIP-I:150-180 = MEYHTKNPRFPGNLQMSDRQLDEAGE SDVNN(SEQ ID No :4)；SSX2，4 :110-139 = KIMPKKPAEEGNDSEEVPEASGPQNDGKEL(SEQ IDNo :5)；XAGE-lb :1-25 = MESPKKKNQQLKVGILHLGSRQKKI(SEQ ID No :6)；NY-ES0-1 :1-40 = MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPG EAGAT(SEQ ID No: 7)；XAGE-lb :57-81 = GVKVKIIPKEEHCKMPEAGEEQPQV(SEQ ID No :8)；AMACR :251-282 = KSDELPNQMSMDDffPEMKKKFADVFAKKTKAE(SEQ ID No :9)；HIP-I :338-378 = SQQNLFDNKFDDIFGSSFSSDPFNFNSQNGVNKDEKD HLIE(SEQ ID No 10)；和p62 :156-184 = DEEVSSPSPPQRAQRGDHSSREQGHAPGG(SEQ ID No :11)。然后，通過本領(lǐng)域已知的方法合成候選肽。具體地，候選肽在Genscript公司(New Brunswick, NJ)和GeneMed合成公司(San Antonio, TX)的多肽合成儀(吉爾森公司， fforthington, 0H)上，通過固相合成得到。每個候選肽的分子量均由質(zhì)譜確定以確認(rèn)其同一性。所述候選肽重懸于二甲基亞砜，濃度為20mg/ml，儲存在-20°C待用。接下來，采用本領(lǐng)域已知的方法，將候選肽與患有組織學(xué)證實的前列腺癌的受試者和健康受試者所采集到的血清樣本一起進(jìn)行篩選。參見kng等J Cancer 114 :268-73以及kng等Q000)J Immunol 165 :1153_9，在此將其全部內(nèi)容引入作為參考。所有血清樣品的采集均在加州大學(xué)洛杉磯分校所批準(zhǔn)的內(nèi)部評級標(biāo)準(zhǔn)(IRB)操作條件下完成。所述患有組織學(xué)證實的前列腺癌的受試者分別處于不同的癌癥臨床階段。血清樣品儲存在-20°C待用。在96孔MaxiSorp板(Nunc，Denmark)上，以50微升PBS緩沖液將多肽稀釋至10納克/孔，4°C過夜。作為對照的96孔板包被了來自貝塔-半乳糖苷酶的肽。除非另外特殊說明，所有的血清樣品均以含有5%胎牛血清的PBST(PBS緩沖液中加入吐溫-20)稀釋為1 25、1 125以及1 625。這三個稀釋濃度下的每個樣品分別加入到預(yù)先包被的ELISA平板中。室溫孵育2個小時后，洗滌平板，再加入以含有5%胎牛血清的PBST稀釋的第二抗體(共價偶聯(lián)了辣根過氧化物酶的山羊抗人免疫球蛋白，Sigma公司， 圣路易斯)。平板顯影后，利用酶標(biāo)儀(ELISA reader)在450nm處讀取吸收值。截止值被定義為健康捐贈者的平均光密度值(OD)加上三倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。每個血清樣品的三個稀釋濃度中，有兩個的OD值超過截止值，則提供該血清的癌癥患者被認(rèn)定為陽性。預(yù)測以及合成的候選肽列于下表1中
權(quán)利要求
1.一種試驗方法，其特征在于，該方法針對樣品中的至少一種抗體以及至少一種第二生物標(biāo)志物，所述抗體特異性結(jié)合第一生物標(biāo)志物或其抗原決定表位，該方法包括通過單一反應(yīng)步驟，使針對所述抗體的第一捕獲試劑以及針對所述第二生物標(biāo)志物的第二捕獲試劑共同與所述樣品接觸；檢測所述抗體的存在與否或數(shù)量；以及檢測所述第二生物標(biāo)志物的存在與否或數(shù)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試驗方法，其中，所述抗體是針對前列腺癌的自身抗體，以及所述第二生物標(biāo)志物是前列腺特異性抗原；或其中，所述至少一種抗體是多個自身抗體，它們中的每個特異性地結(jié)合多個表明前列腺癌的第一生物標(biāo)志物，而不結(jié)合前列腺特異性抗原，以及所述第二生物標(biāo)志物為前列腺特異性抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試驗方法，其中，所述第一捕獲試劑不同于所述第二生物標(biāo)志物，且所述第二捕獲試劑不同于所述抗體。
4.一種診斷或指定受試者為患有疾病或者可能患有疾病的方法，其特征在于，該方法包括使用根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的試驗方法試驗來自受試者的樣本，和當(dāng)所述抗體的存在與否或數(shù)量與所述第二生物標(biāo)志物的存在與否或數(shù)量表明疾病，則診斷或指定該受試者為患有該疾病或可能患有該疾病。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述疾病為癌癥，所述第一生物標(biāo)志物為第一腫瘤標(biāo)志物，所述第二生物標(biāo)志物為第二腫瘤標(biāo)志物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述第一腫瘤標(biāo)志物為腫瘤抗原、所述第二腫瘤標(biāo)志物為腫瘤抗原、或者二者均為腫瘤抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任意一項所述的方法，其中，所述抗體的存在與否或數(shù)量被設(shè)定為第一值，所述第二生物標(biāo)志物的存在與否或數(shù)量被設(shè)定為第二值，所述第一值和所述第二值相結(jié)合以得到指標(biāo)值，以及所述方法還包括使用該指標(biāo)值以診斷或指定該受試者為患有該疾病或可能患有該疾病。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述第一值可以為基于其在患有該疾病的受試者中的普遍性的加權(quán)值、所述第二值可以為基于試驗的數(shù)量的加權(quán)值、或者二者均為加權(quán)值。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任意一項所述的方法，其中，所述癌癥為前列腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、甲狀腺癌、尿路上皮細(xì)胞癌、以及包括本領(lǐng)域已知的其它上皮癌寸寸。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-9中任意一項所述的方法，其中，至少一種所述第一腫瘤抗原和至少一種所述第二腫瘤抗原為前列腺癌相關(guān)抗原，或者所述第一腫瘤抗原和所述第二腫瘤抗原均為前列腺癌相關(guān)抗原。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任意一項所述的方法，其中，所述抗原決定表位選自由以下物質(zhì)組成的組AMACR :341-371 ；p90 :796-827 ；LEDGFp75 :313-345 ；HIP-I :150-180 ； HIP-I :338-375 ；SSX2，4 :110-139 ；NY-ES0-1 :1_40 ；XAGE-Ib :1_25 以及 XAGE-Ib :57_87。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項所述的方法，其中，所述第二標(biāo)志物為前列腺特異性抗原(PSA)。
13.根據(jù)權(quán)利要求7-12中任意一項所述的方法，其中，所述第一值設(shè)定為0，表示不存在所述抗體，以及被設(shè)定為1，表示存在所述抗體；所述第二值被設(shè)定為0，表示正常數(shù)量的所述第二生物標(biāo)志物，被設(shè)定為1，表示非正常的高數(shù)量的所述第二生物標(biāo)志物，或者被設(shè)定為0-1之間的數(shù)值，表示正常數(shù)量和非正常的高數(shù)量之間的所述第二生物標(biāo)志物。
14.根據(jù)權(quán)利要求7-13中任意一項所述的方法，其中，當(dāng)所述指標(biāo)值超過給定的截止值，則該受試者被診斷或指定為患有該疾病或可能患有該疾病。
15.一種診斷或指定受試者為患有或可能患有前列腺癌的方法，其特征在于，該方法包括測定來自所述受試者的樣品中，自身抗體的存在與否或數(shù)量，所述自身抗體特異性結(jié)合前列腺癌相關(guān)抗原或其抗原決定表位，以及測定前列腺特異性抗原的存在與否或數(shù)量， 其中，所述前列腺癌相關(guān)抗原并非前列腺特異性抗原，以及當(dāng)所述自身抗體的存在與否或數(shù)量與前列腺特異性抗原的存在與否或數(shù)量表明前列腺癌，則診斷或指定該受試者為患有或可能患有前列腺癌。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，試驗該樣品在單一反應(yīng)步驟中進(jìn)行，通過該步驟，針對所述自身抗體的第一捕獲試劑和針對前列腺特異性抗原的第二捕獲試劑共同與所述樣品接觸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種試驗方法，該方法包括檢測樣品中至少一種抗體的存在與否或數(shù)量，該抗體特異性的結(jié)合第一生物標(biāo)志物或其抗原決定表位，以及檢測至少一種第二生物標(biāo)志物的存在與否或數(shù)量，該方法包括單一反應(yīng)步驟，通過該步驟，針對所述抗體的第一捕獲試劑和針對所述第二生物標(biāo)志物的第二捕獲試劑共同與所述樣品接觸，檢測所述抗體的存在與否或數(shù)量，并檢測所述第二生物標(biāo)志物的存在與否或數(shù)量。本發(fā)明還公開了用于前列腺癌的試驗方法。
文檔編號G01N33/574GK102326080SQ201080008503
公開日2012年1月18日 申請日期2010年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月20日
發(fā)明者曾鋼 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會