專利名稱：含有在其表面固定的細(xì)胞的質(zhì)量敏感性傳感器及利用所述傳感器檢測配體結(jié)合的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析方法和適用于實(shí)現(xiàn)所述方法的傳感器。特別地但并非排它性地，本發(fā)明涉及一種制備質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器的方法，所述質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器能檢測分析物種與包括細(xì)胞的表面的結(jié)合。
背景技術(shù)：
質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器可以定義為考慮到測量與質(zhì)量成比例的尺度的性質(zhì)的任何裝置，所述質(zhì)量與所述裝置的敏感表面相關(guān)或結(jié)合?？梢岳靡恍┻@種傳感器技術(shù)，如基于漸逝波的傳感器例如表面等離子體共振(SPR，其能夠通過表面折射率的相關(guān)變化指示質(zhì)量的變化)、光波導(dǎo)(也是基于與質(zhì)量結(jié)合事件相關(guān)的折射率的變化)、光衍射、光干涉、 橢圓偏振和聲波裝置(例如石英晶體微天平OiCMs))。這些傳感器方法在現(xiàn)有技術(shù)中是熟知的(例如參見生物分子傳感器(Biomolecular Sensors)，Gizeli和Lowe. Taylor和 Francis，倫敦；2002)，并且這些類型的儀器可以用于研究原位化學(xué)反應(yīng)和在試樣中檢測特定的分子。QCM系統(tǒng)利用石英晶體的壓電效應(yīng)。在這種系統(tǒng)中，如果AC電壓的頻率接近石英晶體振動(dòng)模式的共振頻率，則位于連接到AC電壓的兩個(gè)電極之間的石英晶體開始振動(dòng)。石英晶體的共振頻率是多個(gè)參數(shù)的函數(shù)，例如溫度、壓力、晶體的切割角度、晶體的機(jī)械應(yīng)力和厚度。共振頻率與晶體的厚度成反比。用在液體應(yīng)用中的典型的共振頻率的范圍從IMHz到50MHz。晶體通常是具有圓形或者方形形狀的AT切型，并且具有大約5-10mm的直徑。電極(驅(qū)動(dòng)電極和對(duì)電極)通常在其兩個(gè)側(cè)面是金的，但其他金屬也并不稀奇。相對(duì)于石英晶體板而言，電極是非常薄的， 因此可以認(rèn)為是晶體板的一部分。當(dāng)在電極的一極上添加材料或者移除材料時(shí)，電極將變厚或者變薄，即電極的有關(guān)重量改變。作為電極質(zhì)量的變化的結(jié)果，晶體板的共振頻率會(huì)減小或者增大，從而可以測量共振頻率的改變以檢測電極質(zhì)量的改變。QCM系統(tǒng)的質(zhì)量分辨率可以低到lpg/cm2，對(duì)應(yīng)于不到單層氫原子的1%。典型的QCM壓電傳感器包括傳感元件、試樣插入單元、用于確定石英晶體壓電性質(zhì)(包括振動(dòng)頻率)的設(shè)備、和信號(hào)顯示設(shè)備以及緩沖劑和廢料容器(不同于傳感元件，這些部件可以被稱為傳感器的“相關(guān)設(shè)備”)。含有任何有關(guān)化學(xué)物質(zhì)的試樣通過試樣插入單元進(jìn)入傳感元件。傳感元件包括壓電共振器OiCM傳感器)、試樣室、從試樣室流入和流出的流動(dòng)通道、以及振動(dòng)電路。試樣引起與壓電傳感器表面的相互作用，這隨之可以通過監(jiān)測晶體板的振動(dòng)特征被觀察到，例如通過測量壓電共振器頻率的變化。晶體板在其表面提供有用于驅(qū)動(dòng)電極和對(duì)電極的電接觸區(qū)域，該電接觸區(qū)域可以像連接到測量裝置上一樣連接到信號(hào)源(例如交流電源)。為了測量，壓電晶體板的一側(cè)與待檢驗(yàn)的流體(例如液體)試樣接觸。晶體通過改變其共振頻率和/或振動(dòng)振幅響應(yīng)待檢測物質(zhì)質(zhì)量的聚集或者試樣物理性質(zhì)的變化。
壓電傳感器可以用于分析液體試樣的粘性，且特別適用于研究化學(xué)和生物化學(xué)相互作用。如果壓電傳感器用于后者，則暴露于試樣的電極具有特殊的表面涂層，該表面涂層將與試樣相互作用。Cooper 和 Singleton(J. Mol. Recognit.，2007，20，154)提供了使用 QCM 傳感器進(jìn)行研究的相互作用的類型的綜述。無論化學(xué)傳感器的類型怎樣，常用的表面涂層方法包括自裝配的單層(例如在金上吸附的烷基硫醇)和/或聚合物基體，其中每一種可攜帶可用于固定有關(guān)的第一化學(xué)物質(zhì)的官能團(tuán)。通常，已固定的第一化學(xué)物質(zhì)為有機(jī)小分子或抗體。隨后攜帶第一化學(xué)物質(zhì)的傳感器與第二化學(xué)物質(zhì)或細(xì)胞的分散體接觸，并且通過在敏感表面上所得到的質(zhì)量的變化來監(jiān)測第二化學(xué)物質(zhì)或細(xì)胞與第一化學(xué)物質(zhì)的結(jié)合。 Fung和Wong (Anal. Chem. 2001，73，5302)描述了使用這種方法來檢測液體分散體中的沙門氏菌細(xì)胞，并且Cooper和Singleton描述了其他類似的研究(參見上面)。更具有挑戰(zhàn)性的方法是采用細(xì)胞作為化學(xué)傳感器中的固定的第一物質(zhì)。少數(shù)的研究已實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，但是所報(bào)道的方法采用活的細(xì)胞并且未分析結(jié)合的相互作用本身；更確切地說，這些方法使用生物傳感器技術(shù)來監(jiān)測結(jié)合后的細(xì)胞中的形態(tài)學(xué)或其他的改變(參見Marx等人，Anal. Biochem.，2007，361，77)。由于在結(jié)合事件之后來自細(xì)胞變化的已檢測的信號(hào)的干擾，這些方法很少或不用于準(zhǔn)確監(jiān)測結(jié)合的相互作用?，F(xiàn)有技術(shù)未描述或提出一種制備具有已固定的細(xì)胞，并且適用于準(zhǔn)確檢測和監(jiān)測細(xì)胞與分析物配體之間的結(jié)合的相互作用的質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器的方法。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器，所述化學(xué)傳感器具有粘附于其敏感表面的失活的細(xì)胞，并且適用于通過由于分析物配體與細(xì)胞的結(jié)合而在傳感器表面處的質(zhì)量的變化來檢測分析物配體與粘附的失活的細(xì)胞之間的相互作用，其中， 所述傳感器提供有流路池或形成部分流路池。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞被固定。在第一方面的某些實(shí)施方式中，通過以下方法來制備質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器，所述方法包括以下步驟使含有細(xì)胞的懸浮液與傳感元件的敏感表面接觸；使得細(xì)胞粘附于敏感表面并可能在所述敏感表面上生長；以及，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間之后，處理所述粘附的細(xì)胞， 以便使得它們失活。本發(fā)明的質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器能潛在地實(shí)時(shí)準(zhǔn)確檢測和監(jiān)測分析物配體與細(xì)胞表面上的結(jié)構(gòu)之間的結(jié)合事件本身。與通過現(xiàn)有技術(shù)方法制備的傳感器不同，由于細(xì)胞生長和/或形態(tài)學(xué)變化的影響最小，通過本發(fā)明的傳感器產(chǎn)生的信號(hào)與在敏感表面上結(jié)合的材料的質(zhì)量更直接相關(guān)。此外，通過使用固定的細(xì)胞(其中可通過化學(xué)手段或物理手段來實(shí)現(xiàn)固定，如以下更詳細(xì)描述的)，在使用過程中細(xì)胞對(duì)在流路池中出現(xiàn)的任何剪切力更具有抗性，否則會(huì)面臨細(xì)胞被破壞或細(xì)胞從傳感器表面剝離的風(fēng)險(xiǎn)。本文使用的關(guān)于細(xì)胞的術(shù)語“失活的”是指細(xì)胞的正常的生物化學(xué)基本上停止，使得細(xì)胞基本上不再能生長、分裂、運(yùn)動(dòng)和/或形態(tài)學(xué)變化。根據(jù)第二方面，本發(fā)明還提供了一種制備質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器的方法，所述質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器能檢測分析物配體與固定的細(xì)胞之間的相互作用，所述方法包括以下步驟使含有細(xì)胞的懸浮液與傳感元件的敏感表面接觸；使得細(xì)胞粘附于敏感表面并可能在所述敏感表面上生長；以及，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間之后，處理所述粘附的細(xì)胞，以便使得它們失活。第二方面的方法能制備質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器，該質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器能潛在地實(shí)時(shí)準(zhǔn)確檢測和監(jiān)測分析物配體與細(xì)胞表面上的結(jié)構(gòu)之間的結(jié)合事件本身，與第一方面的傳感器一樣。與通過現(xiàn)有技術(shù)方法制備的傳感器不同，由通過該方法制備的傳感器所產(chǎn)生的信號(hào)與在敏感表面上結(jié)合的材料的質(zhì)量更直接相關(guān)，如上所解釋。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法包括將所述傳感器整合到流路池中的另外的步驟，使得所述傳感器提供有流路池或形成部分流路池。將傳感器整合到流路池中可發(fā)生在所述方法的任何階段，即，在傳感器與細(xì)胞接觸之前；在細(xì)胞已粘附于敏感表面并可能在敏感表面上生長之前、期間或之后；或在處理細(xì)胞以使得它們失活之前、期間或之后。根據(jù)本發(fā)明使用或形成的流路池應(yīng)優(yōu)選為適于確定所研究的相互作用的動(dòng)態(tài)速率參數(shù)的流路池。流路池應(yīng)由生物學(xué)相容的材料制成，所述材料優(yōu)選選自，但不限于，聚甲醛、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯和諸如聚苯乙烯或丙烯腈-丁二烯-苯乙烯的可注塑的熱塑性塑料。流路池的尺寸應(yīng)適于確定分子相互作用的動(dòng)態(tài)速率參數(shù)，即，流動(dòng)特性應(yīng)考慮到保持分析物配體的體內(nèi)溶液濃度，分析物配體在帶有已固定的細(xì)胞的表面上或非常接近于帶有已固定的細(xì)胞的表面，而不考慮分析物配體到細(xì)胞表面上的目標(biāo)分子的大量的擴(kuò)散的限制。流路池的優(yōu)選的高度應(yīng)為50 μ m或更低(從傳感器表面到流路池的頂部進(jìn)行測量)。 合適的流路池例如描述于PCT/GB2008/001515 (W02008/132487)。含有細(xì)胞的懸浮液優(yōu)選含有細(xì)胞生長介質(zhì)。用于多種細(xì)胞的合適的細(xì)胞生長介質(zhì)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并且現(xiàn)有技術(shù)充分提供了關(guān)于用于培養(yǎng)大多數(shù)原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的介質(zhì)的優(yōu)選的和必需的組分的信息。優(yōu)選的介質(zhì)含有血清蛋白。雖然本發(fā)明人不希望束縛于該信念，但是我們認(rèn)為在這種生長介質(zhì)中存在的血清蛋白在細(xì)胞之前(或者， 較少可能，與細(xì)胞同時(shí))吸附于敏感表面；隨后已吸附的蛋白提供具有基序(motifs)的表面，該基序能被細(xì)胞的細(xì)胞表面組分識(shí)別，從而增強(qiáng)細(xì)胞在敏感表面上或附近的粘附。在所述方法的某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞懸浮液還含有與所關(guān)注細(xì)胞有關(guān)聯(lián)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。這種基質(zhì)蛋白可根據(jù)所關(guān)注的細(xì)胞類型而變，但是，同樣可參考標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室教科書來確定，通過提供被細(xì)胞表面組分識(shí)別和結(jié)合的另外的基序來幫助細(xì)胞粘附。在一些實(shí)施方式中，可使用被蛋白質(zhì)覆蓋的傳感器表面，或者通過使敏感表面與血清蛋白和/或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的溶液接觸以使得該溶液吸附于表面，來預(yù)處理敏感表面；在這種情況下，可容易地使用不含血清的細(xì)胞懸浮液。在第一和第二方面的某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為真核細(xì)胞。具體地，所述細(xì)胞可為動(dòng)物細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是人類細(xì)胞。在具體的實(shí)施方式中，在與含有細(xì)胞的懸浮液接觸之前，將所述敏感表面改性，以便提高表面能，從而增強(qiáng)血清蛋白和/或細(xì)胞與表面的粘附。多種材料可形成第一方面的傳感元件的敏感表面或在第二方面與細(xì)胞懸浮液接觸的傳感元件的敏感表面。在一些情況下，可使用未經(jīng)處理的金屬傳感器表面，例如，如可在一些基于光波導(dǎo)的裝置中發(fā)現(xiàn)的，QCM的金電極，或sra生物傳感器的貴金屬表面，或玻璃表面。然而，在許多實(shí)施方式中，可能期望通過化學(xué)處理或物理處理將表面改性，以增大血清蛋白和/或細(xì)胞在該表面上吸附的速率和/或程度?；瘜W(xué)處理包括向表面吸附極性的、親水性的和/或帶電荷的物質(zhì)(例如聚氨基酸，例如聚賴氨酸；或血清和/或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，如上所提及的，在這種情況下，除了對(duì)表面極性等的任何影響以外，特定的可識(shí)別的生物化學(xué)基序在細(xì)胞粘附中起作用)。物理處理包括使用適當(dāng)類型的等離子體轟擊或電磁輻射來引起敏感表面的表面化學(xué)性質(zhì)的改性。這種方法可特別用于另外的疏水性表面的情況，例如某些涂有聚合物的表面。在任何情況下，用于粘附細(xì)胞的表面的適合性及其任何改性的效果可容易地通過將傳感器與和傳感器相關(guān)的設(shè)備偶聯(lián)來確定，隨后通過來自傳感器的信號(hào)的變化來確定，而無論血清蛋白和/或細(xì)胞是否與敏感表面粘附接觸以及粘附接觸程度如何。作為一種選擇或除此以外，可使用顯微術(shù)來監(jiān)測細(xì)胞與敏感表面的粘附?？刹捎眠@種方式優(yōu)化敏感表面并隨后在本發(fā)明的方法中使用以得到甚至更大的效果。在許多情況下，在將細(xì)胞固定之前，敏感表面的接觸角為10-90度，優(yōu)選20-80度， 更優(yōu)選30-70度。特別優(yōu)選60度左右的接觸角。可通過本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法來確定接觸角， 本文使用的，涉及使用高純度水來確定接觸角。在第一方面和第二方面的某些實(shí)施方式中，敏感表面提供有與含有細(xì)胞的懸浮液接觸的聚合物涂層。這種聚合物涂層可含有聚苯乙烯。質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器的聚合物涂層是常見的方法，并且就什么可隨后與敏感表面偶聯(lián)而論具有靈活性。聚苯乙烯為用于培養(yǎng)細(xì)胞的常用的表面，因此，在本發(fā)明的方法中特別有用。然而，由于聚苯乙烯涂層的疏水性，優(yōu)選通過等離子體轟擊或電磁輻射處理將聚苯乙烯涂層改性。特別優(yōu)選UV處理?？赏ㄟ^用聚合物溶液旋涂傳感元件來制備聚合物涂層(例如聚苯乙烯)。在傳感器與細(xì)胞懸浮液接觸之前，聚合物涂層可與血清和/或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的分散體接觸，使得它們吸附。在粘附的細(xì)胞失活之前，允許細(xì)胞在敏感表面上生長一定時(shí)間是有用的。這樣可減少在懸浮液培養(yǎng)過程中發(fā)生的細(xì)胞的任何破壞或擾亂。以上所涉及的“合適的時(shí)間”可根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要和目標(biāo)以及采用的細(xì)胞類型來確定，并且該時(shí)間段可容易地通過反復(fù)試驗(yàn)來估計(jì)。具體地，許多細(xì)胞在懸浮液中采用球形形態(tài)，而與表面的粘附則涉及細(xì)胞鋪展和變平的程度。就為了在傳感器的表面上接種而收獲細(xì)胞的生長階段而論，應(yīng)理想地為生長的指數(shù)階段-在該階段細(xì)胞更豐富地表達(dá)受體?？赏ㄟ^物理手段(例如將細(xì)胞保持在降低的溫度下(例如2_8°C )、急速冷凍或減壓熱處理；參見www. denator. com)或更優(yōu)選通過化學(xué)手段(例如毒素處理或化學(xué)交聯(lián))實(shí)現(xiàn)使細(xì)胞失活的細(xì)胞處理。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過物理手段或者更優(yōu)選通過化學(xué)手段， 通過將細(xì)胞固定來實(shí)現(xiàn)粘附的細(xì)胞的失活?；瘜W(xué)手段包括基于有機(jī)溶劑的方法或更優(yōu)選交聯(lián)方法?；谟袡C(jī)溶劑的方法通常通過將脂質(zhì)和水從細(xì)胞中除去并沉淀細(xì)胞蛋白質(zhì)來進(jìn)行，而交聯(lián)劑在細(xì)胞的表面組分之間形成分子間橋鍵?；谌軇┑姆椒òㄊ褂帽?、甲醇和/或乙醇，通常在大約-20°C。交聯(lián)方法可使用，例如，福爾馬林、甲醛或多聚甲醛，任選與表面活性劑和/或甲醇配合使用。多種可選的固定方案還描述于Brock等人(Cytometry， 1999，35，353)。在傳感器表面上固定細(xì)胞防止細(xì)胞進(jìn)一步生長、遷移和/或形態(tài)學(xué)變化，但是保持細(xì)胞的表面組分在其中至少一部分仍可用于與分析物配體結(jié)合的狀態(tài)。固定細(xì)胞還使得在隨后的分析過程中粘附的細(xì)胞不太可能從敏感表面離解。如關(guān)于第一方面所提及的，在傳感器提供有流路池或形成部分流路池的實(shí)施方式中，這是特別有利的。固定細(xì)胞還增大了細(xì)胞層的剛性，這樣可改善化學(xué)傳感器的敏感性，如以下將更詳細(xì)討論的。
在使得細(xì)胞失活之前，可使用顯微術(shù)的任選的步驟檢查傳感器表面上的細(xì)胞的布置和密度。可使用多種顯微術(shù)方法，但是可提及熒光顯微術(shù)，在這種情況下，在顯微術(shù)之前使用熒光染料(例如核染料)進(jìn)行粘附的和/或固定的細(xì)胞的培養(yǎng)。如果未達(dá)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞計(jì)數(shù)和/或密度，則在失活之前允許細(xì)胞進(jìn)一步生長?？稍谒龇椒ǖ娜魏坞A段或所有階段進(jìn)行敏感表面的顯微監(jiān)測，以確定細(xì)胞層形成的進(jìn)展。還可在失活步驟之后以及在固定細(xì)胞的任選的步驟之后使用顯微術(shù)。在粘附和使得細(xì)胞失活之后，優(yōu)選將敏感表面用酸性溶液處理，以除去未粘附的細(xì)胞和非細(xì)胞物質(zhì)。該酸性溶液的PH可小于5，優(yōu)選小于3，在一些情況下，pH大約為1，該酸性溶液還可含有低分子量鹽。該酸性溶液還可含有適當(dāng)?shù)木彌_劑，例如甘氨酸。在本發(fā)明的傳感器和方法的某些實(shí)施方式中，傳感器為聲波裝置。在具體的實(shí)施方式中，這種裝置可為壓電傳感器或石英晶體微天平。當(dāng)傳感器為QCM時(shí)，可將傳感器封裝在傳感元件中，該傳感元件具有可進(jìn)入傳感器表面的可移動(dòng)的蓋，而無需從外殼移動(dòng)傳感器/QCM晶體。這種傳感元件排列描述于WO 2008/132487。在相關(guān)的第三方面，本發(fā)明提供了一種檢測分析物配體與細(xì)胞之間的相互作用的方法，所述方法包括以下步驟提供質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器，所述質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器為根據(jù)第一方面的質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器或根據(jù)第二方面的方法得到的質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器，并且所述質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器具有粘附于其敏感表面或接近其敏感表面的失活的細(xì)胞；將分析物配體引入至敏感表面的附近，使得分析物配體與細(xì)胞之間相互作用；以及， 當(dāng)存在相互作用時(shí)，通過由于分析物配體與細(xì)胞的結(jié)合而在敏感表面處質(zhì)量的變化來檢測該相互作用。在本發(fā)明的第三方面的實(shí)施方式中，在引入分析物之前，通過與用于相互作用檢測的預(yù)期的流動(dòng)緩沖劑接觸來穩(wěn)定傳感器表面。該穩(wěn)定可進(jìn)行數(shù)小時(shí)。在某些實(shí)施方式中， 使用已事先用于穩(wěn)定傳感器的流動(dòng)緩沖溶液來稀釋分析物配體。在傳感器提供有流路池或形成部分流路池的實(shí)施方式中，流動(dòng)緩沖劑可取自流路池的出口，并用于在將分析物試樣引入至流路池之前稀釋該分析物試樣。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，流動(dòng)緩沖劑取自出口，并用于基本上在將分析物注射至流路池入口之前立即稀釋該分析物。應(yīng)理解的是，根據(jù)該步驟使用的流動(dòng)緩沖劑僅可在當(dāng)在流路池中不存在分析物的階段得到。通過使用已事先用于穩(wěn)定傳感器表面的流動(dòng)緩沖劑，可改善分析物緩沖劑與流動(dòng)緩沖劑之間的匹配。這樣有助于降低當(dāng)引入分析物時(shí)由于緩沖特性的變化而引起的信號(hào)偽差。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，還進(jìn)行對(duì)照分析，其中將來自穩(wěn)定步驟的流動(dòng)緩沖劑重新引入到傳感器，而不包括分析物。在某些實(shí)施方式中，在分析物配體的多個(gè)不同濃度下檢測分析物配體與細(xì)胞之間的結(jié)合的相互作用。這種方法能確定分析物與細(xì)胞之間的結(jié)合的相互作用的動(dòng)態(tài)參數(shù)。 例如，使用由 Myszka(J. Molec. Recognit.，1999，12,279)或 Morton 禾口 Myszka(Methods Enzymo 1.，1998,295,268-294)描述的方法，可實(shí)現(xiàn)在分析物的多個(gè)濃度下由收集的數(shù)據(jù)確定動(dòng)態(tài)參數(shù)。在第四方面，本發(fā)明提供了一種質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器，所述質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器可通過第二方面的方法得到，所述化學(xué)傳感器適于通過由于分析物配體與細(xì)胞的結(jié)合而在傳感器表面處質(zhì)量的變化來檢測分析物配體與粘附的失活的細(xì)胞之間的相互作用。第四方面的傳感器優(yōu)選提供有流路池或形成部分流路池。應(yīng)理解的是，第四方面的傳感器可用于第三方面的方法。與具有在傳感器的敏感表面或敏感表面附近粘附的細(xì)胞的現(xiàn)有技術(shù)的傳感器相比，第四方面的傳感器的優(yōu)點(diǎn)在于，細(xì)胞為失活的，因此傳感器能提供代表結(jié)合的相互作用本身的準(zhǔn)確的信號(hào)。在第五方面，本發(fā)明提供了使用質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器來分析分析物配體與在化學(xué)傳感器的傳感器表面上或附近固定的細(xì)胞之間的結(jié)合的相互作用。與現(xiàn)有技術(shù)方法不同，第五方面關(guān)注分析分析物與細(xì)胞之間的結(jié)合的相互作用本身。在現(xiàn)有技術(shù)中，涉及固定的細(xì)胞的那些研究使用傳感器來分析結(jié)合后的在細(xì)胞中發(fā)生的形態(tài)學(xué)和其他變化。在第五方面的優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為失活的。在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞被固定。固定方法描述于以上關(guān)于本發(fā)明的第一方面。在某些實(shí)施方式中，結(jié)合的相互作用是定量的；特別是可在分析物配體的一個(gè)特定濃度下或優(yōu)選在分析物配體的多個(gè)不同濃度下檢測分析物配體與細(xì)胞之間的結(jié)合的相互作用。這種方法能確定分析物與細(xì)胞之間的結(jié)合的相互作用的動(dòng)態(tài)參數(shù)，如上所述。在第六方面，本發(fā)明提供了一種改善質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器的敏感性和/或敏感范圍的方法，所述質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器包含聲波裝置，例如石英晶體微天平，并且具有在其傳感器表面上或附近固定的細(xì)胞，所述方法包括將細(xì)胞固定或?qū)⒓?xì)胞嵌入交聯(lián)的聚合物基體內(nèi)的步驟。在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為失活的(例如固定的)。此外或可選地，傳感器可提供有流路池或形成部分流路池。聲傳感器具有有限的衰變長度，該衰變長度確定距敏感表面的敏感距離。尺寸在 IOym范圍的真核細(xì)胞可能不能被壓電傳感器完全感應(yīng)。然而，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，如果細(xì)胞層具有充分的剛性，則距表面的敏感范圍可擴(kuò)大。在本發(fā)明中，固定細(xì)胞(例如使用交聯(lián)劑，如上所述)，或者將細(xì)胞嵌入交聯(lián)的聚合物基體內(nèi)，為敏感表面上的細(xì)胞層提供剛性。這很可能擴(kuò)大細(xì)胞層中聲傳感器的敏感范圍，并因此提高傳感器的敏感性。如果在第六方面使用交聯(lián)的聚合物基體，該交聯(lián)的聚合物基體可選自生物傳感器領(lǐng)域已知的多種基體，例如，基于多糖的基體。通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)可容易地確定細(xì)胞與聚合物基體組分的適當(dāng)?shù)谋嚷?。?yīng)理解的是，在敏感表面遠(yuǎn)端的基體表面處需要以某一最小密度的細(xì)胞來接近分析物配體，以便提供可靠的敏感響應(yīng)。在第七方面，本發(fā)明提供了一種改善質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器的敏感性和/或敏感范圍的方法，所述質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器基于聲波裝置，例如石英晶體微天平，所述方法包括在其傳感器表面上或附近固定聚合物顆粒。第七方面的聚合物顆粒(由交聯(lián)的聚合物組成，并且為例如珠粒形式，例如多糖珠粒，例如瓊脂糖)可采用類似的方式用于第六方面的固定的或嵌入的細(xì)胞?？墒褂贸Ｒ?guī)方法(例如使用生物傳感器領(lǐng)域中的有機(jī)偶聯(lián)化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，例如EDC/NHS偶聯(lián))將顆粒與敏感表面連接。在珠粒與敏感表面連接(同樣使用常規(guī)有機(jī)偶聯(lián)技術(shù))之前或更優(yōu)選之后， 用于化學(xué)傳感研究的有關(guān)分子(受體、配體、酶、凝集素等)可與珠粒連接，使得敏感表面呈現(xiàn)該分子的剛性層。如第六方面，距離根據(jù)第七方面制備的傳感器的表面的敏感范圍被擴(kuò)大，因此增強(qiáng)了傳感器的敏感性。當(dāng)以第六方面的方法固定或嵌入一層細(xì)胞時(shí)，可進(jìn)行將一層有關(guān)的其他化學(xué)物質(zhì)與細(xì)胞層連接的另外的步驟。這樣形成的其他化學(xué)物質(zhì)(例如受體、受體配體、凝集素、糖等)的層則可用于化學(xué)傳感研究，將獲得剛性細(xì)胞層的有益效果。在第八方面，本發(fā)明還提供了一種質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器，該質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器可根據(jù)第七方面的方法得到。在第九方面，本發(fā)明提供了一種在質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器中增強(qiáng)信號(hào)與噪聲的比率的方法，所述方法包括在將分析物試樣引入至敏感表面之前，使用已事先用于穩(wěn)定傳感器的流動(dòng)緩沖溶液來稀釋分析物試樣的步驟。第九方面的優(yōu)點(diǎn)描述于以上關(guān)于第三方面中。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器提供有流路池或形成部分流路池，并且所述方法包括在將分析物試樣注射至流路池之前，使用來自流路池出口的流動(dòng)緩沖劑來稀釋分析物試樣的步驟。


現(xiàn)在僅通過舉例并參考附圖來更詳細(xì)地描述本發(fā)明，在附圖中圖1為其上具有固定的人類乳腺癌細(xì)胞的QCM傳感器的熒光顯微照片；圖2顯示來自使用根據(jù)圖1的QCM傳感器進(jìn)行的一系列伴刀豆球蛋白A(ConA)結(jié)合實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。分別以 12.51^/1111、251^/1111、501^/1111、1001^/1111注射&)11 A，以增加的順序作出各自的反應(yīng)。確定親和力為15nM;圖3顯示來自使用根據(jù)圖1的QCM傳感器進(jìn)行的一系列小麥胚芽凝集素(WGA)結(jié)合實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。分別以6. 5μ g/ml、12. 5μ g/ml、25l·! g/ml、50l·! g/ml注射WGA，以增加的順序作出各自的反應(yīng)。確定親和力為93nM;圖4為其上具有固定的人類表皮癌(A-431)細(xì)胞的QCM傳感器的熒光顯微照片；圖5顯示使用圖4的QCM傳感器和抗-EGFR抗體進(jìn)行的一系列結(jié)合實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)。分別以6、12.5和25yg/ml注射抗體，以增加的順序作出各自的反應(yīng)。確定親和力為 1. 2nM ；圖6舉例說明由篩選用于結(jié)合到其上具有固定的A-431細(xì)胞的QCM傳感器的一系列凝集素得到的數(shù)據(jù)(a)，以及其中不存在細(xì)胞的等價(jià)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)(b)；圖7a和圖7b顯示與含有和不含固定的A-431細(xì)胞的QCM傳感器結(jié)合的ConA與 WGA之間的比較；圖8顯示研究與固定在金或聚苯乙烯(PS)表面上的A-431細(xì)胞結(jié)合的ConA的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。對(duì)于每一種表面，使用兩種固定方法，甲醛(F)或甲醛+甲醇(FM)。該圖編制了作為對(duì)于四種條件PSFM、PSF、金FM(GoldFM)和金F(GoldF)，Con A以12. 5 μ g/ml和 6. 25 μ g/ml結(jié)合到A-431細(xì)胞的結(jié)果，由Attana Cell 200儀器記錄的最大頻率；圖9顯示依賴Con A與A-431細(xì)胞的結(jié)合和釋放的時(shí)間的頻率變化。在圖8中所描述的實(shí)驗(yàn)所采用的四種條件即，PSFM、PSF、金FM和金F下，評(píng)價(jià)該相互作用；圖10顯示由GalNAc結(jié)合凝集素與GalNAc結(jié)合兩種不同的細(xì)胞系之間的相互作用得到的數(shù)據(jù)，在它們各自的細(xì)胞表面上暴露不同的糖型(glycotopes)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1通用方案本發(fā)明提供了一種方法，該方法最終致力于確定細(xì)胞與蛋白質(zhì)或其他生物學(xué)相關(guān)分子(例如藥物、抗體或受體)之間的動(dòng)態(tài)和親和力數(shù)據(jù)。雖然對(duì)細(xì)胞表面受體和它們的受體/結(jié)合劑作為分離蛋白已事先確定了相互作用親和力和速率，但是對(duì)于實(shí)際的細(xì)胞還未確定相互作用親和力和速率。在為了例如藥物開發(fā)而追求更多的生物學(xué)相關(guān)的檢測中， 用真核全細(xì)胞的實(shí)時(shí)相互作用檢測應(yīng)構(gòu)成一個(gè)主要的前進(jìn)步驟。本文研發(fā)了一種用于真核細(xì)胞及其相互作用搭檔的實(shí)時(shí)相互作用研究的方法。一種示例性方案包括以下步驟1、在傳感器上旋涂聚苯乙烯表面2、UV處理聚苯乙烯表面3、在傳感器表面上生長細(xì)胞4、在傳感器表面上固定細(xì)胞5、使用甘氨酸任選地預(yù)處理傳感器表面6、在生物傳感器中穩(wěn)定傳感器表面7、注射配體/分析物以確定結(jié)合的動(dòng)態(tài)和親和力固定的全細(xì)胞的生物傳感器分析提供了一些需要克服的困難。首先，由于預(yù)期的信號(hào)水平低并且顯著的信號(hào)漂移將使得相互作用常數(shù)的確定困難，具有固定的真核細(xì)胞的表面構(gòu)成的顯著更復(fù)雜的表面需要穩(wěn)健的方法來穩(wěn)定傳感器系統(tǒng)中的細(xì)胞表面。該示例性方法的步驟4促進(jìn)細(xì)胞的穩(wěn)定的表面，該細(xì)胞穩(wěn)固地連接到傳感器表面并且不離解。步驟 5和6在系統(tǒng)中提供了傳感器表面所需的的穩(wěn)定以實(shí)現(xiàn)顯著低的漂移來進(jìn)行檢測。第二，聲傳感器具有有限的衰變長度，該衰變長度決定在液體中距敏感表面的敏感距離。尺寸在10 μ m范圍的真核細(xì)胞不可能完全被壓電傳感器感應(yīng)。然而，實(shí)驗(yàn)已表明， 如果增加的層具有充分的剛性，則距表面的敏感范圍可擴(kuò)大。在本發(fā)明中，使用根據(jù)步驟4 的交聯(lián)劑固定細(xì)胞使在敏感表面上的細(xì)胞剛性化，這樣可能擴(kuò)大細(xì)胞層中的聲傳感器的敏感范圍，并因此增大敏感性。第三，由于有限的敏感距離以及由于通常存在于真核細(xì)胞上的相對(duì)低濃度的表面受體，用于細(xì)胞表面的相互作用研究的預(yù)期信號(hào)水平低，因此需要消除不需要的實(shí)驗(yàn)副作用，例如來自緩沖基體的信號(hào)作用(緩沖效果)。如在該示例性方法的步驟7中所描述的， 例如通過精確匹配試樣緩沖劑可實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。方法步驟的詳細(xì)描述1、在傳感器上旋涂聚苯乙烯表面在旋涂之前，將傳導(dǎo)率-檢查的(Smart Tweezers, Siborg Systems Inc.)未拋光的QCM晶體進(jìn)行氧等離子體處理(Electronic Diener，F(xiàn)emto)，接著在乙醇中超聲處理，以確保晶體表面的適當(dāng)清潔。通過旋涂完成晶體的聚苯乙烯涂層。簡單地說，將事先在甲苯中制備為5mg/ml濃度的10 μ 1的聚苯乙烯溶液在晶體的中心沉積，并旋涂(SpinCoater ，型號(hào) P6700 系列，Specialty Coating Systems，INC.)。在每個(gè)晶體上涂布平均56人+/-21A 的聚苯乙烯。隨后，在UV處理之前，將涂有聚苯乙烯的晶體在+4°C下儲(chǔ)存。2、UV處理聚苯乙烯表面為了使優(yōu)化的細(xì)胞連接和生長，通過UV輻射來氧化聚苯乙烯表面是優(yōu)選的步驟。進(jìn)行UV處理以確保表面更好的潤濕性，潤濕性通過水滴與聚苯乙烯表面的接觸角來測定 (The pocket Goniometer, PG-3，F(xiàn)IBRO System AB)。事先確定 UV 暴露時(shí)間以得到 60-65 度的接觸角，與傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)表面一致。3、在傳感器表面上生長細(xì)胞在37°C、5%的(X)2培養(yǎng)箱中胰酶消化(trypsinised)(根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞胰酶消化 (trypsination)程序)在適當(dāng)培養(yǎng)基(根據(jù)細(xì)胞系)中生長的細(xì)胞，以制備單細(xì)胞懸浮液。 使用血球計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并將細(xì)胞在聚苯乙烯表面上接種至適當(dāng)?shù)拿芏?濃度，以在M小時(shí)培養(yǎng)之后達(dá)到約70-80%傳感器表面的覆蓋，通過核染色(描述于下一段)固定之后進(jìn)行評(píng)價(jià)。4、在傳感器表面上固定細(xì)胞在M小時(shí)培養(yǎng)之后，將事先在晶體上接種的細(xì)胞在甲醛(Sigma)中進(jìn)行固定。將細(xì)胞培養(yǎng)基移除，并將細(xì)胞在冰冷的PBS中洗滌。隨后，通過在+4°C下用0. 5ml在冰冷的 PBS中新制備的3. 7%甲醛溶液培養(yǎng)細(xì)胞10分鐘，進(jìn)行細(xì)胞的固定。進(jìn)行三次5分鐘的洗滌步驟，以除去剩余的甲醛。隨后進(jìn)行核染色以評(píng)價(jià)晶體的細(xì)胞覆蓋率。簡單地說，將細(xì)胞用制備成最終濃度為2. 8 μ M的核染料DAPI (Invitrogen, λ Ex/Em 358-46lnm)培養(yǎng)3分鐘。在PBS中進(jìn)行洗滌步驟之后，在熒光顯微鏡(Nikon Eclipse 80i)下目測細(xì)胞-晶體。 隨后在+4°C下將細(xì)胞-晶體保存在PBS中。 5、使用甘氨酸預(yù)處理傳感器表面在安裝到碎片夾具中并在Attana Cell 200儀器(www. attana. com)中操作之前， 使用再生溶液(甘氨酸10mM，NaCl 500mM, pHl)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行任選的預(yù)處理。該處理進(jìn)一步清潔表面，因此能更快地穩(wěn)定細(xì)胞-晶體以及在Attana Cell 200儀器中更穩(wěn)定的基線。6、在生物傳感器中穩(wěn)定傳感器表面以25-50 μ 1/min、在補(bǔ)充0. 025% Tween (PBST)的PBS中，將已預(yù)處理的細(xì)胞-晶體安裝在Attana Cell 200儀器碎片夾具中，并插入至該儀器中以穩(wěn)定數(shù)小時(shí)或整夜。在 20°C下，以25 μ 1/min進(jìn)行凝集素和/或抗體結(jié)合的操作及評(píng)價(jià)。7、注射配體/分析物以確定結(jié)合的動(dòng)態(tài)和親和力設(shè)計(jì)檢測，通過確定親和力常數(shù)來表征在細(xì)胞表面，細(xì)胞受體或其他特定組分 (例如碳水化合物結(jié)構(gòu))所導(dǎo)向的配體分析物(例如抗體或凝集素)的分子相互作用的機(jī)理。目的是提供在固定的細(xì)胞(例如人類癌性粘附細(xì)胞)的表面發(fā)生的相互作用的生物物理解釋。在生物分子結(jié)合反應(yīng)中結(jié)合常數(shù)的評(píng)價(jià)的質(zhì)量取決于進(jìn)行檢測的條件。通過在分析物的一個(gè)特定濃度下或在分析物的多個(gè)不同濃度下監(jiān)測結(jié)合的相互作用可確定親和力和速率常數(shù)，任選在分析物注射之間具有細(xì)胞表面的中間體再生(使用補(bǔ)充有0.5M NaCl 的PH為1的IOmM甘氨酸可實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn))。在本文報(bào)道的實(shí)施例中，被70-80%細(xì)胞覆蓋的細(xì)胞-晶體、流速05μ1/πι1)、 流動(dòng)緩沖劑(PBST)和80-170秒的接觸時(shí)間用于使響應(yīng)最大化以及使非特異性相互作用最小化，降低質(zhì)量輸送效果和分散。為了穩(wěn)健和精確地確定動(dòng)態(tài)和親和力常數(shù)，可使用一組濃度，并且在典型的實(shí)施方式中，該組包括3-5種不同的濃度，每個(gè)濃度重復(fù)至少兩次。 濃度范圍應(yīng)為至少10倍，并且在最高濃度時(shí)，分析物應(yīng)與至少一半的可用的表面受體結(jié)合。分析物分子的適當(dāng)?shù)臐舛热Q于分析物對(duì)受體的親和力。對(duì)于InM親和力抗體，發(fā)現(xiàn)3-50 μ g/ml的范圍是適當(dāng)?shù)?，而?duì)于15nM親和力凝集素，需要高達(dá)100 μ g/ml的濃度范圍來達(dá)到最大響應(yīng)(對(duì)于與細(xì)胞表面受體結(jié)合的抗體，通常為5-lOHz，而對(duì)于與細(xì)胞表面碳水化合物結(jié)合的凝集素，通常為250Hz)。具有小的預(yù)期的信號(hào)響應(yīng)，具有高度復(fù)雜的傳感器表面，流動(dòng)緩沖劑與試樣緩沖劑的匹配變得高度優(yōu)選。在提供試樣緩沖劑與流經(jīng)傳感器表面的流動(dòng)緩沖劑之間的最優(yōu)化匹配的任選的方法中，從出口收集通過傳感器表面的緩沖劑并再次用于試樣稀釋。優(yōu)選地， 恰好在試樣注射之前收集緩沖劑，以提供緩沖劑之間的最佳可能的匹配。任選地，采用相同的方式進(jìn)行對(duì)照注射，但是未加入任何分析物。緩沖劑對(duì)照物則可用于消除偽差并提供有效的高品質(zhì)生物傳感器分析。與常規(guī)相互作用檢測類似，用開/關(guān)速率和親和力常數(shù)(Kd)(參見以上Myszka參考書)的確定進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。實(shí)施例加在Attana Cell 200儀器上細(xì)胞-凝集素相互作用將MDAMB468細(xì)胞(人類乳腺癌細(xì)胞系)在經(jīng)UV處理的PS晶體上接種，在3. 7% 甲醛中M小時(shí)后固定，核染色如圖1所示。在20°C下、在25 μ 1/min流速下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。補(bǔ)充0. 025% Tween的PBS用作流動(dòng)緩沖劑。將各種濃度的凝集素(conA和WGA)在細(xì)胞上注射，其中接觸時(shí)間為85秒，并監(jiān)測離解至少300秒。數(shù)據(jù)示于圖2和圖3。使用software Clamp (TIBS, 1998, 23,149)進(jìn)行動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)。兩種凝集素(Con A和WGA)攜帶不同的結(jié)構(gòu)和糖特異性。本文呈現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)表明， 在具有不同強(qiáng)度和親和力的細(xì)胞的表面，兩種凝集素均與碳水化合物相互作用，由此提供關(guān)于MDAMB468細(xì)胞表面的復(fù)合糖的聚糖組合物的有價(jià)值的信息。對(duì)于Con A和WGA，細(xì)胞表面碳水化合物與兩種凝集素之間的相互作用的親和力常數(shù)分別為15nM和93nM。實(shí)施例2b凝集素-細(xì)胞表面相互作用的特異性為了進(jìn)一步證實(shí)凝集素-細(xì)胞表面碳水化合物相互作用的特異性，讓結(jié)合凝集素的(ialNAc在不同的濃度下與兩種不同的細(xì)胞系(SW480和HT29)相互作用，在它們各自的表面上暴露不同的糖型。在濃度為6. 25 μ g/ml-200 μ g/ml的流動(dòng)緩沖劑中制備凝集素，隨后在各自的傳感器表面上在SW480和HD9細(xì)胞上注射凝集素。將凝集素注射85秒，隨后讓其離解200秒。如圖10所示，在SW480細(xì)胞上僅檢測到少量結(jié)合，而與細(xì)胞的結(jié)合是依賴濃度的并且顯著更大。實(shí)施例3在Attana Cell 200儀器上的細(xì)胞抗體相互作用A-431細(xì)胞系為過量表達(dá)EGFR受體的人類上皮粘著細(xì)胞系(表皮癌)。在經(jīng)UV處理的聚苯乙烯QCM晶體上的經(jīng)固定和DAPI染色的A-431細(xì)胞示于圖4。于室溫下，將晶體在pH為1的IOmM甘氨酸、500mM的NaCl中預(yù)處理20分鐘， 并在PBS-T中洗滌，隨后安裝到碎片夾具中。將該晶體在20°C和40 μ 1/min流速下在 PBS-T (0. 025% Tween)中穩(wěn)定過夜。在抗體注射期間流速降至25 μ 1/min。抗體在ang/ml的PBS(Santa Cruz)中的抗-EGFR sc 101。測試3種不同的抗體濃度:25,12. 5 和 6μ g/ml。分析結(jié)果示于圖5。確定在抗-EGFR與細(xì)胞表面EGFR受體之間的相互作用的動(dòng)態(tài)速率和親和力常數(shù)(Kd = 1. 2nM)。
實(shí)施例4在Attana Cell 200儀器上細(xì)胞-凝集素相互作用-通過細(xì)胞固定對(duì)敏感性的改善將A-431細(xì)胞(人類上皮癌細(xì)胞系)在經(jīng)UV處理的PS晶體上接種，在3. 7%甲醛中24小時(shí)后進(jìn)行固定。在20°C、25 μ 1/min流速下，在補(bǔ)充有0. 025% Tween的PBS中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以50 μ g/ml的濃度將凝集素WGA和ConA在細(xì)胞上注射，接觸時(shí)間為85秒，并監(jiān)測離解215秒。由不含細(xì)胞但經(jīng)同樣處理和制備的經(jīng)UV處理的PS晶體組成對(duì)照晶體，在實(shí)驗(yàn)中包括該對(duì)照晶體以評(píng)價(jià)非凝集素-細(xì)胞相互作用的貢獻(xiàn)。在相同的條件下，使用多種其他凝集素進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)，以說明ConA和WGA相互作用的特異性(圖6a中存在A-431細(xì)胞，而圖6b中不存在細(xì)胞)。WGAO 800Hz)與A-431細(xì)胞表面的高結(jié)合響應(yīng)(圖7a)說明，與含有相關(guān)碳水化合物的相同或更高的表面密度的兩種尺寸的表面的預(yù)期的響應(yīng)相比，其響應(yīng)顯著增大。由于在表面上存在分子堆積密度的實(shí)際限制，在兩種尺寸的表面上能達(dá)到的預(yù)期的最大響應(yīng)應(yīng)為100Hz，條件是WGA的分子量為35000Da。敏感性增大約8倍可解釋為固定在表面上的固定的細(xì)胞提供的表面增強(qiáng)。雖然細(xì)胞的厚度在10 μ m范圍并且QCM傳感器通常的衰變長度在幾百nm范圍內(nèi)，但如果不是為了固定所提供的細(xì)胞的剛性化，那么由于表面增強(qiáng)而對(duì)敏感性的改善應(yīng)該是有限的。因此，提供的數(shù)據(jù)表明，通過向表面加入和固定細(xì)胞，可改善傳感器的敏感性和動(dòng)力學(xué)范圍。圖7b直接比較了對(duì)于ConA和WGA結(jié)合，A-431和對(duì)照晶體的頻率位移。實(shí)施例5表面和固定方法將A-431細(xì)胞固定在金或聚苯乙烯(PS)表面上。隨后根據(jù)兩種不同的方法來固定已固定的細(xì)胞。固定策略通常分為添加固定(基于在蛋白質(zhì)之間形成共價(jià)鍵)和變性固定(包括各種細(xì)胞組分的脫水)。在本實(shí)驗(yàn)中，測試基于這兩種原則中的每一種的固定方法。進(jìn)行對(duì)經(jīng)核染色的細(xì)胞的顯微評(píng)價(jià)，來評(píng)價(jià)固定的程度。所測試的4種條件如下所示-在聚苯乙烯上固定并用甲醛+甲醇固定(PSFM)的A-431-在聚苯乙烯上固定并用甲醛固定(PSF)的A-431-在金上固定并用甲醛+甲醇固定(金FM)的A-431-在金上固定并用甲醛固定(金F)的A-431除了以前描述的聚苯乙烯表面以外，凝集素ConA與A-431的結(jié)合用于評(píng)價(jià)金表面作為宿主哺乳動(dòng)物細(xì)胞的供選。另外，將使用甲醛和甲醇的變性固定方法與先前描述的基于甲醛的添加固定策略相比較。由圖8和圖9清楚地表明，PS為用于細(xì)胞連接的較好的底物，其具有使用變性固定得到的最高信號(hào)；然而，金表面可用作供選。類似地，雖然可使用兩種固定方法，但是在該具體的實(shí)施例中變性固定看起來是有利的。固定方法以及表面類型的優(yōu)選取決于待研究的系統(tǒng)。這些實(shí)施例表明，不僅添加固定方法和變性固定方法，而且金或聚苯乙烯表面，與使用Attana Cell 200儀器的高品質(zhì)測量均是條件相容的。上述實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，而不是限定其范圍，范圍由附加的權(quán)利要求限定。本文中所有引用的文獻(xiàn)全文引入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器，所述化學(xué)傳感器具有粘附于其敏感表面的失活的細(xì)胞，并且適用于通過由于分析物配體與細(xì)胞的結(jié)合而在傳感器表面處引起的質(zhì)量的變化來檢測分析物配體與粘附的失活的細(xì)胞之間的相互作用，其中，所述傳感器提供有流路池或形成部分流路池。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器，其中，所述細(xì)胞被固定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的傳感器，其中，所述細(xì)胞為真核的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的傳感器，其中，在將細(xì)胞固定之前，使用高純度水測定，所述敏感表面的接觸角為10-90度，優(yōu)選為20-80度，更優(yōu)選為30-70度。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的傳感器，其中，所述敏感表面提供有聚合物涂層，所述細(xì)胞粘附于所述聚合物涂層上。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的傳感器，其中，所述聚合物涂層含有聚苯乙烯，所述聚苯乙烯優(yōu)選通過用等離子體轟擊或電磁輻射處理來改性。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的傳感器，其中，所述傳感器為聲波裝置，例如石英晶體微天平。
8.一種用于檢測分析物配體與細(xì)胞之間的相互作用的方法，所述方法包括以下步驟 提供根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器；將所述分析物配體引入至所述敏感表面的附近，使得分析物配體與細(xì)胞之間相互作用；以及，當(dāng)存在相互作用時(shí)， 通過在所述敏感表面處的質(zhì)量的變化來檢測所述相互作用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，使用流動(dòng)緩沖溶液稀釋所述分析物配體，所述流動(dòng)緩沖溶液事先已與所述敏感表面接觸。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中，在分析物配體的一個(gè)特定濃度下或在分析物配體的多個(gè)不同濃度下檢測分析物配體與細(xì)胞之間的結(jié)合的相互作用。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，使用在分析物配體的一個(gè)特定濃度下或在分析物配體的多個(gè)不同濃度下收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析物與細(xì)胞之間的結(jié)合的相互作用的動(dòng)態(tài)參數(shù)的確定。
12.質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器在分析分析物配體與在所述化學(xué)傳感器的傳感器表面上或附近固定的細(xì)胞之間的結(jié)合的相互作用中的用途，其中，所述細(xì)胞為失活的。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中，所述細(xì)胞被固定。
14.一種用于改善質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器的敏感性和/或敏感范圍的方法，所述質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器包括聲波裝置，例如石英晶體微天平，并且具有在所述質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器的傳感器表面上或附近固定的細(xì)胞，所述方法包括將細(xì)胞固定或?qū)⒓?xì)胞嵌入交聯(lián)的聚合物基體內(nèi)的步驟，其中，所述細(xì)胞為失活的，并且其中，所述傳感器提供有流路池或形成部分流路池。
15.一種用于改善質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器的敏感性和/或敏感范圍的方法，所述質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器基于聲波裝置，例如石英晶體微天平，所述方法包括在所述質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器的傳感器表面上或附近固定聚合物顆粒。
16.一種根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法得到的質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器。
17.一種用于增強(qiáng)質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器中信號(hào)與噪聲比率的方法，所述方法包括在將分析物試樣引入所述敏感表面之前，使用流動(dòng)緩沖溶液來稀釋分析物試樣的步驟，所述流動(dòng)緩沖溶液已事先用于穩(wěn)定所述傳感器。
18.一種用于制備質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器的方法，所述質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器能檢測分析物配體與固定的細(xì)胞之間的相互作用，所述方法包括以下步驟使含有細(xì)胞的懸浮液與傳感元件的敏感表面接觸；使得細(xì)胞粘附于所述敏感表面并可能在所述敏感表面上生長；在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間之后，處理所述粘附的細(xì)胞，使得它們失活；以及，將所述傳感器整合到流路池中，使得所述傳感器提供有流路池或形成部分流路池。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述細(xì)胞為真核的。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的方法，其中，在與含有細(xì)胞的懸浮液接觸之前，將所述敏感表面改性，以提高表面能，從而增強(qiáng)細(xì)胞與該表面的粘附。
21.根據(jù)權(quán)利要求18-20中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，在將細(xì)胞固定之前，使用高純度水測定，所述敏感表面的接觸角為10-90度，優(yōu)選20-80度，更優(yōu)選30-70度。
22.根據(jù)權(quán)利要求18-21中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述敏感表面提供有聚合物涂層，該聚合物涂層與所述含有細(xì)胞的懸浮液接觸。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述聚合物涂層含有聚苯乙烯，所述聚苯乙烯優(yōu)選通過用等離子體轟擊或電磁輻處理來改性。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的方法，其中，所述聚合物涂層通過用聚合物溶液旋涂所述傳感元件來制備。
25.根據(jù)權(quán)利要求18-24中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，通過物理手段或通過化學(xué)手段實(shí)現(xiàn)所述粘附的細(xì)胞的失活，所述物理手段例如將細(xì)胞保持在降低的溫度下、急速冷凍或減壓熱處理，所述化學(xué)手段例如毒素處理或化學(xué)交聯(lián)。
26.根據(jù)權(quán)利要求18-25中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，通過將細(xì)胞固定實(shí)現(xiàn)所述粘附的細(xì)胞的失活。
27.根據(jù)權(quán)利要求18-26中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，在失活之后，將所述敏感表面用酸性溶液處理，以除去未粘附的細(xì)胞和非細(xì)胞物質(zhì)。
28.根據(jù)權(quán)利要求18-27中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述傳感器為聲波裝置，例如石英晶體微天平。
全文摘要
一種質(zhì)量敏感型化學(xué)傳感器，所述化學(xué)傳感器具有粘附于其敏感表面的失活的細(xì)胞，并且適用于通過由于分析物配體與細(xì)胞的結(jié)合而在傳感器表面處引起的質(zhì)量的變化來檢測分析物配體與粘附的失活的細(xì)胞之間的相互作用，其中，所述傳感器提供有流路池或形成部分流路池。
文檔編號(hào)G01N21/55GK102356315SQ201080012281
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2010年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月20日
發(fā)明者B·英厄馬松, C·謝克, J·圣圭龍斯, K·倫德爾 申請(qǐng)人:安塔納公司