專利名稱：異常線粒體dna、相關(guān)的融合轉(zhuǎn)錄本和翻譯產(chǎn)物及其雜交探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及線粒體基因組學(xué)和蛋白組學(xué)領(lǐng)域。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及線粒體基因組融合轉(zhuǎn)錄本和翻譯產(chǎn)物的確定鑒定和應(yīng)用，以及與其雜交的探針。
背景技術(shù)：
線粒體基因組線粒體基因組是小型而關(guān)鍵的核酸序列。相對(duì)于33億bp的巨大核基因組(單倍的)而言，線粒體DNA或者"mtDNA"包括16，569個(gè)核酸堿基對(duì)(bp)的小基因組 (Anderson 等人，1981 ;Andrews 等人，1999)。它的遺傳組(genetic complement)大大小于核細(xì)胞遺傳組(0.0005% )。然而，單個(gè)細(xì)胞根據(jù)具體的細(xì)胞功能攜帶IO3至IO4個(gè)線粒體(Singh and Modica-Napolitano 2002)。通信和化學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)常規(guī)地發(fā)生于核和線粒體基因組之間(Sierratt等人，1997)。此外，特定的核組份負(fù)責(zé)線粒體序列的維持和完整性 (Croteau等人，1999)。給定個(gè)體中的全部mtDNA基因組是相同的，其原因在于在發(fā)生受精后卵子內(nèi)線粒體的克隆擴(kuò)增。然而突變事件可誘發(fā)反映為體細(xì)胞突變的序列多樣性。在稱為異序性(heteroplasmy)的情況下這些突變可在整個(gè)身體的不同組織中積累。線粒體蛋白質(zhì)組需要大約3，000個(gè)核基因來構(gòu)建、操作和維持線粒體，它們中僅有37個(gè)由線粒體基因組編碼，表明線粒體極其依賴于核基因座。該線粒體基因組編碼M個(gè)基因的組，包括 2個(gè)rRNA和22個(gè)tRNA，它們確保其余13個(gè)基因的正確翻譯，這13個(gè)基因?qū)τ陔娮觽鬟f是至關(guān)重要的(參見圖1)。除由該線粒體基因組提供的13個(gè)多肽外，該線粒體基因組依賴于 70個(gè)核編碼的蛋白質(zhì)以完成此種重要功能所需的氧化和還原反應(yīng)。核和線粒體蛋白二者形成跨越線粒體內(nèi)膜的復(fù)合物并總共產(chǎn)生80-90%的細(xì)胞代謝所需的化學(xué)燃料三磷酸腺苷或 ATP0除了產(chǎn)生能量以外，線粒體在其它代謝途徑中也發(fā)揮重要作用。線粒體的關(guān)鍵功能是細(xì)胞死亡或者凋亡的介導(dǎo)(參見Green and Kroemer，2005)。本質(zhì)上，存在有滲透線粒體外膜的信號(hào)通路，或者除此之外還滲透線粒體內(nèi)膜。當(dāng)特定的線粒體蛋白質(zhì)釋放進(jìn)入細(xì)胞溶質(zhì)中時(shí)，啟動(dòng)不可逆的細(xì)胞死亡。這一過程強(qiáng)調(diào)了一些線粒體蛋白質(zhì)所具有的多功能作用。 這些多任務(wù)蛋白質(zhì)暗示其它線粒體蛋白質(zhì)也可能具有另外功能。線粒體融合轉(zhuǎn)錄組/蛋白質(zhì)組線粒體基因組不尋常之處在于它是一種環(huán)狀的、無內(nèi)含子的DNA分子。該基因組散布有重復(fù)基序，該基序處于特定長度的序列的側(cè)翼。這些重復(fù)之間的序列在尚未充分理解的情況下容易缺失。鑒于該線粒體基因組中重復(fù)基因的數(shù)目，有許多可能的缺失。最熟知的例子是4977 “共同缺失(common deletion)”。此缺失與有證據(jù)支持的若干病癥和疾病有關(guān)，并且據(jù)認(rèn)為隨衰老而頻率增加(Dai等人，2004 ；Ro等人，2003 ；Barron等人，2001 ； Lewis 等人，2000 ；MulIer-Hocker，1998 ；Porteous 等人，1998)(圖 4)。線粒體基因組學(xué)領(lǐng)域目前的觀點(diǎn)是，線粒體缺失僅僅是通過諸如活性氧簇和UVR的試劑損害線粒體基因組的有害副產(chǎn)物(Krishnan等人2008，Nature Genetics)。此外，盡管認(rèn)識(shí)到高水平的mtDNA缺失可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生ATP形式的能量的能力有嚴(yán)重的影響(其原因是缺少細(xì)胞呼吸所必需的基因序列)，但是未預(yù)料到的是這些缺失的線粒體分子可以是下游通路的組分，具有預(yù)定的功能作用，并且可能更適合將其認(rèn)為是已確定的線粒體基因的另外的天然形式。mtDNA的序列動(dòng)力學(xué)是重要的診斷工具。mtDNA中的突變通常是發(fā)展成疾病的初期指示信號(hào)。例如，已經(jīng)證實(shí)，線粒體基因組中的點(diǎn)突變是前列腺中腫瘤病灶的特征。這種趨勢(shì)還延伸到了腫瘤組織近端和遠(yuǎn)端的表現(xiàn)正常的組織(Parr等人2006)。這表明線粒體突變?cè)趷盒赞D(zhuǎn)化通路早期即已發(fā)生。例如，3. 4kb線粒體缺失的頻率在良性和惡性前列腺組織之間的區(qū)分中具有優(yōu)良的效用(Maki等人2008)。此外，對(duì)與缺失有關(guān)的疾病和新序列(通過確定許多開放閱讀框的分子的再接近而產(chǎn)生)的研究鑒定表明獨(dú)特的線粒體融合蛋白的可能性。線粒體融合轉(zhuǎn)錄本此前在文獻(xiàn)中已有報(bào)道，首次報(bào)道于大豆中(Morgens等人 1984)，后來報(bào)道于兩名卡恩斯-塞爾綜合征(Kearns-Sayre Syndrome)患者中，該卡恩斯-塞爾綜合征是一種罕見的神經(jīng)肌肉障礙(Nakase等人1990)。重要的是，未發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)錄本與任何人類癌癥有關(guān)聯(lián)(或者未被研究認(rèn)為與任何人類癌癥有關(guān))。核融合蛋白質(zhì)組融合蛋白及其對(duì)癌癥產(chǎn)生的影響在核中已有重要的先例。核MLL基因?qū)σ孜槐怀浞执_定與高風(fēng)險(xiǎn)急性白血病以及用靶向拓?fù)洚悩?gòu)酶II的藥劑治療后的治療相關(guān)急性髓細(xì)胞性白血病有關(guān)聯(lián)(Libura等人，2005)。目前，已知人MLL基因的大約50種易位與這些癌癥有關(guān)(Meyer等人，200 。在大部分這些事件中，這些突變的斷裂點(diǎn)不論是部分串聯(lián)重復(fù)還是易位都出現(xiàn)在核特異性重復(fù)基序例如Alu I中。這些突變的大多數(shù)是相互易位的 (84% ),并且包括大約40種不同基因(Libura等人2005)。已知影響惡性疾病進(jìn)程的一些此類重排產(chǎn)生的功能性嵌合蛋白。例如，表達(dá) MLL-ENL的蛋白質(zhì)的鼠細(xì)胞加速了存活于依托泊苷暴露的細(xì)胞的普遍染色體異常(Eguchi 等人，2006)。尤其引人關(guān)注的是MLL-SMAP1和交互的SMAPI-MLL。SMAPl結(jié)合鈣，并且因此參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和運(yùn)輸。線粒體融合蛋白可以被假定與核融合蛋白具有相似作用，特別是由于線粒體和線粒體蛋白質(zhì)在信號(hào)傳導(dǎo)和凋亡中發(fā)揮類似作用。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供異常線粒體DNA、相關(guān)的融合轉(zhuǎn)錄本和翻譯產(chǎn)物及其雜交探針。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了與癌癥有關(guān)的分離的線粒體融合轉(zhuǎn)錄本。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了編碼本發(fā)明融合轉(zhuǎn)錄本的分離的mtDNA。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種雜交探針，其具有與本發(fā)明的線粒體融合轉(zhuǎn)錄本或mtDNA的至少一部分互補(bǔ)的核酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了檢測哺乳動(dòng)物癌癥的方法，該方法包括通過將哺乳動(dòng)物組織樣品與至少一種雜交探針雜交來分析該樣品中與癌癥有關(guān)的至少一種線粒體融合轉(zhuǎn)錄本的存在，所述雜交探針具有與本發(fā)明的線粒體融合轉(zhuǎn)錄本的至少一部分互補(bǔ)的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了檢測哺乳動(dòng)物癌癥的方法，該方法包括通過將哺乳動(dòng)物的組織樣品與至少一種雜交探針雜交來分析所述樣品中與癌癥相關(guān)的至少一種異常mtDNA的存在，所述雜交探針具有與本發(fā)明的mtDNA的至少一部分互補(bǔ)的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于進(jìn)行檢測哺乳動(dòng)物中癌癥存在的分析的試劑盒，所述試劑盒包括至少一種與本發(fā)明的融合轉(zhuǎn)錄本或mtDNA的至少一部分互補(bǔ)的雜交探針。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種線粒體融合蛋白，該蛋白質(zhì)具有由本發(fā)明線粒體融合轉(zhuǎn)錄本的翻譯產(chǎn)生的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了檢測哺乳動(dòng)物癌癥的方法，該方法包括分析哺乳動(dòng)物的組織樣品中至少一種線粒體融合蛋白的存在，該蛋白質(zhì)具有由本發(fā)明線粒體融合轉(zhuǎn)錄本翻譯產(chǎn)生的氨基酸序列。


現(xiàn)參照附圖僅以示例的方式描述本發(fā)明的一些實(shí)施方案，其中圖1是顯示線粒體蛋白質(zhì)編碼基因的示意圖。圖2顯示了前列腺樣品中的聚腺苷酸化融合轉(zhuǎn)錄本，其由3. 41Λ缺失的喪失引起。圖3顯示了前列腺樣品中的聚腺苷酸化融合轉(zhuǎn)錄本，其由49771Λ共同缺失的喪失引起。圖4顯示了乳腺樣品中的聚腺苷酸化融合轉(zhuǎn)錄本，其由mt基因組的3. 4kb區(qū)段的喪失引起。圖fe和恥顯示基因剪接之前和之后的線粒體DNA區(qū)域的實(shí)例。圖6a至6g說明了本發(fā)明轉(zhuǎn)錄本2，3，8，9，10，11和12在結(jié)直腸癌腫瘤鑒定中的結(jié)果。圖7a至7d說明了本發(fā)明轉(zhuǎn)錄本6，8，10和20在肺癌腫瘤鑒定中的結(jié)果。圖8a至8j說明了本發(fā)明轉(zhuǎn)錄本6，10，11，14，15，16和20在黑素瘤鑒定中的結(jié)果。圖9a至9h說明了本發(fā)明轉(zhuǎn)錄本1，2，3，6，11，12，15和20在卵巢癌鑒定中的結(jié)果。圖10至18說明了本發(fā)明轉(zhuǎn)錄本2，3，4，11，12，13，15，16和20在睪丸癌鑒定中的結(jié)果。圖19說明了在融合蛋白發(fā)現(xiàn)期進(jìn)行的RWPEl和WPE1-NA22細(xì)胞系的細(xì)胞溶質(zhì)和線粒體級(jí)分的SDS PAGE凝膠。圖 20a 說明了基于肽 ILYMTDEVNDPSLTIK 和 STPYECGFDPMSP 的融合轉(zhuǎn)錄本 P0026 的鑒定的蛋白質(zhì)。圖20b說明了檢索人(SwissProt)數(shù)據(jù)庫后圖19的線粒體NA22細(xì)胞系凝膠切片 5中鑒定的野生型C02蛋白。圖 21a 說明了基于肽 KGPNVVGPYGLLQPFADAMK、YDQLMHLLffK 和 LITTQQWLIK 的融合轉(zhuǎn)錄本P0062的鑒定的蛋白質(zhì)。圖21b說明了檢索人(SwissProt)數(shù)據(jù)庫后圖19的凝膠切片5中鑒定的NDl的
鑒定肽。圖 22 說明了基于肽 KGPNVVGPYGLLQPFADAMK 和 WAIIEEFTK 的融合轉(zhuǎn)錄本 P0064 的
鑒定的蛋白質(zhì)。圖 23a 說明了 基于肽 KGPNVVGPYGLLQPFADAMK、VFSffLATLHGSNMK 和 VLMVEEPSMNLEWLYGCPPPYHTFEEPVYMK的融合轉(zhuǎn)錄本P0176的鑒定的蛋白質(zhì)。圖2 說明了檢索人(SwissProt)數(shù)據(jù)庫后圖19的線粒體NA22細(xì)胞系凝膠切片 4中鑒定的野生型COl蛋白。圖2 至24d分別說明了融合轉(zhuǎn)錄本P0026、P0062、P0064和P0176的定量測定結(jié)^ ο
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了用于預(yù)測、診斷和/或監(jiān)測癌癥的新穎的線粒體融合轉(zhuǎn)錄本、突變的親本mtDNA分子和得到的翻譯產(chǎn)物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于檢測融合轉(zhuǎn)錄本和相關(guān) mtDNA分子的雜交探針以及此類探針的應(yīng)用。定義除非另有說明，用于本文的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有與本發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。術(shù)語“包括”、“包含”或“含有”可用于本申請(qǐng)文件。如本文所述的(包括說明書和/或權(quán)利要求書)，這些術(shù)語解釋為說明存在所述特征、整體、步驟或組份，但是如對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的那樣，不解釋為排除存在一種或多種其它的特征、整體、步驟、組份或其組。如本文使用的，“異常”或“突變”包括會(huì)產(chǎn)生融合轉(zhuǎn)錄本的野生型線粒體DNA序列的任何修飾，并且包括但不限于，插入、易位、缺失、重復(fù)、重組、重排或其組合。如本文定義的，“生物樣品”是指含有細(xì)胞的組織或體液，可以從其中可以獲得感興趣的分子。例如，該生物樣品可得自組織例如前列腺，乳腺，結(jié)直腸，肺和皮膚，或者得自血液，唾液，腦脊液，痰液，尿液，粘液，滑液，腹腔液，羊水等。該生物樣品可以是外科手術(shù)樣品或生物活檢樣品。該生物樣品可以從來源所得那樣直接使用或者經(jīng)預(yù)處理以改變樣品性質(zhì)之后再使用。因此該生物樣品可以在使用前預(yù)處理，例如通過從血液中制備血漿或血清、 破壞細(xì)胞、從固體材料制備液體、稀釋粘稠液體、過濾液體、蒸餾液體、濃縮液體、使干擾組分失活、添加試劑等。“連續(xù)的”轉(zhuǎn)錄本是一種融合轉(zhuǎn)錄本，其保留有兩個(gè)剪剪接基因的起始到終點(diǎn)的閱讀框?！澳┒恕鞭D(zhuǎn)錄本是一種融合轉(zhuǎn)錄本，其會(huì)在第二剪剪接基因的原始終止密碼子之前產(chǎn)生早熟的終止密碼子。如本文使用的，“線粒體DNA”或“mtDNA”是存在于線粒體中的DNA。如本文使用的，措辭“線粒體融合蛋白”或“融合蛋白”是指通過突變線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生的肽產(chǎn)物，其中此類突變包含缺失或者其它“大規(guī)模”線粒體DNA重排。此外或者可選擇的，同框(in-frame)蛋白可以從在此序列中的另外的起始和終止密碼子翻
6譯而來。如本文使用的，措辭“線粒體融合轉(zhuǎn)錄本”或“融合轉(zhuǎn)錄本”是指由于突變線粒體 DNA序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中此類突變可包含線粒體缺失和其它大規(guī)模線粒體DNA重排。如本文使用的，措辭“線粒體翻譯產(chǎn)物”或“翻譯產(chǎn)物”是指得自線粒體融合轉(zhuǎn)錄本的任何氨基酸鏈，包括肽、多肽和蛋白質(zhì)。應(yīng)當(dāng)理解，“線粒體翻譯產(chǎn)物”包括上文定義的 “融合蛋白”。計(jì)算機(jī)分析和序列靶向如上文討論的，線粒體融合轉(zhuǎn)錄本已被報(bào)道于大豆(Morgens等人1984)中以及罹患罕見神經(jīng)肌肉障礙的人(Nakase等人1990)中。然而與人類癌癥有關(guān)的融合轉(zhuǎn)錄本未被披露。使用與癌癥相關(guān)的人類線粒體基因組的大規(guī)模缺失繪圖中獲得的知識(shí)、此類缺失的高頻率的觀察，以及在轉(zhuǎn)錄活化突變的mtDNA分子的另一有機(jī)體和另一疾病類型中的證據(jù)，本發(fā)明人推測，此類缺失具有超越與癌癥有關(guān)的DNA分子以及損傷和修復(fù)過程的重要性。為了檢驗(yàn)此推測，進(jìn)行了線粒體基因組的計(jì)算機(jī)分析，特別是對(duì)于重復(fù)元件，其提示許多潛在的缺失位點(diǎn)。在鑒定具有非鄰近或非串聯(lián)位置的線粒體序列中的獨(dú)特重復(fù)的初始步步驟之后，進(jìn)行以下篩選以鑒定這些重復(fù)，即通過在該DNA分子中啟動(dòng)缺失事件，其中這些 DNA分子可能重新接近或者重新連接以產(chǎn)生具有開放讀碼框(ORF)的融合DNA序列，并因此能夠通過線粒體轉(zhuǎn)錄機(jī)制而被轉(zhuǎn)錄。然后選擇這些分子的18個(gè)的亞組以用于靶向研究是否它們存在于人類的天然生物學(xué)狀態(tài)中；它們被聚腺苷酸化并因此有望進(jìn)行蛋白質(zhì)合成；它們與惡性腫瘤有關(guān)聯(lián)。這些研究的結(jié)果證實(shí)對(duì)于全部三個(gè)疑問均是肯定的，并且描述于下文。基因組突變線粒體DNA (mtDNA)動(dòng)力學(xué)是一種重要的診斷工具。mtDNA中的突變體通常是疾病發(fā)生的初步指示并且可作為指示與疾病發(fā)生相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因子的生物標(biāo)志物。根據(jù)本發(fā)明， 線粒體基因組中的突變導(dǎo)致產(chǎn)生與癌癥相關(guān)的融合轉(zhuǎn)錄本。因此，提供了編碼此類轉(zhuǎn)錄本的mtDNA和針對(duì)它的探針在癌癥的檢測、診斷和監(jiān)測中的用途。本領(lǐng)域技術(shù)人員一應(yīng)理解，用于本發(fā)明方法的mtDNA分子可通過分離天然出現(xiàn)的突變而得到，或者可以基于本文所述任一融合轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)序列而得到。示例性的mtDNA序列和融合轉(zhuǎn)錄本公開于本申請(qǐng)人的共同待決美國申請(qǐng)No. 61/040，616和公開的PCT申請(qǐng) PCT/CA2009/000351(以 WO 2009/117811 公開)中。突變基因組序列的檢測本發(fā)明的突變體mtDNA序列可包括導(dǎo)致融合轉(zhuǎn)錄本生成的任何修飾。此類修飾的非限制性實(shí)例包括插入、易位、缺失、重復(fù)、重組、重排或其組合。雖然修飾或變化可以在大小上極大地變化，從僅幾個(gè)堿基到幾千個(gè)堿基，優(yōu)選地，該修飾會(huì)造成大型缺失或者其它大規(guī)?；蚪M異常。提取DNA以檢測此類突變體的存在可以使用本領(lǐng)域公知的方法、接著通過擴(kuò)增線粒體基因組的全部或區(qū)域來進(jìn)行，并且可以包括線粒體基因組的測序，如Current Protocols in Molecular Biology 所述。
檢測該突變體的步驟可以從本領(lǐng)域的任何已知技術(shù)中選擇。例如分析mtDNA可包括對(duì) mtDNA 測序，通過 PCR 擴(kuò)增 mtDNA，Southern、Northern、Western South-Western 印記雜交，變性HPLC，與微陣列雜交，生物芯片或基因芯片，分子標(biāo)志物分析，生物傳感器，熔解溫度曲線或者上述任一方法的組合?？梢允褂萌魏芜m宜方法對(duì)線粒體DNA測序。優(yōu)選地，mtDNA在測序之前通過PCR 擴(kuò)增。PCR方法是本領(lǐng)域公知的，并且可以如Mullis和Faloona，1987，Methods Enzymo 1.， 155 335中所述來執(zhí)行。PCR產(chǎn)物可以被直接測序列，或者被克隆到載體中，然后將該載體置于細(xì)菌宿主中。DNA測序方法的實(shí)例可見于Brumley, R. L. Jr.和Smith, L. Μ.，1991， Rapid DNA sequencing by horizontal ultrathin gel electrophoresis,Nucleic Acids Res. 19 :4121-4126,以及 Luckey，J. A.，等人，1993，High speed DNA sequencing by capillary gel electrophoresis, Methods Enzymol. 218 :154—172。 mtDNA 的 PCR 禾口測序的組合應(yīng)用描述于 Hopgood, R.,等人，1992, Strategies for automated sequencing of human mtDNA directly from PCR products,Biotechniques 13 :82-92,以及Tanaka,M.等人，1996, Automated sequencing of mtDNA, Methods Enzymol. 264 :407-421。選擇適宜序列以用于制備各種引物的方法亦是本領(lǐng)域已知的。例如，該引物可使用常規(guī)固相合成法應(yīng)用商購設(shè)備來制備，所述商購設(shè)備例如得自Applied Biosystems USA Inc. (Foster City,California)>DuPont, (Wilmington,Del.)或 Milligen(Bedford, Mass. ) ο根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，為了測定候選的基因組序列，首先鑒定序列缺失的連接點(diǎn)。序列缺失主要是通過直接或間接的重復(fù)元件來鑒定，該重復(fù)單元在待缺失序列的5’和 3’端側(cè)翼。從該基因組中去除核苷酸的一部分，接著連接該基因組，結(jié)果產(chǎn)生新的連接點(diǎn)。在鑒定了該連接點(diǎn)以后，確定連接點(diǎn)側(cè)翼的基因的核苷酸，以確定剪剪接基因。通常，該剪接基因包括來自第一基因的起始密碼子以及第二基因的終止密碼子，并且可以被表達(dá)為連續(xù)轉(zhuǎn)錄本，即，其從兩個(gè)剪接基因的起始到終點(diǎn)保持讀碼框。表1提供了當(dāng)重排序列在剪接位點(diǎn)重新接合時(shí)發(fā)現(xiàn)具有開放讀碼框(ORF)的一些已知的線粒體缺失。用于本發(fā)明方法的示例性的mtDNA分子提供于下文。這些mtDNA基于已知線粒體基因組(SEQ ID NO 1)的修飾，并已賦予融合或“FUS”名稱。其中A:B表示第一剪接基因的最末線粒體核苷酸與第二剪接基因的第一線粒體核苷酸之間的連接點(diǎn)。剪接基因的出處提供于括弧內(nèi)，其后是相應(yīng)的序列標(biāo)識(shí)。當(dāng)以下面提供時(shí)，(AltMet)和(OrigMet)分別是指另外的和原始的翻譯起始位點(diǎn)。FUS 8469 :13447 (AltMet) (ATP 合酶 FO 亞基 8 至 NADH 脫氫酶亞基)(SEQ ID No 2)FUS 10744 14124 (NADH 脫氫酶亞基 4L (ND4L)至 NADH 脫氫酶亞基 5(ND5)) (SEQ ID No 3)FUS 7974 :15496 (細(xì)胞色素 C 氧化酶亞基 II 0Χ)ΙΙ)至細(xì)胞色素 b (Cytb)) (SEQ ID No 4)FUS 7992 15730 (細(xì)胞色素 C 氧化酶亞基 II 0Χ)ΙΙ)至細(xì)胞色素 b (Cytb)) (SEQ ID No 5)FUS 8210 15339 (細(xì)胞色素 C 氧化酶亞基 II 0Χ)ΙΙ)至細(xì)胞色素 b (Cytb)) (SEQ IDNo 6)FUS 8828 14896 (ATP 合酶 FO 亞基 6 (ATPase6)至細(xì)胞色素 b (Cytb)) (SEQ ID No
7)FUS 10665 :14856 (NADH 脫氫酶亞基 4L(ND4L)至細(xì)胞色素 b (Cytb)) (SEQ ID No:
8)FUS 6075 13799 (細(xì)胞色素C氧化酶亞基I (COI)至NADH脫氫酶亞基5 (ND5)) (SEQ ID No 9)FUS 6325 13989 (細(xì)胞色素C氧化酶亞基I (COI)至NADH脫氫酶亞基5 (ND5)) (SEQ ID No 10)FUS 7438 :13476(細(xì)胞色素C氧化酶亞基I (COI)至NADH脫氫酶亞基5(ND5)) (SEQ ID No 11)FUS 7775 :13532 (細(xì)胞色素C氧化酶亞基II (COII)至NADH脫氫酶亞基5 (ND5)) (SEQ ID No 12)FUS 8213 :13991 (細(xì)胞色素C氧化酶亞基II (COII)至NADH脫氫酶亞基5 (ND5)) (SEQ ID No 13)FUS 9191 :12909 (ATP 合酶 FO 亞基 6 (ATPase6)至 NADH 脫氫酶亞基 5 (ND5)) (SEQ ID No 14)FUS 9574 :12972(細(xì)胞色素C氧化酶亞基III (COIII)至NADH脫氫酶亞基5(ND5)) (SEQ ID No 15)FUS 10367 :12829 (NADH 脫氫酶亞基 3 (ND3)至 NADH 脫氫酶亞基 5 (ND5)) (SEQ ID No 16)FUS 11232 :13980 (NADH 脫氫酶亞基 4 (ND4)至 NADH 脫氫酶亞基 5 (ND5) (SEQ ID No 17)FUS 8469 13447 (OrigMet) (ATP 合酶 FO 亞基 8 至 NADH 脫氫酶亞基)(SEQ ID No 18)FUS 9144 I38I6 ((ATP 合酶 FO 亞基 6 (ATPase6)至 NADH 脫氫酶亞基 5 (ND5)) (SEQ ID No 54)本發(fā)明還提供了這些序列的變體或片段在預(yù)測、診斷和/或監(jiān)測癌癥中的用途。“變體"，如本文使用的，是指與本發(fā)明mtDNA序列不同但保留了它們的必需的性質(zhì)的核酸。通常來說，變體總體上很相似，并且在許多區(qū)域，與所選的mtDNA序列相同。具體地說，本發(fā)明的變體包括剪接基因的連接點(diǎn)的至少一個(gè)核苷酸，并且可進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)與其鄰近的核苷酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該變體序列與任一本發(fā)明mtDNA 序列或者其互補(bǔ)鏈至少有80 %，85 %，90 %，95 %，96 %，97 %，98 %或99 %的同一性。在本發(fā)明中，“片段"是指一條短的核酸序列或與其互補(bǔ)的鏈，所述核酸序列是包含在公開的基因組序列中的一部分。此部分包括至少一個(gè)核苷酸(其包含剪接基因的連接點(diǎn))，并且可進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)與其鄰近的核苷酸。本發(fā)明的片段長度優(yōu)選為至少約 15nt，更優(yōu)選至少約20nt，還更優(yōu)選至少約30nt，再更優(yōu)選至少約40nt，至少約50nt，至少約75nt或至少約150nt。“長度至少20ng〃的片段，例如，將包括上文所列任一個(gè)mtDNA序列的20個(gè)或者更多個(gè)連續(xù)堿基。在本上下文中，“約”包括具體引述的數(shù)值，在任一末端或者兩個(gè)末端大幾個(gè)或小幾個(gè)(5，4，3，2或1)核苷酸的數(shù)值。這些片段用途包括但不限于作為如本文討論的診斷探針和引物。當(dāng)然，還考慮更大的片段(例如，50，150，500，600，2000 個(gè)核苷酸)。因此，在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，該mtDNA序列選自SEQ ID NO :2(FUS 8469 :13447 ；AltMet)SEQ ID NO :3(FUS 10744 :14124)SEQ ID NO :4(FUS 7974 :15496)SEQ ID NO :5(FUS 7992 :15730)SEQ ID NO :6(FUS 8210 :15339)SEQ ID NO :7(FUS 8828 :14896)SEQ ID NO :8(FUS 10665 :14856)SEQ ID NO :9(FUS 6075 :13799)SEQ ID NO :10(FUS 6325 :13989)SEQ ID NO :11(FUS 7438 :13476)SEQ ID NO :12(FUS 7775 :13532)SEQ ID NO :13(FUS 8213 :13991)SEQ ID NO :14(FUS 9191 :12909)SEQ ID NO :15(FUS 9574 :12972)SEQ ID NO :16(FUS 10367 :12829)SEQ ID NO :17(FUS 11232 :13980)SEQ ID NO :18(FUS 8469 :13447 ；OrigMet)SEQ ID NO 54 (FUS 9144:13816)，-及其片段或變體。泄本發(fā)明另一方面提供了能夠識(shí)別本發(fā)明異常mtDNA序列的雜交探針。如本文使用的，術(shù)語"探針"是指一種寡核苷酸，其與靶核酸序列形成雙鏈結(jié)構(gòu)，原因是該探針中的至少一個(gè)序列與靶區(qū)域中的序列互補(bǔ)?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法標(biāo)記該探針。一旦與特定疾病有關(guān)的異常mtDNA被鑒定，mtDNA與例如寡核苷酸陣列的雜交可用于鑒定特定的突變，然而，可以使用任一已知的雜交方法。與本發(fā)明引物用相同，可以產(chǎn)生直接針對(duì)本發(fā)明示例性的mtDNA融合分子或其片段或變體產(chǎn)生探針。例如，SEQ ID NO :2-18和M所述的序列和表1公開的序列可用于設(shè)計(jì)引物或探針，它們將檢測包含目的融合序列的核酸序列。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的， 與這些核酸分子雜交的引物或探針在高度嚴(yán)格雜交條件或者較低嚴(yán)格條件下可以雜交， 這些條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可例如見于Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York (1989)), 6. 3. 1-6. 3.6。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明探針含有與包含剪接基因的連接點(diǎn)的異常mtDNA的至少一部分互補(bǔ)的序列。此部分包括至少一個(gè)構(gòu)成連接點(diǎn)A:B的核苷酸，并且可進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)與其鄰近的核苷酸。關(guān)于此方面，本發(fā)明包括任何適宜的靶向機(jī)制，該機(jī)制會(huì)使用構(gòu)成和/或鄰近于該連接點(diǎn)A:B的核苷酸來選擇mtDNA分子。
本發(fā)明考慮本領(lǐng)域已知的多種類型的探針。例如，該探針可以是雜交探針，其與靶核苷酸序列的結(jié)合可以使用通用DNA結(jié)合染料例如溴化乙錠、SYBR Green, SYBR Gold等來檢測?；蛘撸撎结樋梢哉弦粋€(gè)或多個(gè)可檢測標(biāo)記。可檢測標(biāo)記是分子或者部分，其性質(zhì)或者特征可以直接或間接地被檢測，并按照該探針與其靶序列雜交的能力不受影響來選擇。標(biāo)記核酸序列的方法是本領(lǐng)域公知的(參見，例如，Ausubel等人，(1997，和更新資料) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York)。適合用于本發(fā)明探針的標(biāo)記包括可以直接檢測的那些，例如放射性同位素、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光團(tuán)、酶、膠體顆粒、熒光微粒等。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，直接可檢測標(biāo)記可能需要另外的組分，例如底物、觸發(fā)試劑、光等使得該標(biāo)記能夠檢測。本發(fā)明還考慮間接檢測的標(biāo)記的用途。本發(fā)明探針長度優(yōu)選至少約15nt，更優(yōu)選至少約20nt，還更優(yōu)選至少約30nt，再更優(yōu)選至少約40nt，至少約50nt，至少約75nt或至少約150nt。“長度至少20nt〃的探針， 例如，將包括與本發(fā)明mtDNA序列互補(bǔ)的的20個(gè)或者更多個(gè)連續(xù)堿基。當(dāng)然，可優(yōu)選更大的探針(例如，50，150，500，600，2000個(gè)核苷酸)。本發(fā)明探針還將在生物樣品中與核酸分子雜交，從而促成了本發(fā)明的方法。相應(yīng)地，在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了用于檢測癌癥的雜交探針，其中該探針與異常mtDNA分子的至少一部分互補(bǔ)。在另一方面，本發(fā)明提供了探針以及此探針用于檢測結(jié)直腸癌，肺癌， 乳腺癌，卵巢癌，睪丸癌，前列腺癌和/或黑素瘤皮膚癌的用途(或者使用方法)。分析法測定生物樣品中異常mtDNA的水平可以確定受試者中一種或多種癌癥的存在。因此，本發(fā)明包括用于預(yù)測、診斷或監(jiān)測癌癥的方法，該方法包括獲得一種或多種生物樣品， 從該樣品中提取mtDNA，以及分析該樣品中的異常mtDNA，其方式是對(duì)樣品中的一種或多種異常mtDNA序列進(jìn)行定量并與參比值比較檢測的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，該參比值是基于該方法是否是旨在預(yù)測、診斷或監(jiān)測癌癥。因此，該參比值可以與從一種或多種已知的非癌性生物樣品、一種或多種已知的癌性生物樣品、和/或一種或多種隨時(shí)間獲取的生物樣品中收集的mtDNA數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了檢測哺乳動(dòng)物癌癥的方法，該方法包括分析哺乳動(dòng)物的組織樣品中上述異常線粒體DNA的存在。本發(fā)明還提供了包括通過使該樣品與至少一種雜交探針雜交來分析哺乳動(dòng)物的組織樣品的方法。該探針可針對(duì)本文所述本發(fā)明突變線粒體DNA序列來產(chǎn)生。在另一方面，本發(fā)明提供了上文所述方法，其中該分析法包括a)使用至少一種探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，使該至少一種探針與互補(bǔ)的異常線粒體DNA 序列雜交；b)通過對(duì)與該至少一種探針雜交的線粒體DNA定量，來定量樣品中的至少一種異常線粒體DNA序列；和c)將樣品中的線粒體DNA的量與至少一種已知參比值進(jìn)行比較。本發(fā)明還包括用于預(yù)測、診斷或監(jiān)測癌癥的方法，該方法包括如下文所述的診斷顯像分析。本發(fā)明的診斷分析可以容易地適用于高通量法。高通量分析法提供了同時(shí)處理許多樣品并且顯著減少了篩選大量樣品所需的時(shí)間的益處。因此，本發(fā)明考慮本發(fā)明的核苷酸在高通量篩選法或者分析法中用于在許多測試樣品中檢測和/或定量靶核苷酸序列的用途。融合轉(zhuǎn)錄本本發(fā)明進(jìn)一步提供了可用于預(yù)測、診斷和/或監(jiān)測癌癥的方法的融合轉(zhuǎn)錄本和相關(guān)雜交探針的鑒定。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，此類分子可以通過分離天然轉(zhuǎn)錄本得到，或者，通過重組表達(dá)本發(fā)明方法分離的mtDNA而得到。如所討論的，此類mtDNA通常包含剪接基因，該剪接基因具有來自第一基因的起始密碼子和第二基因的終止密碼子。因此，由此得到的融合轉(zhuǎn)錄本包括與該剪接基因相關(guān)的連接點(diǎn)。融合轉(zhuǎn)錄本的檢測天然融合轉(zhuǎn)錄本可從生物樣品中提取，并且根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何適宜方法鑒定，或者可以根據(jù)實(shí)施例所述方法進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定的聚腺苷酸化融合轉(zhuǎn)錄本是使用靶向具有聚腺苷酸尾的轉(zhuǎn)錄本的寡聚(dT)引物，接著使用設(shè)計(jì)為針對(duì)該靶轉(zhuǎn)錄本的引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR而鑒定的。使用此類方法檢測以下示例性的融合轉(zhuǎn)錄本，并且發(fā)現(xiàn)其如實(shí)施例中所述可用于預(yù)測、診斷和/或監(jiān)測癌癥。同樣，得自表1所示ORF序列的融合轉(zhuǎn)錄本可用于預(yù)測、診斷
和/或監(jiān)測癌癥t
SEQIDNO:19(轉(zhuǎn)錄本 1 ；8469 13447 ；AltMet)
SEQIDNO:20(轉(zhuǎn)錄本 2 ； 10744:14124)
SEQIDNO:21(轉(zhuǎn)錄本 3 ；7974 15496)
SEQIDNO:22(轉(zhuǎn)錄本 4 ;7992 15730)
SEQIDNO:23(轉(zhuǎn)錄本 5 ；8210 15339)
SEQIDNO:24(轉(zhuǎn)錄本 6 ；8828 14896)
SEQIDNO:25(轉(zhuǎn)錄本 7 ；10665:14856)
SEQIDNO:26(轉(zhuǎn)錄本 8 ；6075 13799)
SEQIDNO:27(轉(zhuǎn)錄本 9 ；6325 13989)
SEQIDNO:28(轉(zhuǎn)錄本 10 ；7438:13476)
SEQIDNO:29(轉(zhuǎn)錄本 11 ；7775:13532)
SEQIDNO:30(轉(zhuǎn)錄本 12 ；8213:13991)
SEQIDNO:31(轉(zhuǎn)錄本 14 ；9191:12909)
SEQIDNO:32(轉(zhuǎn)錄本 15 ；9574:12972)
SEQIDNO:33(轉(zhuǎn)錄本 16 ；10367 12829)
SEQIDNO:34(轉(zhuǎn)錄本 17 ；11232 13980)
SEQIDNO:35(轉(zhuǎn)錄本 20 ；8469:13447 ；OrigMet)
SEQIDNO:53(轉(zhuǎn)錄本 13 ；9144:13816)融合轉(zhuǎn)錄本還可以通過本領(lǐng)域已知的重組技術(shù)來制備。通常地，它包括用包含目的mtDNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化(包括轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染)適宜的宿主細(xì)胞。還提供了本文鑒定的融合轉(zhuǎn)錄本的變體或片段。此類序列可符合上文所述關(guān)于基因組變體和片段的或者熟練技術(shù)人員所確定的適當(dāng)?shù)拇笮∠薅群桶俜直韧恍浴Ｌ结?br> 一旦表征了融合轉(zhuǎn)錄本，則引物或探針可以被開發(fā)成靶向生物樣品中的轉(zhuǎn)錄本。 此類引物和探針可以使用任何已知方法(如上文所述的)或者下文提供的實(shí)施例中所述的方法來制備。例如，針對(duì)該融合轉(zhuǎn)錄本可以產(chǎn)生探針，并且例如Panomics 的QuantiGene 2. 0 的檢測技術(shù)用于檢測樣品轉(zhuǎn)錄本的存在。可以針對(duì)本發(fā)明示例性的融合轉(zhuǎn)錄本或其片段或變體而直接產(chǎn)生引物和探針。例如，SEQ ID NO :19-35和53所述以及表1所公開的序列可用于設(shè)計(jì)探針，該探針將檢測包含目的融合序列的核酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，設(shè)計(jì)用于與本發(fā)明融合轉(zhuǎn)錄本雜交的探針含有與表達(dá)剪接基因的連接點(diǎn)的該轉(zhuǎn)錄本的至少一部分互補(bǔ)的序列。該部分包括與該表達(dá)的連接點(diǎn)互補(bǔ)的至少一個(gè)核苷酸，并且可進(jìn)一步包含與其鄰接的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)的核苷酸。在此方面，本發(fā)明包括任何適宜的選擇融合轉(zhuǎn)錄本的靶向機(jī)制，該融合轉(zhuǎn)錄本使用構(gòu)成并鄰近剪接基因的連接點(diǎn)的核苷酸。本領(lǐng)域已知的各種類型的探針和標(biāo)記方法均考慮用于制備轉(zhuǎn)錄探針。這些類型和方法已就基因組序列的檢測描述于上文。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄探針長度優(yōu)選至少約15nt，更優(yōu)選至少約20nt，還更優(yōu)選至少約30nt，再更優(yōu)選至少約40nt，至少約50nt，至少約75nt或者至少約150nt。“長度至少20nt"的探針，例如，將包括與本發(fā)明mtDNA序列互補(bǔ)的的20個(gè)或者更多個(gè)連續(xù)堿基。當(dāng)然，可優(yōu)選更大的探針(例如，50，150，500，600，2000個(gè)核苷酸)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于檢測癌癥的雜交探針，其中該探針與上文提供的線粒體融合轉(zhuǎn)錄本的至少一部分互補(bǔ)。在另一方面，本發(fā)明提供了探針以及此探針在檢測結(jié)直腸癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，睪丸癌，前列腺癌或黑素瘤皮膚癌中的用途。分析法測定生物樣品中線粒體融合轉(zhuǎn)錄本水平可以確定在受試者中一種或多種癌癥的存在。因此，本發(fā)明提供了用于預(yù)測、診斷或監(jiān)測癌癥的方法，該方法包括獲得一種或多種生物樣品，從該樣品中提取線粒體RNA，以及通過下列方式分析該樣品中的融合轉(zhuǎn)錄本對(duì)樣品中的一種或多種融合轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量，再將檢測的量與參比值進(jìn)行比較。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，該參比值是基于該方法是否旨在預(yù)測、診斷或監(jiān)測癌癥。因此，該參比值可以與從一種或多種已知的非癌性生物樣品、一種或多種已知的癌性生物樣品、和/或一種或多種過去獲取的生物樣品中收集的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了檢測哺乳動(dòng)物癌癥的方法，該方法包括通過使所述樣品與至少一種雜交探針雜交來分析來自所述哺乳動(dòng)物的組織樣品中至少一種本發(fā)明融合轉(zhuǎn)錄本的存在，所述雜交探針具有與線粒體融合轉(zhuǎn)錄本的至少一部分互補(bǔ)的核酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供了上文所述方法，其中該分析法包括a)使用至少一種上述探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，使該至少一種探針與互補(bǔ)的線粒體融合轉(zhuǎn)錄本雜交；b)通過對(duì)與該至少一種探針雜交的轉(zhuǎn)錄本定量，來定量樣品中的至少一種線粒體融合轉(zhuǎn)錄本；和c)將樣品中的線粒體融合轉(zhuǎn)錄本的量與至少一種已知參比值進(jìn)行比較。如上文討論的，本發(fā)明的診斷分析還包括如本文所述的診斷顯像方法，并且可以容易地適用于高通量法。因此，本發(fā)明考慮本發(fā)明的融合轉(zhuǎn)錄本及相關(guān)探針在高通量篩選法或分析法中檢測和/或定量多個(gè)測試樣品中的靶核苷酸序列的用途。翻譯產(chǎn)物迄今為止，線粒體融合蛋白尚未被檢測或分離。然而，下文提供的實(shí)施例中觀察到的線粒體融合轉(zhuǎn)錄本的水平以及它們是聚腺苷酸化的證據(jù)進(jìn)一步提供了支持此類線粒體融合蛋白存在的證據(jù)。因此，本發(fā)明提供了用于預(yù)測、診斷和/或監(jiān)測癌癥的融合蛋白的鑒定?？紤]用于本發(fā)明方法的融合蛋白可通過從天然多肽的分離獲得或者通過基因表達(dá)獲得。此類多肽可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備，例如從細(xì)胞提取物中純化或者使用重組技術(shù)。與轉(zhuǎn)錄本1-17和20相應(yīng)的推測蛋白序列連同它們各自的序列標(biāo)識(shí)提供下于文。 這些以及公開于表1中的與缺失序列相應(yīng)的推測蛋白序列在本文考慮用于本發(fā)明方法。SEQIDNO:36(轉(zhuǎn)錄本1)
SEQIDNO:37(轉(zhuǎn)錄本2)
SEQIDNO:38(轉(zhuǎn)錄本3)
SEQIDNO:39(轉(zhuǎn)錄本4)
SEQIDNO:40(轉(zhuǎn)錄本5)
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SEQIDNO:55(轉(zhuǎn)錄本1 融合蛋白的檢測本發(fā)明的融合蛋白可以從生物樣品中通過公知方法來回收和純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀法、酸提取法、陰離子或陽離子交換色譜法、磷酸纖維素色譜法、疏水相互作用色譜法、親合色譜法、羥基磷灰石色譜法、疏水荷電相互作用色譜法和凝集素色譜法。最優(yōu)選高效液相色譜法(“HPLC “)用于純化。分析生物樣品中的融合蛋白水平可以使用諸多技術(shù)來進(jìn)行。例如，組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)可以用經(jīng)典免疫組織學(xué)方法來研究(Jalkanen等人，J. Cell. Biol. 101 976-985(1985) Jalkanen，Μ.，等人，J. Cell. Biol. 105 :3087-3096 (1987))。用于檢測蛋白質(zhì)表達(dá)的其它方法包括免疫分析法，例如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和放射免疾分析法 (RIA)。適宜的抗體分析標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的并且包括酶標(biāo)記(例如葡萄糖氧化酶)以及放射性同位素例如碘(<125>1、<121>1)、碳(<14>C)、硫(<35>S)、氚(<3>H)、銦(<112>In) 和锝(<99m>Tc)，以及熒光標(biāo)記例如熒光素和若丹明，以及生物素。本發(fā)明的多肽還可通過本領(lǐng)域已知的重組技術(shù)來制備。通常地，它包括用包含目的編碼多核苷酸的蛋白質(zhì)或多肽的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化(包括轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染)適宜的宿主細(xì)胞。Si^用于本發(fā)明分析方法的蛋白質(zhì)特異性抗體可以針對(duì)本發(fā)明的野生型或表達(dá)的線粒體融合蛋白或者其抗原多肽片段產(chǎn)生，其可以與載體蛋白例如白蛋白一起提供給動(dòng)物系統(tǒng)(例如兔或小鼠)，或者如果其長度足夠(至少約25個(gè)氨基酸)可以沒有載體。如本文使用的，術(shù)語“抗體”(Ab)或“單克隆抗體”(Mab)表示包括完整的分子以及抗體片段，或者其抗原結(jié)合片段(例如，F(xiàn)ab和F(ab' ) 2片段)，其能夠特異地結(jié)合到線粒體融合蛋白，或者對(duì)線粒體融合蛋白具有“特異性”。Fab和F(ab' ) 2片段缺少完整抗體的Fc片段，更容易從循環(huán)中清除，并且可具有較低的完整抗體的非特異性組織結(jié)合(Wahl 等人，J. Nucl. Med. 24 :316-325 (1983))。因此，這些片段是優(yōu)選的。本發(fā)明的抗體可通過眾多方法的任一種來制備。例如，表達(dá)線粒體融合蛋白或其抗原片段的細(xì)胞可以被施用于動(dòng)物以便誘導(dǎo)產(chǎn)生含有多克隆抗體的血清。在一個(gè)方法中， 制備和純化線粒體融合蛋白的制品，使其基本上不含有天然污染物。然后將此制品引入動(dòng)物中以便產(chǎn)生更高特異活性的多克隆抗血清。在一個(gè)相關(guān)的方法中，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以使用雜交瘤技術(shù)來制備(Kohler 等人，Nature 256 :495(1975) ；Kohler 等人，Eur. J. Immunol. 6 511(1976) ；Kohler 等人，Eur. J. Immunol. 6 :292(1976) ；Hammerling 等人，于=Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y. , (1981) pp. 563-681)。通常，這些操作法包括用線粒體融合蛋白抗原或者用表達(dá)線粒體融合蛋白的細(xì)胞對(duì)動(dòng)物(優(yōu)選小鼠)免疫。本發(fā)明包括免疫分析法，該方法使用對(duì)本文所述融合蛋白具有特異性的抗體或抗原結(jié)合片段。此類免疫分析法可以借助于試劑盒，該試劑盒包括抗體或抗原結(jié)合片段以及任何其它必需的試劑、試片、材料和說明書等等。分析法測定生物樣品中翻譯產(chǎn)物例如融合蛋白水平可以確定受試者中一種或多種癌癥的存在。因此，本發(fā)明提供了用于預(yù)測、診斷或監(jiān)測癌癥的方法，該方法包括獲得一個(gè)或多個(gè)生物樣品，從該樣品中提取線粒體融合蛋白，以及通過下列方式分析該樣品的此分子對(duì)樣品中的一種或多種分子進(jìn)行定量，再將檢測的量與參比值進(jìn)行比較。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，該參比值是基于該方法是否旨在預(yù)測、診斷或監(jiān)測癌癥。因此，該參比值可以與從一種或多種已知的非癌性生物樣品、一種或多種已知的癌性生物樣品、和/或一種或多種過去獲取的生物樣品中收集的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)。對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)定量的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括，例如，經(jīng)典的免疫組織學(xué)方法(Jalkanen 等人，J. Cell. Biol. 101 :976-985(1985) Jalkanen, Μ.，等人，J. Cell. Biol. 105 :3087-3096(1987))。用于檢測蛋白質(zhì)表達(dá)的其它方法包括免疫分析法，例如放射免疫分析法(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了檢測哺乳動(dòng)物癌癥的方法，該方法包括分析哺乳動(dòng)物的組織樣品中至少一種線粒體融合蛋白的存在。在另一方面，本發(fā)明提供了結(jié)直腸癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，睪丸癌，前列腺癌和/或黑素瘤皮膚癌的診斷中線粒體融合蛋白的檢測。診斷成像診斷設(shè)備本發(fā)明包括用于診斷特定疾病或鑒定特定突變的診斷設(shè)備，如生物芯片、基因芯片或微陣列。對(duì)所有測序的線粒體基因組進(jìn)行評(píng)估從而得到堿基對(duì)排列的共有結(jié)構(gòu)，并對(duì)與特定疾病或病癥相關(guān)的堿基對(duì)缺失和突變的比例賦予禁止指數(shù)(prohibiting index) 0 其后所述診斷性排列用于制造生物芯片、基因芯片或微陣列。一旦鑒定出與特定疾病、疾病狀態(tài)或病癥有關(guān)的序列，可使用將線粒體核苷酸樣品與寡核苷酸陣列進(jìn)行雜交從而鑒定特定的突變?？梢允褂萌魏我阎碾s交方法。優(yōu)選地， 使用具有與野生型或突變區(qū)匹配的寡核苷酸探針以及對(duì)照探針的陣列。市售的陣列如微陣列或基因芯片是適合的。這些陣列在載片或微芯片上含有數(shù)千匹配的以及對(duì)照探針對(duì)，并能夠非常迅速地進(jìn)行全基因組測序。描述微陣列在基因組和DNA序列分析中的應(yīng)用的綜述文獻(xiàn)可在線獲得。微陣列多核苷酸陣列提供了能在包含一種或多種靶核酸序列的樣品中測定大量多核苷酸的高通量技術(shù)。本發(fā)明的陣列可用于基因表達(dá)分析、疾病診斷和疾病預(yù)后(例如，監(jiān)測患者對(duì)治療的反應(yīng)等)。指示疾病或疾病進(jìn)展的mtDNA多核苷酸序列的任何組合均可用于構(gòu)建微陣列。使用微陣列進(jìn)行分析的靶核酸樣品來自如上述包含足量mtDNA的任何人組織或體液。在足以產(chǎn)生互補(bǔ)核酸成員/靶標(biāo)復(fù)合體的雜交模式的雜交條件下使靶核酸樣品接觸多核苷酸成員。微陣列的構(gòu)建所述微陣列包含附著在固體支持物一個(gè)表面的許多獨(dú)有多核苷酸，其中每種多核苷酸附著在所述固體支持物表面上不相同的預(yù)選區(qū)中。陣列上每種相關(guān)樣品包含身份已知 (通常序列已知)的多核苷酸組合物，這在下面有更詳細(xì)的描述。任何可能的基質(zhì)都可以應(yīng)用在本發(fā)明中。使用任何已知的方法構(gòu)建所述陣列。可以使用已建立的技術(shù)生產(chǎn)所述核酸成員， 如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和逆轉(zhuǎn)錄(RT)。這些方法與本領(lǐng)域目前已知的方法類似(參閱如，PCR Strategies, Michael A. Innis (編者)，等人(1995)，以及 PCR introduction to Biotechniques Series, C. R. Newton, A. Graham(1997))。經(jīng)擴(kuò)增的多核苷酸通過本領(lǐng)域熟知的方法純化(例如柱純化)。當(dāng)多核苷酸已被分離從而基本上不含引物以及所需多核苷酸的合成期間產(chǎn)生的不完整產(chǎn)物時(shí)，則認(rèn)為多核苷酸是純的。優(yōu)選地，純化的多核苷酸還將基本上不含可能阻礙或以其他方式掩蓋所述分子的結(jié)合活性的污染物。在本發(fā)明的陣列中，所述多核苷酸組合物與固體支持物的表面穩(wěn)定結(jié)合，其中該支持物可以是柔性或剛性固體支持物。本發(fā)明中可以使用核酸成員可附著于其上的任何固體支持物。適宜的固體支持物材料的實(shí)例包括但不限于硅酸鹽如玻璃和硅膠、纖維素和硝酸纖維素紙、尼龍、聚苯乙烯、 聚甲基丙烯酸酯、膠乳、橡膠和碳氟樹脂如TEFLON ?？梢允褂酶鞣N形狀的固體支持物材料，包括但不限于載片和珠。載片提供了一些功能上的優(yōu)勢(shì)，因此是優(yōu)選的固體支持物形式。由于其表面扁平，因此使用玻璃載片將探針和雜交試劑減至最少。載片還使得試劑能靶向應(yīng)用，易于保持恒定的溫度，易于清洗并且便于直接觀察固定在固體支持物上的RNA和/或DNA。使用載片還便于去除固定在固體支持物上的RNA和/或DNA。選擇作為固體支持物的具體材料對(duì)于本發(fā)明不是關(guān)鍵的，只要其提供所述功能。 通常實(shí)施或使用本發(fā)明的人會(huì)基于成本節(jié)約和可獲得性、最終產(chǎn)品的預(yù)期應(yīng)用需求以及整個(gè)制造過程的需要而選擇最佳的市售材料。使用許多方法用于將本發(fā)明的核酸成員附著在基質(zhì)上(稱作點(diǎn)樣的過程)。例如， 使用如美國專利No. 5，807，522中的技術(shù)附著多核苷酸，其為教導(dǎo)聚合物附著方法而通過引用并入本文?；蛘呤褂媒佑|壓印技術(shù)進(jìn)行點(diǎn)樣。每個(gè)組合物中存在的多核苷酸量將足以在使用該陣列的測定中提供充分的靶多核苷酸序列的雜交和檢測。通常，與陣列的固體支持物穩(wěn)定結(jié)合的每一核酸成員量為至少約0. lng，優(yōu)選至少約0. 5ng并且更優(yōu)選至少約lng，其中所述量可以高至IOOOng或更高， 但是通常不超過約20ng?？梢詫?duì)照多核苷酸點(diǎn)樣在該陣列上，并用作靶標(biāo)表達(dá)對(duì)照多核苷酸和錯(cuò)配對(duì)照核苷酸，從而監(jiān)測與所述樣品中除靶標(biāo)外(探針?biāo)赶虻陌袠?biāo))的多核苷酸進(jìn)行的非特異性結(jié)合或交叉雜交。因此，錯(cuò)配的探針指示雜交是否特異。例如，如果存在靶標(biāo)，則完全匹配的探針應(yīng)該始終比錯(cuò)配的探針更亮。另外，如果存在所有主要錯(cuò)配，則使用錯(cuò)配探針檢測突變。制備靶標(biāo)所述微陣列的靶標(biāo)可以來源于一種或多種生物樣品。可能希望在雜交之前對(duì)靶核酸樣品進(jìn)行擴(kuò)增。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)了解，無論使用何種擴(kuò)增方法，如果需要定量結(jié)果的話，則必需注意使用維持或控制所述擴(kuò)增多核苷酸的相對(duì)頻率的方法?！岸俊?擴(kuò)增的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。例如，定量PCR包括使用相同的引物同時(shí)共同擴(kuò)增已知量的對(duì)照序列。這提供了可以用于校準(zhǔn)該P(yáng)CR反應(yīng)的內(nèi)標(biāo)。然后高密度陣列可以包括內(nèi)標(biāo)特異性探針，以定量所擴(kuò)增的多核苷酸。PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis ^X, Academic Press, Inc. N. Y. , (1990)巾IK共了定量PCR的詳細(xì)方案。其它適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增方法包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) (Irmis， 等人，PCR Protocols. A guide to Methods and Application. Academic Press, Inc. San Diego, (1990))、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)(參見 Wu and Wallace, Genomics, 4 560 (1989), Landegren，等人，Science, 241 :1077(1988)以及 Barringer，等人，Gene，89 :117 (1990)、 轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(Kwoh，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86 :1173(1989))以及自主序列復(fù)制 (Guatelli，等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87 :1874 (1990))。本發(fā)明提供了上文所述標(biāo)記的靶標(biāo)或標(biāo)記的探針。對(duì)于微陣列，任何附著于或摻入于分子中的可分析檢測的標(biāo)記均可用于本發(fā)明。可分析檢測的標(biāo)記指任何被分析檢測和定量的分子、部分或原子。適用于本發(fā)明的檢測標(biāo)記包括任何可通過光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電、光學(xué)或化學(xué)方法檢測的組合物。可用于本發(fā)明的標(biāo)記包括用標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白綴合物染色的生物素、磁珠(例如，Dynabeads )、熒光染料(例如，熒光素、 得克薩斯紅、羅丹明、綠色熒光蛋白等)、放射性標(biāo)記(例如，3H，1251，35S，14C或32P)、酶 (如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶及其它普遍用于ELISA的酶)和比色標(biāo)記如膠體金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳等)珠。教導(dǎo)該標(biāo)記用途的專利包括美國專利 No. 3，817，837 ；3，850，752 ；3，939，350 ；3，996，345 ；4，277，437 ；4，275，149 和 4，366，241。檢測這些標(biāo)記的方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的。因此，例如，可以使用膠片或閃爍計(jì)數(shù)器檢測放射性標(biāo)記，可使用檢測發(fā)射光的光檢測器檢測熒光標(biāo)記。酶標(biāo)記通常通過為酶提供底物并檢測該酶對(duì)底物的作用所產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物來檢測，而比色標(biāo)記通過簡單地觀察有色標(biāo)記進(jìn)行檢測。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的許多方法摻入所述標(biāo)記。然而，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述標(biāo)記在制備樣品多核苷酸的擴(kuò)增步驟中同時(shí)摻入。因此，例如，帶有標(biāo)記引物或標(biāo)記核苷酸的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)將提供標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如上述使用標(biāo)記的核苷酸(如熒光素標(biāo)記的UTP和/或CTP)的轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增將標(biāo)記摻入轉(zhuǎn)錄的多核苷酸中。或者，可以將標(biāo)記直接加入原始多核苷酸樣品(例如，mRNA，聚腺苷酸化mRNA，cDNA等)或在擴(kuò)增完成之后加入擴(kuò)增產(chǎn)物。將標(biāo)記附著在多核苷酸上的方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的，包括如切口平移或末端標(biāo)記(例如使用標(biāo)記的RNA)，通過用激酶處理多核苷酸并隨后附著(連接)連接多核苷酸樣品與標(biāo)記(例如，熒光團(tuán))的多核苷酸接頭。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述靶標(biāo)將包括一種或多種對(duì)照分子，其與微陣列上的對(duì)照探針雜交，從而將該微陣列得到的信號(hào)歸一化。標(biāo)記的歸一化靶標(biāo)是與如上述點(diǎn)樣在所述微陣列上的對(duì)照寡核苷酸完全互補(bǔ)的多核苷酸序列。雜交后得自歸一化對(duì)照的信號(hào)提供了對(duì)雜交條件、標(biāo)記強(qiáng)度、“讀數(shù)”效率及其可造成完全雜交的信號(hào)在陣列間變化的其他因素的變化的對(duì)照。圖像采集和數(shù)據(jù)分析在雜交和任何洗滌步驟和/或常規(guī)的后續(xù)處理之后，檢測得到的雜交模式。在雜交模式的檢測或成像中，標(biāo)記的強(qiáng)度或信號(hào)值將不僅被檢測而且還被定量，這意味著將對(duì)來自每個(gè)雜交點(diǎn)的信號(hào)進(jìn)行測量并與已知數(shù)目的末端標(biāo)記靶多核苷酸所發(fā)射信號(hào)相應(yīng)的單位值進(jìn)行比較，從而獲得雜交模式中與陣列上的特定點(diǎn)雜交的每種末端標(biāo)記靶標(biāo)的拷貝數(shù)的計(jì)數(shù)或絕對(duì)值。分析從陣列雜交收集的數(shù)據(jù)的方法在本領(lǐng)域是熟知的。例如，當(dāng)雜交檢測涉及熒光標(biāo)記時(shí)，數(shù)據(jù)分析可包括如下步驟從收集的數(shù)據(jù)確定作為基質(zhì)位置的函數(shù)的熒光強(qiáng)度， 除去異常值，即偏離預(yù)定統(tǒng)計(jì)分布的數(shù)據(jù)，以及從剩余的數(shù)據(jù)計(jì)算測試多核苷酸的相對(duì)結(jié)合親和力。將得到的數(shù)據(jù)展示為圖像，其中每個(gè)區(qū)域中的強(qiáng)度根據(jù)相關(guān)寡核苷酸和/或多核苷酸與測試多核苷酸之間的結(jié)合親和力而發(fā)生變化。診斷測試檢測或成像后，所述雜交模式用于確定與該陣列接觸從而得到雜交模式的標(biāo)記靶多核苷酸樣品的遺傳譜的定量信息，以及樣品所源自的組織、體液、器官、細(xì)胞等的狀態(tài)或情況。就此而言，本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于檢測癌癥的診斷測試。本發(fā)明還提供了針對(duì)患者狀況進(jìn)行檢測。根據(jù)本發(fā)明的方法，癌癥的存在是通過從患者獲得生物樣品來檢測的。包含核酸的測試樣品是從該生物樣品制備的。從該樣品中提取的核酸與包含固體基質(zhì)和多個(gè)核酸成員的陣列雜交，其中每個(gè)核酸成員指示存在疾病或者有癌癥傾向。根據(jù)此診斷測試， 包含核酸的樣品與該陣列上的一個(gè)或多個(gè)核酸成員雜交指示著癌癥或者有癌癥傾向。診斷性監(jiān)測本發(fā)明方法可進(jìn)一步包括基于一種或多種分析法的結(jié)果來推薦監(jiān)測狀態(tài)或治療進(jìn)程的步驟。這讓臨床醫(yī)生能夠?qū)嵤﹤€(gè)體化給藥；例如通過監(jiān)測患者癌癥進(jìn)程(例如通過識(shí)別何時(shí)起始和或后續(xù)的突變發(fā)生)或者治療進(jìn)程(例如通過識(shí)別何時(shí)突變穩(wěn)定)而治療癌癥。有了序列變化范圍的知識(shí)，該信息可用于診斷癌前狀況或者癌存在時(shí)的狀況。此外，通過對(duì)隨時(shí)間的連續(xù)樣品中異常mtDNA的定量，可以監(jiān)測癌癥狀況的進(jìn)展。例如通過在某一時(shí)間點(diǎn)分析患者組織以檢測第一組從野生型的突變而獲得數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)可以與后續(xù)分析所提供的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以確定在該異常中是否發(fā)生了變化。當(dāng)在尚未發(fā)展成癌癥癥狀的個(gè)體中發(fā)現(xiàn)突變時(shí)，該突變可能指示有發(fā)展為癌癥狀況的遺傳易感性。其疾病易感性的確定或其存在的診斷可以進(jìn)一步基于以下信息量化評(píng)價(jià)，該信息是關(guān)于患者家族史中癌癥狀況(如果有)的普遍性以及其它風(fēng)險(xiǎn)因子的存在 (例如暴露于環(huán)境因素)以及患者細(xì)胞是否還攜帶另一類突變。生物樣品本發(fā)明提供了診斷測試法，其包括獲得或采集一種或多種生物樣品。在本發(fā)明的上下文中，“生物樣品”是指含有細(xì)胞的組織或體液，從該細(xì)胞中可以獲得mtDNA、mtRNA和翻譯產(chǎn)物或者融合蛋白。例如，該生物樣品可以得自包括但不限于下列的組織皮膚，肺，乳腺，前列腺，神經(jīng)，肌肉，心臟，胃，結(jié)腸，直腸組織等；或者得自血液，唾液，腦脊液，痰液，尿液，粘液，滑液，腹腔液，羊水等。該生物樣品可以得自癌性或非癌性組織，并且可以，但不限于外科手術(shù)樣品或生物活檢樣品。該生物樣品可以以從來源獲得的那樣直接使用或者預(yù)處理以改變樣品性質(zhì)后使用。因此，該生物樣品在使用前進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理的方式例如是，從血液制備血漿或血清， 破壞細(xì)胞，從固體材料制備液體，稀釋粘稠液體，過濾液體，蒸餾液體、濃縮液體，使干擾組分失活，添加試劑等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以單次分析一種以上的樣品類型(即，對(duì)于檢測一種以上的癌癥)。此外，當(dāng)需要一系列采集時(shí)例如對(duì)于癌癥經(jīng)時(shí)監(jiān)測時(shí)，給定樣品可以單獨(dú)被診斷，或者整個(gè)試驗(yàn)期獲得的其它樣品一起被診斷。就此而言，生物樣品可以僅一次獲取， 或者以規(guī)則間隔獲取，例如兩周一次、一月一次、半年一次或每年一次。試劑盒本發(fā)明提供了用于在臨床環(huán)境下檢測癌癥的診斷/篩查試劑盒。此試劑盒可包括一個(gè)或多個(gè)取樣工具，以及一種或多種本發(fā)明的探針?；蛘撸虺艘酝?，該試劑盒可包括用于檢測本發(fā)明翻譯產(chǎn)物的工具。該試劑盒可任選包括進(jìn)行診斷分析所需的試劑，例如緩沖劑、鹽、檢測試劑等。其它成分例如用于分離和/或處理生物樣品的緩沖劑和溶液亦可包含在該試劑盒中。該試劑盒的一種或多種組分可以被冷凍干燥，并且該試劑盒可進(jìn)一步包括適用于使該冷凍干燥組分復(fù)溶的試劑。如果適宜，則該試劑盒還可包含反應(yīng)容器，混合容器以及其它有助于制備測試樣品的組件。該試劑盒還任選可包括使用說明書，其可以紙質(zhì)形式提供，或者以計(jì)算機(jī)可讀形式例如磁盤、⑶、DVD等提供。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于診斷癌癥的試劑盒，其包括取樣工具以及本發(fā)明的雜交探針。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒可包括免疫分析。在此情況下，該試劑盒可包括對(duì)本文所述融合蛋白具有特異性的抗體或抗原結(jié)合片段?？梢岳斫猓嗣庖叻治鏊璧母鞣N其它試劑、試片等將被包含在該試劑盒中，所需要的用戶說明書也被包含在該試劑盒中。實(shí)施例本發(fā)明的多個(gè)方面將通過使用以下實(shí)施例來示意性描述。本文提供的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明某些具體的實(shí)施方案，而不是用于以任何方式限定本發(fā)明范圍。實(shí)施例1 線粒體融合轉(zhuǎn)錄本的檢測先前本申請(qǐng)人在PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/CA2007/001711(公開號(hào)WO 2009/039601，其全部內(nèi)容通過引用并入本文)中鑒定的線粒體4977 “共同缺失”和3. 41Λ缺失產(chǎn)生了獨(dú)特的開放讀碼框，其具有前列腺組織中寡-dT篩選所鑒定的活性轉(zhuǎn)錄本(圖2和幻。乳腺組織樣品的檢查亦揭示存在從3. 4kb缺失產(chǎn)生的穩(wěn)定的聚腺苷酸化融合轉(zhuǎn)錄本(圖4)。用于缺失轉(zhuǎn)錄本檢測的逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR方案RNA 分離 cDNA 合成總RNA是從快速冷凍的前列腺和乳腺組織樣品(惡性和鄰近于腫瘤的正常樣品兩者)分離的，其中使用 Aurum Total RNAi^atty 和 Fibrous Tissue 試劑盒(Bio-I ad， Hercules,CA)并遵照用戶說明書。由于在此試驗(yàn)中應(yīng)避免基因組DNA污染，所以包括DNase I處理步驟，其使用本領(lǐng)域公知的方法。用ND-1000分光光度計(jì)(NanoDrop technologies) 對(duì)RNA定量和定性。來自約IOOg的起始材料，總RNA濃度變化范圍為lOO-lOOOng/ul， 260/280比率為1. 89-2. 10。將RNA濃度調(diào)節(jié)到lOOng/ul，將2ul的每個(gè)模板用于第一鏈 DNA合成，其中使用的superscript 第一鏈DNA合成系統(tǒng)(Invitrogen)并遵照用戶說明書進(jìn)行RT-PCR。為了鑒定穩(wěn)定的聚腺苷酸化融合轉(zhuǎn)錄本，使用了靶向具有聚-A尾的轉(zhuǎn)錄本的寡聚(dT)引物。PCR每個(gè)cDNA模板使用5ul進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，其中在DNA Engine 0pticon 2連續(xù)熒光檢測系統(tǒng)(Bio-Rad, Hercules, CA)上使用 iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad, Hercules, CA)進(jìn)行。靴向 4977bp 缺失的引物對(duì)為；8416F 5，-CCTTACACTATTCCTCATCAC-3，， 13637R 5，-TGACCTGTTAGGGTGAGAAG-3，，而靴向 3. 4kb 缺失的引物對(duì)為；ND4LF 5 ‘ -TCGCTCACACCTCATATCCTC-3 ‘，ND5R 5 ‘ -TGTGATTAGGAGTAGGGTTAGG-3 '。反應(yīng)混合液包括2X SYBR Green Supermix(IOOmM KCL,40mM Tris-HCl, pH 8.4，0.4mM 的各種 dNTP[dATP，dCTP, dGTP 禾口 dTTP]，iTaq DNA 聚合酶，50 單位 /ml，6mM MgCl2, SYBR Green 1，20nM熒光素，以及穩(wěn)定劑)，每種引物250nM，以及ddH20。PCR循環(huán)參數(shù)如下 (1) 95 V 2min, (2) 95 V 30sec, (3) 55 V (對(duì)于 4977bp 缺失)和 63 V (對(duì)于 3. 4kb 缺失)30sec，(4)72°C45sec, (5)讀板，接著步驟3至5進(jìn)行39個(gè)循環(huán)，最終在4°C下孵育。除了循環(huán)閾值以及熔解曲線分析以外，針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性顯影使樣品跑瓊脂糖凝膠(參見圖2至4)。圖2是顯示由線粒體基因組失去3. 4kb引起的前列腺樣品中的聚腺苷酸化融合轉(zhuǎn)錄本的瓊脂糖凝膠。圖2的圖例B-空白，泳道l-6cDNA中檢測的轉(zhuǎn)錄本；泳道7-12泳道 1-6樣品的無逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)對(duì)照。圖3顯示了由失去49771Λ共同缺失引起的前列腺樣品中的聚腺苷酸化融合轉(zhuǎn)錄本。圖3的圖例B-空白，泳道l-6cDNA中檢測的轉(zhuǎn)錄本；泳道7_12泳道1_6樣品的的無 RT對(duì)照。圖4顯示了由失去3. 41Λ mt基因組引起的乳腺樣品中的聚腺苷酸化融合轉(zhuǎn)錄本。 圖4的圖例泳道2-8來自乳腺cDNA的轉(zhuǎn)錄本；泳道9陰性(水)對(duì)照；泳道10和11，陰性，無RT，泳道2和3樣品的對(duì)照。這些結(jié)果證實(shí)了存在穩(wěn)定的線粒體融合轉(zhuǎn)錄本。實(shí)施例2 融合產(chǎn)物的鑒定和靶向設(shè)計(jì)多種雜交探針以檢測并進(jìn)一步證實(shí)由突變的線粒體基因組得到的新轉(zhuǎn)錄本的存在，例如3. 41Λ缺失。為此目的，使用單重分支DNA平臺(tái)(single-plex branched DNA platform)進(jìn)行定量基因表達(dá)分析(QuantiGene 2. 0 ，Panomics )。本實(shí)施例中所列舉的特異性缺失和序列基于它們與整個(gè)mtDNA基因組(其描述于SEQ ID NO :1)的相對(duì)位置。 針對(duì)四種轉(zhuǎn)錄本的核酸序列設(shè)計(jì)的本實(shí)施例探針在本文中標(biāo)識(shí)如下轉(zhuǎn)錄本1 (SEQ ID NO 19)，轉(zhuǎn)錄本 2 (SEQ ID NO 20)，轉(zhuǎn)錄本 3 (SEQ ID NO 21)和轉(zhuǎn)錄本 4 (SEQ ID NO :22)。來自3. 4kb線粒體基因組缺失的連續(xù)轉(zhuǎn)錄本的實(shí)例在基因ND4L (NADH脫氫酶亞基 4L)和ND5(NADH脫氫酶亞基5)之間發(fā)生。具有對(duì)SEQ ID NO :20的互補(bǔ)序列的探針用于檢測轉(zhuǎn)錄本2。重復(fù)元件出現(xiàn)位置為ND4L中的10745-10754以及ND5中的14124-14133。3. 4kb缺失導(dǎo)致去除ND4L的3，端、全部的ND4基因、tRNA組氨酸、tRNA絲氨酸2、 tRNA亮氨酸2以及ND5的5，端的大部分(參見圖fe)，造成ND4L和ND5的基因剪接，連接點(diǎn)為 10744 (ND4L) 14124 (ND5)(圖 5b)。通過啟動(dòng)第一基因ND4L的原始起動(dòng)密碼子，翻譯該氨基酸序列直到出現(xiàn)終止密碼子。在此實(shí)施例中，該終止密碼子是ND5的原始的終止密碼子。因此，盡管將兩個(gè)基因剪接在一起，該讀碼框保持完整，導(dǎo)致一種假設(shè)或預(yù)測的轉(zhuǎn)錄本，其長度為100個(gè)氨基酸(或者300bp)。此融合蛋白轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)物在本文標(biāo)識(shí)為SEQ ID N0:37。編碼此蛋白質(zhì)的核苷酸序歹丨J (SEQ ID NO 3)與線粒體基因組位置10470-10744 :14124-14148相對(duì)應(yīng)。SEQ ID NO 3是與上文所述方式檢測的RNA轉(zhuǎn)錄本(SEQ ID NO 20)互補(bǔ)的DNA序列。類似地，轉(zhuǎn)錄本1是AIPase 8和ND5之間對(duì)應(yīng)位置8469 :13447的融合轉(zhuǎn)錄本(SEQ ID NO 19)。轉(zhuǎn)錄本 3 禾口 4 (分別為 SEQ ID NO 21 和 SEQ ID NO 22)是 COII 和 Cytb 之間分別對(duì)應(yīng)核苷酸位置7974 15496和7992 :15730的融合轉(zhuǎn)錄本。表3提供了本實(shí)施例使用的各種序列之間關(guān)系的匯總。表3包括檢測的融合轉(zhuǎn)錄本、與檢測的融合轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)的 DNA序列以及針對(duì)每種轉(zhuǎn)錄本的推測翻譯產(chǎn)物。實(shí)施例3 應(yīng)用于前列腺癌使用4種融合轉(zhuǎn)錄本，即上文討論的轉(zhuǎn)錄本1至4，分析來自一名患者的兩個(gè)前
21列腺組織樣品，以評(píng)價(jià)新預(yù)測的融合轉(zhuǎn)錄本的定量差異。試驗(yàn)結(jié)果提供于以下表2。其中“Homog 1，，是指來自患者的冷凍前列腺腫瘤的勻漿物，“Homog 2”是指與該患者腫瘤鄰近的冷凍的正常前列腺組織的勻漿物。根據(jù)制造商方案(用于新鮮或冷凍的動(dòng)物組織的 QuantiGene 樣品樣品處理試劑盒；以及QuantiGene 2. 0試劑系統(tǒng)用戶手冊(cè))處理這些樣品，以25. 8mg的Homog 1和28. 9mg的Homog 2開始(該分析方案顯示于表fe和5b)。清楚證明的是，與正常鄰近的前列腺組織相比，前列腺癌組織中線粒體融合轉(zhuǎn)錄本存在增加。該融合轉(zhuǎn)錄本存在于正常組織中，盡管水平很低。探針與靶轉(zhuǎn)錄本雜交產(chǎn)生的相對(duì)發(fā)光單位(RLU)直接與每種轉(zhuǎn)錄本的豐度成比率。表2還標(biāo)明了以百分?jǐn)?shù)表示的樣品讀數(shù)的變異系數(shù)CV。該CV由標(biāo)準(zhǔn)偏差除以該數(shù)值的均值得到。這些癌癥組織中穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄的線粒體基因產(chǎn)物的顯著性暗示了疾病演化和進(jìn)展。實(shí)施例4 應(yīng)用于乳腺癌使用與實(shí)施例3相同的方案，但是僅針對(duì)轉(zhuǎn)錄本2 (與3. 4kb mt基因組缺失相關(guān)的新融合轉(zhuǎn)錄本)在兩個(gè)乳腺腫瘤組織樣品上兩個(gè)與這些腫瘤鄰近無腫瘤組織的樣品上， 以及三個(gè)前列腺腫瘤組織樣品、一個(gè)包含鄰近的無腫瘤組織的樣品進(jìn)行分析。本實(shí)施例的結(jié)果提供于表4。具有相應(yīng)的正常組織部分的前列腺腫瘤組織樣品證實(shí)與實(shí)施例3分析的前列腺樣品有相似模式，即，該腫瘤組織比正常鄰近的組織具有約2倍量的融合轉(zhuǎn)錄本。當(dāng)與鄰近非-腫瘤組織相比時(shí)，證實(shí)該乳腺腫瘤樣品有顯示增加的融合轉(zhuǎn)錄本水平。勻漿物的1 100稀釋液用于本分析，因?yàn)樗趯?shí)施例3的試驗(yàn)進(jìn)行中最具重現(xiàn)性。因此，上文討論的結(jié)果說明本發(fā)明轉(zhuǎn)錄本在前列腺和乳腺組織腫瘤檢測中的應(yīng)用。實(shí)施例5 應(yīng)用于結(jié)盲腸癌本研究旨在測定本發(fā)明若干轉(zhuǎn)錄本在檢測結(jié)直腸癌中的效力。制備了總計(jì)19個(gè)樣品，它們包括9個(gè)對(duì)照(良性)組織樣品(樣品1至9)和10個(gè)腫瘤(惡性)組織樣品 (樣品10至19)。根據(jù)制造商建議(用于新鮮或冷凍的動(dòng)物組織的QimntiGene 樣品樣品處理試劑盒；以及QuantiGene 2. O試劑系統(tǒng)用戶手冊(cè))將該樣品勻漿。以上文前面實(shí)施例所述方式制備7個(gè)靶轉(zhuǎn)錄本和一個(gè)看家基因轉(zhuǎn)錄本。該轉(zhuǎn)錄本的特征匯總?cè)缦卤? 乳腺癌轉(zhuǎn)錄本的特征
權(quán)利要求
1.一種分離的線粒體融合蛋白，該蛋白質(zhì)具有的氨基酸序列得自與線粒體DNA中的突變相應(yīng)的線粒體融合轉(zhuǎn)錄本的翻譯。
2.權(quán)利要求1的線粒體融合蛋白，其中所述融合蛋白具有SEQID NO =36-52,55,58, 61，64或67的任一個(gè)所述的氨基酸序列。
3.檢測哺乳動(dòng)物癌癥的方法，該方法包括分析哺乳動(dòng)物的組織樣品中至少一種線粒體融合蛋白的存在，該蛋白質(zhì)具有的氨基酸序列得自與線粒體DNA中的突變相應(yīng)的線粒體融合轉(zhuǎn)錄本的翻譯。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述癌癥選自前列腺癌，睪丸癌，卵巢癌，乳腺癌，結(jié)直腸癌，肺癌和黑素瘤皮膚癌。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述融合蛋白具有SEQID NO :36-52，55，58，61，64或67的任一種所述的氨基酸序列。
6.對(duì)權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)具有特異性的抗體或其抗原結(jié)合片段。
7.權(quán)利要求6的抗體，其中所述抗體是多克隆的或單克隆的。
8.權(quán)利要求3的方法，其中所述分析包括免疫分析。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述分析是用權(quán)利要求7所述抗體或抗原結(jié)合片段進(jìn)行的。
10.用于進(jìn)行檢測哺乳動(dòng)物中癌癥存在的分析法的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求 6的抗體或抗原結(jié)合片段。
11.一種分離的線粒體融合轉(zhuǎn)錄本，其具有SEQ ID NO :56，59，62或65所述的核酸序列。
12.編碼權(quán)利要求11的融合轉(zhuǎn)錄本的分離的mtDNA。
13.權(quán)利要求12的分離的mtDNA，其具有SEQID NO =57,60,63或66的任一個(gè)所述的序列。
14.一種雜交探針，其具有與權(quán)利要求9的線粒體融合轉(zhuǎn)錄本或者權(quán)利要求12或13的 mtDNA的至少一部分互補(bǔ)的核酸序列。
15.檢測哺乳動(dòng)物癌癥的方法，該方法包括通過使哺乳動(dòng)物的組織樣品與至少一種雜交探針雜交來分析該樣品中與癌癥有關(guān)的至少一種線粒體融合轉(zhuǎn)錄本的存在，所述雜交探針具有與權(quán)利要求11的線粒體融合轉(zhuǎn)錄本的至少一部分互補(bǔ)的核酸序列。
16.權(quán)利要求15的方法，其中該癌癥選自前列腺癌，睪丸癌，卵巢癌，乳腺癌，結(jié)直腸癌，肺癌和黑素瘤皮膚癌。
17.用于執(zhí)行檢測哺乳動(dòng)物中癌癥存在的分析法的試劑盒，所述試劑盒包括至少一種與權(quán)利要求11的融合轉(zhuǎn)錄本的至少一部分互補(bǔ)的雜交探針。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于預(yù)測、診斷和/或監(jiān)測癌癥的新線粒體融合轉(zhuǎn)錄本、突變的親本mtDNA分子以及得到的翻譯產(chǎn)物(蛋白質(zhì))。還提供了與其互補(bǔ)的用于本發(fā)明方法的雜交探針。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102388140SQ201080014122
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2010年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日
發(fā)明者丹尼爾·克萊因, 凱麗·魯濱遜, 加布里埃爾·達(dá)庫波, 安德魯·哈博特爾, 布賴恩·賴古伊, 珍妮弗·克里德, 瑞安·帕爾 申請(qǐng)人:米托米克斯公司