專利名稱：用于甘油三酯合成途徑的基于細(xì)胞的測定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
提供了一種同時(shí)檢測用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的脂肪酸孵育的細(xì)胞中脂類和磷脂酸酯中間體的方法。該方法可用于以高通量形式篩選調(diào)節(jié)甘油三酯生物合成的化合物。相關(guān)技術(shù)說明甘油三酯或三酰甘油是真核生物主要的轉(zhuǎn)運(yùn)源和能量貯存。甘油三酯從一個(gè)甘油分子和三個(gè)脂肪酸分子合成而來。每個(gè)脂肪酸分子通過酯鍵連接到甘油分子三個(gè)羥基中的每一個(gè)。像很多中性脂類一樣，甘油三酯含有各種鏈長的脂肪酸分子，通常長度為16、18或 20個(gè)碳。甘油三酯的兩種主要生物合成途徑是甘油-3-磷酸途徑(主要存在于肝臟和脂肪組織中)和單酰甘油途徑(主要存在于腸中)。肝臟中產(chǎn)生超過90%的甘油三酯的甘油-3-磷酸途徑如下所示
CH2OHCH2OOCRCH2OOCR
^HOH _Ι3^Τ ^ 0HOH _AGPAT , 0HOOCR. ιFA-CoAιFA-CoA_
CH2OPO3HCH2OPO3HCH2OPO3H
甘油-3-騎酸溶血磷脂酸4脂酸
PAPCH2OOCR 0HOOCR· CH2OH 二酰甘油
DGAT FA-CoA
ir
CH2OOCR CHOOCR' CH2OOCR" 三酰甘油其中FA-CoA是脂肪酸輔酶A，GPAT是甘油_3_磷酸?；D(zhuǎn)移酶，AGPAT是1_?；视?3-磷酸-O-酰基轉(zhuǎn)移酶，PAP是磷脂酸磷酸酶，DGAT是?；o酶A: 二?；视王；D(zhuǎn)移酶。甘油-3-磷酸的生物合成途徑的最后步驟可由DGATl或DGAT2催化(Cases等 1998，Proc Natl Acad Sci USA 95 13018 ;Cases 等 2001 J Biol Chem 276:38870)。雖然DGATl和DGAT2兩者均能將甘油二酯轉(zhuǎn)化成甘油三酯，但它們?cè)诤塑账峄虬被嵝蛄蟹矫鏇]有相似性。已有報(bào)道指出缺少DGATl的敲除小鼠(Dgatl+)肝臟沒有顯示明顯的甘油三酯代謝變化(Smith等2000，Nat Genet 25 :87)。此夕卜，缺少DGAT2 (Dgat2+)的敲除小鼠肝臟顯示甘油三酯的含量嚴(yán)重減少(Stone等2004，J Biol Chem 279:11767)。而且，研究
3已表明用反義寡核苷酸抑制DGAT2降低嚙齒類的肝臟甘油三酯含量(Choi等2007，J Biol Chem 沘2 :2洸78 ;Liu 等 2008，Biochim Biophy Acta 1781 :97)，并且逆轉(zhuǎn)大鼠中飲食誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性和胰島素抗性(Choi等2007，J Biol Chem 282 :22678) 0這些研究表明 DGATl和DGAT2在甘油三酯生物合成中功能不同。因此，特異性靶向DGATl或DGAT2可在有限毒性下提供調(diào)節(jié)甘油三酯益處。甘油三酯代謝的紊亂或失調(diào)與肥胖癥、代謝綜合征、II型糖尿病、非酒精性脂肪肝病和冠心病的發(fā)病機(jī)理及增加的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(Lewis等2002，Endocrine Reviews 23 :201 ； Malloy and Kane 2001,Adv Intern Med 47 :111)。因此，在甘油三酯生物合成途徑中調(diào)節(jié)酶活性的化合物，包括DGATl和DGAT2，可用作針對(duì)代謝疾病的潛在治療靶標(biāo)。放射性底物和薄層層析法已廣泛應(yīng)用于監(jiān)測甘油三酯合成(Stone等2004，J Biol Chem 279 :11767 ；Zhu 等 2002，Atherosclerosis 164 :221)。Stone 等在原代肝細(xì)胞中用 3H-甘油標(biāo)記甘油三酯，并用薄層層析法和放射成像分析檢測放射性同位素標(biāo)記的甘油三酯(Stone等2004，J Biol Chem 279 :11767)。同樣地，Zhu等在人肝癌細(xì)胞中用3H-油酸標(biāo)記甘油三酯，并用薄層層析法檢測標(biāo)記的甘油三酯(Zhu等2002，AtherOSClerOSiS 164 221)。最近，Magkos等用質(zhì)譜技術(shù)檢測中性脂類(Magkos等2007，J Lipid Research 48 :1204)。Magkos等在體內(nèi)給予1，1，2，3，3- -甘油和2，2- -棕櫚酸酯，并通過氯仿/ 甲醇和超速離心從血漿中提取極低密度脂蛋白甘油三脂。Magkos等用氣相層析-質(zhì)譜系統(tǒng)檢測從甘油三酯釋放的標(biāo)記的甘油和甲基化棕櫚酸酯(Magkos等2007，J Lipid Research 48 :1204)。Magkos等未檢測完整的甘油三酯(如特定的甘油三酯分子)，也未檢測甘油三酯途徑中的不同中間體。據(jù)申請(qǐng)人所知，現(xiàn)有測定法不監(jiān)測或檢測在甘油三酯生物合成期間生成的包括溶血磷脂酸、磷脂酸和二?；视驮趦?nèi)的中間體。此外，現(xiàn)有測定法需要額外的提取程序以及繁瑣的檢測技術(shù)。另外，這些方法的通量有限并難以適用于篩選大量化合物的高通量形式。 因此，仍需要開發(fā)一種以高通量形式分析甘油三酯生物合成和鑒定調(diào)節(jié)甘油三酯途徑的化合物的方法。發(fā)明概述本申請(qǐng)的一個(gè)目標(biāo)是提供一種用于鑒定抑制?；o酶A 二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶 (DGAT)活性的化合物的方法。該方法包括如下步驟在化合物存在或不存在情況下，使穩(wěn)定同位素標(biāo)記的脂肪酸與細(xì)胞接觸，用異丙醇提取細(xì)胞，在化合物存在的情況下測定穩(wěn)定同位素標(biāo)記的甘油三酯的水平，以及在化合物不存在的情況下測定穩(wěn)定同位素標(biāo)記的甘油三酯的水平；其中所述穩(wěn)定同位素標(biāo)記的甘油三酯的水平變化表明所述化合物抑制DGAT 活性。本申請(qǐng)的另一個(gè)目標(biāo)是提供一種測定參與甘油三酯合成的酶活性的方法。該方法包括如下步驟使穩(wěn)定同位素標(biāo)記的脂肪酸分子與細(xì)胞接觸，用異丙醇提取細(xì)胞，并檢測穩(wěn)定同位素標(biāo)記的溶血磷脂酸、磷脂酸、二酰甘油或甘油三酯的存在情況。依據(jù)本申請(qǐng)，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的脂肪酸可為13C18-油酸。此外，依據(jù)本申請(qǐng)，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的甘油三酯可通過液相層析-質(zhì)譜分光光度計(jì)系統(tǒng)檢測。根據(jù)下文詳述并結(jié)合附圖，本發(fā)明的其他目標(biāo)和特征將顯而易見。然而，應(yīng)理解的是，附圖的設(shè)計(jì)僅為說明的目的而非作為限定限制本發(fā)明，為此，應(yīng)參考所附權(quán)利要求。還應(yīng)理解的是，附圖不一定是按比例繪制的，除非另有說明，附圖僅意在概念上說明本文描述的結(jié)構(gòu)和步驟。附圖簡述

圖1具有3個(gè)油?；?13C18側(cè)鏈的13C標(biāo)記的三油酸甘油酯的提取的離子層析圖， 顯示在0分鐘(A)、30分鐘⑶、60分鐘(C)、120分鐘⑶和180分鐘(E)時(shí)FU5AH細(xì)胞中游離的13C18-油酸全部摻入甘油三酯。圖2使用LC-MS陽離子和陰離子切換同時(shí)監(jiān)測三油酸甘油酯合成的中間體和最終產(chǎn)物㈧油?；苎字狨ァⅱ菃?油酰基甘油、(C) 二油?；字狨ァⅱ嵌王；视秃?E)三油?；视?。圖3 DGATl和DGAT2抑制劑對(duì)HUH7肝細(xì)胞中新合成的具有三個(gè)油?；?13C18鏈的三油酸甘油酯的作用的評(píng)價(jià)。圖4 DGATl抑制劑對(duì)3T3-L1分化的脂肪細(xì)胞中新合成的具有三個(gè)油?；梗?鏈的三油酸甘油酯的作用的評(píng)價(jià)。圖5 HUH7肝細(xì)胞中DGATl抑制時(shí)具有2個(gè)油?；?13C18鏈的甘油二酯的瞬時(shí)增加。圖6 DGAT2抑制劑對(duì)MCF7細(xì)胞中新合成的具有三個(gè)油酰基」％8鏈的三油酸甘油酯的作用的評(píng)價(jià)。圖7在與油-1Vw酸培養(yǎng)60分鐘后的FU5AH細(xì)胞中，同時(shí)檢測具有1、2和3個(gè)油酰基-13Cw側(cè)鏈的三油酸甘油酯㈧在m/z 903.0檢測內(nèi)源性三油酸甘油酯，⑶在m/z 921. 0檢測13C18-三油酸甘油酯，(C)在m/z 939. 0檢測13C36-三油酸甘油酯和(D)在m/z 957. 0檢測13C54-三油酸甘油酯。圖8在用或不用13C18-油酸孵育120分鐘的THP-I單核細(xì)胞中，同時(shí)檢測具有1、 2和3個(gè)油?；?13C18側(cè)鏈的三油酸甘油酯㈧13C18-油酸不存在下，在m/z 921. 0未檢測到13C18-三油酸甘油酯、⑶13C18-油酸存在下，觀察到13C18-三油酸甘油酯、(C)13C18-油酸不存在下，在m/z 939. 0未檢測到"C36-油酸、(D) 13C18-油酸存在下，觀察到13C36-三油酸甘油酯、(E) 13C18-油酸不存在下，在m/z 957. 0未檢測到13C54-三油酸甘油酯和(F) 13C18-油酸存在下，觀察到"C54-三油酸甘油酯。優(yōu)選實(shí)施方案詳述本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N克服用于分析甘油三酯合成的現(xiàn)有測定法限制的方法。本文所描述的方法在反應(yīng)混合物中使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的脂肪酸，使得反應(yīng)混合物包含細(xì)胞、生長培養(yǎng)基和穩(wěn)定同位素標(biāo)記的脂肪酸。本文所描述的方法還可用于篩選調(diào)節(jié)參與甘油三酯合成的酶的化合物。為篩選目的，反應(yīng)混合物還可以包括參與甘油三酯的酶的調(diào)節(jié)劑，如甘油-3-磷酸途徑中的DGAT。任何原核和真核細(xì)胞可用于本發(fā)明。優(yōu)選為脂肪細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、癌細(xì)胞或白血病細(xì)胞，例如 3T3-L1、HUH7、FU5AH、THP-U H印G2、C3HT101/2、McA_RH7777、MCF7、A549 和 RA擬64. 7。細(xì)胞可通過市售來源獲得或通過公知方法分離。例如，分離肝細(xì)胞的方法可參見 Berry 和 Friend，1969，J Cell Biol 43 :506，分離脂肪細(xì)胞的方法可參見 Green 等 1990， J Biol Chem 265 :5206。白細(xì)胞可分離自取自個(gè)體的生物樣品，例如任何體液或組織樣品。任何體液包括但不限于血清、血漿、淋巴、囊液(cystic fluid)、尿、糞便、腦脊液(csf)和腹水。合適的組織樣品包括全血、精液、唾液、眼淚、尿、糞便材料、汗液、頰膜涂片、皮膚、特定器官組織例如肌肉或神經(jīng)組織的活檢和毛發(fā)。生物樣品中甘油-3-磷酸途徑活性的分析可用作監(jiān)測患者對(duì)用于代謝疾病藥物治療的應(yīng)答的生物標(biāo)記物?？蓪⒓?xì)胞保持于常規(guī)的生長培養(yǎng)基，如Dulbecco改進(jìn)的fegle培養(yǎng)基、極限必需培養(yǎng)基、RPMI等。有些細(xì)胞可在分析之前被誘導(dǎo)或分化。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到需要合適的培養(yǎng)基和條件來保持和/或誘導(dǎo)特定細(xì)胞系。例如3T3-L1前脂肪細(xì)胞可保持在Dulbecco 改進(jìn)的fegle培養(yǎng)基，并在誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下變成成熟的脂肪細(xì)胞。用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的任何脂肪酸分子可用于本文所描述的方法。本文所用術(shù)語 “穩(wěn)定同位素”通常意指不具放射性的同位素分子，包括1V或咕。穩(wěn)定同位素標(biāo)記的脂肪酸可自制合成或通過市售獲得。優(yōu)選的脂肪酸分子包含Cltl-C2tl的鏈長度，例如單去飽和C16 和ci8。脂肪酸分子可通過1V或2H —致或部分標(biāo)記；例如，一致標(biāo)記的13c-14:0、"c-16:1、 13C-16 0、13C-18 2、13C-18 1 和 13C-18 0、2H29_16 1、2H31_16 0、2H33_18 U2H35-18 0 或質(zhì)量漂移(mass shift)至少4amu的部分標(biāo)記的2H。在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記的分子為13C18-油酸。穩(wěn)定同位素標(biāo)記的脂肪酸可摻入生成新合成中間體或穩(wěn)定同位素標(biāo)記產(chǎn)物的途徑的每 “■步 ο反應(yīng)混合物還可以包括多種其他試劑。這些試劑包括可用來促進(jìn)酶活性的如鹽、 緩沖劑、中性蛋白(例如白蛋白)、去污劑等試劑。這類試劑也可降低反應(yīng)組分的非特異性或背景相互作用。也可用其他提高測定效率的試劑如抑制劑、抗微生物劑等。在用于分析甘油三酯生物合成的方法開始之前，通過用活性炭-處理的血清或無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，耗盡內(nèi)源性脂肪酸。接著，將穩(wěn)定同位素標(biāo)記的脂肪酸例如"C18-油酸加入反應(yīng)物中。然后用磷酸緩沖鹽水洗滌細(xì)胞并用異丙醇提取脂類分子。還可用其他溶劑系統(tǒng)包括己烷、氯仿、庚烷、丙酮、二甲基亞砜和丁醇提取脂類分子?？赏ㄟ^任何適用于檢測同位素存在情況或測定同位素分子分子量的方法來檢測新合成的標(biāo)記的脂類中間體或產(chǎn)物。例如，可用薄層層析和質(zhì)譜。在一個(gè)實(shí)施方案中，液相層析-質(zhì)譜(LC-MQ系統(tǒng)用來檢測和定量含有穩(wěn)定同位素標(biāo)記的酰基鏈的新合成脂類分子。此外，可同時(shí)檢測多種標(biāo)記的脂類分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，修改質(zhì)譜系統(tǒng)用于同時(shí)分析多種中性脂類，包括甘油-3-磷酸途徑中的單、二和三-酰甘油和磷脂酸酯中間體。修改包括在質(zhì)譜系統(tǒng)中無需柱前衍生化以正負(fù)切換電噴霧離子化的運(yùn)行。同時(shí)檢測多種脂類也可在一次分析運(yùn)行中完成?！z測到標(biāo)記的脂類分子，可通過標(biāo)準(zhǔn)化濃度方法測定它們的近似水平。作為實(shí)例，標(biāo)準(zhǔn)化濃度通過1，3_ 二棕櫚酰-2-硬脂酰-甘油-d5(PSP_d5)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)確定。獲得樣品中三油酸甘油酯或新合成的脂類分子對(duì)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的相對(duì)響應(yīng)并用于定量。本文發(fā)現(xiàn)約 μΜ 的PSP-d5異丙醇溶液可直接用于提取脂類分子。此外，m/z 858. 0的PSP_d5銨加合離子可用于離子提取和整合(integration)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過其他常用的方法確定所檢測分子的特定水平。為評(píng)價(jià)一種化合物是否能夠調(diào)節(jié)甘油三酯合成，將該化合物加入到含穩(wěn)定同位素標(biāo)記的脂肪酸、生長培養(yǎng)基和細(xì)胞的反應(yīng)化合物中。將反應(yīng)物孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，例如約10 分鐘至約24小時(shí)。用異丙醇從反應(yīng)物提取脂類分子并用LC-MS系統(tǒng)分析。當(dāng)含有化合物的反應(yīng)中標(biāo)記的甘油三酯水平與不含化合物的反應(yīng)中標(biāo)記的甘油三酯水平有顯著差異時(shí)， 該化合物可能調(diào)節(jié)參與甘油三酯合成的酶。本文所用術(shù)語“顯著差異”意指該差異使本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為甘油三酯合成被調(diào)節(jié)。標(biāo)記甘油三酯水平的差異可為至少10%，優(yōu)選至少 25%。盡管化合物通常為有機(jī)化合物，但化合物涵蓋眾多化學(xué)種類。此外，化合物包含與多肽結(jié)構(gòu)上相互作用所需的化學(xué)官能團(tuán)，且通常包括至少胺基、羰基、羥基或羧基，優(yōu)選至少兩種化學(xué)官能團(tuán)，且更優(yōu)選至少三種化學(xué)官能團(tuán)。化合物可包含由一個(gè)或多個(gè)上述官能團(tuán)取代的碳環(huán)結(jié)構(gòu)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳族結(jié)構(gòu)或多芳族結(jié)構(gòu)?；衔镆部蔀樯锓肿永珉?、糖類、脂肪酸、固醇、類異戊二烯、嘌呤、嘧啶、上述物質(zhì)的衍生物或結(jié)構(gòu)類似物、或其組合等。當(dāng)化合物為核酸時(shí)，盡管還考慮具有非天然鍵或亞基的經(jīng)修飾的核酸，但化合物通常為DNA或RNA分子?；衔锟色@自多種來源，包括合成或天然化合物文庫。例如可用眾多手段隨機(jī)和直接合成多種有機(jī)化合物和生物分子，包括隨機(jī)化寡核苷酸的表達(dá)、合成的有機(jī)組合文庫、隨機(jī)肽的噬菌體展示文庫等。也可使用本領(lǐng)域已知的組合文庫法中眾多手段中的任一種獲得化合物，包括生物文庫、空間可尋址的平行固相或溶液相文庫、需要去褶合 (deconvolution)的合成文庫法、“一珠一化合物”文庫法以及用親和層析選擇的合成文庫法(Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12 :145)?；蛘?，也可獲得或容易產(chǎn)生細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物文庫。此外，可通過常規(guī)化學(xué)的、物理的和生化手段容易地修飾天然和合成產(chǎn)生的文庫和化合物。此外，已知的藥理學(xué)藥劑可經(jīng)過定向或隨機(jī)的化學(xué)修飾如?；?、烷基化、酯化、酰胺化等，從而產(chǎn)生這些藥劑的結(jié)構(gòu)類似物?；衔锟呻S機(jī)選擇或可基于結(jié)合到和/或調(diào)節(jié) DGAT活性的現(xiàn)有化合物選擇。因此，候選藥劑的來源為基于已知DGAT調(diào)節(jié)劑的分子文庫， 其中在分子的一個(gè)或多個(gè)位置將化合物結(jié)構(gòu)改變?yōu)榘嗷蚋倩瘜W(xué)部分或不同化學(xué)部分。在創(chuàng)建類似物激活劑/抑制劑文庫中對(duì)分子所作的結(jié)構(gòu)改變可定向、隨機(jī)或定向與隨機(jī)兩者結(jié)合的取代和/或添加。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在制備組合文庫中能容易地制備基于現(xiàn)有DGAT調(diào)節(jié)劑的這樣的文庫。本文所用術(shù)語“調(diào)節(jié)劑”、“調(diào)節(jié)”等意指增加或降低酶活性的化合物。當(dāng)在化合物存在下，酶活性降低時(shí)，該化合物被稱為抑制劑。當(dāng)在化合物存在下，酶活性升高時(shí)，該化合物被稱為激活劑。作為實(shí)例，使用本文所述方法評(píng)價(jià)DGAT調(diào)節(jié)劑化合物1和2對(duì)甘油三酯合成的作用。W02008148868和W02004069809公開了化合物1和2，均通過引用以其整體結(jié)合到本文中?；衔?即DGAT 1抑制劑是N-[2，6-二氯-4-(吡咯烷-1-基甲基)苯基]-4-{[(4-甲氧基苯基)乙?；鵠氨基}苯基)哌嗪-1-甲酰氨?；衔?分子量為596. 55且結(jié)構(gòu)為
化合物2即DGAT 2抑制劑是1_[環(huán)己基(3，4_ 二氯苯基)甲基]_2_硫代_2， 3- 二氫-IH-咪唑_4，5- 二甲酸二甲酯?；衔?分子量為457. 38且結(jié)構(gòu)為當(dāng)LC-MS系統(tǒng)用于檢測標(biāo)記的甘油三酯分子時(shí)，需要合適的溶液用于從反應(yīng)混合物中提取脂類分子。一些有機(jī)溶劑例如己烷、氯仿/甲醇、DMSO等可能與反相LC-MS檢測系統(tǒng)不相容。因此，當(dāng)己烷、氯仿/甲醇、DMSO等用于提取時(shí)，需要額外的步驟來去除有機(jī)溶劑，并在用LC-MS系統(tǒng)檢測之前，用相容的溶劑系統(tǒng)重構(gòu)提取的反應(yīng)混合物。本文發(fā)現(xiàn)異丙醇的使用是與LC-MS系統(tǒng)相容的；因此它不需要額外的步驟便可用于提取和遞送脂類分子。一步提取提高了效率而且使高通量形式得以實(shí)現(xiàn)，這是用于篩選大量化合物和鑒定調(diào)節(jié)甘油三酯合成的化合物所需要的。術(shù)語“高通量”意指能同時(shí)簡易篩選多個(gè)樣品并具有機(jī)器操作能力的測定設(shè)計(jì)。高通量測定的另一個(gè)所需特征是經(jīng)過優(yōu)化以降低試劑使用或使操作數(shù)最少從而實(shí)現(xiàn)所需分析的測定設(shè)計(jì)。測定形式的實(shí)例包括96-孔板或384-孔板、漂浮小滴和用于液態(tài)處理實(shí)驗(yàn)的〃芯片實(shí)驗(yàn)室(lab on a chip)"微通道芯片。本領(lǐng)域熟知的是，隨著塑料模具的微型化和液態(tài)處理設(shè)備的改進(jìn)，或隨著設(shè)計(jì)的測定設(shè)備的改進(jìn)，可使用本發(fā)明的設(shè)計(jì)處理更大量的樣品。在一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)胞在含有多個(gè)孔的微量滴定板(例如96-孔板或384-孔板)中培養(yǎng)并分析。將板裝入檢測系統(tǒng)例如LC-MS等，該系統(tǒng)讀取每個(gè)板的每個(gè)孔的反應(yīng)從而生成數(shù)值數(shù)據(jù)。本文所描述的方法也可用于評(píng)價(jià)參與甘油三酯合成的酶的細(xì)胞活性， 包括DGAT、GPAT、AGPAT和PAP。該方法也可用于以高通量形式篩選甘油三酯生物合成中調(diào)節(jié)酶活性的化合物。此外，本申請(qǐng)的方法可用作確定人受試者分離的細(xì)胞中甘油三酯合成的代謝活性的診斷性測定。實(shí)施例1.細(xì)胞系制備將3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞保持在含有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco改進(jìn)的 fegle培養(yǎng)基(DMEM)中。將細(xì)胞接種在96-孔板中。匯合后兩天，將培養(yǎng)基更換為含有 IBMX、胰島素和地塞米松的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Adipolysis kit,Cayman Chemical Company)。誘導(dǎo)三天之后，培養(yǎng)基更換為姨島素培養(yǎng)基(Adipolysis kit, Cayman Chemical Company)。 誘導(dǎo)5天后，培養(yǎng)基用新鮮的胰島素培養(yǎng)基替換兩天。將人肝癌細(xì)胞系HUH7保持在含有 10% FBS,4. 5g/L D-葡萄糖的DMEM中。大鼠肝癌細(xì)胞系FU5AH保持在含5% FBS的極限必需培養(yǎng)基fegle(MEM)中。將肝癌細(xì)胞鋪到96孔板并在80%匯合時(shí)使用。將人乳腺癌細(xì)胞系MCF7細(xì)胞保持在含有10%FBS、4. 5g/L D-葡萄糖的DMEM中。將人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-I保持在含10% FBS的RPMI培養(yǎng)基中并以切IO5細(xì)胞/ml使用。實(shí)施例2.穩(wěn)定同位素標(biāo)記甘油三酯合成途徑
在5% (X)2和37°C條件下用含10%活性炭處理的FBS(Gibco)的DMEM過夜孵育 HUH7細(xì)胞或分化的3T3-L1細(xì)胞。在5% (X)2和37°C條件下用含5%活性炭處理的FBS的 MEM過夜孵育FU5AH細(xì)胞。在5% CO2和37°C條件下，將與0. 5%無脂肪酸的BSA(SIGMA)預(yù)混合(precomplex)的約 100 μ 1 300 μ M13C18-油酸(SIGMA)加入細(xì)胞懸液中 0、30、60、120 和180分鐘。然后將細(xì)胞用磷酸緩沖鹽水洗滌一次并用100 μ 1異丙醇提取。在室溫下孵育10分鐘后，將提取物轉(zhuǎn)移到小玻璃瓶并用LC-MS系統(tǒng)檢測標(biāo)記的脂類分子。LC-MS 檢測通過 Z-噴霧電噴射離子源(ESI)用 Micromass triple-quadrupole Quattro Micro 質(zhì)譜分光光度計(jì)(Waters，Milford，MA)接口連接的 Agilent 1100 Liquid Chromatographic system (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)。代謝產(chǎn)物的分離在 Eclipse XDB-C5柱(2. Ix 50mm，粒度=3. 5um)上進(jìn)行。流動(dòng)相Α、含50mM甲酸銨的異丙醇-水(3 7)，和流動(dòng)相B、含IOmM甲酸銨的異丙醇-水(9 1)用于如下的梯度洗脫 20-100%流動(dòng)相B lmin，保持100%流動(dòng)相B 4min，返回到20%流動(dòng)相B 0. lmin，然后運(yùn)行時(shí)間后4. 5min。流速為0. 5ml/min。以0. 25ml/min的流速用1 2裂縫(split)將所得 LC洗脫液引入到質(zhì)譜儀。質(zhì)譜儀以陽離子和陰離子切換模式運(yùn)行。氮?dú)庥米鲊婌F氣體、去溶劑化氣體和錐孔簾氣(cone curtain gas)。MS系統(tǒng)的源參數(shù)為毛細(xì)管電壓，3. IkV ；錐孔電壓，20V (ESI+)和15V (ESF)；提取錐孔電壓(extractor)，2V ；RF透鏡電壓，0. IV ；源溫度， 1200C ；去溶劑化溫度，300°C ；LM1、HM1、LM2或HM2分辨率15;離子能1、1.0;入口和出口 ； 15。MassLynx軟件4. 1版本用于系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)處理。在FU5AH細(xì)胞中，13C18-油酸摻入到甘油_3_磷酸途徑通過13C18-三油酸甘油酯的存在情況來確定(圖1)。通過比較在30分鐘、60分鐘、120分鐘和180分鐘時(shí)曲線下面積，13C18-三油酸甘油酯的水平隨著孵育時(shí)間增加(圖1)。此外，本文新開發(fā)了一種使用陽離子和陰離子切換用于同時(shí)檢測油?；苎字狨ァ?-單-油酰基甘油、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷脂酸酯、1，2- 二油酰基-sn-甘油中間體以及三油?；?sn-甘油最終產(chǎn)物的LC-MS法(圖2)。這表明穩(wěn)定同位素標(biāo)記結(jié)合LC-MS系統(tǒng)檢測可用于同時(shí)檢測細(xì)胞中甘油三酯生物合成的多個(gè)步驟。實(shí)施例3.評(píng)價(jià)調(diào)節(jié)DGAT活性的化合物為評(píng)價(jià)調(diào)節(jié)DGATl或DGAT2活性的化合物，在37°C下將HUH7或3T3-L1細(xì)胞在 100μ 1含0. 05% DMSO的無血清培養(yǎng)基中用約0、0. 03,0. 1,0. 3、1、3或10 μ M化合物1或 2預(yù)孵育約10分鐘。對(duì)照為在37°C下在不存在任何化合物的情況下用100μ 1含0. 05% DMSO的無血清培養(yǎng)基孵育約10分鐘的細(xì)胞。將與1. 0%無脂肪酸的BSA預(yù)混合的約100 μ 1 600 μ M13C18-油酸加入細(xì)胞懸液中。在37°C下孵育約90分鐘后，按實(shí)施例2所描述的提取并檢測細(xì)胞。圖3-6顯示化合物1和2對(duì)甘油三酯生物合成的作用。在化合物1存在的情況下， HUH7和分化的3T3-L1細(xì)胞系具有降低的新合成的13C18-三油酸甘油酯水平。在HUH7細(xì)胞系中，用10μΜ化合物1孵育的細(xì)胞中"C18-三油酸甘油酯的水平約為對(duì)照水平的30%，而用10 μ M化合物2孵育的細(xì)胞中13C18-三油酸甘油酯的水平約為對(duì)照水平的75% (圖3)。 此外，在用化合物1孵育的HUH7細(xì)胞中檢測到13C18-油?；?甘油二酯的瞬時(shí)增加(圖5)。 這些結(jié)果表明HUH7細(xì)胞具有將13C18- 二油酸甘油酯轉(zhuǎn)化為13C18-三油酸甘油酯的功能性 DGATl 禾口 DGAT2 酶。
在分化的3T3-L1細(xì)胞系中，用約10 μ M化合物1孵育的細(xì)胞中13C18-三油酸甘油酯的水平約為對(duì)照水平的33% (圖4)。該結(jié)果表明在分化的3T3-L1細(xì)胞中，大部分13C18-三油酸甘油酯是通過DGATl合成的。然后，評(píng)價(jià)化合物2在MCF7細(xì)胞中的作用。將MCF7細(xì)胞接種到96-孔培養(yǎng)板中的含有10% FBS,4. 5g/L D-葡萄糖的DMEM中培養(yǎng)M小時(shí)。將匯合或接近匯合的細(xì)胞用約 150μ 1含0. 15%無脂肪酸BSA的無血清DMEM孵育1小時(shí)。接著將含3 % DMSO的DMEM中的約3 μ 1化合物2加至終濃度為約0、0. 1、0. 3、1、3、10 μ Μ。在37°C下孵育15分鐘后，將板排干。然后在37°C下將細(xì)胞用150μ1與0. 15%無脂肪酸的BSA預(yù)混合的ΙΟΟμΜ 13C18-油酸和約3 μ 1含3% DMSO的DMEM中的化合物2孵育約3小時(shí)。細(xì)胞用約100 μ 1異丙醇提取， 接著進(jìn)行如上所述的LC-MS檢測。如圖6所示，用化合物2孵育的細(xì)胞中"C18-三油酸甘油酯的水平約為對(duì)照水平的80%。該結(jié)果表明在此處所用的MCF7細(xì)胞中，大部分的13C18-三油酸甘油酯是通過DGAT2合成的。由于具有三個(gè)標(biāo)記的脂肪酸鏈的"C18-三油酸甘油酯的生成涉及甘油-3-磷酸途徑中的其他酶，因此進(jìn)行了額外的實(shí)驗(yàn)來檢測標(biāo)記的中間體的存在情況。將FU5AH細(xì)胞用 13C18-油酸孵育60分鐘，并用實(shí)施例2所描述的同時(shí)檢測進(jìn)行分析。如圖7所示，具有1、 2和3個(gè)13C18-油?；鶄?cè)鏈的三油酸甘油酯呈現(xiàn)為標(biāo)記分子，其分子量分別為m/z 921. 0、 939. 0 和 957. 0。實(shí)施例3的結(jié)果表明分化的脂肪細(xì)胞和HUH7細(xì)胞可用于篩選調(diào)節(jié)DGATl活性的化合物。在另一方面，MCF7細(xì)胞可用于篩選調(diào)節(jié)DGAT2活性的化合物。此外，MCF7、脂肪細(xì)胞和肝癌細(xì)胞可用于篩選調(diào)節(jié)其它酶的化合物，這些酶包括GPAT、AGPAT或PAP，其均參與甘油三酯生物合成例如甘油-3-磷酸途徑。實(shí)施例4.檢測白細(xì)胞中的甘油三酯生物合成為檢查白細(xì)胞是否存在甘油三酯生物合成，將THP-I細(xì)胞與無血清RPMI孵育并在37°C下孵育2小時(shí)。將約200，000個(gè)細(xì)胞在500Xg下離心5分鐘。將約300 μ 1與含 0. 5%無脂肪酸BSA(SIGM)的RPMI預(yù)混合的300 μ M13C18-油酸(SIGMA)加入細(xì)胞沉淀中。 在37°C下將細(xì)胞與標(biāo)記的分子孵育2小時(shí)，如上所述用異丙醇提取細(xì)胞。如圖8所示，在用標(biāo)記的油酸培養(yǎng)的THP-I細(xì)胞中檢測到新合成的13C18-三油酸甘油酯，而未用標(biāo)記的油酸培養(yǎng)的對(duì)照細(xì)胞沒有檢測到新合成的13C18-三油酸甘油酯。當(dāng)用 13C18-油酸培養(yǎng)THP-I細(xì)胞約120分鐘時(shí)，作為標(biāo)記分子檢測帶有1或2個(gè)13C18-油酰基側(cè)鏈的三油酸甘油酯，其分子量分別為m/z 921. 0和939. 0。檢測到部分標(biāo)記的三油酸甘油酯表明本申請(qǐng)的方法可用來檢測AGPAT、PAP或 DGAT的細(xì)胞活性。此外，本文所述方法可用來檢測分離細(xì)胞中新合成的甘油三酯，因此可用作確定甘油三酯生物合成代謝活性的診斷測定。本部分引用的所有參考文獻(xiàn)均通過引用以其整體結(jié)合到本文中。因此，雖然已顯示、描述并指出如應(yīng)用于本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中的基本的新特征， 但應(yīng)理解的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)所闡述的設(shè)備及其操作做出形式上和細(xì)節(jié)上的各種省略、替換和改變，而不違背本發(fā)明的精神。例如，意在很清楚地表明所有那些以基本同樣的方式執(zhí)行基本相同的功能以達(dá)到相同結(jié)果的要素和/或方法步驟的組合，都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，應(yīng)意識(shí)到，與本發(fā)明公開的任何形式或?qū)嵤┓桨赶嚓P(guān)的所顯示和/或描述的結(jié)構(gòu)和/或元素和/或方法步驟可作為一種設(shè)計(jì)選擇的一般情況摻入任何其它公開的或描述的或暗示的形式或?qū)嵤┓桨?。因此，意在僅受限于所附權(quán)利要求所表明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于鑒定抑制?；o酶A: 二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)活性的化合物的方法，其包括如下步驟a.在所述化合物存在和不存在的情況下，使穩(wěn)定同位素標(biāo)記的脂肪酸與細(xì)胞接觸；b.用異丙醇提取所述細(xì)胞；c.在所述化合物存在的情況下，測定穩(wěn)定同位素標(biāo)記的甘油三酯水平；和d.在所述化合物不存在的情況下，測定穩(wěn)定同位素標(biāo)記的甘油三酯水平； 由此，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的甘油三酯水平的變化表明所述化合物抑制DGAT活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述穩(wěn)定同位素為13C。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述穩(wěn)定同位素標(biāo)記的脂肪酸為13C18-油酸。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述穩(wěn)定同位素標(biāo)記的甘油三酯通過液相層析-質(zhì)譜分光光度計(jì)系統(tǒng)檢測。
5.一種測定參與甘油三酯合成的酶的活性的方法，其包括如下步驟a.使穩(wěn)定同位素標(biāo)記的脂肪酸與細(xì)胞接觸；b.用異丙醇提取所述細(xì)胞；和c.檢測穩(wěn)定同位素標(biāo)記的溶血磷脂酸、磷脂酸或二?；视突蚋视腿サ拇嬖谇闆r。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述酶為酰基輔酶A:二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述酶為甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述酶為1-?；视?3-磷酸-0-?；D(zhuǎn)移酶(AGPAT)。
9.權(quán)利要求5的方法，其中所述酶為磷脂酸磷酸酶(PAP)。
10.權(quán)利要求5的方法，其中所述穩(wěn)定同位素為"C。
11.權(quán)利要求5的方法，其中所述穩(wěn)定同位素標(biāo)記的脂肪酸為13C18-油酸。
全文摘要
一種用于鑒定調(diào)節(jié)酰基輔酶A二?；视王；D(zhuǎn)移酶活性的化合物的方法，包括如下步驟在該化合物存在或不存在的情況下，使穩(wěn)定同位素標(biāo)記的脂肪酸與細(xì)胞接觸，用異丙醇提取細(xì)胞，并在該化合物存在或不存在的情況下測定穩(wěn)定同位素標(biāo)記的甘油三酯的水平；其中所述穩(wěn)定同位素標(biāo)記的甘油三酯的水平變化表明所述化合物調(diào)節(jié)DGAT活性。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102378816SQ201080015824
公開日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2010年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月4日
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