專利名稱：高流通量分子轉(zhuǎn)子黏度測定法測定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本組合物和方法涉及實時測定懸液中黏度變化的速率。該組合物和方法具有廣泛的應(yīng)用，包括測量淀粉酶介導(dǎo)的淀粉懸液的液化。
背景技術(shù)：
旋轉(zhuǎn)黏度計是實驗室中用于評估a-淀粉酶的淀粉液化性能的標(biāo)準(zhǔn)工具。但是，獲得旋轉(zhuǎn)黏度計數(shù)據(jù)的過程緩慢，且需要大量的酶，使得旋轉(zhuǎn)黏度計測定不適于用作エ業(yè) 蛋白質(zhì)工程的主要篩選方法。備選的直接測量黏度變化的小規(guī)模測定常給出錯誤或不可預(yù)測的結(jié)果，也使得它們不適于用作主要篩選方法。因此，存在對更方便、更準(zhǔn)確和更可重復(fù)的黏度測定的需要。
發(fā)明概述所描述的是用于實時測定懸液黏度變化的高流通量分子轉(zhuǎn)子(molecular rotor)黏度測定法測定。該方法一般涉及將分子轉(zhuǎn)子加至包含能夠轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的底物的懸液，其中底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化改變了懸液的黏度；將酶或化學(xué)催化劑加至懸液以起始底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；和測量分子轉(zhuǎn)子的熒光(RFU);其中可以使分子轉(zhuǎn)子的熒光變化與懸液的黏度變化相關(guān)。此黏度變化可以進(jìn)一歩用于測定黏度變化的速率、底物向產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的速率、轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的底物的量等。在一方面，提供用于實時測定懸液黏度變化的方法，其包括向包含底物的懸液加入分子轉(zhuǎn)子分子，和能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶或化學(xué)催化劑，該底物能夠轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，該分子轉(zhuǎn)子分子的熒光量子產(chǎn)率依賴于懸液自由體積；和實時測量懸液中分子轉(zhuǎn)子分子的熒光；其中底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化改變了通過測量分子轉(zhuǎn)子分子的熒光測定的懸液自由體積，且其中懸液自由體積的變化與溶液黏度的變化相關(guān)。在一些實施方案中，用懸液黏度的變化來測定底物向產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的速率。在ー些實施方案中，用懸液黏度的變化來測定轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的底物的量。在一些實施方案中，該懸液是淀粉懸液。在一些實施方案中，該懸液是玉米支鏈淀粉懸液。在其他實施方案中，該懸液是纖維素懸液，或混合的淀粉和纖維素懸液。在一些實施方案中，該酶是糖類加工酶。在一些實施方案中，該酶是淀粉酶、葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶或其組合。在具體實施方案中，該酶是淀粉酶。在一些實施方案中，底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化是淀粉酶介導(dǎo)的產(chǎn)生低分子量葡聚糖的淀粉懸液的液化。在一些實施方案中，該分子轉(zhuǎn)子分子是9-(2-羧基-2-氰基こ烯基)-久洛尼定(CCVJ)。
在一些實施方案中，以多孔形式進(jìn)行該方法。在具體實施方案中，以6孔、12孔、24孔或96孔形式進(jìn)行該方法。組合物和方法的這些和其他方面及實施方案將由于描述和附圖
而顯而易見。
附圖簡述圖I顯示淀粉水解反應(yīng)中分子轉(zhuǎn)子熒光(RFU)的減少作為時間(秒)的函數(shù)的曲線。突光減少與淀粉水解引起的懸液黏度減小相關(guān)。圖2顯示用常規(guī)旋轉(zhuǎn)黏度計測定獲得的峰值黏度數(shù)據(jù)，其確認(rèn)了用分子轉(zhuǎn)子黏度 測定法測定獲得的結(jié)果。
發(fā)明詳述
I.定義在詳細(xì)描述本組合物和方法之前，為了清楚而定義以下術(shù)語和短語。應(yīng)賦予未定義的術(shù)語和短語它們在本領(lǐng)域中使用的普通含義。本文中使用的“分子轉(zhuǎn)子分子”或簡單的“分子轉(zhuǎn)子”是熒光化學(xué)實體，其熒光量子產(chǎn)率(即發(fā)射的光子數(shù)除以吸收的光子數(shù))依賴于其微環(huán)境，例如懸液中的自由體積。本文中使用的術(shù)語“實時”指在事件發(fā)生時對它進(jìn)行測量。本文中使用的術(shù)語“淀粉”指包含具有通式(C6HltlO5)n的多糖的物質(zhì)，其中多糖的糖取代基主要通過a -D-(I — 4)和/或a -D-(I — 6)糖苷鍵連接。本文中使用的術(shù)語“纖維素”指包含具有通式(C6HltlO5)n的多糖的物質(zhì)，其中多糖的糖取代基主要通過β -D-(I — 4)糖苷鍵連接。本文中使用的術(shù)語“糖類加工酶”指能夠水解存在于淀粉和/或纖維素組合物中的至少一種成分的任意酶。示例性酶包含淀粉酶、葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶及其組合。本文中使用的術(shù)語“淀粉酶”或“淀粉分解酶”指能夠催化淀粉的降解等的酶。淀粉酶是切割淀粉中a -D-(I — 4) O-糖苷鍵的水解酶。一般而言，α -淀粉酶(EC 3. 2. I. I ；a-D-(I— 4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)定義為以隨機(jī)方式切割淀粉分子內(nèi)a-D-(l —4)O-糖苷鍵的內(nèi)切酶。相反，外切淀粉分解酶，如β-淀粉酶(EC 3. 2. 1.2 ;a-D-(l —4)-葡聚糖麥芽糖水解酶)和一些產(chǎn)物特異性淀粉酶，如產(chǎn)麥芽糖a -淀粉酶(EC 3. 2. I. 133)從底物的非還原端切割淀粉分子。β -淀粉酶、a -葡糖苷酶(EC 3. 2. 1.20 ； a -D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2. 1.3 ；a -D-(I — 4)-葡聚糖葡糖水解酶)和產(chǎn)物特異性淀粉酶可以從淀粉產(chǎn)生特定長度的麥芽糖寡糖。本文中使用的術(shù)語“纖維素酶”或“纖維素分解酶”指能夠?qū)⒗w維素聚合物水解為較短的纖維寡糖寡聚物、纖維二糖和/或葡萄糖的一類酶。本文中使用的術(shù)語“多孔形式”指涉及常見固相支持體，例如6孔板、12孔板、24孔板或96孔板上的樣品矩陣的測定排列。除非另有說明，冠詞“一”、“一個”和“該”指單數(shù)指代物和復(fù)數(shù)指代物二者。本文中引用的所有參考文獻(xiàn)在此以其整體引入作為參考。
II.高流通量分子轉(zhuǎn)子黏度測定法測定用市售分子轉(zhuǎn)子研發(fā)了高流通量分子轉(zhuǎn)子黏度測定法測定來監(jiān)測淀粉底物的液化。一般而言，分子轉(zhuǎn)子是熒光種類，其量子產(chǎn)率(即發(fā)射的光子數(shù)除以吸收的光子數(shù))依賴于與微環(huán)境黏度相關(guān)的微環(huán)境自由體積。對于這類分子，從激發(fā)態(tài)弛豫的優(yōu)選方式是分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)，分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)以與微環(huán)境黏度成比例的量受抑制。能量平衡通過可以測量的輻射弛豫(熒光發(fā)射)逸散，從而允許計算微環(huán)境黏度。為了測量由對底物的酶活性引起的黏度降低的速率，將分子轉(zhuǎn)子CCVJ(9-(2-羧基-2-氰基こ烯基)久洛尼定)摻入玉米支鏈淀粉的緩沖懸液，然后將其分配至96孔板的孔。然后將一定量的許多a -淀粉酶多肽之一加至含有CCVJ/玉米支鏈淀粉懸液的不同孔，以起始酶促淀粉水解反應(yīng)。在室溫下在以動態(tài)模式運(yùn)行的Spectramax M2 96孔突光計中進(jìn)行反應(yīng)，實時進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。測定中使用的試劑的配制和實驗方案描述于實施例中。通過測量來自CCVJ的熒光信號的降低速率來測定由酶促淀粉水解引起的黏度降低速率。Spectramax儀器的配套軟件Softmax Pro自動將突光信號降低的動態(tài)速率計算為“Vmax (毫單位/分鐘)”。圖I中顯示了涉及酶介導(dǎo)的熒光(黏度)降低的原始動力學(xué)數(shù)據(jù)對時間的曲線。熒光(RFU，y軸)減少的速率與淀粉酶介導(dǎo)的黏度降低的速率成比例。就淀粉水解活性而言，更低的值指示更好的性能。27個變體a-淀粉酶在分子轉(zhuǎn)子測定中顯示優(yōu)于野生型酶的性能。 為了確定分子轉(zhuǎn)子測定的結(jié)果是否準(zhǔn)確反映了變體a -淀粉酶的淀粉水解活性，用常規(guī)旋轉(zhuǎn)黏度計測定評價了相同的變體a-淀粉酶。顯示酶劑量和所獲得的峰值黏度值的表格顯示于圖2中。用更麻煩的旋轉(zhuǎn)黏度計測定確認(rèn)了在分子轉(zhuǎn)子測定中顯示優(yōu)越性能的27個變體中的24個具有優(yōu)越的性能。這些結(jié)果顯示了該方法的功效和準(zhǔn)確性。用于本測定中的示例性分子轉(zhuǎn)子包括但不限于9-(2-羧基-2-氰基こ烯基)-久洛尼定(CCVJ)和9-( ニ氰基こ烯基)-久洛尼定(DCVJ)及其烷基酷、I-(2-羥こ基)-6_[ (2, 2_ 二氛)こ稀基]-2, 3,4_ 二氧喧琳(DCQ)、4,4' -ニ氣-4-砸 _3a, 4a_ 重氣基-s-indacene、硫黃素T(ThT)、對-[(2-氰-2-丙ニ醇酯)こ烯基]ニ甲基苯胺等。
用途本測定允許直接實時監(jiān)測懸液中黏度降低的動態(tài)速率。速度、簡單性、穩(wěn)健性、重復(fù)性和自動化可行性使得該測定很適于高流通量篩選，其中可以以比常規(guī)旋轉(zhuǎn)黏度計測定快約1，000倍的速率產(chǎn)生數(shù)據(jù)。該測定的用途包括測量產(chǎn)生反應(yīng)混合物懸液黏度變化的酶介導(dǎo)的反應(yīng)和其他反應(yīng)中的黏度變化。示例性反應(yīng)是淀粉酶介導(dǎo)的產(chǎn)生低分子量葡聚糖的淀粉懸液的液化。相關(guān)反應(yīng)涉及葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶、淀粉酶或其組合介導(dǎo)的淀粉懸液的液化，及纖維素酶、半纖維素酶或其組合介導(dǎo)的纖維素懸液的液化。
實施例通過將186 U L ニ 甲基亞諷加至含有 5mg 凍干 CCVJ (Sigma Aldrich Corporation,St. Louis, MO)的管中來制備IOOmM的CCVJ儲液。CCVJ儲液在室溫下避光保存，并在使用前檢查沉淀。將90g來自玉米的支鏈淀粉(MP Biomedicals LLC, Solon, 0H)加至2，850 y L蒸餾水，恒速攪拌加熱至沸騰，支鏈淀粉在該條件下逐漸膠凝化和溶解。將產(chǎn)生的黏度均一的5%膠凝化支鏈淀粉懸液從熱源移開，并在它回到室溫時繼續(xù)攪拌，此時加入150mLIMこ酸鈉緩沖液(pH 5. 8)(之前通過用IMこ酸滴定IMこ酸鈉配制)，然后加入150 u LTween-80 (Sigma Aldrich Corporation, St. Louis,MO) Tween-80完全溶解時，加入 150 u LIOOmM CCVJ儲液并溶解(5 μ M終濃度)，此時完成支鏈淀粉/CCVJ試劑配制備用。該試劑在室溫下保存于透明玻璃瓶中，在完成黏度測定法篩選測定所需的三天期間恒速攪拌。通過裝配了能夠同時對96孔微量滴定板的全部96個孔進(jìn)行移液的多通道頭部的Biomek FXp機(jī)器人來進(jìn)行所有液體操作。向黑色未處理的聚苯乙烯96孔微量滴定板(Corning Incorporated, Corning, NY)的各孔加入60 μ L支鏈淀粉/CCVJ試劑。吸取30 μ L酶(IOOppma -淀粉酶)樣品至其頂部,并立即在如下設(shè)置的Spectramax M2e突光計(Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA)上讀數(shù)頂部讀數(shù)突光模式；激發(fā)波長435納米(nm);發(fā)射波長495nm ;臨界波長455nm ;動態(tài)讀數(shù)模式，24秒讀數(shù)間隔；最初讀數(shù)前振動15秒，讀數(shù)間振動3秒；192秒總讀數(shù)時間，20秒停滯期(從各動態(tài)速率計算去除所收集的9個數(shù)據(jù)中的第一個)。典型的結(jié)果顯示在圖I中。根據(jù)用分子轉(zhuǎn)子黏度測定獲得的結(jié)果，將27個α-淀粉酶變體鑒定為具有高水平的淀粉液化活性。將數(shù)據(jù)與用標(biāo)準(zhǔn)旋轉(zhuǎn)黏度計測定獲得的那些比較，這確認(rèn)了變體中的24個具有高水平的淀粉液化活性(圖2)，表明分子轉(zhuǎn)子測定的準(zhǔn)確性。 本組合物的其他特征、方面和實施方案將由于描述和附圖而顯而易見。
權(quán)利要求
1.用于實時測定懸液黏度變化的方法，其包括 向包含底物的懸液加入分子轉(zhuǎn)子分子，和能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶或化學(xué)催化劑，所述底物能夠轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，所述分子轉(zhuǎn)子分子的熒光量子產(chǎn)率依賴于懸液自由體積；和實時測量懸液中分子轉(zhuǎn)子分子的熒光； 其中底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化改變了通過測量分子轉(zhuǎn)子分子的熒光測定的懸液自由體積，且其中懸液自由體積的變化與溶液黏度的變化相關(guān)。
2.權(quán)利要求I的方法，其中用懸液黏度的變化來測定底物向產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的速率。
3.權(quán)利要求I的方法，其中用懸液黏度的變化來測定轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的底物的量。
4.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述懸液是淀粉懸液。
5.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述懸液是玉米支鏈淀粉懸液。
6.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述酶是糖類加工酶。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述酶是淀粉酶。
8.權(quán)利要求I的方法，其中所述底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化是淀粉酶介導(dǎo)的產(chǎn)生低分子量葡聚糖的淀粉懸液液化。
9.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述分子轉(zhuǎn)子分子是9-(2-羧基-2-氰基乙烯基)-久洛尼定(CCVJ)。
10.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其以多孔方式進(jìn)行。
全文摘要
用于實時測定懸液黏度變化的方法，其包括向包含底物的懸液加入分子轉(zhuǎn)子分子，和能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶或化學(xué)催化劑，該底物能夠轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，該分子轉(zhuǎn)子分子的熒光量子產(chǎn)率依賴于懸液自由體積；和實時測量懸液中分子轉(zhuǎn)子分子的熒光；其中底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化改變了通過測量分子轉(zhuǎn)子分子的熒光測定的懸液自由體積，且其中懸液自由體積的變化與溶液黏度的變化相關(guān)。
文檔編號G01N11/14GK102803924SQ201080024294
公開日2012年11月28日 申請日期2010年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月5日
發(fā)明者S-K·李, S·W·拉默, A·R·托波扎達(dá) 申請人:丹尼斯科美國公司