專(zhuān)利名稱(chēng)：合金型金屬膠體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適于作為檢查用標(biāo)記劑等的合金型金屬膠體及其制造方法。
背景技術(shù)：
在檢查藥的開(kāi)發(fā)中，根據(jù)臨床目的，分作定量系試劑和定性系試劑。在流感病毒之類(lèi)的感染性疾病抗原的檢測(cè)、心肌標(biāo)志物等中，作為POCT檢查，重點(diǎn)在于迅速診斷，采用能夠在短時(shí)間簡(jiǎn)易地檢測(cè)出抗原的免疫層析法。免疫層析法中，作為可用于目視檢測(cè)的抗體標(biāo)記用著色探針，使用著色膠乳、金屬膠體、酶標(biāo)記等，但其中金屬膠體操作比較簡(jiǎn)單，此外與膠乳粒子相比較，目視的強(qiáng)度高，所以最普遍使用。金屬膠體中廣泛應(yīng)用的是用檸檬酸還原的金(Au)膠體。但是，使用金膠體標(biāo)記的免疫層析法的靈敏度未必可以說(shuō)是充分的。此外，由于金膠體僅以紅 紅紫色存在，所以也存在不能進(jìn)行如膠乳那樣的2色判定之類(lèi)的問(wèn)題。作為其他的金屬膠體，有鉬(Pt)膠體，已知該膠體呈現(xiàn)黑色。因?yàn)橛糜诿庖邔游龇ǖ南趸w維素膜為白色，所以如果能使用黑色的膠體，則通過(guò)白和黑的高對(duì)比差，可期待辨識(shí)性的提高，甚至是高靈敏度。以往，鉬膠體的合成是用檸檬酸還原的、或使用更強(qiáng)的還原劑的高分子保護(hù)的方法，除此之外，近年已報(bào)告有使用低分子保護(hù)的方法(專(zhuān)利文獻(xiàn)1、專(zhuān)利文獻(xiàn)幻。然而，由于利用任一種合成方法所制造的鉬膠體的粒徑均小，所以相同粒子數(shù)時(shí)與粒徑大的金膠體相比，辨識(shí)性低、欠缺實(shí)用性。對(duì)于粒徑大的鉬膠體，已報(bào)告采用以下結(jié)構(gòu)的復(fù)合膠體以金膠體作為核心(核) 而在其表面擔(dān)載有鉬作為殼(shell)的Au核Pt殼型的結(jié)構(gòu)及Pt核Au殼型、Au和Pt成為一體的合金型等結(jié)構(gòu)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)1 7)。此外，雖然還報(bào)告了通過(guò)將Au核Pt殼型的復(fù)合膠體用于免疫層析法，而使測(cè)定法的靈敏度上升(專(zhuān)利文獻(xiàn)幻，但不能說(shuō)該靈敏度是充分的。專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1日本特開(kāi)2002-239372號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)2國(guó)際公開(kāi)第2005/023468號(hào)小冊(cè)子專(zhuān)利文獻(xiàn)3日本專(zhuān)利第3886000號(hào)公報(bào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn) 1 R. S. Minor et. al. , 7th International Congress oncatalysis. Elsevier S. P. Co. 1981.非專(zhuān)利文獻(xiàn)2 P. A. Sermon et. al.，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 26 (1987) No. 9.非專(zhuān)禾Ij 文獻(xiàn) 3Ρ· A. Sermon et. al. , Mat. Res. Soc. Symp. Proc. Vol. 1988Materials Reserch Society.非專(zhuān)利文獻(xiàn)4]G. Schmid et. al.，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30 (1991)No. 7.
非專(zhuān)禾Ij文獻(xiàn)5Τ· Yonezawa et. al. , J. Molecular Catalyis 83(1993) 167.非專(zhuān)利文獻(xiàn)6 Τ· Yonezawa et. al. ,J. C. S. Faraday Trans. ,1995,91(22),4111.非專(zhuān)利文獻(xiàn)7A. Henglein J. Phys. Chem. B2000,104,2201.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及提供一種與金膠體、Au核Pt殼型復(fù)合膠體相比辨識(shí)性更高的、為更高靈敏度的、適于作為免疫學(xué)測(cè)定之類(lèi)的檢查用標(biāo)記劑等的金屬膠體。本發(fā)明人等對(duì)辨識(shí)性?xún)?yōu)異的Au/Pt復(fù)合膠體進(jìn)行了多種研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不制作成為核的膠體，而預(yù)先將金鹽和鉬鹽使用氨基酸、肽等作為還原劑進(jìn)行混合而制備膠體時(shí)， 得到穩(wěn)定的合金型Au/Pt復(fù)合膠體粒子，該膠體的辨識(shí)性高，作為免疫學(xué)測(cè)定用標(biāo)記劑使用時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)信號(hào)強(qiáng)度高的、更高靈敏度的測(cè)定。S卩，本發(fā)明涉及以下的1) 4)。1) 一種合金型Au/Pt復(fù)合膠體，其是通過(guò)將金鹽及鉬鹽與選自氨基酸及其衍生物、低聚肽及其衍生物、以及氨基糖中的1種以上的還原劑一起在堿的存在下進(jìn)行混合，還原所述金鹽及鉬鹽而形成的。2)如1)中所述的合金型Au/Pt復(fù)合膠體，其中，以Pt量成為Au量的7 25%的方式使用金鹽及鉬鹽。3) 一種免疫學(xué)測(cè)定用標(biāo)記劑，其中，含有上述1)或2、的合金型Au/Pt復(fù)合膠體。4) 一種抗體或抗原，其中，是利用上述1)或幻的合金型Au/Pt復(fù)合膠體進(jìn)行標(biāo)記而得的。5) 一種合金型Au/Pt復(fù)合膠體的制造方法，其特征在于，將金鹽及鉬鹽與選自氨基酸及其衍生物、低聚肽及其衍生物、以及氨基糖中的1種以上的還原劑一起在堿的存在下進(jìn)行混合，還原所述金鹽及鉬鹽。本發(fā)明的合金型Au/Pt復(fù)合膠體與金膠體、Au核Pt殼型復(fù)合膠體相比，辨識(shí)性更高、為更高靈敏度的，作為免疫學(xué)測(cè)定之類(lèi)的檢查用標(biāo)記劑等極其有用。


圖1合金型Au/Pt復(fù)合膠體的電子顯微鏡照片(20萬(wàn)倍，1刻度為8nm)。圖2使用合金型Au/Pt復(fù)合膠體的免疫層析法的測(cè)定結(jié)果(判定部分的照片)。 C:對(duì)照線(xiàn)，T 試驗(yàn)線(xiàn)圖3使用改變Pt量而合成的合金型Au/Pt復(fù)合膠體的免疫層析法的測(cè)定結(jié)果 (判定部分的照片)。C 對(duì)照線(xiàn)，T 試驗(yàn)線(xiàn)圖4使用改變Pt量而合成的合金型Au/Pt復(fù)合膠體的免疫層析法的測(cè)定結(jié)果 (試驗(yàn)線(xiàn)的信號(hào)強(qiáng)度)。圖5使用改變Pt量而合成的合金型Au/Pt復(fù)合膠體的免疫層析法的測(cè)定結(jié)果 (色調(diào))。圖6使用Au核Pt殼型Au/Pt復(fù)合膠體的免疫層析法的測(cè)定結(jié)果(判定部分的照片)。C:對(duì)照線(xiàn)，T 試驗(yàn)線(xiàn)
具體實(shí)施例方式作為在本發(fā)明中使用的“金鹽”，可以舉出氯金酸、氰化金(III)鉀、氰化金鉀、四氨合金硝酸鹽、四硝酸合金銨鹽、二水合(1，10-二氮雜菲)金硝酸鹽等，其中，優(yōu)選為氯金酸。此外，作為“鉬鹽”，可以舉出六氯鉬酸、二硝基二氨鉬、二硝基二氨鉬硝酸鹽、順式二氨二水合鉬硝酸鹽、反式二氨二水合鉬硝酸鹽、四硝基合鉬酸、四(草酸根)合鉬酸、順式二硝基二水合鉬、四氨合氫氧化鉬鹽，六氨合氫氧化鉬鹽、四氨合鉬氯化物、六氨合鉬氯化物、六羥基合鉬酸、氧化鉬、二氯化鉬、四氯化鉬、四氯鉬酸鉀等，其中，優(yōu)選為四氯鉬酸鉀、 六氯鉬酸等。本發(fā)明中的還原劑為氨基酸、低聚肽、氨基糖等，在通常的環(huán)境下沒(méi)有還原特性， 但在堿性環(huán)境下顯示出還原金離子及鉬離子的還原特性。作為氨基酸，例如可以舉出甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、 谷氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸、組氨酸等α-氨基酸，作為其衍生物，可以舉出羧酸酯衍生物(例如甲酯、乙酯等)、羧酸酰胺衍生物。作為低聚肽，可以舉出甘氨酰甘氨酸、甘氨酰丙氨酸、丙氨酰丙氨酸等二肽，甘氨酰甘氨酰甘氨酸、甘氨酰甘氨酰丙氨酸等三肽；也可以是含有其他氨基酸的低聚肽。作為其衍生物，可以舉出羧酸酯衍生物(例如甲酯、乙酯等)、羧酸酰胺衍生物。例如，作為二肽殘基的酯衍生物，可以例示阿斯巴甜(N-(L-α-天冬氨酰)-L-苯丙氨酸1-甲酯)等。作為氨基糖，例如，可以舉出葡萄糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺等。這些還原劑中，作為優(yōu)選的還原劑，可以舉出甘氨酸、丙氨酸等氨基酸，甘氨酰甘氨酸等低聚肽。該還原劑除了可以將氨基酸、其衍生物、低聚肽、其衍生物及氨基糖分別單獨(dú)使用之外，還可以將多種組合使用。應(yīng)予說(shuō)明，本發(fā)明中作為還原劑使用的氨基酸、低聚肽、氨基糖等，其將合金型Au/ Pt復(fù)合粒子包圍，還作為保護(hù)成分發(fā)揮作用。因此，本發(fā)明的膠體即使不另行添加保護(hù)成分，所形成的合金型Au/Pt復(fù)合粒子也可以不沉淀地分散，作為膠體穩(wěn)定地存在。但是，為了更難以沉淀，也可以添加甲硫氨酸、半胱氨酸等含有硫的氨基酸或明膠膠體。作為堿，可以舉出氫氧化鈉、氫氧化鉀等堿金屬的氫氧化物，碳酸鈉、碳酸鉀等堿金屬的碳酸鹽，氫氧化鎂、氫氧化鈣等堿土類(lèi)金屬的氫氧化物，碳酸鎂、碳酸鈣等堿土類(lèi)金屬的碳酸鹽、胼、羥胺、氨等，優(yōu)選為氫氧化鈉、氫氧化鉀等堿金屬的氫氧化物。以下，對(duì)本發(fā)明的合金型Au/Pt復(fù)合膠體的調(diào)制進(jìn)行具體說(shuō)明。1)合金型Au/Pt復(fù)合粒子(膠體)的形成在溶劑中將金鹽、鉬鹽、及還原劑在堿的存在下進(jìn)行混合，使之反應(yīng)，從而能夠得到合金型的Au/Pt復(fù)合粒子(膠體)。此處，所用的溶劑通常使用水，但是也可以使用超純水、將離子交換水經(jīng)多次蒸餾的水。應(yīng)予說(shuō)明，對(duì)金鹽、鉬鹽、還原劑的添加方法沒(méi)有特別限定，例如，可以舉出在溶劑中加入金鹽，接著添加還原劑，然后加入鉬鹽的方法。金鹽的添加量相對(duì)于溶劑總量?jī)?yōu)選為0. 01 0.，更優(yōu)選為0. 05 0. 09w/ v%。此外，從提高所生成的Au/Pt復(fù)合膠體的辨識(shí)性(特別是作為免疫層析用的標(biāo)記物(著色粒子)使用時(shí))、其信號(hào)強(qiáng)度(檢測(cè)靈敏度)的觀(guān)點(diǎn)考慮，金鹽及鉬鹽的添加量?jī)?yōu)選以Pt量為Au量的7 25%、更優(yōu)選為12 18%的方式進(jìn)行添加。還原劑的添加量根據(jù)其種類(lèi)的不同而異，但相對(duì)于金鹽及鉬鹽的1摩爾，優(yōu)選為 1 12摩爾，更優(yōu)選為4 6摩爾。堿優(yōu)選以在溶液中的濃度范圍成為通常5mmol/L 30mmol/L、優(yōu)選12mmol/L 14mmol/L而使用，此外可以以溶液的pH為10以上、優(yōu)選為11 12的方式進(jìn)行添加。反應(yīng)在通常為90 98°C、優(yōu)選為93 97°C的攪拌下進(jìn)行10 60分鐘、優(yōu)選20 45分鐘即可，但優(yōu)選在40 65 °C反應(yīng)5 20分鐘后，進(jìn)一步提高溫度(93 98°C )，反應(yīng) 20 60分鐘。通過(guò)這樣的反應(yīng)，得到合金型Au/Pt復(fù)合粒子(膠體)。2)未反應(yīng)物及脫鹽處理接著，進(jìn)行用于從得到的合金型Au/Pt復(fù)合粒子(膠體)中減少未反應(yīng)物、鹽的處理。作為這樣的處理，例如，可以舉出(1)進(jìn)行使用離心分離器的超過(guò)濾(過(guò)濾器使用分子量為30000的過(guò)濾器，以2000 5000rpm進(jìn)行30分鐘離心)后，添加適宜的水；(2)使用滲透膜；(3)用超離心分離器進(jìn)行分離(6000rpm，10分鐘)，添加適宜的水等。3)中和處理然后，根據(jù)需要，以溶液的pH成為7 9的方式進(jìn)行中和處理。該中和處理是例如將膠體溶液進(jìn)行離心分離，分離為沉淀物與上層澄清，除去上層澄清而取出沉淀物，用水稀釋?zhuān)訮H不成為6以下的方式進(jìn)行中和。此時(shí)可以利用所加水的量調(diào)節(jié)膠體的濃度，容易地獲得高濃度。如此得到的膠體呈現(xiàn)近黑色的黑紫色，為粒子不沉淀地分散而穩(wěn)定地存在的所謂分散膠體。該膠體通過(guò)電子顯微鏡觀(guān)察時(shí)，不是Au核Pt殼型而是Au和Pt成為一體的平滑的合金型(homogeneous alloy)的Au/Pt復(fù)合膠體(參照?qǐng)D1，1刻度為8nm)，Au/Pt復(fù)合粒子的平均粒徑為20nm lOOnm。應(yīng)予說(shuō)明，平均粒徑可以通過(guò)例如拍攝透射型電子顯微鏡照片(TEM)對(duì)100個(gè)粒子測(cè)定粒徑而求出其平均值。因此，該合金型Au/Pt復(fù)合膠體能夠適于作為用于免疫層析法、其他各種免疫學(xué)測(cè)定法的標(biāo)記劑(可視探針)而使用。使用本發(fā)明的合金型Au/Pt復(fù)合膠體的抗原、抗體等蛋白質(zhì)的標(biāo)記能夠按照常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行。例如，使抗體與合金型Au/Pt復(fù)合膠體進(jìn)行混合，攪拌20分鐘 M小時(shí)，使抗體與膠體結(jié)合之后，添加酪蛋白溶液、BSA等而阻遏(block)膠體表面。接著，進(jìn)行離心分離，去除上清后，使之在含有酪蛋白的緩沖液中懸浮，能夠得到合金型Au/Pt復(fù)合膠體標(biāo)記抗體。實(shí)施例實(shí)施例1合金型Au/Pt復(fù)合膠體的合成
在253. 2ml的水中加入(w/v)氯金酸18ml，接著加入作為還原劑的(w/v) 甘氨酸 18ml、0. 5N 的 K0H8. lml，進(jìn)而加入 (w/v)氯鉬酸(II)鉀 2. 70mL (Pt 量 15 % ) 后，在50°C的溫度下反應(yīng)15分鐘。再移入98°C的水浴反應(yīng)30分鐘。加入300ml的水后， 進(jìn)行超過(guò)濾，濃縮至IOOml，制成Au/Pt復(fù)合膠體。以該方法得到的膠體呈現(xiàn)出近黑色的黑紫色，通過(guò)電子顯微鏡來(lái)觀(guān)察時(shí)，不是Au 核Pt殼型而是Au和Pt成為一體的平滑的合金型(homogeneous alloy) Au/Pt復(fù)合膠體。 將電子顯微鏡照片示于圖1。實(shí)施例2標(biāo)記抗體的制備將20 μ g的抗人IgG山羊抗體與得到的合金型Au/Pt復(fù)合膠體lmL(0D52Q = 10)進(jìn)行混合，室溫下攪拌約6小時(shí)而使抗體與膠體結(jié)合。以最終濃度成為的方式添加酪蛋白溶液，室溫下攪拌一夜而阻遏膠體表面。以4500g、4°C進(jìn)行離心分離10分鐘，回收，混懸于含有酪蛋白的緩沖液中而制備合金型Au/Pt復(fù)合膠體標(biāo)記抗體。試驗(yàn)例1利用免疫層析法的測(cè)定使用實(shí)施例2中制備的合金型Au/Pt復(fù)合膠體標(biāo)記抗體，進(jìn)行利用下述所示的免疫層析法的測(cè)定而評(píng)價(jià)該膠體作為可視探針的性能。1)作為用于評(píng)價(jià)的免疫層析法，利用對(duì)樣品中的抗幽門(mén)螺桿菌抗體進(jìn)行檢測(cè)的測(cè)定系統(tǒng)。該免疫層析法是通過(guò)使樣品與使從幽門(mén)螺桿菌菌體中提取的抗原變?yōu)楣滔嗟南趸w維素膜所構(gòu)成的免疫層析法用測(cè)試條進(jìn)行反應(yīng)，利用膠體標(biāo)記抗人IgG抗體而檢測(cè)與膜上的抗原結(jié)合的抗幽門(mén)螺桿菌抗體的方法。材料的調(diào)制法及測(cè)定法如下所述。2)抗原固相膜的制備在硝化纖維素膜上將從幽門(mén)螺桿菌菌體提取的抗原以每Icm為3μ g的量涂布成線(xiàn)狀。同時(shí)將適量的抗人IgG山羊抗體涂布成線(xiàn)狀。涂布后在37°C干燥2小時(shí)以上后，為了防止非特異性吸附，將膜浸入含有脫脂乳的緩沖液中進(jìn)行阻遏(blocking)。之后，使之充分干燥，制成抗原固相膜。3)免疫層析法用測(cè)試條的制備將由玻璃纖維等構(gòu)成的樣本墊、由纖維素等構(gòu)成的吸收墊貼附在2)中制備的抗原固相化膜上。樣本墊作為與測(cè)定樣品接觸而向抗原固相化膜部分供給測(cè)定樣品的部分， 吸收墊用于吸取在膜上展開(kāi)的測(cè)定樣品。將貼附有墊類(lèi)的膜切割成4mm寬而制成免疫層析法用測(cè)試條。4)測(cè)定方法將從幽門(mén)螺桿菌陽(yáng)性者采集的血清用緩沖液進(jìn)行稀釋的陽(yáng)性管理試樣作為抗幽門(mén)螺桿菌抗體陽(yáng)性樣品、將從幽門(mén)螺桿菌陽(yáng)性者采集的尿作為抗幽門(mén)螺桿菌抗體弱陽(yáng)性樣品而用于測(cè)定。并且，將從幽門(mén)螺桿菌陰性者采集的尿作為抗幽門(mén)螺桿菌抗體陰性樣品使用。測(cè)定及判定步驟如下所示。i)將各樣品用測(cè)定用緩沖液進(jìn)行稀釋?zhuān)温溆跍y(cè)定容器中。ii)將各合金型Au/Pt復(fù)合膠體標(biāo)記抗體加入測(cè)定容器中，進(jìn)行混合。iii)向測(cè)定容器中插入免疫層析法用測(cè)試條，室溫下靜置15分鐘。iv) 15分鐘后通過(guò)目視確認(rèn)是否出現(xiàn)有色線(xiàn)。應(yīng)予說(shuō)明，將測(cè)試條上涂布有幽門(mén)螺桿菌提取抗原的部分作為試驗(yàn)線(xiàn)部分，將涂布有抗人IgG抗體的部分作為對(duì)照線(xiàn)部分，將在試驗(yàn)線(xiàn)部分和對(duì)照線(xiàn)部分雙方均出現(xiàn)有色線(xiàn)的情形判定為陽(yáng)性。將出現(xiàn)的有色線(xiàn)僅為對(duì)照線(xiàn)部分的情形判定為陰性。5)測(cè)定結(jié)果將測(cè)定結(jié)果示于圖2。從圖2判斷，對(duì)比度、信號(hào)強(qiáng)度均良好，是適合免疫層析的高性能的膠體。可知利用本發(fā)明的方法調(diào)制的合金型Au/Pt復(fù)合膠體可以用作免疫層析法的高性能的可視探針。實(shí)施例3將和氯金酸混合的Pt量設(shè)為10 %、12 %、13 %、15 %、18 %、20 %，合成Au/Pt復(fù)合膠體。在253. 2ml的水中加入(w/v)氯金酸18ml和分別以1. 80mL(Pt量10 % )、
2.70mL (Pt 量 15 % )、2. 16mL (Pt 量 12 % )、2. 34mL (Pt 量 13 % )、2. 70mL (Pt 量 15 % )、
3.24mL(Pt量18% )、3. 60mL(Pt量20% )的量加入(w/v)氯鉬酸(II)鉀。接著添加 0. 5N的KOH 8. Iml和18ml的作為還原劑的1 % (w/v)甘氨酸之后，在50°C的溫度下反應(yīng)15 分鐘。再移入98°C的水浴反應(yīng)30分鐘。加入300ml的水之后，進(jìn)行超過(guò)濾，濃縮至100ml， 制成Pt量分別為10%、12%、13%、15%、18%、20%的Au/Pt復(fù)合膠體。使用得到的各合金型Au/Pt復(fù)合膠體，與實(shí)施例2同樣地制備合金型Au/Pt復(fù)合膠體標(biāo)記抗體。試驗(yàn)例2使用實(shí)施例3中制備的合金型Au/Pt復(fù)合膠體標(biāo)記抗體，與試驗(yàn)例1同樣地進(jìn)行利用免疫層析法的測(cè)定(圖幻，評(píng)價(jià)該膠體作為可視探針的性能。1)信號(hào)強(qiáng)度拍攝測(cè)定完成的測(cè)試條的判定部分的照片。利用圖像解析軟件(Densitograph， ATTO株式會(huì)社)對(duì)顯現(xiàn)在照片上的試驗(yàn)線(xiàn)進(jìn)行解析，將出現(xiàn)的線(xiàn)的強(qiáng)弱作為信號(hào)強(qiáng)度變成數(shù)值，進(jìn)行比較(圖4)。使Pt量變化而制備的合金型Au/Pt復(fù)合膠體標(biāo)記抗體的信號(hào)強(qiáng)度在20 %時(shí)變?nèi)酰?但在10 18%之間沒(méi)有大的差別，弱陽(yáng)性樣品也能明顯地確認(rèn)。2)色調(diào)對(duì)拍攝1)中陽(yáng)性樣品的測(cè)定結(jié)果的照片，使用圖像軟件(photoshop (注冊(cè)商標(biāo))， adobe公司)調(diào)節(jié)亮度、對(duì)比度等，其結(jié)果是Pt量為12 18%的復(fù)合膠體的色調(diào)是近黑色的色調(diào)，但對(duì)于Pt量為10%的復(fù)合膠體，紅色為強(qiáng)色調(diào)(圖幻。對(duì)于白色硝化纖維素膜， 與紅色相比近黑色的色調(diào)更能夠期待高對(duì)比度，所以?xún)?yōu)選Pt量為12 18%的合金型Au/ Pt復(fù)合膠體作為可視探針。比較例利用專(zhuān)利文獻(xiàn)3 (專(zhuān)利第3886000號(hào)公報(bào))中記載的方法，合成Au核Pt殼型Au/ Pt復(fù)合膠體，與試驗(yàn)例1同樣地進(jìn)行利用免疫層析法的測(cè)定，評(píng)價(jià)該膠體作為可視探針的性能。(1)膠體的合成將390ml的超純水加入燒瓶中使之沸騰，在該沸騰水中加入氯金酸水溶液(每1 升水溶液含金lg) 30ml，之后，加入1重量％檸檬酸鈉水溶液60ml。6分45秒后，加入氯鉬酸水溶液(每1升水溶液含鉬lg) 30ml。從氯鉬酸水溶液添加開(kāi)始5分鐘后，加入1重量％
8檸檬酸鈉水溶液60ml，進(jìn)行4小時(shí)回流，得到膠體。將得到的膠體Iml以13800xg進(jìn)行離心分離25分鐘之后，除去上清，在殘留的沉淀中加入超純水0. 5ml，攪拌后，用超音波使沉淀再次懸浮，將該懸浮液用200mM碳酸鉀水溶液調(diào)節(jié)至pH9. 0。然后在其中加入超純水而使總量為100ml，得到Au/Pt復(fù)合膠體。認(rèn)為該膠體是Pt完全或部分地被覆由Au膠體構(gòu)成的核的Au核Pt殼型的結(jié)構(gòu)。(2)標(biāo)記抗體的制備為了確認(rèn)該膠體的利用免疫層析法的性能，將6. Syg的抗人IgG山羊抗體與得到的膠體ImUOD52tl = 3. 4)進(jìn)行混合，為了得到最適宜的標(biāo)記條件而使pH為7 10，在室溫下攪拌約6小時(shí)，使膠體與抗體結(jié)合。以最終濃度成為的方式添加酪蛋白溶液，室溫下攪拌一夜而阻遏膠體表面。以4500g、4°C進(jìn)行離心分離40分鐘，回收，將之懸浮于含有酪蛋白的緩沖液中而制備Au/Pt復(fù)合膠體標(biāo)記抗體。(3)利用免疫層析法的測(cè)定將制備的Au/Pt復(fù)合膠體標(biāo)記抗體與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行利用免疫層析法的測(cè)定。(4)測(cè)定結(jié)果測(cè)定的結(jié)果為，任一個(gè)標(biāo)記抗體中在陽(yáng)性樣品測(cè)定時(shí)出現(xiàn)的試驗(yàn)線(xiàn)都非常弱。進(jìn)而，在弱陽(yáng)性樣品測(cè)定時(shí)不能確認(rèn)試驗(yàn)線(xiàn)，作為免疫層析法的性能不充分。將免疫層析法的測(cè)定結(jié)果(測(cè)試條上的出現(xiàn)對(duì)照線(xiàn)和試驗(yàn)線(xiàn)的判定部分的照片)示于圖6。
權(quán)利要求
1.一種合金型Au/Pt復(fù)合膠體，其特征在于，是通過(guò)將金鹽及鉬鹽與選自氨基酸及其衍生物、低聚肽及其衍生物、以及氨基糖中的1種以上的還原劑一起在堿的存在下進(jìn)行混合，還原所述金鹽及鉬鹽而形成的。
2.如權(quán)利要求1所述的合金型Au/Pt復(fù)合膠體，其中，以Pt量成為Au量的7 25% 的方式使用金鹽及鉬鹽。
3.一種免疫學(xué)測(cè)定用標(biāo)記劑，其特征在于，含有權(quán)利要求1或2中所述的合金型Au/Pt 復(fù)合膠體。
4.一種抗體或抗原，其特征在于，是利用權(quán)利要求1或2中所述的合金型Au/Pt復(fù)合膠體進(jìn)行標(biāo)記而得的。
5.一種合金型Au/Pt復(fù)合膠體的制造方法，其特征在于，將金鹽及鉬鹽與選自氨基酸及其衍生物、低聚肽及其衍生物、以及氨基糖中的1種以上的還原劑一起在堿的存在下進(jìn)行混合，還原所述金鹽及鉬鹽。
全文摘要
本發(fā)明提供一種與金膠體、Au核Pt殼型復(fù)合膠體相比辨識(shí)性高的、為更高靈敏度的、適于作為免疫學(xué)測(cè)定之類(lèi)的檢查用標(biāo)記劑等的金屬膠體。一種合金型Au/Pt復(fù)合膠體，是通過(guò)將金鹽及鉑鹽與選自氨基酸及其衍生物、低聚肽及其衍生物、以及氨基糖中的1種以上的還原劑一起在堿的存在下進(jìn)行混合，還原所述金鹽及鉑鹽而形成的。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102472748SQ20108002495
公開(kāi)日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日
發(fā)明者渡部正利, 織田哲彌, 赤松優(yōu) 申請(qǐng)人:大塚制藥株式會(huì)社, 學(xué)校法人工學(xué)院大學(xué)