專利名稱：用于測定抗egfr抗體在癌癥治療中的功效的生物標記和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基于基因或基因表達產物的生物標記和方法，用于測定抗EGFR抗體在EGFR表達性癌癥的治療中的功效。本發(fā)明進一步涉及預測患有EGFR表達性癌癥的患者對用特定抗EGFR抗體進行的治療的敏感性或抵抗性。本發(fā)明優(yōu)選涉及相應生物標記的鑒定，該生物標記允許更好地預測在具有KRAS野生型腫瘤的患者中用抗EGFR抗體治療的臨床結果。在本文中，本發(fā)明特別涉及抗EGFR抗體C225/西妥昔單抗(Erbitux )及其在患有特別是結腸直腸癌(CRC)的患者中的用途。
背景技術：
單克隆抗體廣泛地用于癌癥的治療中。因為抗體是由國家衛(wèi)生保健機構付費的昂貴藥物，并且常導致不期望的副作用從而對患有嚴重和通常晚期疾病的患者造成額外的負擔和壓力，所以非常希望預先了解用特定抗體藥物治療特定患者是否可以真正改善或甚至治愈患者的狀況。已存在幾個臨床和組織學參數可以用于預后特定藥物和/或治療方案是否可以成功用于治療疾病。然而，已顯示腫瘤極為常常地引發(fā)多種多樣的遺傳模式，該模式可隨個體而改變。因此，可以改善第一患者的臨床狀況的特定藥物或特定治療在患有相同癌癥的第二患者中可能會功效不高或無效。例如，患有結腸直腸癌的患者可能對某一特定抗體藥物表現(xiàn)出不同的反應。在最糟的情況下，取決于不同遺傳腫瘤模式和素質，一個特定患者組完全不響應藥物，而另一個患者組引發(fā)令人滿意的治療應答。盡管現(xiàn)代分子生物學和生物化學已揭示數百個基因的活性影響腫瘤細胞的行為、 其分化狀態(tài)、及其對某些治療藥物例如抗體的敏感性或抵抗性，但這些基因的狀態(tài)通常不用于對藥物療法例行做出臨床決定的目的。一個例外是在乳腺癌中使用ErbB2(Her2)蛋白質表達來選擇施用Her2拮抗劑藥物Herceptin (Genentech)的患者。另一個例外是發(fā)現(xiàn)——EGFR表達腫瘤的KRAS基因突變與缺乏針對抗EGFR抗體的敏感性或應答相關 (Allegra等人2009，J Clin Oncol [印刷前的電子版])。需要可以利于選擇用于治療的患者的新預后和預測標記，以在臨床中更佳地預測患者對于治療例如小分子或生物分子藥物的反應?；颊邩悠返姆诸愂前┌Y診斷和治療的關鍵方面?；颊邔τ谥委煹姆磻c分子和遺傳標記的聯(lián)系可以開啟在非應答患者上獲得治療發(fā)展的新機會，或基于更高的功效可靠性而從其他治療選擇中區(qū)分出治療的適應癥。進一步地，預先選擇可能良好響應藥物或藥物聯(lián)合或特定方案的患者，可以減少臨床研究中需要的患者數目或加速完成臨床開發(fā)計劃需要的時間。表皮生長因子受體(EGFR)及其下游信號效應物，主要是Ras/Raf/MAP激酶途徑的成員，在正常和惡性上皮細胞生物學中均起重要作用(Normarmo等人，Gene 366， 2-16Q006))，并且因此成為用于治療開發(fā)的已確立的靶點。已開發(fā)了識別且抑制EGFR的幾種單克隆嵌合、人源化或全人單克隆抗體。此時已推向市場的2個抗體例子是西妥昔單抗(cetuximab，ERBITUX )和帕尼單抗 (panitumumab，VECTIBIX )。
已經證實在體外抑制EGF介導的腫瘤細胞生長且在體內抑制人結腸直腸腫瘤生長的抗EGFR抗體c225 (西妥昔單抗)，嵌合IgGl，在2003年獲得市場批準。它的序列首次公開于WO 96/40210中。該抗體以及一般地所有抗EGFR抗體看起來首要的是與某些化學治療劑(即多柔比星、阿霉素、紫杉醇和順鉬)協(xié)同作用，從而在異種移植物小鼠模型中體內根除人腫瘤(例如EP 0667165)。此外，可以證實，抗EGFR抗體c225與第二人源化抗EGFR 抗體馬妥珠單抗(matuzumabjab h425)的組合在體外模型中顯示協(xié)同作用，說明這2種抗體盡管針對相同受體但與受體上的不同表位結合(W0 2004/032960) 0過去證實，在用抗EGFR抗體，包括西妥昔單抗，或相應的小分子抑制劑治療的患者中約75%在開始治療后非常快速發(fā)展或多或少嚴重的皮疹。盡管時常這是可耐受和可處理的，但約10%的患者由于嚴重癥狀而需要劑量中斷和/或劑量減少，并且少數患者中止治療。EGFR抑制劑的皮膚毒性與有利臨床結果之間越來越明顯的關聯(lián)性使得皮疹的“達成”在治療受益患者中成為一個期望的但又潛在令人討厭的毒性，有時限制這些藥物的應用。然而，在抗EGFR抗體治療過程中皮疹的出現(xiàn)可以視為對所述抗體例如西妥昔單抗治療的治療應答的一個可靠替代標記。然而，選擇皮疹出現(xiàn)作為替代標記，因為在將藥物施用于患者較長時間前鑒定一般不響應抗EGFR抗體治療的癌癥患者是不可能的，故該選擇不是最佳的。因此，發(fā)現(xiàn)在EGFR表達腫瘤中KRAS基因(密碼子12/13)和基因產物的突變對 EGFR抑制劑治療轉移性結腸直腸癌的不敏感性負責，可以被認為是在預測治療成功與否方面的進步。WO 2008/112269報道帕尼單抗，人抗EGFR抗體，僅在KRAS野生型腫瘤患者中是有效的。Khambata-Ford等人(2007，J. Clin. Oncol. 25,3230)描述了帶有表皮調節(jié)素 (epiregulin)和雙調蛋白高水平基因表達的腫瘤的轉移性結腸直腸癌患者以及具有野生型KRAS腫瘤的患者更可能以西妥昔單抗治療進行疾病控制。盡管上述近期進展，癌癥治療中的一個主要挑戰(zhàn)仍是，針對具體的治療方案，基于病理遺傳學和/或遺傳學標記，選擇患者以優(yōu)化結果。在用抑制這些腫瘤生長的抗EGFR抗體治療EGFR表達腫瘤的情況下，了解且更好地理解哪些患者能夠響應用這些抗體進行的預期治療，將會是有幫助的，特別是考慮到最近的發(fā)現(xiàn)——即使在KRAS野生型腫瘤組中，也并非所有患者(約40% )都良好響應抗EGFR抗體和其他EGFR抑制劑的治療。因此，存在對使用生物標記的診斷試驗、方法和工具的需要，所述生物標記(包括個體差異的腫瘤基因型)可以同時提供患者對多種治療選項的反應的預測信息。發(fā)明概述本發(fā)明公開了用于確定抗EGFR抗體在癌癥治療中的功效的預測性生物標記。在本發(fā)明的一個實施方案中，描述了特定生物標記，其可以用于在KRAS野生型患者或具有KRAS基因突變的患者中在將抗EGFR抗體施用給所述患者前預測抗EGFR抗體在腫瘤治療中的功效。在本發(fā)明的再一實施方案中，公開了特定生物標記，其可以用于更確切地預測抗 EGFR抗體在KRAS基因無突變(KRAS野生型)的患者中進行腫瘤治療的功效或功效程度，所述KRAS基因無突變的患者通常在統(tǒng)計學上(但不一定在單個體上)對抗EGFR抗體治療具有陽性反應。本發(fā)明的另一個實施方案涉及生物標記，其在患有結腸直腸癌(CRC)，優(yōu)選轉移性結腸直腸癌(mCRC)、鱗狀細胞頭頸癌(SCCHN)或非小細胞肺癌(NSCLC)的患者中指示對于抗EGFR抗體治療產生好的(陽性生物標記)或壞的(負生物標記)應答的高可能性。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，公開了預測用抗EGFR抗體西妥昔單抗 (Erbitux )的腫瘤相關(實體或轉移性腫瘤)治療的功效或無功效的生物標記。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，公開了預測用抗EGFR抗體西妥昔單抗 (Erbitux )的腫瘤相關(實體或轉移性腫瘤)治療的功效或無功效的生物標記，其中所述腫瘤是 CRC、mCRC、SCCHN 或 NSCLC。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，公開了預測用抗EGFR抗體西妥昔單抗 (Erbitux )的腫瘤相關(實體或轉移性腫瘤)治療的功效或無功效的生物標記，其中所述腫瘤是CRC、mCRC、SCCHN或NSCLC，并且患有所述癌癥的患者優(yōu)選顯示個體KRAS野生型基因模式。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及通過診斷工具和/或診斷裝置用于預測患有 KRAS野生型EGFR表達腫瘤的患者將響應或不響應所述EGFR抗體治療的可能性的體外方法，其中所述患者是用EGFR抗體治療的候選者。根據本發(fā)明，該方法包括測定得自所述患者的組織樣品中一種或多種預后基因或其基因表達產物的表達水平，其中與臨床相關參考值比較，基因/基因產物的高或低表達指示患者可能響應所述治療或可能i響應治療。在對抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗治療具有高響應可能性或確實產生響應的腫瘤患者的樣品中高表達的基因或基因產物，根據本發(fā)明，選自由以下基因組成的組 ADAMDEC1、BSDCl、CIorfl44、CAPZB、CDC42、DHCR7、DNAJC8、ECSIT、EX0SC10、FADSl、GBA、 GLT25D1、G0SR2、IMPDHl、KLHL21、KPNA6、KPNBl、LSMl2、MANlB 1、MIDN、PPAN、SH3BP2、SQLE、 SSH3、TNFRSF1B、URM1、ZFYVE26、RGMB, SPIRE2、ABCC5、ACSL5、AOAH、AXIN2、CD24、CEACAM5、 CEACAM6、ETS2、FMNL2、GPSM2、HDAC2、了UN、ME3、MED17、MYB、MYC、NEBL，NOSIP、PITX2、POF1B、 PPARG、PPP1R14C、PRR15、PSMG1、RAB15、RAB40B、RNF43、RPS23、SLC44A3、S0X4、THEM2、VAV3、 ZNF337、EPDRl、KCNK5、KHDRBS3、PGM2L1、STK38 和 SHR00M2。在對抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗治療具有低響應可能性或不產生響應的腫瘤患者的樣品中高表達的基因或基因產物，根據本發(fā)明，選自由以下基因組成的組C7orf46、 CAST、DCP2、DIP2B、ERAPU INSIG2、KIF21A、KLK6、NGRN, NRIPU PHGDH、PPP1R9A、QPCT, RABEPl、RPAl，RPL22L1、SKPl、SLC25A27、SLC25A46、S0CS6、TPD52、ZDHHC2、ZNF654、ASB6、 ATM、BMI1、CDC42EP2、EDEM3、PLLP, RALBPl、SLC4A11、TNFSFl5, TPKl、Cllorf9、C1QC、 CABLES1、CDK6、EHBP1、EX0C6、EXT1、FLRT3、GCNT2、MTHFS、PIK3AP1、ST3GAL1、TK2、ZDHHC14、 ARFGAP3、AXUDl、CAPZB, CHSYl、DNAJB9、GOLTIB, HSPA5、LEPR0TL1、LIMSl、MAPK6、MY06、 PROSC, RAB8B、RAP2B、RWDD2B、SERTAD2、S0CS5、TERF2IP、TIALl、TIPARP, TRIM8, TSC22D2、 TGFA, VAPA和UBE2K，與參考值比較，指示患者可能響應所述治療。在本發(fā)明的另一個實施方案中，高于平均表達且指示患者可能響應或可能優(yōu)良響應相應抗EGFR抗體(例如西妥昔單抗)治療的優(yōu)選生物標記選自下組EPDRl、KCNK5、 KHDRBS3、PGM2L1、SHR00M2、STK38、RGMB, SPIRE2 和 VAV3 或所述組的相應基因表達產物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，高于平均表達且指示患者可能不響應或可能不優(yōu)良響應相應抗EGFR抗體(例如西妥昔單抗)治療的優(yōu)選生物標記選自下組ASB6、ATM、BMI1、CDC42EP2、EDEM3、PLLP、RALBP1、SLC4A11、TNFSFl5、TPK1、ARFGAP3、AXUD1、CAPZB、 CHSY1、DNAJB9、GOLT IB、HSPA5、LEPROTL ULIMSU MAPK6、MY06、PROSC、RAB8B、RAP2B、RWDD2B、 SERTAD2、S0CS5、TERF2IP、TIALU TIPARP, TRIM8、TSC22D2、TGFA, VAPA 和 UBE2K、或所述組
的相應基因表達產物。在再一實施方案中，根據本發(fā)明用于預測患者對于抗EGFR抗體的陽性應答的優(yōu)選生物標記是VAV3，根據本發(fā)明用于預測患者對于抗EGFR抗體的負應答或可忽略不計應答的優(yōu)選生物標記是TGFa。在另一個實施方案中，應用相應方法，其中使用如上文和權利要求中所述的至少一種相當大的或高度表達的第一生物標記，其指示患者將可能良好地或格外好地或優(yōu)良地響應用抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗的治療(與臨床平均或標準反應和/或由相應的平均患者群組(cohort)計算的表達值比較)；并且使用如上文和權利要求中所述的至少一種相當大的或高度表達的第二生物標記，其指示患者將可能王金良好或格外好或優(yōu)良地響應用抗EGFR抗體(優(yōu)選西妥昔單抗)的治療(與臨床平均或標準反應和/或由相應的平均患者群組計算的表達值比較)。在另一個實施方案中，在體外方法中應用相應方法，以預測患者響應所述抗EGFR 抗體治療的可能性，其中所述患者患有KRAS野生型EGFR表達腫瘤且是用EGFR抗體治療的候選者，其中在用抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗治療腫瘤患者的情況中，對AREG和/或EREG 與一種或多種上文和下文述及的生物標記的表達水平進行組合測定。優(yōu)選地，應用相應方法，其中在用抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗治療腫瘤患者優(yōu)選 CRC或mCRC腫瘤患者的情況中，測定VAV3以及ARAG或EREG的基因或基因產物表達水平。在再一具體的實施方案中，應用相應方法，其中在用抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗治療腫瘤患者優(yōu)選CRC或mCRC腫瘤患者的情況中，測定VAV3和ARAG或EREG的基因或基因產物表達水平。在根據本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，應用相應方法，其中在用抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗治療腫瘤患者優(yōu)選CRC或mCRC腫瘤患者的情況中，測定TGFa和ARAG或EREG 的基因或基因產物表達水平。在根據本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，應用相應方法，其中在用抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗治療腫瘤患者優(yōu)選CRC或mCRC腫瘤患者的情況中，測定VAV3和TGFa的基因或基因產物表達水平。在根據本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，應用相應方法，其中在用抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗治療腫瘤患者優(yōu)選CRC或mCRC腫瘤患者的情況中，測定VAV3、TGFa、和ARAG 或EREG的基因或基因產物表達水平。在再一方面，本發(fā)明涉及體外方法，用于預測患有KRAS野生型EGFR表達癌癥的患者將在治療上響應抗EGFR抗體(優(yōu)選西妥昔單抗)治療的可能性，該方法包括(a)通過診斷工具和/或診斷裝置在來自所述患者的腫瘤組織或血漿的活檢組織樣品中測量一種或多種生物標記的表達水平，所述生物標記選自(i)由ADAMDEC1、BSDCl、Clorf 144、CAPZB, CDC42、DHCR7、DNAJC8、ECSIT、EXOSC10、FADS1、GBA、GLT25D1、G0SR2、IMPDHl、KLHL21、KPNA6、 KPNBl、LSMl2, MANlBl、MIDN、PPAN、SH3BP2、SQLE, SSH3、TNFRSF1B、URMl、ZFYVE26、RGMB, SPIRE2、ABCC5、ACSL5、AOAH、AXIN2、CD24、CEACAM5、CEACAM6、ETS2、FMNL2、GPSM2、HDAC2、JUN、ME3、MED17、MYB, MYC, NEBL, NOSIP、PITX2、P0F1B、PPARG, PPP1R14C、PRRl5, PSMGl、 RAB15、RAB40B、RNF43、RPS23、SLC44A3、S0X4、THEM2、VAV3、ZNF337、EPDRl、KCNK5、KHDRBS3、 PGM2L1、STK38、SHR00M2 組成的組，和 / 或(ii)由 C7orf46、CAST、DCP2、DIP2B、ERAPU INSIG2、KIF21A、KLK6、NGRN、NRIPU PHGDH, PPP1R9A、QPCT, RABEPU RPA1, RPL22L1、SKPU SLC25A27、SLC25A46、S0CS6、TPD52、ZDHHC2、ZNF654、ASB6、ATM、BMI1、CDC42EP2、EDEM3、 PLLP、RALBP1、SLC4A11、TNFSF15、TPK1、C11orf9、C1QC、CABLES1、CDK6、EHBP1、EX0C6、EXT1、 FLRT3、GCNT2、MTHFS, PIK3AP1、ST3GAL1、TK2、ZDHHCl4, ARFGAP3、AXUDl、CAPZB, CHSYl、 DNAJB9、GOLTIB, HSPA5、LEPR0TL1、LIMSU MAPK6、MY06、PROSC、RAB8B、RAP2B、RWDD2B、 SERTAD2、S0CS5、TERF2IP、TIALU TIPARP, TRIM8、TSC22D2、TGFA, VAPA 和 ΒΞ2Κ 組成的組，(b)使來自所述患者的腫瘤或血漿的組織樣品離體暴露于所述抗EGFR抗體，(c) 在步驟(b)的所述暴露的組織樣品中再次測量步驟(a)中所述的一種或多種生物標記的表達水平，和(d)計算在步驟(b)和(c)中測量的表達水平的差異，其中與步驟(a)比較，在步驟(C)中獲得的組(i)的生物標記的表達水平的增加指示所述患者在治療上響應所述抗EGFR抗體治療的可能性增加，并且其中與步驟(a)比較，在步驟(c)中獲得的組(ii)的生物標記的表達水平的增加指示所述患者在治療上響應所述抗EGFR抗體治療的可能性降低。在另一個方面，本發(fā)明涉及如上文和下文公開的相應體外方法，其中患者不僅患有KRAS野生型EGFR表達腫瘤，還另外顯示在腫瘤組織的EGFR基因中的突變。在一個具體實施方案中，這個突變負責與抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗施用相關的皮疹。這個突變優(yōu)選引起EGFR中的R521K多態(tài)性。在另一個方面，本發(fā)明涉及如上文和下文公開的相應體外方法，其中患者不僅患有KRAS野生型EGFR表達腫瘤，特別是CRC/mCRC，還另外顯示在腫瘤組織的BRAF基因中的突變。在再一方面，本發(fā)明涉及包含一種或多種下述基因所呈現(xiàn)的多核苷酸的排列或與一種或多種下述基因雜交的多核苷酸的排列的DNA或RNA陣列ADAMDEC1, BSDCLClorf 144, CAPZB，CDC42，DHCR7，DNAJC8，ECSIT，EXOSC10, FADSl, GBA, GLT25D1, G0SR2, IMPDHl，KLHL21, KPNA6, KPNBl，LSM12, MANlBl, MIDN, PPAN, SH3BP2, SQLE, SSH3, TNFRSF1B, URMl, ZFYVE26, RGMB, SPIRE2, ABCC5, ACSL5, AOAH, AXIN2, CD24, CEACAM5, CEACAM6, ETS2, FMNL2, GPSM2, HDAC2, JUN, ME3, MED17, MYB, MYC, NEBL, N0SIP, PITX2，P0F1B，PPARG,PPP1R14C,PRR15，PSMGl，RAB15，RAB40B,RNF43,RPS23,SLC44A3,S0X4, THEM2, VAV3, ZNF337, EPDRl， KCNK5, KHDRBS3, PGM2L1, STK38, SHR00M2, C7orf46, CAST, DCP2, DIP2B, ERAPl，INSIG2, KIF21A, KLK6, NGRN, NRIPl，PHGDH, PPP1R9A, QPCT, RABEP1, RPA1，RPL22L1，SKPl，SLC25A27, SLC25A46, S0CS6, TPD52, ZDHHC2, ZNF654, ASB6, ATM, BMI1， CDC42EP2, EDEM3, PLLP，RALBP1, SLC4A11, TNFSFl5，TPKl，Cllorf9, C1QC, CABLES 1，CDK6, EHBP1，EX0C6，EXT1，F(xiàn)LRT3，GCNT2，MTHFS，PIK3AP1，ST3GAL1，TK2，ZDHHC14，ARFGAP3，AXUD1， CAPZB, CHSYl，DNAJB9，GOLTIB, HSPA5, LEPR0TL1，LIMSl，MAPK6，MY06, PROSC, RAB8B, RAP2B, RWDD2B, SERTAD2, S0CS5, TERF2IP, TIALl，TIPARP, TRIM8, TSC22D2, TGFA, VAPAjP UBE2K， 其中所述基因或基因產物固定在固體表面上。在一個優(yōu)選實施方案中，DNA或RNA陣列包含一種或多種下述基因或與所述基因雜交TNFRSF1B、DNAJC8、ECSIT、G0SR2、PPP1R9A、KLK6、C7orf46、SSH3、SERTAD2、AXIN2、 C10orf99、ETS2、PITX2、PRR15、VAV3、編碼 IKK 相互作用蛋白質的基因、EDEM3、LY6G6D，和任選地加上AREG和/或EREG和/或TGFA。在另一個優(yōu)選實施方案中，根據本發(fā)明的DNA或RNA陣列由以下多核苷酸的排列組成，其中所述多核苷酸由下述基因呈現(xiàn)或與下述基因雜交(a)TNFRSFlB、DNAJC8、ECSIT、 G0SR2、PPPlR9A、KLK6、C7orf46、SSH3、SERTAD2、AXIN2、C10orf99、ETS2、PITX2、PRR15、VAV3、 編碼IKK相互作用蛋白質的基因、EDEM3、LY6G6D、AREG、EREG和TGFA ；或(b) TNFRSF1B、DNAJC8、VAV3、ARAG 或 EREG、TNFa ；或(c) VAV3 ；ARAG 或 EREG、TNFa ；或(d)VAV3、TNFa ；或(e) ARAG 或 EREG、TNFa。附圖簡述

圖1 在具有野生型KRAS基因的患者中，在基線樣品中的表達與在西妥昔單抗單一治療6周后的疾病控制顯著相關的基因(ρ < 0.002，調節(jié)性t檢驗(moderated t-test))?；谘芯縀MR 62202-045 (轉移性CRC的一線治療)。圖2 在基線樣品中的表達與在西妥昔單抗單一治療6周后的疾病控制顯著相關的基因(P < 0. 002，調節(jié)性t檢驗)?；谘芯縀MR 62202-045 (轉移性CRC的一線治療)。圖3 研究EMR 62202-502 (依立替康難治性轉移性CRC患者的西妥昔單抗加依立替康治療)，具有野生型KRAS基因的患者分析在基線樣品中的表達與最佳總體應答顯著相關的基因(P < 0. 002，Welch t檢驗)。圖4 研究EMR 62202-502 (依立替康難治性轉移性CRC患者的西妥昔單抗加依立替康治療)在基線樣品中的表達與最佳總體應答顯著相關的基因(p< 0.002，ffelCh t檢驗)。圖5 研究EMR 62202-502 (在依立替康難治性轉移性CRC患者中的西妥昔單抗加依立替康治療)，具有野生型KRAS基因的患者分析在基線樣品中的表達與總體生存時間顯著相關的基因(P < 0. 002，Cox比例風險回歸)。圖6 研究EMR 62202-502 (在依立替康難治性轉移性CRC患者中的西妥昔單抗加依立替康治療)在基線樣品中的表達與總體生存時間顯著相關的基因(p< 0.002，Cox比例風險回歸)。圖7 研究EMR 62202-502 (在依立替康難治性轉移性CRC患者中的西妥昔單抗加依立替康治療)在基線樣品中的表達與無進展生存時間顯著相關的基因(ρ < 0.002，Cox 比例風險回歸)。圖8 研究EMR 62202-502 (在依立替康難治性轉移性CRC患者中的西妥昔單抗加依立替康治療)，具有野生型KRAS基因的患者分析在基線樣品中的表達與無進展生存時間顯著相關的基因(P < 0. 002，Cox比例風險回歸)。圖9 用于評估腫瘤活檢組織的肝組織污染程度的Affymetrix探針組。圖10 在具有KRAS野生型腫瘤的患者中，基線表達數據與在第6周時的疾病控制的相關性具有ρ < . 002的57個探針組。Log比值是具有疾病控制的患者的平均log2表達水平減去具有進展性疾病的患者的平均log2表達水平，針對樣品的肝污染程度進行調離
iF. ο圖11 :47個探針組顯示從基線到第4周表達的治療中(on-treatment)變化與最佳總體應答相關。Log比值代表具有部分應答的患者的治療中變化的平均值減去具有穩(wěn)定或進展性疾病的患者的治療中變化的平均值，針對樣品的肝污染程度進行調整。圖12 從基線到第4周候選基因表達的治療中變化與最佳總體應答的相關性。Log 比值代表具有部分應答的患者的治療中變化的平均值減去具有穩(wěn)定或進展性疾病的患者的治療中變化的平均值，針對樣品的肝污染程度進行調整。圖13 在具有KRAS野生型狀態(tài)的腫瘤中，候選基因的基線表達與在第6周時的疾病控制的相關性。Log比值是具有疾病控制的患者的平均log2表達水平減去具有進展性疾病的患者的平均log2表達水平，針對樣品的肝污染程度進行調整。圖14 =Luminex血漿蛋白質組學數據的統(tǒng)計學分析結果。分析指的是，在所有患者中以及在具有KRAS野生型腫瘤的患者中，基線和第4周樣品之間的一般改變、治療中改變與在第6周時的應答的相關性。對于這些分析之每一個，針對每一種測量的蛋白質，給出 Iog2比值、ρ值和q值。Log2比值指的是在第4周和基線樣品之間log2濃度的平均差異 (一般改變)，或在應答者和非應答者之間的這些平均差異之間的差異(與應答的相關性)。圖15 抗體試劑和免疫組織化學測定條件。圖16 基于在結腸直腸癌(藍色框)和正常肝(紫色框)中優(yōu)勢表達的基因的表達，鑒定具有高(綠色)、中(紅色)或低(黑色)肝污染的RNA樣品。色度反映在標準化后的絕對元素信號強度。圖17 從基線到第4周表達的治療中改變與最佳總體應答的相關性(部分應答與穩(wěn)定疾病加進展性疾病比較)。顯示了具有P < 0.002的47個探針組。在圖右側上給出基因名稱，隨后為元素ID (element ID)。元素強度代表在第4周時的基因表達超過在基線時的基因表達的10 比?？s寫；PD，進展性疾??；SD，穩(wěn)定疾??；PR，部分應答。圖18 從基線到第4周候選基因表達的治療中改變與最佳總體應答的相關性(部分應答與穩(wěn)定疾病加進展性疾病比較)。在圖右側上給出基因名稱，隨后為元素ID。元素強度代表在第4周時的基因表達超過在基線時的基因表達的10 比?？s寫；PD，進展性疾??；SD，穩(wěn)定疾??；PR，部分應答。圖19 在具有KRAS野生型狀態(tài)的腫瘤中候選基因的基線表達與疾病控制的相關性(部分應答加穩(wěn)定疾病與進展性疾病比較)。在圖右側上給出基因名稱，隨后為元素ID。 強度程度反映，相對于每個探針組在所有樣品上的平均值，每種元素的10 比值?？s寫；PD， 進展性疾?。籗D，穩(wěn)定疾??；PR，部分應答。圖20 在用西妥昔單抗(Erbitux)治療的mCRC患者中KRAS狀態(tài)與應答率和無進展生存的相關性。圖21.在皮膚㈧和腫瘤⑶樣品中所選EGFR信號途徑相關標記的表達的免疫組織化學分析在配對的第4周/基線樣品之間的改變。圖22.根據KRAS腫瘤突變狀態(tài)，相對于無進展生存時間(以月表示)，無疾病進展的患者的比例。圖23.在具有KRAS野生型腫瘤的患者中，基線基因表達數據與在第6周時的疾病控制的相關性(部分應答加穩(wěn)定疾病與進展性疾病比較)。顯示了具有P < 0. 002的57個探針組。在圖右側上給出基因名稱，隨后為元素ID。色度反映，相對于每個探針組在所有樣品上的平均值，每種元素的10 比值?？s寫；PD，進展性疾??；SD，穩(wěn)定疾??；PR，部分應答。圖24.在所有患者中(分別為圖A、C和E)和在腫瘤具有野生型KRAS的患者中 (分別為圖B、D和F)，根據第6周時的應答，在基線樣品中的AREG (element 205239_at)、 EREG(element 205767_at)禾口 TGFA(element 205016_at)的表達水平。P 值指與疾病控制的相關性(部分應答I3R和穩(wěn)定疾病SD與進展性疾病PD比較)。圖25.在意向治療(ITT)群體中的45個患者(圖A)中和在具有KRAS野生型腫瘤的M個ITT患者(圖B)中，從基線到第4周血漿蛋白質濃度的治療中改變與在第6周時的應答的相關性(部分應答I3R與穩(wěn)定疾病SD加進展性疾病PD比較)。顯示了具有P <.01的所有蛋白質。元素強度代表在第4周時的蛋白質濃度超過在基線時的蛋白質濃度的Iog2比。圖沈盒圖(boxplot)顯示VAV3與應答的相關性。PD 進展性疾病，PR 部分應答，SD 穩(wěn)定疾病。綠點具有KRAS和BRAF野生型腫瘤的患者，紅點具有KRAS突變的患者，黑點具有BRAF突變的患者，藍點突變狀態(tài)未知。P值基于Welch t檢驗。圖27 =Kaplan-Meier曲線顯示通過VAV3表達分層的估計的無進展生存分布函數。 取決于患者的基線VAV3表達水平是高于還是低于全部患者的中值水平，已將患者分類為高或低VAV3表達者。ρ值衍生自Cox比例風險模型。圖28 =Kaplan-Meier曲線顯示通過VAV3表達分層的估計的總體生存分布函數。 取決于患者的基線VAV3表達水平是高于還是低于全部患者的中值水平，已將患者分類為高或低VAV3表達者。ρ值衍生自Cox比例風險模型。圖四=Kaplan-Meier曲線顯示通過VAV3表達和KRAS突變狀態(tài)分層的估計的無進展生存分布函數。患者已分為4層，代表KRAS突變狀態(tài)和基線VAV3表達(高于或低于中值)的所有可能組合。圖30 :Vav3與活化的EGFR相互作用。在用VAV3和EGFR單獨地或組合地轉染HEK 293細胞后，使細胞裂解且實施免疫沉淀(IP)和蛋白質印跡(WB)。發(fā)明詳述EGFR靶向免疫球蛋白(Ig)Gl單克隆抗體西妥昔單抗是批準用于治療實體瘤的第一個單克隆抗體。已進行了關于預測西妥昔單抗應答的有用生物標記的深入研究，以鑒定將從西妥昔單抗治療中最顯著獲益的那些患者。對于CRC中的EGFR靶向治療功效，通過免疫組織化學評價的腫瘤EGFR表達已被證明為是一個令人失望的生物標記。對于KRAS基因突變， 已報道了更有希望的數據，所述KRAS基因編碼⑶P/GTP結合蛋白，其將EGFR信號級聯(lián)的配體依賴性受體激活與細胞內途徑聯(lián)系在一起。在多個臨床研究中KRAS突變狀態(tài)的回顧性分析，包括在轉移性CRC (mCRC)中的一線治療的2個隨機化研究EMR 62202-047和EMR 62202-013，以及隨機化CO. 17研究(研究在先化療失敗的mCRC患者中的西妥昔單抗單一治療)，已證實KRAS密碼子12/13突變狀態(tài)對CRC中的西妥昔單抗活性具有預測性。在其腫瘤為KRAS野生型的患者亞組中主要觀察到腫瘤應答，攜帶KRAS密碼子12/13突變的患者不獲益于西妥昔單抗治療。KRAS的突變狀態(tài)因此看起來是CRC中西妥昔單抗活性的一個有力預測生物標記，允許從治療中排除不可能獲得顯著利益的亞群。
然而，具有KRAS野生型腫瘤的CRC患者中約60%，并非所有，獲益于西妥昔單抗治療。約40%的KRAS野生型腫瘤患者不響應西妥昔單抗治療，并且在這些患者中一個相當大的部分早期進展且具有短的總體生存。因此，需要鑒定和使用進一步的生物標記，加上KRAS突變狀態(tài)，其可以用于更好地預測CRC患者中西妥昔單抗治療的臨床結果。還需要鑒定除KRAS突變狀態(tài)外允許更好地預測西妥昔單抗在CRC治療中的功效的生物標記。在2個西妥昔單抗CRC研究EMR 62202-502和EMR 62202-045中，執(zhí)行了新鮮冷凍的肝轉移灶活檢組織的微陣列分析，以鑒定在一般患者群體或具有KRAS野生型腫瘤的患者中，其表達與應答、無進展生存或總體生存相關的基因。這些基因的表達可以用作西妥昔單抗在CRC中的治療功效的預測性生物標記，和用于更好地鑒定將在CRC中從西妥昔單抗治療中獲得最大利益的那些患者。上述基因的表達被用作生物標記，用于預測西妥昔單抗和其他抗EGFR定向治療抗體在具有CRC的患者中的功效、和用于促進臨床中的治療決定，即患者是否將接受西妥昔單抗或其他抗EGFR定向治療抗體。臨床實踐中的應用是1.自福爾馬林固定的石蠟包埋的(FFPE)或新鮮的腫瘤活檢組織(后者必須直接在液氮中冷凍或用RNA-Iater處理以保存RNA完整性)分析這些基因的mRNA表達?；顧z組織可以得自原發(fā)性腫瘤或轉移灶。mRNA表達的分析可以通過基于PCR的方法(例如實時 PCR, qPCR)使用基因特異性引物擴增目的基因而執(zhí)行，或通過目的基因的mRNA與基因陣列上的基因特異性的固定化雜交探針雜交而執(zhí)行。2.自FFPE或新鮮腫瘤活檢組織(后者必須直接在液氮中冷凍或用RNA-Iater處理以保存RNA完整性)分析這些基因的蛋白質表達?；顧z組織可以得自原發(fā)性腫瘤或轉移灶。蛋白質表達的分析包括方法例如免疫組織化學、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、Luminex、 在膜上的蛋白質印跡和檢測、質譜法。對于可溶性蛋白質自血漿或血清分析蛋白質表達，包括方法例如ELISA、 LuminexiiIH為了建立用于臨床實踐的診斷試驗，候選基因(一種或多種)或蛋白質(一種或多種)的表達水平需要針對另一基因或蛋白質(或多種基因或多種蛋白質的組合)的表達進行標準化，所述另一基因或蛋白質用相同測定法從相同活檢組織中進行評價。這些“標準化”基因或蛋白質可以包括已知在患者之間展示極低變異的細胞持家基因。可替代地，可以測定來自“良好預后”(或不管最終使用的術語如何(例如“敏感性”))組的基因或蛋白質 (或多種基因或多種蛋白質的組合)的表達水平和來自“不良預后”(或例如“抗性”)組的基因或蛋白質(或多種基因或多種蛋白質的組合)的表達水平的比值。后面一種方法提供了優(yōu)點——僅使用與抗EGFR療法的功效直接相關的基因或蛋白質的表達水平。這種方法導致高動態(tài)范圍，不依賴于適宜的持家基因或蛋白質。在實施診斷試驗前，必須定義閾值，其是為了觸發(fā)使用相應抗EGFR療法治療患者的正決定，必須達到的所應用標記(如上所述)的表達水平的比值。這個閾值應以最佳可能方式區(qū)分從抗EGFR治療中獲益的患者和不獲益的患者。此閾值必須源自用抗EGFR療法治療的患者的腫瘤樣品的“訓練集”。隨后閾值必須在來自足夠數目的患者的一個不同腫瘤樣品集合中進行前瞻性驗證，以證明其能夠選出將獲得最大利益的患者或能夠排除將不
1從治療中獲益的患者。在用西妥昔單抗治療CRC患者的2個獨立的臨床研究中(EMR62202-502和EMR 62202-045)，發(fā)現(xiàn)上文和下文描述的基因的表達與應答和/或無進展生存和/或總體生存相關?！?EGFR基因擴增可以預測對于抗EGFR治療的有利結果·后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因擴增的較低發(fā)生率。·方法學/可比較性問題· K-Ras突變“壓倒” EGFR基因擴增在患者中的益處·皮疹迄今為止可能是Erbitux活性(mCRC，NSCLC)的最佳預測性生物標記.Erbitux的WiIII研究FLEX:皮疹的早期發(fā)作(前21天)與延長的總體生存 (OS)相關 在5%患者中發(fā)現(xiàn)BRAF突變· BRAF和KRAS突變是相互排斥的· BRAF突變看起來是一個不良預后標記，而非Erbitux功效的預測標記· mCRC中的AREG和EREG表達不依賴于KRAS突變狀態(tài)·通過組合AREG和EREG表達狀態(tài)與KRAS突變狀態(tài)的額外預測力根據本發(fā)明的實驗，西妥昔單抗處理與基底角質化細胞(basal keratinocytes) 中p-EGFR、p-MAPK和增殖的實質性下調以及p27Kipl和p_STAT3水平的實質性上調相關。 對于不同的施用方案和劑量水平，未注意到在這些效應中的顯著差異。在西妥昔單抗單一治療階段中，僅在其腫瘤是KRAS野生型的患者中實現(xiàn)了應答(8/ 與KRAS突變型腫瘤的 0/19相比；P = . 015)。與KRAS突變型腫瘤比較，無進展生存對于KRAS野生型的患者更長 (logrank, P = . 048)。基因組學/蛋白質組學分析鑒定了與應答相關的候選標記。在西妥昔單抗單一治療的I期劑量遞增試驗中進行的這個轉化研究 (translational study)，據我們所知，是使用藥理基因組學和藥理蛋白質組學分析在一線背景中鑒定西妥昔單抗應答性mCRC的預測性治療前生物標記的首次嘗試。此臨床研究(在其他地方報道)證實西妥昔單抗可以作為第一線療法每兩周以 400-700mg/m2的劑量安全地施用于具有mCRC的患者。以此最高劑量水平未達到MTD，并且以不同劑量水平在不良事件的發(fā)生率或嚴重性或西妥昔單抗的活性上不存在顯著差異。使用皮膚測量靶影響，藥效生物標記評估中的IHC數據顯示在所有這些劑量遞增組中EGFR途經內信號蛋白質的一致抑制。這些數據提供了支持每周和每兩周給藥方案在功能上等價的生物學基礎。單臂和隨機化mCRC研究的回顧分析已證實，腫瘤中KRAS在密碼子12和13上的突變狀態(tài)是西妥昔單抗活性的強預測物，其中治療益處與野生型狀態(tài)緊密聯(lián)系4’7—13。本研究首次解決了在mCRC患者的第一線治療中KRAS突變狀態(tài)對西妥昔單抗單一治療的影響。 與來自用西妥昔單抗治療(作為單一活性劑或與化學療法組合)的先前一系列化療難治性患者的數據一致8’"’13，在研究的單一治療部分中的客觀應答僅在具有KRAS野生型腫瘤的那些患者中觀察到( 個患者中的8個，觀％ )，在具有該基因攜帶突變的腫瘤的患者中未見到應答(19中的0個)(P = . 015)。在具有KRAS野生型腫瘤(55% )和KRAS突變腫瘤 (32% )的患者中最佳的總體應答率(包括在加入F0LFIRI后的應答)與CRYSTAL和OPUS研究(其中西妥昔單抗分別與F0LFIRI和FOLFOX組合作為第一線治療4’12)中獲得的結果相當。在本研究中，在接受與化學療法組合的西妥昔單抗作為第一線治療的具有KRAS突變腫瘤的mCRC患者中觀察到的應答十分可能歸因于化學療法的效應。總體PFS對于其腫瘤為KRAS野生型的患者明顯更長，證實KRAS腫瘤突變狀態(tài)作為與西妥昔單抗治療相關的預測性生物標記的臨床意義。具有KRAS野生型腫瘤的一個患者亞集看起來不獲益于西妥昔單抗治療。因此可以鑒定進一步的預測生物標記，以便于使治療更準確地針對將響應西妥昔單抗的那些患者。近來，已初步描述了 BRAFn^P PII19J突變以及PTEN去調節(jié)19_21的負向預測價值。已推定與西妥昔單抗的臨床活性相關的其他分子標記包括VEGF、IL8、EGFR和PTGS2 (C0X2) 的腫瘤表達水平22 ；在治療過程中VEGF的循環(huán)水平M ；PTGS2和EGFR的組成多態(tài)性 (constitutional polymorphisms)24 禾口 TP53 月中瘤突變狀態(tài) 25。對于一系列抗癌劑，高通量基因組學技術越來越多地被用于預測性生物標記的搜索中％#。在西妥昔單抗的情況下，通過微陣列1(1’3°(未選擇的群體和具有KRAS野生型腫瘤的群體)和定量逆轉錄酶-PCR31 (接受西妥昔單抗加依立替康的患者)方法，已經證實， 在腫瘤中編碼EGFR配體AREG (雙調蛋白)和EREG (表皮調節(jié)素)的基因的高水平表達與 mCRC患者中的臨床活性相關。類似地，在本申請的一線研究中，在總群體和KRAS野生型腫瘤亞組中，AREG和EREG表達看起來在無疾病進展的患者的腫瘤中是升高的。相比之下， TGFa (編碼TGF-α)在無疾病進展的患者中顯示更低水平的表達。KRAS野生型腫瘤的此全面基因表達分析鑒定到推定與在第6周時的疾病控制相關的57種基因(P < . 002)。在這些候選物中，發(fā)現(xiàn) 6 種基因(TNFRSF1B、DNAJC8、ECSIT、G0SR2、PPP1R9A 和 KLK6)具有< 0. 1 假發(fā)現(xiàn)率。用于改善KRAS野生型mCRC中西妥昔單抗功效預測的這些推定生物標記的價值需要進一步研究。血漿蛋白質的Luminex分析揭示，在西妥昔單抗單一療法的治療過程中雙調蛋白和TGF-α水平的強增加，對于EGF也觀察到了此趨勢。這些EGFR配體的上調可能是對于 EGFR抑制的補償反應。有趣的是，雙調蛋白水平的增加在響應西妥昔單抗治療的患者中明顯更低。在應答者中在西妥昔單抗單一治療下觀察到癌胚抗原和癌抗原125和19-9的明顯降低。還值得注意的是，IL-8水平的降低與所有腫瘤以及KRAS野生型腫瘤中的應答明顯相關。IL-8是促進腫瘤細胞增殖和生存且對腫瘤微環(huán)境具有深遠作用的促炎細胞因子32。 IL-8看起來是西妥昔單抗功效的預測生物標記。此外，根據本發(fā)明，當EGFR和VAV3在HEK 293細胞中表達時，可以檢測到EGFR和 VAV3的直接相互作用。這說明VAV3在EGFR信號中的直接和顯著作用以及在觀察到的高 VAV3表達水平和西妥昔單抗的抗EGFR治療活性的調節(jié)之間的直接聯(lián)系。本發(fā)明首次證實，在第一線情況中用抗EGFR抗體優(yōu)選西妥昔單抗(每兩周和每周施用)作為單一活性劑進行治療，將有益于具有KRAS野生型腫瘤的mCRC患者。此外，在此早期研究中的全面基因表達分析已產生了與某些基因的表達和西妥昔單抗的臨床活性相關的許多有意義的結果。這些觀察促使可以使用不同方法學在更大的患者系列上進行驗證。這些研究的結果，為優(yōu)化在患有不同癌癥特別是CRC或mCRC的患者中用西妥昔單抗或具有類似活性的抗EGFR抗體進行的治療，提供了合理的基礎。EGFR途徑組分的免疫組織化學分析
從多達35個患者中獲得可評估的配對基線/第4周皮膚活檢組織，以分析所評價的標記的藥效學改變。與基線樣品比較，在第4周中觀察到p-EGFR、p-MAPK和增殖的實質性下調(如通過Ki67染色評價的)。平行地，觀察到p27Kipl和P-STAT3的實質性上調。在不同的施用方案和劑量水平的分析中，對于基線到治療中時間點，患者組間在這些標記的水平的改變上不存在相關差異(圖21A)。從高達17個患者中獲得可評估的配對基線/第4周腫瘤活檢組織。在治療后在腫瘤細胞中觀察到增殖的減少以及P-EGFR和p-MAPK的顯著下調(圖21B)。然而，p27KiP1、 P-STAT3和ρ-ΑΚΤ水平通過西妥昔單抗治療未發(fā)生顯著改變(數據未顯示)。此小數目的可得配對腫瘤活檢組織不允許將劑量組和應答變量與生物標記水平的改變進行比較。KRAS突變分析KRAS密碼子12或13突變在19/48 (40%)患者樣品中檢測到(G12V，9個患者； G13D，5個患者；G12D，4個患者；G12A，1個患者)。在西妥昔單抗單一治療階段中，在此48個患者中存在8個部分應答O3Rs)。所有均在其腫瘤為KRAS野生型的患者中(8/29 ；28%). 在其腫瘤攜帶KRAS突變的19個患者中未報道應答(P = . 015)(表1)。在總體研究(單一治療和聯(lián)合治療階段)中，應答在具有KRAS野生型的16/29(55%)患者和具有KRAS突變型腫瘤的6/19(32%)患者中見到(P = .144)。與其腫瘤攜帶突變的那些患者比較，PFS在其腫瘤為KRAS野生型的患者中明顯更長(圖22 ；中值9. 4對5. 6個月，風險比0. 47 ；Iogrank P = .048)?；虮磉_的微陣列分析來自基線和第4周時間點的總共106個腫瘤來源樣品與Affymetrix GeneChip HG-U133Plus 2. 0陣列雜交?；谝话愕馁|量控制參數，4個陣列從進一步分析中排除，并且由于正常肝組織污染的存在，M個樣品被排除(圖16 ；補充材料)并且未進一步分析。 在此成對排除后，來自42個ITT患者(36個基線，沈個第4周20對)的62個陣列數據集保留用于分析。對于分析的腫瘤樣品，基于變異性、信號強度和探針組注釋(參見補充方法)，預過濾來自54，675個探針組的數據。此方法使腫瘤表達分析局限于15，230個探針組，代表 10，538個基因。根據應答進展性疾病(PD ；η = 12)相對于在第6周時的疾病控制(n = 23 ； 1個患者不可評估)，以及針對最佳總體應答PD和穩(wěn)定疾病(SD) (n = 19)相對于I3R (η =14 ;3個患者不可評估)，全局比較基線預過濾后的數據，在此全局比較中，P值的分布 (數據未顯示)基本上與偶然預期的一樣，提示對于全體群體未鑒定到預測應答的基因表達譜。然而，使分析局限于KRAS野生型腫瘤(具有PD的8個患者相對于具有疾病控制的11 個患者)，鑒定到57個探針組，其表達模式推定與在第6周時的疾病控制相關(P < . 002 ； 圖23)。利用0. 1的假發(fā)現(xiàn)率(FDR)閾值(關于FDR定義，參見補充方法部分)，發(fā)現(xiàn)6種基因與疾病控制顯著相關(TNFRSF1B, P = 6. 90Ε-07 ；DNAJC8, P=L 60Ε-06 ；ECSIT, P = 6. 80Ε-06 ；G0SR2, P = 3. 90Ε-05，在顯示疾病控制的患者中具有更高表達；以及PPP1R9A，P =8. 90Ε-07和KLK6，P = 3. 00Ε-05，在具有PD的患者中具有更高表達)。使用從具有來自基線和第4周時間點的可用樣品的患者得到的數據，檢查與應答相關的治療中改變。與PD(n = 8)比較，未鑒定到看起來與在第6周時的疾病控制(η = 12)緊密相關的表達改變?？紤]與化學療法的組合，PR(n = 7)相對于SD/PD(n = 13)在表達譜上的比較揭示了 47個探針組顯示出在治療中改變上的差異(P < . 002，調節(jié)性t檢驗， 參見圖17)。在具有KRAS野生型腫瘤的患者中，以及在所分析患者的全集中，基線EREG(表皮調節(jié)素)和AREG(雙調蛋白)表達水平在響應西妥昔單抗的那些腫瘤中更高(圖對；圖 18)。這些發(fā)現(xiàn)與Khambata-Ford等人報道的結果一致10。有趣的是，TGFA (TGF-α )表現(xiàn)出了相反表達模式(圖M ；圖18)。在已知直接或間接參與EGFR信號傳導的其他基因中， 例如ERBB受體以及配體ERBB3 (HER3)和ERBB2 (HER2)顯示出在具有I3R作為最佳總體應答的腫瘤中更強下調的趨勢(圖19)。血漿蛋白質組學使用Luminex技術在血漿樣品中分析了 97種不同蛋白質的濃度。該組蛋白質包括 EGFR配體、其他生長因子、白細胞介素和各種其他候選蛋白質。在西妥昔單抗單一治療階段中，在基線和第4周之間白細胞介素(IL)-8、巨噬細胞炎性蛋白(MIP)-Ia以及腫瘤標記癌胚抗原、癌抗原125和19-9的血漿水平降低與在第6周時的應答顯著地相關(P < . 01) (圖25A)。雙調蛋白血漿濃度的一般性強增加在對于西妥昔單抗單一治療具有部分應答的患者中顯著更弱(P < . 01)(圖25A)。當分析局限于具有KRAS野生型腫瘤的患者時，也在癌胚抗原、癌抗原19-9、IL-8和雙調蛋白上發(fā)現(xiàn)了與在第6周時的應答的相關性(來自M 個患者的數據，圖25B)。此外，在西妥昔單抗單一治療治療的前4周過程中在血漿中觀察到 TGF- α和EGF水平的一般性增加(不依賴于應答)和可溶性EGFR的降低。在所研究的基因和候選物(顯示出表達水平和接受西妥昔單抗的轉移性結腸直腸癌(mCRC)患者中的治療成功性相關)中，VAV3是特別有意義的。在研究EMR 62202-502 中，高腫瘤VAV3mRNA表達水平不僅與對西妥昔單抗與依立替康的組合的更佳應答強相關 (圖26)，還與無進展生存(PFS)(圖27)和總體生存(OS)(圖28)強相關。此外，發(fā)現(xiàn)高腫瘤VAV3表達水平與具有KRAS野生型腫瘤的患者中的應答和延長的PFS尤其相關(參見圖 1和圖29)。因此，VAV3表達看起來是用于在具有KRAS野生型腫瘤的患者中預測西妥昔單抗療法在CRC中的臨床結果的良好生物標記候選物，其將幫助進一步優(yōu)化對如下患者的選擇，所述患者將從西妥昔單抗治療中獲得最大利益。有趣的是，當EGFR和VAV3在HEK 293細胞中表達時，可以檢測到EGFR和VAV3的直接相互作用(圖30)。這提示VAV3在EGFR信號傳導中的直接作用、以及VAV3表達水平和抗EGFR治療的活性變化之間的直接聯(lián)系。
實施例臨床研究EMR 62202-502 該隨機化研究在具有EGFR表達性mCRC (包括依立替康的治療失敗)的患者(Pts)中調查西妥昔單抗的劑量遞增?；颊咴陂_始西妥昔單抗G00mg/m2初始劑量，隨后250mg/m2/周[w])和I (180mg/m2q 2w)后22天，如果他們未經歷> 1度(G)皮膚反應、任何其他> G2西妥昔單抗相關不良事件并且對于I耐受，則進行隨機化分組。隨機化分入標準西妥昔單抗劑量組(A組；250mg/m2/w)或劑量遞增組(B組；西妥昔單抗劑量以50mg/m2q 2w增加，直至> G2毒性、腫瘤應答或劑量=500mg/m2)。未隨機化的患者(C 組)繼續(xù)用標準西妥昔單抗劑量。主要終點是在治療前和治療過程中采集的皮膚和腫瘤
19活檢組織中，與標準西妥昔單抗方案比較劑量遞增對EGFR和下游信號標記的影響。次要終點是PK、功效、安全性、耐受性、在腫瘤活檢組織和血漿樣品上的生物標記分析。從腫瘤活檢組織分析KRAS突變狀態(tài)。EMR 62202-045 此研究調查在具有轉移性結腸直腸癌的患者中西妥昔單抗的每兩周施用的安全性和藥物代謝動力學。第二目的包括藥效學生物標記分析。患者接受西妥昔單抗單一治療6周，隨后為西妥昔單抗加F0LFIRI直至疾病進展?；颊咴趯φ战M中以 400mg/m2初始劑量隨后250mg/m2/周接受西妥昔單抗，在劑量遞增組中以400-700mg/m2， 每兩周，接受西妥昔單抗。從腫瘤活檢組織分析KRAS突變狀態(tài)。用于基因表汰(微陣列)分析的腫瘤材料EMR 62202-502 在基線時(治療前)、在第22天時、以及可能的話在劑量遞增組 (B組)中在患者的疾病進展時，通過開放手術、內窺鏡術或Core針/細針活檢，獲得腫瘤材料。樣品在液氮中進行速凍。EMR 62202-045 在基線時、在第4周時、以及可能的話在疾病進展時，通過開放手術、內窺鏡術或Core針/細針活檢，獲得腫瘤材料。樣品在液氮中進行速凍。RNA表汰譜分析在補充方法部分中詳述了與微陣列分析有關的實驗程序。簡言之，速凍的腫瘤活檢組織進行勻漿化，并且使用RNeasy Micro KW Oliagen，Hilden)提取總RNA。根據 Affymetrix Two-Cycle Eukaryotic Target標記方案，從所有樣品中制備用于陣列雜交實驗的生物素化的靶cRNAs。對于分析的每一腫瘤，在此cRNA擴增/標記法的第一 cDNA合成反應中包括了起始50ng總RNA。標記的cRNA隨后與Affymetrix GeneChip HG_U133Plus 2. 0基因表達陣列在45°C以60rpm雜交16小時。在雜交后，在Affymetrix Fluidics Station 450上染色陣列，并且使用GeneChip Manner定量信號。使用Affymetrix GCOS 專利軟件和Bioconductor包，affyPLM，執(zhí)行原始表達數據的質量控制和預處理。EMR 62202-502 在已執(zhí)行所有質量控制檢查和預處理步驟后，來自意向治療 (ITT)群體的47個受試者的總共68個陣列數據集對于進一步分析是合格的。基線樣品從 35個受試者獲得。EMR 62202-045 在已執(zhí)行所有質量控制檢查和預處理步驟后，來自42個ITT患者的總共62個陣列數據集對于進一步分析是合格的。基線樣品從36個受試者獲得。對于在2個研究的至少一個中基于變異性和信號強度通過了初始過濾的具有可靠基因注釋的所有Affymetrix探針組(代表10785種基因的16414個Affymetrix探針組)，進行了統(tǒng)計分析。在應答者和非應答者之間(EMR 62202-502)比較，或在西妥昔單抗單一治療6周后具有疾病控制的患者與具有進展性疾病的患者之間(EMR62202-045)比較，用Welch t檢驗鑒定了其表達與臨床應答相關的基因。使用Cox比例風險回歸，鑒定了其表達與無進展生存或總體生存相關的基因(EMR 62202-502)。針對患者全集以及僅針對具有KRAS野生型腫瘤的患者，執(zhí)行了這些分析。使用單研究單側ρ值的乘積作為檢驗統(tǒng)計量和來自這些乘積的零分布(null distribution)的衍生ρ值，進行了跨此2個研究的元分析(meta-analysis)以鑒定應答相
關基因。
在低于0. 01和0. 0001的范圍中的P值，特別是低于0. 01，優(yōu)選0. 005、更優(yōu)選 0. 002、最優(yōu)選0. 0005或0. 0001 (來自與臨床應答的相關性的元分析，和來自與無進展生存和總體生存的相關性的EMR 62202-502分析)，視為統(tǒng)計上顯著的。對于代表179種已知基因的200個Affymetrix探針組，在至少一個比較中滿足了這個標準。患者合格性和研究設計在分開的手稿中已全面地報道了合格性標準和研究設計。簡言之，研究分成2個部分；持續(xù)6周的西妥昔單抗單一治療階段和聯(lián)合治療階段，在聯(lián)合治療階段中患者接受與單一治療階段相同劑量/方案的西妥昔單抗和方案基于依立替康的F0LHRI?；颊唔槾伪环值綐藴拭恐芊桨负蛣┝康奈魍孜魡慰菇MGOOmg/m2，隨后為250mg/m2的每周劑量)，或每兩周方案的西妥昔單抗劑量遞增組(具有從400到700mg/m2的不同群組)。在西妥昔單抗單一治療6周后，作為最佳總體應答(單一治療和聯(lián)合治療階段)，報道了臨床應答。患者材料的收集和貯存在基線時和在第沈-觀天(第4周)時獲得皮膚活檢組織。如果出現(xiàn)皮疹，那么從無疹區(qū)域中獲得樣品。將活檢組織立即浸入20倍其體積的中性緩沖甲醛溶液內， 并且在室溫保持8-16小時。使用梯度乙醇系列使固定的樣品脫水至二甲苯，并且在真空下在60°C縱向包埋到石蠟中。在基線時、在第4周時和可能的話在疾病進展時，通過開放手術、內窺鏡術或Core針/細針活檢，獲得腫瘤材料。如先前所述13a，1個樣品/時間點進行甲醛固定和石蠟包埋，3個樣品在液氮中速凍。為了提供正常DNA，在基線時從每個患者中獲得IOml全血，并且貯存于-20°C或更低直至使用。對于Luminex分析，在基線和第4周時收集血漿(2. 5ml)，并且貯存于-80°C。免疫組織化學甲醛固定石蠟包埋的(FFPE)組織的免疫組織化學(IHC)分析用于研究下述蛋白質的表達EGFR、磷酸(ρ) -EGFR、p-MAPK、Ki67 (MIBl)、p27KiP1 (CDKNlB)和 p_STAT3 (皮膚和腫瘤活檢組織)；HER2、p-HER2和p-AKT(腫瘤活檢組織)。如先前描述的執(zhí)行免疫組織化學分析。13a使用的抗體和方法的細節(jié)在補充方法部分中提供。KRAS突變分析FFPE患者來源的存檔腫瘤組織從意向治療(ITT)群體的48個患者中獲得。提取DNA且就KRAS密碼子12和13突變的存在進行篩選，其中使用由Chen等人， 200414(LightMix, k-ras Glyl2, TIB MOLB10L, Berlin，德國)改良的聚合酶鏈反應(PCR) 發(fā)夾和熔解曲線技術(PCRclamping and melting curve，如先前描述的12)。RNA表達譜分析在補充方法部分中詳述了與微陣列分析有關的實驗程序。簡言之，速凍的腫瘤活檢組織進行勻漿化，并且使用RNeasy Micro KW Oliagen，Hilden)提取總RNA。根據 Affymetrix Two-Cycle Eukaryotic Target標記方案，從所有樣品中制備用于陣列雜交實驗的生物素化的靶cRNAs。對于分析的每一腫瘤，在此cRNA擴增/標記過程的第一 eDNA合成反應中包括了起始50ng總RNA。標記的cRNA隨后與Affymetrix GeneChip HG_U133Plus 2. 0基因表達陣列在45°C以60rpm雜交16小時。在雜交后，在Affymetrix Fluidics Station 450上染色陣列，并且使用GeneChip Manner定量信號。使用Affymetrix GCOS 專利軟件和Bioconductor包affyPLM，執(zhí)行原始表達數據的質量控制。15如果從樣品個體獲得重復陣列，那么選擇具有最佳質量控制評價的數據集用于分析。使用GCRMA算法執(zhí)行原始探針水平強度數據的預處理。w蛋白質組學分析^fc Rules-Based Medicine (Austin, Texas, US)，Luminex χΜΑΡ ^^^ 臺(如補充方法部分中所述)，對來自血漿的97種蛋白質(HumanMAP版本1.6加雙調蛋白、β-cellulin、EGFR、肝素結合(HB)-EGF、表皮調節(jié)素、白細胞介素-18、轉化生長因子 (TGF)-a和血小板反應蛋白-1)的多重分析。在來自隨后入選試驗的患者的23個樣品中僅評價了 β -eelIulin、EGFR 和 HB-EGF。統(tǒng)計學分析對于腫瘤是KRAS野生型或突變型的患者，分別使用Fisher確切檢驗和Iogrank 檢驗，比較了應答率和無進展生存(PFQ——定義為從西妥昔單抗的第一次輸注直到在西妥昔單抗和F0LFIRI組合下首次放射學證實疾病進展的持續(xù)時間。使用Bioconductor軟件15和SAS版本9. 1執(zhí)行IHC、微陣列和蛋白質組學數據的所有統(tǒng)計分析(參見補充方法)。這些探索性分析被認為生成假設。參考文獻(相關的和/或在本說明書中使用的)1. 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權利要求
1.一種用于預測患有KRAS野生型EGFR表達腫瘤的患者作為EGFR抗體治療的候選者將響應以所述抗EGFR抗體進行的治療的可能性的體外方法，所述方法包括在得自所述患者的組織樣品中，通過對來自所述患者的腫瘤組織的核酸樣品施用PCR或RNA或DNA陣列或相當的診斷工具或裝置，測定一種或多種預后基因或其基因表達產物的表達水平，其中(i)與參考值比較，選自下組基因的基因或基因產物的高表達指示所述患者可能響應所述治療ADAMDEC1,BSDCl,Clorf144,CAPZB，CDC42,DHCR7，DNAJC8，ECSIT，EXOSC10,FADS1,GBA, GLT25D1, G0SR2, IMPDHl，KLHL21, KPNA6, KPNB1，LSMl2，MANlBl, MIDN, PPAN, SH3BP2, SQLE， SSH3, TNFRSF1B, URMl, ZFYVE26, RGMB, SPIRE2, ABCC5, ACSL5, AOAH, AXIN2, CD24, CEACAM5, CEACAM6, ETS2, FMNL2, GPSM2, HDAC2, JUN, ME3, MED17, MYB, MYC, NEBL, NOSIP, PITX2, P0F1B, PPARG, PPP1R14C, PRRl5, PSMGl，RAB15，RAB40B, RNF43, RPS23, SLC44A3, S0X4, THEM2, VAV3, ZNF337, EPDRl, KCNK5, KHDRBS3, PGM2L1, STK38，和 SHR00M2，禾口( )與參考值比較，選自下組基因的基因或基因產物的高表達指示所述患者可能不響應所述治療C7orf46, CAST, DCP2, DIP2B, ERAPl， INSIG2, KIF21A, KLK6, NGRN, NRIPl， PHGDH, PPP1R9A, QPCT, RABEP1, RPAl，RPL22L1, SKPl，SLC25A27, SLC25A46, S0CS6, TPD52, ZDHHC2, ZNF654，ASB6，ATM，BMI1，CDC42EP2，EDEM3，PLLP，RALBP1，SLC4A11，TNFSF15，TPK1，C11orf9， C1QC, CABLES 1, CDK6, EHBPl，EX0C6, EXTl，F(xiàn)LRT3, GCNT2, MTHFS, PIK3AP1, ST3GAL1, TK2, ZDHHC14, ARFGAP3, AXUD1, CAPZB, CHSYl，DNAJB9，GOLTIB, HSPA5, LEPR0TL1, LIMSl, MAPK6, MY06, PROSC, RAB8B, RAP2B, RWDD2B, SERTAD2, S0CS5, TERF2IP, TIALl， TIPARP, TRIM8, TSC22D2, TGFA, VAPAjP UBE2K。
2.權利要求1的方法，其中用所述抗EGFR抗體的治療為一線治療，并且選自(i)基因組的基因或基因表達產物是 ADAMDEC1、BSDCl、Clorfl44、CAPZB, CDC42、DHCR7、DNAJC8、 ECSIT、EX0SC10、FADS1、GBA、GLT25D1、G0SR2、IMPDH1、KLHL21、KPNA6、KPNB1、LSM12、MAN1B1、 MIDN、PPAN、SH;3BP2、SQLE、SSH3、TNFRSF1B、URMl、VAV3 和 ZFYVE^ 中的一種或多種，選自組 (ii)的是 C7orf46、CAST、DCP2、DIP2B、ERAPU INSIG2、KIF21A、KLK6、NGRN、NRIPU PHGDH, PPP1R9A、QPCT, RABEPU RPAl，RPL22L1、SKPl、SLC25A27、SLC25A46、S0CS6、TPD52、TGFA, ZDHHC2和ZNF654中的一種或多種。
3.權利要求1的方法，其中用所述抗EGFR抗體的治療是在所述患者已發(fā)展了化療難治性腫瘤后與化學治療劑的聯(lián)合治療，并且選自組(i)的基因或基因表達產物是RGMB、 SPIRE2、ABCC5、ACSL5、AOAH、AXIN2、CD24、CEACAM5、CEACAM6、ETS2、FMNL2、GPSM2、HDAC2、 JUN、ME3、MED17、MYB、MYC、NEBL, NOSIP、PITX2、P0F1B、PPARG, PPP1R14C、PRRl5, PSMGl、 RAB15、RAB40B、RNF43、RPS23、SLC44A3、S0X4、THEM2，VAV3、ZNF337、EPDRl、KCNK5、KHDRBS3、 PGM2L1、STK38 和 SHR00M2 中的一種或多種，選自組(ii)的是 ASB6、ATM、BMI1、CDC42EP2、 EDEM3、PLLP、RALBP1、SLC4A11、TNFSF15、TPK1、C11orf9、C1QC、CABLES1、CDK6、EHBP1、EX0C6、 EXT1、FLRT3、GCNT2、MTHFS、PIK3AP1、ST3GAL1、TK2、ZDHHC14、ARFGAP3、AXUD1、CAPZB、CHSY1、 DNAJB9、G0LT1B、HSPA5、LEPR0TL1、LIMSl、MAPK6、MY06、PROSC、RAB8B、RAP2B、RWDD2B、 SERTAD2、S0CS5、TERF2IP、TIALl、TIPARP、TRIM8、TSC22D2、TGFA、VAPA 和 UBE2K 中的一種或多種。
4.權利要求3的方法，其中臨床應答是總體生存時間(0S)，并且選自組(i)的基因或基因表達產物是 EPDRl、KCNK5、KHDRBS3、PGM2L1、SHR00M2、STK38 和 VAV3 中的一種或多種， 選自組(ii)的是 ASB6、ATM、BMIU CDC42EP2、EDEM3、PLLP, RALBPU SLC4A11、TNFSF15 禾口 TPKl中的一種或多種。
5.權利要求3的方法，其中臨床應答是無進展生存時間(PFS)，并且選自組⑴的基因或基因表達產物是 ACSL5、A0AH、AXIN2、CD24、CEACAM5、CEACAM6、ETS2、FMNL2、GPSM2、HDAC2、 JUN、ME3、MED17、MYB、MYC、NEBL, NOSIP、PITX2、P0F1B、PPARG, PPP1R14C、PRRl5, PSMGl、 RAB15、RAB40B、RNF43、RPS23、SLC44A3、S0X4、THEM2, VAV3 和 ZNF337 中的一種或多種，選自組(i i)的是 C11 orf9、C1QC、CABLES 1、CDK6、EHBP1、EX0C6、EXT1、FLRT3、GCNT2、MTHFS1、 PIK3AP1、ST3GAL1、TK2 和 ZDHHC14 中的一種或多種。
6.權利要求3的方法，其中臨床總體應答(OR)按照部分應答相對于穩(wěn)定或進展性疾病進行測量，并且選自組(i)的基因或基因表達產物是VAV3、RGMB和SPIRE2中的一種或多種，選自組(ii)的是 ARFGAP3、AXUD1、CAPZB、CHSY1、DNAJB9、GOLTIB、HSPA5、LEPR0TLU LIMS1、MAPK6、MY06、PROSC、RAB8B、RAP2B、RWDD2B、SERTAD2、S0CS5、TERF2IP、TIALUTIPARP、 TRIM8、TSC22D2、TGFA, VAPA 和 UBE2K 中的一種或多種。
7.權利要求1-6中任一項的方法，其中參考值通過得自參考患者或參考患者組的特定功能或臨床特性、和/或特定表達譜中的一種或多種進行定義。
8.權利要求7的方法，其中所述參考值得自不表達或幾乎不表達所述基因或基因產物的參考患者或患者組。
9.權利要求1-8中任一項的方法，其中參考值是對照基因的表達閾值或選自組(i)的基因的基因表達與選自組(ii)的基因的基因表達的比值，或參考值是由待測定的特定臨床應答參數或由特定處理前或處理條件定義的表達閾值。
10.權利要求9的方法，其中臨床應答參數是無進展生存時間(PFS)、總體生存時間 (OS)、部分應答(PR)、穩(wěn)定疾病(SD)、進展性疾病(PD)或其組合。
11.權利要求1-10中任一項的方法，其中在用所述抗EGFR抗體治療前自所述患者獲得組織樣品。
12.權利要求11的方法，其中還在用所述抗EGFR抗體治療時從所述患者獲得組織樣
13.權利要求12的方法，其中將治療中獲得的所述基因或基因表達產物的表達水平與在所述患者開始治療前獲得的值比較。
14.權利要求1-13中任一項的方法，其中患者樣品源自腫瘤組織。
15.權利要求1-13中任一項的方法，其中患者樣品源自血漿。
16.權利要求1-15中任一項的方法，其中測定由所述基因編碼的表達蛋白質的水平。
17.一種用于預測患有KRAS野生型EGFR表達癌癥的患者將在治療上響應以抗EGFR抗體進行的治療的可能性的體外方法，所述方法包括(a)通過診斷工具和/或診斷裝置在來自所述患者的腫瘤組織或血漿的活檢組織樣品中測量選自組⑴和/或選自組(ii)的一種或多種生物標記的表達水平，其中組(i)由ADAMDEC1、BSDCl、Clorf 144、CAPZB, CDC42、 DHCR7、DNAJC8、ECSIT、EXOSC10、FADS1、GBA、GLT25D1、G0SR2、IMPDHl、KLHL21、KPNA6、KPNB1、 LSMl2, MANlBl、MIDN、PPAN、SH3BP2、SQLE, SSH3、TNFRSF1B、URMl、ZFYVE26、RGMB, SPIRE2、ABCC5、ACSL5、AOAH、AXIN2、CD24、CEACAM5、CEACAM6、ETS2、FMNL2、GPSM2、HDAC2、JUN、ME3、 MED17、MYB、MYC、NEBL，N0SIP、PITX2、P0F1B、PPARG、PPP1R14C、PRR15、PSMG1、RAB15、RAB40B、 RNF43、RPS23、SLC44A3、S0X4、THEM2、VAV3、ZNF337、EPDRl、KCNK5、KHDRBS3、PGM2L1、STK38、 SHR00M2 組成，且組(ii)由 C7orf46、CAST、DCP2、DIP2B、ERAPl、INSIG2、KIF21A、KLK6、NGRN、 NRIPl、PHGDH、PPP1R9A、QPCT, RABEPU RPAl，RPL22L1、SKPl、SLC25A27、SLC25A46、S0CS6、 TPD52、ZDHHC2、ZNF654、ASB6、ATM、BMI1、CDC42EP2、EDEM3、PLLP、RALBP1、SLC4A11、TNFSF15、 TPKl、Cllorf9、C1QC、CABLES 1、CDK6、EHBP1、EX0C6、EXTl、FLRT3、GCNT2、MTHFS、PIK3AP1、 ST3GAL1、TK2、ZDHHC14、ARFGAP3、AXUD1、CAPZB、CHSY1、DNAJB9、GOLTIB、HSPA5、LEPR0TL1、 LIMS1、MAPK6、MY06、PROSC、RAB8B、RAP2B、RWDD2B、SERTAD2、S0CS5、TERF2 IP、TIALU TIPARP、 TRIM8、TSC22D2、TGFA, VAPA和UBEI組成，(b)使來自所述患者的腫瘤或血漿的組織樣品離體暴露于所述抗EGFR抗體，(c)在步驟(b)的所述暴露的組織樣品中再次測量步驟(a) 中所述的一種或多種生物標記的表達水平，和(d)計算在步驟(b)和(c)中測量的表達水平的差異，其中與步驟(a)比較，在步驟(c)中獲得的組⑴的生物標記的表達水平增加指示所述患者在治療上響應用所述抗EGFR抗體的治療的可能性增加，并且其中與步驟(a)比較， 在步驟(c)中獲得的組(ii)的生物標記的表達水平增加指示所述患者在治療上響應用所述抗EGFR抗體的治療的可能性減少。
18.權利要求1-17中任一項的方法，其中所述基因或基因表達產物選自TNFRSF1B、 DNAJC8、ECSIT、G0SR2、PPP1R9A、VAV3 和 KLK6。
19.權利要求1-17中任一項的方法，其中來自組(i)的基因或基因表達產物之一是 TGFa0
20.權利要求19的方法，其中測定VAV3和TGi^i的表達水平。
21.權利要求1-17中任一項的方法，其中來自組(ii)的基因或基因表達產物之一是 AREG 或 EREG。
22.權利要求19-21中任一項的方法，其中測定TGFaJPAREG或EREG、及任選地VAV3 和/或EGF的表達水平。
23.權利要求1-22中任一項的方法，其中患有KRAS野生型EGFR表達腫瘤的所述患者還在腫瘤組織中具有EGFR突變。
24.權利要求23的方法，其中所述EGFR突變是R521K多態(tài)性。
25.權利要求I-M中任一項的方法，其中所述抗EGFR抗體是c225(西妥昔單抗)。
26.權利要求25的方法，其中患者患有的腫瘤是結腸直腸癌(CRC)或轉移性結腸直腸癌(mCRC)。
27.權利要求沈的方法，其中另外還測定AREG和/或EREG或其表達產物的表達水平， 并且與組⑴和/或組(ii)的基因或基因表達產物中的一種或多種比較。
28.權利要求27的方法，其中測定AREG和/或EREG和至少TGFA和/或VAV3和/或 EGF或其基因表達產物的表達水平。
29.DNA或RNA陣列，其包含固定在固體表面上由下述基因呈現(xiàn)的或與下述基因雜交的多核苷酸的排列TNFRSF1B、DNAJC8、ECSIT、G0SR2、PPP1R9A、KLK6、C7orf46、SSH3。
30.權利要求四的基因陣列，其進一步包含由下述基因呈現(xiàn)的或與下述基因雜交的多核苷酸的排列SERTAD2、AXIN2、C10orf99、ETS2、PITX2、PRR15、VAV3、編碼 IKK 相互作用蛋白質的基因、EDEM3、LY6G6D。
31.權利要求四或30的基因陣列，其還包含與基因AREG和/或EREG和/或TGFA雜交的多核苷酸。
32.由多核苷酸的排列組成的DNA或RNA陣列，所述多核苷酸由下述基因呈現(xiàn)或與下述基因雜交TNFRSFIB、DNAJC8、ECSIT、G0SR2、PPP1R9A、KLK6、C7orf46、SSH3、SERTAD2、AXIN2、 C10orf99、ETS2、PITX2、PRRl5, VAV3、編碼 IKK 相互作用蛋白質的基因、EDEM3、LY6G6D、 AREG、EREG 禾口 TGFA0
33.包含固定在固體表面上的多核苷酸的排列的DNA或RNA陣列，其中由基因呈現(xiàn)或與所述基因雜交的所述多核苷酸排列在陣列上，其中所述多核苷酸的排列選自(a)ADAMEC1，C7orf46，CAST,DHCR7，ERAPl，F(xiàn)ADSl，INSIG2,KLK6，MIDN，PHGDN,PPP1R9A, QPCT, RABEP1, RPL22L1, SLC25A27, S0CS6, SQLE, TNFRSF1B, TPD52, ZDHHC2,(b)GOLTIB, HSPA5, LEPR0TL1, MAPK6, PROSC, RGMB, RWDD2B, SERTAD2, SPIRE2,(c)ASB6,ATM, BMI1，CDC42EP2, EDEM3, KCNK5, PGM2L1, RALBP1, SHR00M2, TNFSF15；(d)ACSL5,C1QC,CBALES1, CDK6, EHBPl，ETS2, EX0C6, EXTl，F(xiàn)MNL2, HDAC2, JUN, MED17, MTHFS, PITX2, P0F1B, PRRl5, PSMGl，RAB15, RAB40B, RNF43, SLC44A3, S0X4, TK2, TNFSFl5, ZDHHC14,(e)ZDHHC14,TK2, PRR15, MTHFS, CABLES1, EHBP1, MED17, BMI1, CDC42EP2, EDEM3, PGM2L1, RGMB, ADAMEC1, ERAPl，F(xiàn)ADSl，KLK6, PHGDH, PPP1R9A, QPCT, SLC25A27, TNFRSF1B, ZDHHC2.
34.權利要求33的基因陣列，其還包含由基因AREG和/或EREG和/或TGFA呈現(xiàn)或與基因AREG和/或EREG和/或TGFA雜交的多核苷酸。
35.一種用于遺傳學抗EGFR抗體生物標記的實時PCR擴增的試劑盒，其包括包含如權利要求1中所述的組(i)和/或組(ii)的一種或多種基因的DNA或RNA的第一包裝、包含與所述第一包裝中的所述DNA/RNA分子特異性雜交的PCR引物的第二包裝、包含孔板的第三包裝、和包含用于使實時PCR擴增能夠實施的診斷工具和溶劑的第四包裝。
36.權利要求35的試劑盒，其中所述第一包裝包含下述基因的DNA/RNA:TNFRSF1B、 DNAJC8、ECSIT、G0SR2、PPP1R9A、KLK6、C7orf46、SSH3、SERTAD2、AXIN2、C10orf99、ETS2、 PITX2、PRRl5, VAV3、編碼 IKK 相互作用蛋白質的基因、EDEM3、LY6G6D、AREG, EREG 和 TGFA， 任選加上AREG或EREG。
37.一種或多種遺傳學生物標記或基因陣列或用于遺傳學抗EGFR抗體生物標記的實時PCR擴增的試劑盒用于預測預期用于治療的抗EGFR抗體對于患有KRAS野生型EGFR表達癌癥的患者的藥學功效和/或臨床反應的用途，其中，所述遺傳學生物標記或基因陣列或試劑盒包含一種或多種生物標志，選自ADAMDEC1,BSDCl,Clorf144,CAPZB，CDC42，DHCR7，DNAJC8，ECSIT，EXOSC10,FADS1,GBA, GLT25D1, G0SR2, IMPDHl，KLHL21, KPNA6, KPNB1，LSMl2，MANlBl，MIDN，PPAN, SH3BP2, SQLE， SSH3, TNFRSF1B, URMl, ZFYVE26, RGMB, SPIRE2, ABCC5, ACSL5, AOAH, AXIN2, CD24, CEACAM5, CEACAM6, ETS2, FMNL2, GPSM2, HDAC2, JUN, ME3, MED17, MYB, MYC, NEBL, NOSIP, PITX2, P0F1B, PPARG, PPP1R14C, PRRl5, PSMGl, RAB15, RAB40B, RNF43, RPS23, SLC44A3, S0X4, THEM2, VAV3,ZNF337, EPDRl，KCNK5, KHDRBS3, PGM2L1, STK38, SHR00M2 ；C7orf46, CAST, DCP2, DIP2B, ERAPl， INSIG2, KIF21A, KLK6, NGRN, NRIPl， PHGDH, PPP1R9A, QPCT, RABEP1, RPAl，RPL22L1, SKPl，SLC25A27, SLC25A46, S0CS6, TPD52, ZDHHC2, ZNF654，ASB6，ATM，BMI1，CDC42EP2，EDEM3，PLLP，RALBP1，SLC4A11，TNFSF15，TPK1，C11orf9， C1QC, CABLES 1, CDK6, EHBP1, EX0C6, EXT1, FLRT3, GCNT2, MTHFS, PIK3AP1, ST3GAL1, TK2, ZDHHC14, ARFGAP3, AXUD1, CAPZB, CHSYl，DNAJB9，GOLTIB, HSPA5, LEPR0TL1, LIMSl, MAPK6, MY06, PROSC, RAB8B, RAP2B, RWDD2B, SERTAD2, S0CS5, TERF2IP, TIALl， TIPARP, TRIM8, TSC22D2, TGFA, VAPAjP UBE2K，任選地加上AREG和/或EREG，或其相應的蛋白質表達產物，其中通過針對由基礎臨床測定參數確定的閾值計算表達水平的差異，而導致所述預測。
38.權利要求37的用途，其中使用下述生物標記中的至少一種TNFRSF1B、DNAJC8、 ECSIT、G0SR2、PPP1R9A、KLK6、C7orf46、SSH3、SERTAD2、AXIN2、C10orf99、ETS2、PITX2、 PRRl5、VAV3、編碼IKK相互作用蛋白質的基因、EDEM3、LY6G6D、TGFA、或其包括AREG和/或 EREG的組合。
39.一種或多種遺傳學生物標記或基因陣列或用于遺傳學抗EGFR抗體生物標記的實時PCR擴增的試劑盒用于制備抗EGFR抗體藥物中的用途，其中，所述遺傳學生物標記或基因陣列或試劑盒包含一種或多種生物標記，選自TNFRSF1B、DNAJC8、ECSIT、G0SR2、 PPP1R9A、KLK6、C7orf46、SSH3、SERTAD2、AXIN2、C10orf99、ETS2、PITX2、PRRl5, VAV3、編碼 IKK相互作用蛋白質的基因、EDEM3、LY6G6D、TGFA、或其還包括AREG和/或EREG的組合，其中當所述基因或基因產物中的一種或多種在患者的腫瘤樣品中表達或過表達時，所述藥物用于在所述患者中治療KRAS野生型EGFR表達CRC或mCRC。
40.權利要求37-39中任一項的用途，其中從所述患者的體液，包括血漿，中測定所述蛋白質表達產物。
41.權利要求37-40中任一項的用途，其中所述預期潛在治療是一線治療。
42.權利要求37-41中任一項的用途，其中所述預期潛在治療是所述抗EGFR抗體與化學治療劑的聯(lián)合治療，并且所述患者已發(fā)展化療難治性癌癥。
43.根據權利要求37-42中任一項的用途，其中所述抗EGFR抗體是c225(西妥昔單抗)O
44.根據權利要求37-43中任一項的用途，其中所述癌癥是結腸直腸癌(CRC)或轉移性結腸直腸癌(mCRC)。
45.單克隆或多克隆抗體用于在體外測定預期用于治療的抗EGFR抗體對于患有KRAS 野生型EGFR表達癌癥的患者的藥學功效和/或臨床反應的用途，所述單克隆或多克隆抗體特異性結合權利要求37-39之任一項中描述的基因或基因產物的蛋白質表達產物。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于基因表達產物的生物標記和方法，用于確定抗EGFR抗體在EGFR表達性癌癥的治療中的功效。本發(fā)明進一步涉及預測患有EGFR表達性癌癥的患者對用特定抗EGFR抗體進行的治療的敏感性或抵抗性。本發(fā)明優(yōu)選涉及相應生物標記的鑒定，該生物標記允許更好地預測在具有KRAS野生型腫瘤的患者中用抗EGFR抗體治療的臨床結果。在本文中，本發(fā)明特別涉及抗EGFR抗體c225/西妥昔單抗及其在患有結腸直腸癌(CRC)的患者中的用途。
文檔編號G01N33/574GK102459638SQ201080027063
公開日2012年5月16日 申請日期2010年6月15日 優(yōu)先權日2009年6月19日
發(fā)明者海德布雷克 A·范, C·斯特羅 申請人:默克專利有限公司