專利名稱：利用cnt傳感器對過氧化物進(jìn)行電測定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用CNT傳感器對過氧化物進(jìn)行電的測定的方法。
背景技術(shù)：
利用過氧化氫一過氧化物酶類的生化學(xué)檢查是臨床檢查的基本手法之一。例如， 在血糖或中性脂肪、低密度脂蛋白(LDL)膽固醇、高密度脂蛋白(HDL)膽固醇、脂肪酸、尿酸(痛風(fēng)的原因物質(zhì))、肌酸酐(腎功能的指標(biāo))等的檢查中，在按每個測定對象而不同的第1工序中，通過對測定對象使用具有特異性的酶的反應(yīng)而產(chǎn)生過氧化氫，在共同的第2工程中，通過使用了過氧化物酶類反應(yīng)的分光學(xué)方法測定在第1工序中產(chǎn)生的過氧化氫。此夕卜，在免疫測定中，過氧化氫一過氧化物酶類也被用作評價抗原抗體反應(yīng)的生成物的指標(biāo)之一。因此，對于這些檢查而言，對過氧化氫進(jìn)行定量是重要的程序。另一方面，還公開了過氧化氫的電化學(xué)測定法。例如，通過將金或鉬電極設(shè)為工作電極，Ag/AgCl電極等設(shè)為參比電極，并在向工作電極施加一定電壓或?qū)﹄妷哼M(jìn)行掃描時， 測定在工作電極中流過的氧化還原電流，由此進(jìn)行過氧化氫的定量?；铙w內(nèi)的過氧化脂質(zhì)作為氧化應(yīng)激標(biāo)記物，有望用于臨床(參照非專利文獻(xiàn)1、 2)。因此，需要過氧化脂質(zhì)的定量方式。作為現(xiàn)有的過氧化脂質(zhì)的測定方法，已知的有化學(xué)發(fā)光-HPLC法。但是，化學(xué)發(fā)光-HPLC法需要大規(guī)模的裝置。此外，作為其他過氧化脂質(zhì)的測定方法，還知道硫代巴比土酸法。但是，硫代巴比土酸法是主要用于測定過氧化脂質(zhì)以外的醛類的非特異性方法。此外，硫代巴比土酸法需要煩雜的操作和分光學(xué)測定裝置。最近，提出了稱作CNT傳感器的電化學(xué)檢查設(shè)備。CNT傳感器實現(xiàn)了更高的高靈敏度化和設(shè)備的小型化。雖然提出了各種方式的CNT傳感器，但是作為一般的方式之一，有一種CNT傳感器具有如下的工作電極，該工作電極具有以接觸金屬電極的方式重疊了各種形態(tài)的碳納米管(CNT)或石墨的結(jié)構(gòu)(參照專利文獻(xiàn)1 3)。在先技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 國際公開第2006/103872號小冊子專利文獻(xiàn)2 國際公開第2007/114140號小冊子專利文獻(xiàn)3 特開2008-258594號公報非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn) 1 :Hui SP,Murai Τ, Yoshimura Τ, Chiba H, Nagasaka H and Kurosawa Τ, " Improved HPLC Assay for Lipid Peroxides in Human Plasma Using the Internal Standard of Hydroperoxide" , Lipids, Vol. 40, No. 5,pp. 515-522.非專利文獻(xiàn) 2 :Hui SP, Chiba H, Sakurai Τ, Asakawa C, Nagasaka H, Murai Τ, Ide H and Kurosawa Τ, " An improved HPLC assay for phosphatidy1cho1inehydroperoxi des(PCOOH) in human plasma with synthetic PC00H as internal standard" , Journal of Chromatography B, Vol. 857, pp.158-163.

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于，提供能夠簡便地測定過氧化物濃度的方法及傳感器。并且，本發(fā)明的目的還在于，將該方法和傳感器應(yīng)用于臨床檢查。第一，本發(fā)明代替以往的過氧化氫的測定方法、即利用過氧化物酶類的分光學(xué)測定方法，而提供一種利用了以電信號形式檢測過氧化物濃度的CNT傳感器的電化學(xué)測定方法。以往的分光學(xué)測定方法需要光源或檢測器。另一方面，利用CNT傳感器的電化學(xué)測定方法實現(xiàn)了測定裝置的簡單化及小型化，對POCT等臨床檢查做很大貢獻(xiàn)。第二，本發(fā)明提供一種測定在過氧化物中尤其是脂質(zhì)過氧化物的方法。以往，通過需要較大規(guī)模的裝置的化學(xué)發(fā)光-HPLC法測定脂質(zhì)過氧化物，所以很難成為POCT的檢查對象。根據(jù)本發(fā)明，能夠測定很多種類的脂質(zhì)過氧化物的濃度。因此，本發(fā)明對臨床檢查做出了很大貢獻(xiàn)。解決技術(shù)問題的方案本發(fā)明的第一方式涉及對以下所示的過氧化物進(jìn)行測定的方法。[1] 一種對試樣中的過氧化物進(jìn)行測定的方法，包括準(zhǔn)備CNT傳感器的步驟，該 CNT傳感器具備工作電極、單層碳納米管、對電極以及參比電極，該工作電極配置在絕緣基板上，該單層碳納米管接觸上述工作電極，并且，在該單層碳納米管的表面具有羥基或羧基；以與上述單層碳納米管接觸的方式，將含有過氧化物的溶液的試樣提供到上述CNT傳感器的步驟；以及在上述工作電極和上述對電極之間形成電位差的步驟。[2]根據(jù)[1]所述的方法，上述單層碳納米管是在含有酸及過氧化氫的溶液中被分散而處理過的碳納米管。[3]根據(jù)[1]或[2]所述的方法，上述過氧化物是通過使用對活體成分具有特異性的酶使上述活體成分進(jìn)行反應(yīng)而生成的過氧化氫。[4]根據(jù)[3]所述的方法，上述活體成分選自葡萄糖、總膽固醇、游離膽固醇、甘油三酸酯、磷脂、LDL膽固醇、HDL膽固醇、游離脂肪酸、尿酸、肌酸、膽紅素、乳酸、丙酮酸、肌酸酐、膽堿、酶。[5]根據(jù)[1]或[2]所述的方法，上述過氧化物是過氧化脂質(zhì)。[6]根據(jù)[5]所述的方法，上述過氧化脂質(zhì)是膽固醇酯過氧化物、膽固醇過氧化物、磷脂過氧化物、甘油三酸酯過氧化物、糖脂質(zhì)過氧化物。本發(fā)明的第二方式涉及以下所示的傳感器。[7] 一種過氧化物測定用的傳感器，具備工作電極，配置在絕緣基板；單層碳納米管，接觸上述工作電極，在其表面具有羥基或羧基；對電極；以及參比電極。以接觸上述單層碳納米管的方式提供用于測定過氧化物的試樣溶液。[8]根據(jù)[7]所述的過氧化物測定用的傳感器，上述單層碳納米管是在含有酸及過氧化氫的溶液中被分散而處理過的碳納米管。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，能夠高靈敏度且迅速地測定過氧化物。例如，根據(jù)本發(fā)明，能夠高靈敏度且迅速地測定各種濃度的過氧化物。因此，能夠通過本發(fā)明的方法，對以往通過利用了過氧化物酶類反應(yīng)的分光學(xué)方法測定的臨床檢查對象物進(jìn)行測定。并且，根據(jù)本發(fā)明，能夠測定活體中的過氧化物(例如蛋白質(zhì)，核酸，脂質(zhì)等的過氧化物，尤其是過氧化脂質(zhì))。已知過氧化脂質(zhì)成為生活習(xí)慣病的指標(biāo)。因此，過氧化脂質(zhì)的測定方法對生活習(xí)慣病的診斷和生活習(xí)慣病的治療方法的開發(fā)做貢獻(xiàn)。


圖IA是示出用于本發(fā)明的測定方法的CNT傳感器的例子的俯視圖。圖IB是示出用于本發(fā)明測定方法的CNT傳感器的例子的截面圖。圖2是示出在實施例中使用的CNT傳感器的結(jié)構(gòu)的立體圖。圖3是示出基于使用了 CNT傳感器的電化學(xué)測定的過氧化氫的測定結(jié)果(黑色方形，實線)和基于分光學(xué)測定的過氧化氫的測定結(jié)果(空心圈，虛線)的圖表。圖4是示出抗壞血酸的存在對過氧化氫的電化學(xué)測定的影響的圖表。圖5是示出膽紅素的存在對過氧化氫的電化學(xué)測定的影響的圖表。圖6是示出尿酸的存在對過氧化氫的電化學(xué)測定的影響的圖表。圖7是示出人血清白蛋白的存在對過氧化氫的電化學(xué)測定的影響的圖表。圖8是示出進(jìn)行了過濾的血清(黑色方形，實線)或未進(jìn)行過濾的血清(空心圈， 虛線)的存在對過氧化氫的電化學(xué)測定的影響的圖表。圖9是示出乳酸的電化學(xué)測定的測定結(jié)果的圖表。圖10是示出基于膽固醇酯及膽固醇酯的過氧化物的電化學(xué)測定的測定結(jié)果的圖表。圖11是示出利用共軛二烯法(實心黑圓)、TBARS法(黑三角)及本發(fā)明的方法 (黑色方形)測定了氧化LDL的結(jié)果的圖表。圖12是示出利用本發(fā)明的方法測定了氧化LDL(實線)及未氧化LDL(虛線)的結(jié)果的圖表。
具體實施例方式1. CNT 傳感器本發(fā)明的CNT傳感器具備絕緣性基板、配置在上述絕緣基板上的工作電極、接觸上述工作電極的碳納米管、對電極以及參比電極。在圖IA及圖IB上示出了 CNT傳感器的例子。如圖IA所示，在絕緣性基板110上固定有工作電極120和接觸工作電極120的碳納米管130。在固定于絕緣性基板110上的碳納米管130上，提供作為試料的試樣溶液140。 此外，對電極150及參比電極160配置成接觸試樣溶液140(參照圖1B)。對電極150及參比電極160無需固定在絕緣性基板110上，優(yōu)選配置成能夠從絕緣性基板110拆下。優(yōu)選對電極配置成不接觸碳納米管。若對電極接觸碳納米管，則工作電極和對電極之間的電流變大，因而有時不能夠確定過氧化物的取決于用量的氧化還原電流之差。若調(diào)整所固定的碳納米管的量，則還能夠把對電極配置成接觸碳納米管，但是，通常把對電極配置成不接觸碳納米管。絕緣性基板的材料可以是無機(jī)物，也可以是有機(jī)物。例如，絕緣性基板是玻璃基板。工作電極及對電極的材料通常是金屬，優(yōu)選為金、鉬、鈦等。工作電極最好成膜并固定在絕緣性基板上。在絕緣性基板上成膜的電極也可以是二層電極。例如，可以把貼近性高的鉻作為襯底層，層疊導(dǎo)電性高的金或鉬。對電極例如是針狀的金屬。參比電極不特別限定，但是，例如是Ag/AgCl電極。固定在絕緣性基板上的碳納米管優(yōu)選為單層碳納米管。此外，優(yōu)選碳納米管在含酸及過氧化氫的溶液中被分散處理。發(fā)明人認(rèn)為經(jīng)過該處理的碳納米管的表面上，被導(dǎo)入了羥基及/或羧基。因此，該處理對于碳納米管在絕緣性基板上的固定也有效果。一般來說，為了得到碳納米管的分散液，需要界面活性劑的共存。但是，為了抑制對傳感器的性能的影響，優(yōu)選不用界面活性劑。[CNT傳感器的制作例]首先，在玻璃基板上形成工作電極。例如，對形成電極的區(qū)域以外的玻璃基板的表面，覆上抗蝕劑膜。之后，在用于形成電極的區(qū)域，通過蒸鍍法，對金、鉬、鉻等的金屬、ITO等導(dǎo)電性氧化物、或光透射性半導(dǎo)體進(jìn)行成膜。如上所述，電極也可以是二層電極。接著，以接觸工作電極的方式，將碳納米管固定在玻璃基板上。對玻璃基板的固定有碳納米管的區(qū)域優(yōu)選實施親水性處理。例如，可使玻璃基板的固定碳納米管的區(qū)域接觸堿水溶液。通過親水性處理，碳納米管容易固定到玻璃基板上。在固定碳納米管的區(qū)域，通過滴下碳納米管的水分散液來固定碳納米管。在碳納米管的水分散液中，優(yōu)選均勻分散碳納米管。能夠通過向含有酸及過氧化氫的水溶液添加碳納米管，得到碳納米管的水分散液。酸優(yōu)選是硫酸和硝酸的混合酸。不特別限定硫酸和硝酸的比率，但是只要按體積比為硫酸硝酸=3 1左右就可以。不特別限定酸及過氧化氫的量，但是相對于0. 5mg CNT,含有4mL酸、500 μ L過氧化氫水溶液(濃度約30% )左右就可以。在將碳納米管添加到含酸及過氧化氫的水溶液中后，優(yōu)選進(jìn)行超聲波處理。超聲波處理的時間可以是1 2小時左右。在進(jìn)行了過長時間的超聲波處理時，碳納米管有可能斷片化。在超聲波處理后，用水稀釋含有碳納米管的水溶液，通過滲析進(jìn)行中性化，由此得到碳納米管水分散液。通過將所得到的碳納米管水分散液少量地分批提供到玻璃基板的規(guī)定區(qū)域，能夠?qū)⑻技{米管固定到玻璃基板上。如上所述，參比電極及對電極也可以不固定在絕緣性基板上，優(yōu)選配置成能夠從絕緣性基板拆下。2.過氧化物的測定利用本發(fā)明的CNT傳感器，能夠測定過氧化物(特別是，溶液中的過氧化物)。所謂過氧化物的測定，表示過氧化物的定量及定性中某一個。為了測定過氧化物，首先，將含有過氧化物的溶液提供到固定于絕緣性基板上的碳納米管上。使被提供的溶液和對電極及參比電極接觸。利用參比電極，設(shè)定工作電極。接著，在工作電極和對電極之間形成電位差。然后， 測定在工作電極和對電極之間流過的電流值Id。通常，含在試樣中的過氧化物的濃度越高， 電流值Id就越高。若預(yù)先求出表示過氧化物的濃度和電流值Id之間的關(guān)系的校準(zhǔn)曲線，則能夠迅速求出試樣中的過氧化物濃度。
本發(fā)明的測定方法能夠測定各種過氧化物，例如，能夠測定蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等活體中的過氧化物。如上所述，作為現(xiàn)有的活體成分的測定手法，廣泛知道的有利用過氧化物酶類反應(yīng)的分光學(xué)方法。在現(xiàn)有的分光學(xué)方法中，通過測定由酶反應(yīng)生成的過氧化氫，間接地測定了活體成分。相對于此，本發(fā)明的測定方法即使沒有像現(xiàn)有測定方法那樣產(chǎn)生過氧化氫，也能夠直接測定溶液試樣中的有機(jī)化合物的過氧化物(例如，過氧化脂質(zhì)等)。過氧化脂質(zhì)有望作為臨床檢查中的氧化生物標(biāo)記物。例如，過氧化脂質(zhì)可以成為生活習(xí)慣病等的各種疾患(例如，動脈硬化癥或糖尿病、老年癡呆癥、血液透析合并癥、老化等)的指標(biāo)。過氧化脂質(zhì)大體分為游離脂肪酸過氧化物(FA-OOH)、甘油三酸酯過氧化物(TG-OOH)、亞油酸膽固醇酯氫過氧化物(cholesteryl linoleate hydroperoxide)等的膽固醇酯過氧化物(CE-OOH)，甘油磷脂和神經(jīng)鞘脂質(zhì)的氫過氧化物等的磷脂過氧化物 (PL-OOH)、膽固醇過氧化物、糖脂質(zhì)過氧化物等，本發(fā)明的測定方法能夠直接測定任何一種過氧化脂質(zhì)。過氧化脂質(zhì)的一部分已經(jīng)進(jìn)行了化學(xué)合成。本發(fā)明者也報告了膽固醇酯過氧化物，作為磷脂的一種的磷脂酰膽堿過氧化物，甘油三酸酯過氧化物等的化學(xué)合成(Hui SP, et al.，Analytical Sciences，Vol. 16，No. 10，pp. 1023-1028. ；Hui SP, et al.，Journal of Chromatography B，Vol. 857，pp.158-163. ；Hui SP, et al.，Lipids，Vol. 38，No. 12， PP. 1287-1292.)。若預(yù)先利用這些化學(xué)合成的過氧化物，以校準(zhǔn)曲線的形式取得過氧化物的濃度和CNT傳感器的電流值Id之間的關(guān)系，則能夠根據(jù)試樣測定中的電流值Id，求出過氧化物濃度。如上所述，過氧化脂質(zhì)的測定對生活習(xí)慣病等的各種疾患的診斷、治療和治療藥物的開發(fā)等做貢獻(xiàn)。當(dāng)然，本發(fā)明的測定方法還能夠測定溶液試樣中的過氧化氫的濃度。如上所述，作為現(xiàn)有的活體成分的測定手法，廣泛知道的有利用了過氧化物酶類反應(yīng)的分光學(xué)方法。在該方法中，利用對活體成分具有特異性的酶使活體成分產(chǎn)生反應(yīng)而產(chǎn)生過氧化氫，在以過氧化物酶作為催化劑的基于過氧化氫的氧化反應(yīng)中使色素顯色，通過分光學(xué)方法測定基于該色素的吸收。作為代表性的例子，有以下的膽固醇酯的測定。[化學(xué)式1]膽固醇酯酶第1段酯化膽固醇一游離型膽固醇+脂肪酸膽固醇氧化酶第2段游離型膽固醇+Α+Η20 —膽甾烯酮+ 過氧化物酶第3段H2A+氨基安替比林(色原體)+苯酚一苯醌色素^l2O第4段使用分光光度計進(jìn)行苯醌色素的吸光度測定若使用本發(fā)明的測定方法，則能夠測定在第2段產(chǎn)生的過氧化氫(通過活體成分的特異性酶反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化氫)。本發(fā)明的測定方法對于低濃度的過氧化氫，也能夠以高靈敏度進(jìn)行測定，并且，即使在溶液試樣中混合存在各種活體成分，也能夠?qū)崿F(xiàn)適當(dāng)?shù)臏y定。例如，如后述的實施例所示，即使抗壞血酸或膽紅素，尿酸，人血清白蛋白等混合存在， 也基本不會對過氧化氫的測定造成影響。此外，若是進(jìn)行過濾處理的血清，則充分降低對過氧化氫測定的影響。如上所述，通過本發(fā)明的測定方法，能夠提供一種代替利用了上述的過氧化物酶類反應(yīng)的分光學(xué)方法的、新的活體成分的測定手法。根據(jù)本發(fā)明的測定方法，通過測定過氧化氫，能夠測定各種活體成分?；铙w成分的例子中包含葡萄糖，總膽固醇，游離膽固醇，甘油三酸酯，磷脂，LDL膽固醇，HDL膽固醇，游離脂肪酸，尿酸，肌酸酐，膽紅素，乳酸，丙酮酸，膽堿。此外，活體成分也可以是酶。酶的例子中包含膽堿酯酶，淀粉酶，脂肪酶等，在酶活性測定系統(tǒng)中包含含有過氧化氫生成反應(yīng)的酶。根據(jù)本發(fā)明的測定方法，除了活體成分以外，還能夠測定通過包含過氧化氫生成反應(yīng)的免疫學(xué)測定系統(tǒng)來測定的微量成分。在這種微量成分的例子中，除了包含激素、腫瘤標(biāo)記物、細(xì)胞因子之外，包括藥物等的外因性物質(zhì)等。
實施例1. CNT傳感器的制作(1)基板的準(zhǔn)備利用光刻法，用抗蝕劑膜覆蓋玻璃基板(20mmX20mm)的電極形成預(yù)定部位以外的區(qū)域。在電極形成預(yù)定部位，通過蒸鍍法形成鈦和金膜，形成二層結(jié)構(gòu)的電極。之后，除去抗蝕劑膜。另一方面，向3mL硫酸少量分別分批添加ImL的30%過氧化氫水溶液來調(diào)制硫酸 /過氧化氫混合液。將形成了電極的玻璃基板放入20mL的燒杯中，對整個燒杯進(jìn)行冷卻的同時滴下硫酸/過氧化氫混合液。輕輕攪拌的同時，在室溫下培養(yǎng)10分鐘。10分鐘后，用去離子水清洗玻璃基板，接著，用純乙醇進(jìn)行清洗。將清洗后的玻璃基板正面(電極形成面)朝上放入50mL錐形離心管(Falcon tube)中。將該錐形離心管置于加熱到80°C的加熱器之上。此時，用鋁箔使錐形離心管傾斜。用剪刀剪切1.5mL微管的蓋子，向蓋子的凹部注入二氯硅烷。將保持二氯硅烷的蓋子移到50mL錐形離心管內(nèi)，輕輕閉合錐形離心管的蓋，靜置1分鐘。從50mL錐形離心管取出玻璃基板，把玻璃基板直接置于加熱器上，在80°C下靜置30分鐘。之后，用去離子水清洗玻璃基板。向玻璃基板正面的用于載置碳納米管的部分，供給4 μ L的2N氫氧化鈉，使其反應(yīng) 10分鐘并進(jìn)行親水性處理。之后，用去離子水清洗玻璃基板。(2)單層碳納米管的酸處理用硫酸及硝酸(均為關(guān)東化學(xué)產(chǎn)品)的混合酸清洗0.5mg的單層碳納米管 (SWCNT ；Carbon Nanotechnologies Inc.)。使清洗后的 SWCNT 懸浮在 1. 8mL硫酸、0. 6mL 硝酸及0. 2mL過氧化氫水(關(guān)東化學(xué))的混合液中，進(jìn)行1個小時的超聲波處理。用水稀釋所得到的黑色SWCNT分散液，進(jìn)行滲析直到pH成為中性，得到lmg/mL的SWCNT水分散液。(3)單層碳納米管的載置用浴槽型超聲波器進(jìn)行10分鐘超聲波處理，使SWCNT水分散液中的SWCNT分散。 在預(yù)先加溫到80°C的加熱器上放置玻璃基板，向電極間隙部每次4μ L地分5次共重疊 20 μ L的SWCNT分散液(lmg/mL)。之后，為了穩(wěn)定化，在150°C下靜置2個小時。2.過氧化氫的測定
(1)電化學(xué)測定用lXPBS(pH7. 4)稀釋 30%過氧化氫水溶液，調(diào)制 3 μ Μ、30 μ Μ、300 μ Μ、3mM、30mM
的過氧化氫水溶液(試樣)。將CNT傳感器設(shè)置于多探針檢驗臺(prober)上，用真空泵固定玻璃基板。在工作電極及對電極上分別連接電極探頭。并且，以與玻璃基板之間的間隙大致為2mm的方式，設(shè)置對電極及參比電極(參照圖2)。向玻璃基板的SWCNT載置部和參比電極之間提供20μ L的1XPBS(參照圖2)。向工作電極和對電極之間施加_50mV的電壓，連續(xù)2分鐘測定電流值Id。取20 30秒鐘的測定電流值平均作為IXPBS的測定電流值(基準(zhǔn)值)。在回收IXPBS之后，將試樣(各濃度的過氧化氫水溶液)提供到SWCNT載置部和參比電極之間，連續(xù)2分鐘測定電流值Id。按照濃度由低到高的順序提供試樣。取20 30秒鐘的測定電流值平均，作為各濃度的過氧化氫水溶液的測定電流值。設(shè)橫軸為過氧化氫濃度(對數(shù)刻度)，縱軸為各濃度的過氧化氫水溶液的測定電流值和1 XPBS的測定電流值(基準(zhǔn)值)之間的差(對數(shù)刻度)，制作校準(zhǔn)曲線(參照圖3 ； 黑色方形，實線)。(2)分光學(xué)測定(對照實驗)如下進(jìn)行試樣的調(diào)制?；旌狭?20 μ L的最終濃度的10倍濃度的過氧化氫水溶液、 20 μ L 10XPBS(pH7. 4)、20μ L 15mM 的 4-氨基安替比林、20 μ L 的 0. 4%二甲基苯胺、20 μ L 的400mM戊二酸二甲酯、99 μ L去離子水。過氧化氫的濃度設(shè)為3 μ Μ、30 μ Μ、300 μ M、3mM、 30mM。向上述混合液添加1 μ L的5U/ μ L過氧化物酶(POD)，在水浴器中，在37°C下培養(yǎng)10 分鐘。10分鐘后，測定了反應(yīng)液的吸光度(565nm)。設(shè)橫軸為過氧化氫濃度(對數(shù)刻度)，縱軸為反應(yīng)液的吸光度(對數(shù)刻度)，制作了校準(zhǔn)曲線(參照圖3;空心圈，虛線)。(3)測定結(jié)果如圖3所示，在電化學(xué)測定(黑色方形，實線)中，在3μΜ 30mM的濃度范圍內(nèi)得到了直線校準(zhǔn)曲線，但是在分光學(xué)測定(空心圈，虛線)中，在3μΜ 3mM的濃度范圍內(nèi)得到了直線的校準(zhǔn)曲線。電化學(xué)測定的可測定濃度區(qū)域與分光學(xué)測定相比，在高濃度側(cè)擴(kuò)展1個數(shù)量級。此外，在電化學(xué)測定中，對每一試樣的測定需要30秒鐘，很短。另一方面， 在分光學(xué)測定中，需要進(jìn)行10分鐘的培養(yǎng)?？芍獜目s短測定時間的觀點來看，電化學(xué)測定的實用性比分光學(xué)測定高。3.阻礙物質(zhì)對過氧化氫的測定的影響的研究(1)抗壞血酸、膽紅素、尿酸及人血清白蛋白的影響的研究作為試樣，調(diào)制了 3mM過氧化氫水溶液以及向3mM的過氧化氫水溶液添加了測定阻礙物質(zhì)(抗壞血酸，膽紅素，尿酸或人血清白蛋白)的水溶液。設(shè)抗壞血酸及膽紅素的濃度為0. 5μΜ、5μΜ、50μΜ、500μΜ。設(shè)尿酸的濃度為30μΜ、300μΜ、3πιΜ。設(shè)人血清白蛋白濃度為0. 05mM、0. 5mM、2mM、5mM。各試樣的溶媒為1XPBS。以與上述的使用了 CNT傳感器的電化學(xué)測定同樣的步驟，測定了各試樣的過氧化氫。設(shè)3mM過氧化氫水溶液(無測定阻礙物質(zhì))的測定電流值為100%，在縱軸上繪制了各試樣的測定電流值的相對值(參照圖4 圖7)。(2)人血清的影響的研究
關(guān)于人血清，將空腹?fàn)顟B(tài)的健康人(M歲，男性)的血液采集到IOmL平口采血管中，在室溫下靜置1個小時之后，以3500rpm進(jìn)行10分鐘的離心操作來分離血清。將500 μ L 血清以10萬分子量截留過濾器(amicon)進(jìn)行過濾處理，得到通過了過濾器的液體。在 8000rpm下進(jìn)行10分鐘的離心操作。作為試樣，準(zhǔn)備了 3mM過氧化氫水溶液和向3mM的過氧化氫水溶液添加了人血清 (未經(jīng)過過濾處理的或經(jīng)過過濾處理的)的水溶液。設(shè)人血清的最終濃度為1000倍稀釋、 100倍稀釋、10倍稀釋。各試樣的溶媒為1XPBS。按照與使用了上述的CNT傳感器的電化學(xué)測定同樣的步驟，測定了各試樣的過氧化氫。設(shè)3mM過氧化氫水溶液(無血清)的測定電流值為100%，在縱軸上繪制了各試樣的測定電流值的相對值(參照圖8)。(3)測定結(jié)果圖4是示出抗壞血酸存在下的過氧化氫的測定結(jié)果的圖表。抗壞血酸的活體內(nèi)的基準(zhǔn)范圍為3 10 μ M。根據(jù)該結(jié)果，可知健康人血清中的抗壞血酸對測定造成的影響大約小于10%。圖5是表示膽紅素存在下的過氧化氫的測定結(jié)果的圖表。膽紅素的活體內(nèi)的基準(zhǔn)范圍為4 ΜμΜ。根據(jù)該結(jié)果，可知健康人血清中的膽紅素對測定造成的影響大約小于5%。圖6是示出尿酸存在下的過氧化氫的測定結(jié)果的圖表。尿酸的活體內(nèi)的基準(zhǔn)范圍為150μΜ 420μΜ。根據(jù)該結(jié)果，可知健康人血清中的尿酸對測定造成的影響大約小于5%。圖7是示出人血清白蛋白存在下的過氧化氫的測定結(jié)果的圖表。人血清白蛋白的活體內(nèi)的基準(zhǔn)范圍為0. 59 0. 74 μ M0根據(jù)該結(jié)果，可知健康人血清中的人血清白蛋白對測定造成的影響大約小于10%。圖8是示出人血清存在下的過氧化氫的測定結(jié)果的圖表。未經(jīng)過濾處理的血清的存在引起較大的測定障礙(空心圈，虛線)。另一方面，通過對血清進(jìn)行過濾處理，能夠減輕測定障礙(黑色方形，實線)。因使用10萬分子量截留過濾器進(jìn)行了過濾處理，認(rèn)為分子量大于10萬的高分子(例如，脂蛋白，球蛋白，部分未被除去的白蛋白)阻礙了測定。4.乳酸的測定用lXPBS(pH7. 4)稀釋乳酸水溶液，調(diào)制了 1 μ M、10 μ M、100 μ M、ImM、IOmM 的乳酸
水溶液(試樣)。按照與上述的使用了 CNT傳感器的電化學(xué)測定同樣的步驟，測定各試樣的乳酸。具體來說，向玻璃基板的SWCNT載置部和參比電極之間，提供20 μ L的預(yù)先在水浴器中以37°C培養(yǎng)了 2分鐘的空白試樣(19 μ L lXPBS，lyL乳酸氧化酶(LOD，5mU/μ L))。 向工作電極和對電極之間施加電壓，并連續(xù)2分鐘測定電流值Id。取20 30秒鐘的測定電流值平均，作為空白試樣的測定電流值(基準(zhǔn)值)。在回收空白試樣之后，將20 μ L的預(yù)先在水浴器中以37°C培養(yǎng)了 2分鐘的試樣 (各濃度的乳酸水溶液19 μ L，1 μ L的LOD (5mU/ μ L))提供到SWCNT載置部和參比電極之間，連續(xù)2分鐘測定電流值Id。按濃度從低到高的順序提供試樣。取20 30秒鐘的測定電流值平均，作為各濃度的乳酸水溶液的測定電流值。
設(shè)橫軸為乳酸濃度(對數(shù)刻度)，縱軸為各濃度的乳酸水溶液(含L0D)的測定電流值和IXPBS (含L0D)的測定電流值(基準(zhǔn)值)之差(對數(shù)刻度)，制作了校準(zhǔn)曲線(參照圖9)。如圖9所示，在O.OOlmM LOmM的范圍內(nèi)得到良好的校準(zhǔn)曲線。人血清中的乳酸的濃度為數(shù)mM。因此，若考慮將血清試樣稀釋10倍或100倍來進(jìn)行測定，則可以說使用了 CNT傳感器的電化學(xué)測定的測定范圍良好。5.膽固醇酯(亞油酸膽固醇酯(cholesteryl Iinoleate))的過氧化物的測定將3. 2mg亞油酸膽固醇酯溶解到IOmL 100%甲醇中，調(diào)制50 μ M亞油酸膽固醇酯溶液。用100%甲醇稀釋亞油酸膽固醇酯溶液，各調(diào)制200 μ L的50ηπι、500ηπι、5μΜ的亞油酸膽固醇酯溶液。向各亞油酸膽固醇酯溶液20 μ L添加180 μ L的1 XPBS進(jìn)行10倍稀釋， 并調(diào)制成甲醇的最終濃度成為10% (膽固醇酯的最終濃度成為5ηΜ 5μΜ)。同時，調(diào)制向ISOyLm IXPBS添加了 20 μ L的100%甲醇的溶液，用于陰性對照。接著，調(diào)制亞油酸膽固醇酯的過氧化物。首先，用膽固醇和亞麻酸調(diào)制出膽固醇酯。接著，以血卟啉作為光敏劑，在光照射下，流入氧氣來進(jìn)行基于單態(tài)氧的過氧化反應(yīng)。 利用NMR法、HPLC法、質(zhì)量分析法等各種分析方法，確定了所生成的過氧化物的構(gòu)造。關(guān)于過氧化物的調(diào)制順序的詳細(xì)內(nèi)容，記載在在先技術(shù)文獻(xiàn)(Hui SP, et al.，Analytical Sciences, Vol. 16，No. 10，pp. 1023-1028.)中。用100%甲醇稀釋亞油酸膽固醇酯過氧化物的溶液，調(diào)制了 50ηπι、500ηπι、5μΜ、 50 μ M的亞油酸膽固醇酯過氧化物溶液。向各亞油酸膽固醇酯過氧化物溶液20 μ L添加 180 μ L的1 XPBS來稀釋10倍，調(diào)制成甲醇的最終濃度成為10% (膽固醇酯過氧化物的最終濃度成為5nm 5 μ Μ)。同時，調(diào)制向IXPBS 180 μ L添加了 20 μ L 100%甲醇的溶液， 用于陰性對照。按照與上述的使用了 CNT傳感器的電化學(xué)測定同樣的步驟，測定各試樣的亞油酸膽固醇酯或亞油酸膽固醇酯過氧化物。具體來說，向玻璃基板的SWCNT載置部和參比電極之間，提供20 μ L的陰性對照試樣。工作電極和對電極之間施加_300mV的電壓，連續(xù)2分鐘測定電流值Id。取60 120 秒鐘的測定電流值平均，作為陰性對照試樣的測定電流值(基準(zhǔn)值)。在回收了陰性對照試樣之后，將20 μ L試樣(亞油酸膽固醇酯溶液或亞油酸膽固醇酯過氧化物溶液)提供到SWCNT載置部和參比電極之間，連續(xù)2分鐘測定電流值Id。按濃度從低到高的順序提供試樣。取60 120秒鐘的測定電流值平均，作為各濃度的亞油酸膽固醇酯溶液或亞油酸膽固醇酯過氧化物溶液的測定電流值。設(shè)橫軸為膽固醇酯或膽固醇酯過氧化物的濃度(對數(shù)刻度)，縱軸為各濃度的試樣的測定電流值和陰性對照試樣的測定電流值(基準(zhǔn)值)之差(對數(shù)刻度)，制作了圖表 (參照圖10)。如圖10所示，在含有亞油酸膽固醇酯過氧化物的溶液試樣中，觀察到依賴濃度的信號的增大(黑色方形，實線)。另一方面，在含有(非過氧化)亞油酸膽固醇酯的溶液試樣中，沒有顯現(xiàn)依賴于濃度的信號的變化(空心圈，虛線)。由此，給出了將過氧化物的結(jié)構(gòu) 「-00H」、即氫過氧化物作為信號的啟示。根據(jù)以上結(jié)果，認(rèn)為不限于膽固醇酯過氧化物，同樣能夠測定各種過氧化脂質(zhì)。
6.氧化LDL的測定(電流響應(yīng))通過通常的方法(超離心法)，從由健康人采集的血清分離了低密度脂蛋白 (LDL)。將所得到的LDL和硫酸銅稀釋混合到IXPBS 2mL中，以使其最終濃度分別成為 83 μ g/mL、0. 553 μ Μ,在室溫培養(yǎng)而對LDL進(jìn)行氧化。設(shè)混合了 LDL和硫酸銅的時間點為0 分鐘，按以下的三種方法測定了隨著時間經(jīng)過生成的氧化LDL(共軛二烯體)。1)共軛二烯法在從混合之后經(jīng)過了 1分鐘后，3分鐘后及5 180分(5分鐘間隔)后，測定了混合液的吸光度OMnm)。2) TBARS ^在混合之后經(jīng)過了 10分鐘后，30分鐘后，60分鐘后，120分鐘后及180分鐘后，各采集25 μ L的混合液。向各混合液(25 μ L)添加ImL的5. 3mg/mL硫代巴比土酸(TBA)醋酸鈉溶液，在100°C下反應(yīng)1個小時。反應(yīng)后，測定了反應(yīng)液的吸光度(535nm)。3)本發(fā)明的方法在混合之后經(jīng)過了 1分鐘后，3分鐘后及5 180分(5分鐘間隔)后，各采集20 μ L 混合液。將各混合液(25 μ L)提供到上述的CNT傳感器的SWCNT載置部和參比電極之間。 施加電壓使工作電極相對于參比電極的電位成為_300mV，連續(xù)2分鐘測定電流值Id。將共軛二烯法(實心黑圓)、TBARS法(黑三角)及本發(fā)明的方法(黑色方形)的測定結(jié)果示于圖11。圖11的橫軸表示混合之后的經(jīng)過時間，縱軸從右起表示按共軛二烯法測定的吸光度034nm)、按本發(fā)明的方法測定的電流變化量及按TBARS法測定的硫代巴比土酸反應(yīng)性物質(zhì)(TBARS)的丙二酰二醛(MDA)換算量。如圖11所示，觀察到共軛二烯法、TBARS法及本發(fā)明的方法均隨著時間經(jīng)過而信號增大。特別是，在使用了 CNT傳感器的本發(fā)明的方法中，從反應(yīng)初期開始就明確出現(xiàn)信號的變化，在初始階段就能夠檢測到脂質(zhì)的過氧化。作為對照實驗，分別以沒有添加硫酸銅而用IXPBS稀釋的LDL溶液，以及只含硫酸銅的IXPBS作為測定對象的情況下，沒有觀察到電流值的增加。根據(jù)以上結(jié)果，本發(fā)明的方法與共軛二烯法及TBARS法相比，能夠高靈敏度地且在短時間內(nèi)檢測到脂質(zhì)的氧化狀態(tài)。7.氧化LDL的測定(電位變化響應(yīng))通過通常的方法(超離心法)，從由健康人采集的血清中分離出LDL。將所得到的 LDL和硫酸銅稀釋混合到0. 2mL 1 XPBS中，以使其最終濃度分別成為83 μ g/mL、0. 553 μ Μ, 在37°C下培養(yǎng)而對LDL進(jìn)行氧化。設(shè)混合了 LDL和硫酸銅的時間點為0分鐘，按上述的共軛二烯法測定隨著時間的經(jīng)過生成的氧化LDL (共軛二烯體)，在混合之后經(jīng)過3個小時后， 幾乎觀察不到吸光度的增加。將該混合之后經(jīng)過了 3個小時后的試樣設(shè)為氧化LDL溶液。 此外，將代替硫酸銅而添加1 XPBS來調(diào)制的試樣設(shè)為未氧化LDL溶液。在向上述的CNT傳感器的SWCNT載置部和參比電極之間提供20 μ L緩沖溶液之后，隨著時間經(jīng)過測定對參比電極的工作電極的電位。在信號大體穩(wěn)定之后，吸取緩沖溶液的一部分( ο μ L)。接著，向SWCNT載置部和參比電極之間的間隙提供了 10 μ L的氧化LDL 溶液或未氧化LDL溶液之后，隨著時間的經(jīng)過測定對參比電極的工作電極的電位。將提供了氧化LDL溶液(實線)或未氧化LDL溶液(虛線)之后的對參比電極的表示經(jīng)過時間，縱軸表示對參比電極的工作電極的電位的變化。此外，圖表中央的箭頭表示提供氧化LDL溶液或未氧化LDL 溶液的時間。如圖12所示，在提供氧化LDL溶液或未氧化LDL溶液之前的0 1000秒之間，觀察到基線的趨勢(向右上升)。在提供了氧化LDL溶液的情況下，觀察到大約30mV的電位變化。另一方面，在提供了未氧化LDL溶液的情況下，只觀察到5mV以下的電位變化，很難與連續(xù)變化進(jìn)行區(qū)別。此外，在提供了含有未氧化的HDL的溶液的情況下，以及提供了只含有硫酸銅的溶液的情況下，均沒有觀察到電位變化。根據(jù)以上結(jié)果，可知CNT傳感器對氧化LDL做出響應(yīng)。本申請主張于2009年7月17日申請的日本專利申請2009-169126的優(yōu)先權(quán)。該在先申請的說明書及附圖中所記載的所有內(nèi)容均援用到本申請說明書中。工業(yè)實用性CNT傳感器在下述方面較有利，S卩，不使用光源或檢測器，通過電信號體現(xiàn)反應(yīng)，以及能夠大量生產(chǎn)。因此，即使說使用CNT傳感器的本發(fā)明的測定方法能夠掀起臨床檢查的革命也不為過。首先，CNT傳感器能夠用作檢查室外的檢查(POCT，SMBG, 0TC)平臺。本發(fā)明的測定方法與以往在實驗室中用于脂質(zhì)過氧化物的測定的化學(xué)發(fā)光-HPLC法相比，操作顯著簡化，測定時間也較短，所以還能夠進(jìn)行以往很難成為POCT對象的脂質(zhì)過氧化物的P0CT。此外，只要將持續(xù)采集血液的裝置連接到CNT傳感器，或?qū)⑨槾痰浇M織的間質(zhì)液中并連接到CNT傳感器，就能夠?qū)崟r地監(jiān)視運動選手的訓(xùn)練效果，能夠從戴在手腕或腰上的小型發(fā)送裝置向PC發(fā)送數(shù)據(jù)。這種裝置還能夠應(yīng)用于家庭醫(yī)療或老人保健設(shè)施中患者的監(jiān)視中。并且，CNT傳感器還能夠?qū)︶t(yī)院的臨床檢查室?guī)響騽⌒缘淖兓Ｄ壳霸卺t(yī)院檢查室中使用的生化學(xué)分析裝置為大型且昂貴，需要對試管及導(dǎo)管進(jìn)行清洗等的維護(hù)。對于生化學(xué)分析裝置也嚴(yán)格要求節(jié)約成本和空間，因此試藥使用量較少的小型裝置受到歡迎。但是，目前的分光學(xué)分析裝置的縮小已到了極限。通過利用小型且低價能夠用后扔掉的CNT傳感器片，能夠使分析裝置小型化到目前不可能實現(xiàn)的水平。此外，試藥使用量也能夠達(dá)到目前的10分之1以下，能夠開發(fā)不需要維護(hù)作業(yè)的裝置。這種裝置能夠在診所、手術(shù)室、急救室、急救車、醫(yī)療車、老人保健設(shè)施、 甚至是街頭的廉價體檢等各種場合進(jìn)行各種項目的實時檢查。此外，還能夠在抗氧化食品或抗氧化藥物等的篩選中，利用CNT傳感器。例如，只要制作用CNT傳感器進(jìn)行一定的氧化反應(yīng)的系統(tǒng)，就能夠?qū)⒅参锾崛∥锘蛩幬锾砑拥狡渲校瑥亩菀讬z測抗氧化活性。如利用CNT傳感器的便攜性優(yōu)點，在世界的任何環(huán)境(例如，叢林或山中等)下都能夠篩選天然的抗氧化物，對食品產(chǎn)業(yè)界以及醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)都做出大貝獻(xiàn)。附圖標(biāo)記說明110絕緣性基板112玻璃基板120工作電極
130碳納米管140試樣溶液150對電極160參比電極
權(quán)利要求
1.一種對試樣中的過氧化物進(jìn)行測定的方法，其特征在于，包括準(zhǔn)備CNT傳感器的步驟，該CNT傳感器具備工作電極、單層碳納米管、對電極、參比電極，該工作電極配置在絕緣基板上，該單層碳納米管接觸上述工作電極并且在該單層碳納米管的表面具有羥基或羧基；以與上述單層碳納米管接觸的方式，將含有過氧化物的溶液的上述試樣提供到上述 CNT傳感器的步驟；以及在上述工作電極和上述對電極之間形成電位差的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，上述單層碳納米管是在含有酸及過氧化氫的溶液中被分散而處理過的碳納米管。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，上述過氧化物是通過使用對活體成分具有特異性的酶使上述活體成分進(jìn)行反應(yīng)而生成的過氧化氫。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，上述活體成分選自葡萄糖、總膽固醇、游離膽固醇、甘油三酸酯、磷脂、LDL膽固醇、 HDL膽固醇、游離脂肪酸、尿酸、膽紅素、乳酸、丙酮酸、肌酸酐、膽堿、酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，上述過氧化物是過氧化脂質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，上述過氧化脂質(zhì)是酯化膽固醇過氧化物、膽固醇過氧化物、磷脂過氧化物、甘油三酸酯過氧化物、糖脂質(zhì)過氧化物。
7.—種過氧化物測定用的傳感器，具備工作電極，配置在絕緣基板；單層碳納米管，接觸上述工作電極，在該單層碳納米管表面具有羥基或羧基；對電極；以及參比電極，以與上述單層碳納米管接觸的方式提供用于測定過氧化物的試樣溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的過氧化物測定用的傳感器，上述單層碳納米管是在含有酸及過氧化氫的溶液被分散而處理過的碳納米管。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用了CNT傳感器的過氧化物的濃度的測定方法。CNT傳感器具有配置在絕緣基板上的工作電極、接觸工作電極的單層碳納米管、對電極以及參比電極。通過向單層碳納米管上提供試樣，在工作電極和對電極之間形成電位差，能夠測定試樣中的過氧化物的濃度。本發(fā)明的測定方法能夠應(yīng)用于臨床檢查等。
文檔編號G01N27/30GK102472722SQ20108003114
公開日2012年5月23日 申請日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日
發(fā)明者中村基訓(xùn), 千葉仁志, 惠淑萍, 武田晴治, 武笠幸一, 石井睦, 黑澤隆夫 申請人:國立大學(xué)法人北海道大學(xué), 學(xué)校法人東日本學(xué)園·北海道醫(yī)療大學(xué)