專利名稱：預(yù)測(cè)化學(xué)物質(zhì)毒性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)、毒理學(xué)和藥物篩選領(lǐng)域。具體地講，本發(fā)明涉及預(yù)測(cè)化學(xué)物質(zhì)(chemical)對(duì)發(fā)育途徑的毒性的方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明描述設(shè)計(jì)用于在化學(xué)傷害后提供人細(xì)胞/組織或胎兒發(fā)育信息的方法。它利用人干細(xì)胞系響應(yīng)已知刺激的體外分化，作為模擬體內(nèi)細(xì)胞/組織發(fā)育的手段。其它實(shí)施方案包括i)使用寬范圍細(xì)胞/組織標(biāo)記，ii)使用早期和晚期細(xì)胞/組織標(biāo)記。這些可組合指示哪個(gè)發(fā)育途徑被干擾和處于什么階段。在祖細(xì)胞分化期間，使細(xì)胞暴露于化學(xué)、藥物、化妝品或致畸原，并通過監(jiān)測(cè)分化程度評(píng)價(jià)對(duì)發(fā)育過程的影響。實(shí)際上，Suter (Current Opinion in Chemical Biology (化學(xué)生物學(xué)的當(dāng)前意見)，2006，10，362-366)描述藥物安全評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)(非干細(xì)胞)體外試驗(yàn)的預(yù)測(cè)值和限制。很多目前試驗(yàn)有顯著缺陷，因?yàn)槿狈ΜF(xiàn)有方法的特異性。實(shí)際上，很多現(xiàn)有方法耗時(shí)、沒有豐富信息、昂貴且通常需要使用大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。因此，得到大量數(shù)據(jù)/ 信息的人發(fā)育毒性方法的使用是傳統(tǒng)方法的有吸引力的替代，這潛在減少試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)和費(fèi)用，而不損害消費(fèi)者和患者的安全性。最近的公開文獻(xiàn)已強(qiáng)調(diào)化學(xué)物質(zhì)對(duì)發(fā)育中的胎兒的影響。據(jù)估計(jì)，全部活嬰的 5%有發(fā)育和行為缺陷，很多可歸因于化學(xué)傷害。另外，歐盟已制定O007) —項(xiàng)新的化學(xué)法規(guī)，稱為REACH(化學(xué)物質(zhì)注冊(cè)、評(píng)估和授權(quán))，這項(xiàng)法規(guī)有希望成為已建立的最復(fù)雜和全面的監(jiān)管努力。在此法規(guī)內(nèi)，對(duì)生殖和發(fā)育毒理學(xué)的要求很重要，因?yàn)樗鼈儗?dǎo)致對(duì)資助和試驗(yàn)動(dòng)物需求的最高要求。另外，生殖和發(fā)育考慮因素可導(dǎo)致現(xiàn)在普遍使用的很多物質(zhì)的限制。 雖然REACH對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物研究有嚴(yán)格要求，但法規(guī)不贊成在試驗(yàn)中使用脊椎動(dòng)物，需要實(shí)驗(yàn)室考慮替代方法。很多已建立的替代動(dòng)物方法經(jīng)常出現(xiàn)問題，因此，非常需要能夠精確預(yù)測(cè)化學(xué)傷害對(duì)人胎兒和/或生殖發(fā)育的后果的更好和改善的實(shí)驗(yàn)方法。因此，需要引入和驗(yàn)證評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)對(duì)人發(fā)育的潛在毒性影響的新的基于細(xì)胞的方法。干細(xì)胞在人發(fā)育期間，對(duì)毒性損傷最敏感的組織包括神經(jīng)系統(tǒng)、肝、腎、肺、皮膚等，因此， 用祖細(xì)胞系與細(xì)胞/組織特異標(biāo)記組合的試驗(yàn)將不僅幫助確定是否特定化學(xué)物質(zhì)為毒性，而且確定是否細(xì)胞/組織受影響。另外，在本專利說明書中描述的方法有另外的許可 (enabling)特征，即它具有在早期和晚期細(xì)胞分化標(biāo)記(例如，Nkx2. 5和α MHC各自為早期和晚期心臟標(biāo)記)之間區(qū)分的能力。例如，胚胎干(EQ細(xì)胞可分化成神經(jīng)元細(xì)胞。在分化時(shí)，胚胎干細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)水平和經(jīng)分化細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)水平可以量化。在此，胚胎干細(xì)胞分化用作反映胎兒/細(xì)胞發(fā)育的手段(參見，例如

圖1)。在化學(xué)損傷時(shí)，識(shí)別其中已干擾表達(dá)水平的標(biāo)記可幫助識(shí)別哪種細(xì)胞發(fā)育途徑受影響。另外，早期和晚期細(xì)胞標(biāo)記兩者的定量允許更深入地探詢?nèi)魏翁囟?xì)胞類型(例如， 各自利用早期和晚期標(biāo)記olig2和MOG的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)的發(fā)育。因此，所有具體細(xì)胞標(biāo)記的定量幫助探詢整個(gè)細(xì)胞發(fā)育/分化途徑。因此，本文所述發(fā)明可用于構(gòu)建例如用于胎兒發(fā)育的毒性分布或毒性生物圖。干細(xì)胞為在大多數(shù)(若非全部)多細(xì)胞生物體中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞。它們的特征在于通過有絲細(xì)胞分裂和分化成不同范圍的專化細(xì)胞類型而自身更新的能力。兩個(gè)寬類型哺乳動(dòng)物干細(xì)胞為從胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離的胚胎干細(xì)胞，和在成體組織中發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞。在發(fā)育中的胚胎中，干細(xì)胞可分化成所有?；咛ソM織。在成年生物體中，干細(xì)胞和祖細(xì)胞充當(dāng)身體的修復(fù)系統(tǒng)，補(bǔ)充?；?xì)胞，而且保持再生器官(如血、皮膚或腸組織)的正常更替。 現(xiàn)在，可使干細(xì)胞生長(zhǎng)并轉(zhuǎn)變成具有與不同組織細(xì)胞一致特征的?；?xì)胞，如通過細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)變成肌肉或神經(jīng)。成體干細(xì)胞可分化成發(fā)育不相關(guān)的細(xì)胞類型，如神經(jīng)細(xì)胞成為血細(xì)胞。內(nèi)在和外在信號(hào)均控制干細(xì)胞命運(yùn)，這些信號(hào)中的一些已經(jīng)識(shí)別(Watt&Hogan，Science 2000,287，1427-1430)。來自多種來源(包括臍帶血和骨髓)的成體干細(xì)胞常規(guī)用于醫(yī)學(xué)治療。胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)為從早期階段胚胎(稱為胚泡)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)得到的干細(xì)胞。人胚胎在受精后 4-5天達(dá)到胚泡階段，此時(shí)它們由50-150個(gè)細(xì)胞組成。胚胎干(EQ細(xì)胞是多能的。這意味著它們能夠分化成三個(gè)初級(jí)胚層(外胚層、內(nèi)胚層和中胚層)的所有衍生物。這些包括成年體中各自多于220個(gè)細(xì)胞類型。多能性使ES細(xì)胞區(qū)分于在成體中發(fā)現(xiàn)的多能祖細(xì)胞，這些只形成有限的一些細(xì)胞類型。在不對(duì)分化給予刺激時(shí)(即，在體外生長(zhǎng)時(shí))，ES細(xì)胞在整個(gè)多細(xì)胞分裂中保持多能性。多能成體干細(xì)胞的存在仍然是科學(xué)爭(zhēng)論的主題，然而，研究證明，可直接從成體成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生多能干細(xì)胞。由于它們對(duì)自我更新的可塑性和潛在無限能力，已提出將ES細(xì)胞療法用于再生醫(yī)學(xué)和損傷或疾病后的組織更新。然而，至今未從胚胎干細(xì)胞研究得到經(jīng)認(rèn)可的醫(yī)學(xué)治療。因此，成體干細(xì)胞和臍帶血干細(xì)胞遠(yuǎn)不是成功治療任何疾病使用的唯一干細(xì)胞。由這些非胚胎干細(xì)胞治療的疾病包括一些血液和免疫系統(tǒng)相關(guān)的遺傳疾病、癌癥和病癥；青少年糖尿?。慌两鹕?；失明和脊髓損傷。涉及干細(xì)胞治療的一個(gè)技術(shù)問題是與異基因干細(xì)胞移植相關(guān)的移植物抗宿主疾病問題。然而，可用自身供體成體干細(xì)胞或通過治療性克隆解決與組織相容性相關(guān)的問題。干細(xì)胞的實(shí)際定義為功能定義-有潛力終生使組織再生的細(xì)胞。例如，對(duì)骨髓或造血干細(xì)胞(HSC)的黃金標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)是移植一個(gè)細(xì)胞并解救沒有HSC的個(gè)體的能力。在此情況下，干細(xì)胞必須能夠長(zhǎng)期產(chǎn)生新的血細(xì)胞和免疫細(xì)胞， 而證明其效力。也應(yīng)能夠使干細(xì)胞從移植的個(gè)體分離，這些細(xì)胞可自身移植到?jīng)]有HSC的另一個(gè)個(gè)體，而證明干細(xì)胞能夠自我更新。干細(xì)胞的性質(zhì)可用諸如產(chǎn)克隆(clonogenic)試驗(yàn)的方法體外說明，其中單細(xì)胞特征為分化和自我更新的能力。另外，可根據(jù)不同的細(xì)胞表面標(biāo)記組分離干細(xì)胞。
現(xiàn)有技術(shù)有涉及干細(xì)胞的很多公開專利和專利申請(qǐng)，在允許時(shí)，以下所列專利的內(nèi)容也在此全文通過引用結(jié)合到本申請(qǐng)中。US5843780 和 US6200806 (Wisconsin Alumni Research Foundation)描述分離靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞的方法。W02007/120699 (Wisconsin Alumni Res Foundation)描述能夠預(yù)測(cè)發(fā)育毒性的
5低分子量細(xì)胞代謝物(10-1500道爾頓)的生物標(biāo)記分布，和用人胚胎干細(xì)胞篩選化合物的方法，所述化合物包括藥劑、先導(dǎo)和候選藥物化合物和其它化學(xué)物質(zhì)。Mumman等Q009) Toxicology 257 (3) 117-1 描述利用胚胎干細(xì)胞的甲基汞對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的胚胎毒性危害評(píng)估。該文章描述胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)作為發(fā)育毒性化合物的工具，尤其是針對(duì)改善甲基汞胚胎毒性的體外預(yù)測(cè)。^ummarm等描述基于三個(gè)終點(diǎn)的預(yù)測(cè)模型，即，細(xì)胞毒性試驗(yàn)、RT-PCR和免疫組織化學(xué)。W02007/063316 (Plasticell)公開識(shí)別細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的潛在調(diào)節(jié)劑的方法， 所述方法包含以下步驟(a)提供第一細(xì)胞類型的細(xì)胞，其中通過使第一細(xì)胞類型依次暴露于兩個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)條件，可使第一細(xì)胞類型經(jīng)祖細(xì)胞分化成第二細(xì)胞類型；(b)利用暴露于包含潛在調(diào)節(jié)劑的一個(gè)或多個(gè)不同反應(yīng)條件，加入或代替祖細(xì)胞已暴露的兩個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)條件的至少一個(gè)條件；并且(c)監(jiān)測(cè)第一細(xì)胞類型的分化，以測(cè)定第二細(xì)胞類型的形成。Buesen 等(2009, Toxicological Sciences, 108, (2)389-400)描述從單一樣品只測(cè)量一種生物標(biāo)記(細(xì)胞毒性)。WO 2004/013316 (University of Durham)公開制備從細(xì)胞群體分離的個(gè)體哺乳動(dòng)物多能干細(xì)胞得到的克隆多能干細(xì)胞的一種或多種組合物的方法，包含異質(zhì)細(xì)胞群體至標(biāo)記量，其識(shí)別和結(jié)合表達(dá)哺乳動(dòng)物多能干細(xì)胞的標(biāo)志的個(gè)體細(xì)胞，其中標(biāo)記包含檢索手段。W02007/002568 (Geron Corporation)描述快速測(cè)定對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞群體中靴組織類型的藥理作用的系統(tǒng)。細(xì)胞含有反映由正被篩選的作用劑(agent)導(dǎo)致的毒理或代謝變化的啟動(dòng)基因-報(bào)道基因結(jié)構(gòu)。US7041438 (Geron Corporation)公開在沒有飼養(yǎng)細(xì)胞存在下培養(yǎng)靈長(zhǎng)類多能干細(xì)胞的改進(jìn)系統(tǒng)。US2006/0275816 (Henderson&Cheatham)描述能夠用生物標(biāo)記識(shí)別藥理學(xué)和毒理學(xué)機(jī)制的微陣列和基于細(xì)胞的篩選策略。US2004/0254736 (Michelson&Bangs)公開用計(jì)算機(jī)建模和生物方法識(shí)別生物系統(tǒng)中潛在毒性的方法和裝置。US2002/0192671 (Castle&Elashoff)描述一種評(píng)價(jià)物質(zhì)毒性的方法，所述方法包含使至少兩種基因暴露于物質(zhì)；用對(duì)比分析來分析各基團(tuán)對(duì)物質(zhì)響應(yīng)的差異；建立基因組中各基因的概括分?jǐn)?shù)；對(duì)概括分?jǐn)?shù)進(jìn)行邏輯回歸分析；并用邏輯回歸分析結(jié)果提供關(guān)于物質(zhì)毒性的預(yù)測(cè)模型。US7354730(HemoGenix, Inc)公開造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞增殖的高通量試驗(yàn)。US7202081 (Hoffmann La Roche)描述用增殖中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞樣品作為試驗(yàn)系統(tǒng)同時(shí)測(cè)定物質(zhì)的細(xì)胞增殖抑制活性和細(xì)胞毒性(誘導(dǎo)細(xì)胞死亡)的方法。US6998249 (Pharmacia&UpJohn)公開預(yù)測(cè)指定化合物的體內(nèi)毒性的方法。該方法包括平行進(jìn)行至少三個(gè)不同試驗(yàn)，以提供關(guān)于指定靶細(xì)胞中化學(xué)物質(zhì)的細(xì)胞毒性的三個(gè)不同參數(shù)的信息，該信息可用于預(yù)測(cè)體內(nèi)細(xì)胞毒性。該方法未描述涉及干細(xì)胞或多重化 (multiplexing)的技術(shù)。US6007993A (Insitut fur Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung)描述一種體外試驗(yàn)程序，用于檢測(cè)對(duì)胚胎發(fā)育的化學(xué)誘導(dǎo)作用和用于分化，其目的在于使用從原始生殖細(xì)胞得到的胚胎干(EG)細(xì)胞，基于來自小鼠和大鼠的分化的多能胚胎干(ES) 細(xì)胞的胚胎毒性/致畸性篩選。所提出的試驗(yàn)程序的特征在于，選擇含有組織特異性啟動(dòng)基因和報(bào)道基因的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因ES或EG細(xì)胞克隆，在特定時(shí)間起作用的胚胎毒性物質(zhì)存在下ES細(xì)胞分化成不同的萌發(fā)途徑衍生物后進(jìn)行組織特異性基因的分化依賴性表達(dá)；隨后檢測(cè)調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的組織特異性基因的化學(xué)誘導(dǎo)激活、阻抑或調(diào)節(jié)。US2008/0280300 (Plasticell)公開識(shí)別細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的潛在調(diào)節(jié)劑的方法， 所述方法包含以下步驟(a)提供第一細(xì)胞類型的細(xì)胞，其中通過使第一細(xì)胞類型依次暴露于兩個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)條件，可使第一細(xì)胞類型經(jīng)祖細(xì)胞分化成第二細(xì)胞類型；(b)利用暴露于包含潛在調(diào)節(jié)劑的一個(gè)或多個(gè)不同反應(yīng)條件，加入或代替祖細(xì)胞已暴露的兩個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)條件的至少一個(gè)條件；并且(c)監(jiān)測(cè)第一細(xì)胞類型的分化，以測(cè)定第二細(xì)胞類型的形成。US2008/0248503描述篩選化合物以預(yù)測(cè)毒性和淋巴-造血系統(tǒng)的殘余增殖及分化能力的方法。US2008/0132424公開利用增殖所用的ATP測(cè)量的基于人胚泡衍生干細(xì)胞和祖細(xì)胞的毒性試驗(yàn)。US2007/0248947 (Wisconsin Alumni Research Foundation)描述低分子量細(xì)胞代謝物的生物標(biāo)記分布，和用人胚胎干細(xì)胞或由其產(chǎn)生的譜系特異性細(xì)胞篩選化合物的方法，所述化合物包括藥劑、先導(dǎo)和候選藥物化合物和其它化學(xué)物質(zhì)。所述方法用于試驗(yàn)毒性，特別是發(fā)育毒性，并檢測(cè)這些化合物的致畸作用。US2007/0248947未描述本文所述的多重方法或細(xì)胞生物標(biāo)記。US 7541185 (Cythera, Inc.)公開用于識(shí)別一種或多種分化因子的方法，所述分化因子可用于使內(nèi)胚層細(xì)胞群體中的細(xì)胞分化成能夠形成由腸管得到的組織和/或器官的細(xì)胞。US 7510876 (Cythera, Inc)描述制備人內(nèi)胚層細(xì)胞的體外方法。Cezar (Int. J. Pharm. Med, 2006，20，107-114)回顧在產(chǎn)生疾病和毒性反應(yīng)的體外模型中干細(xì)胞技術(shù)的關(guān)鍵機(jī)遇。0' Brien&Haskins (Methods in Molecular Biology (分子生物學(xué)中的方法)， 2007,356,415-425)描述用于評(píng)價(jià)化合物導(dǎo)致人毒性的可能性的多參數(shù)、活細(xì)胞、致死前細(xì)
胞毒性高含量篩選試驗(yàn)。Bremer&Hartung (Current Pharmaceutical Design (當(dāng)前藥物設(shè)計(jì))，2004,10, 2733-2747)回顧在國際失明合作研究中與體內(nèi)結(jié)果比較的胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)的驗(yàn)證。Mumman等(Toxicology 2007 242，130-43)描述利用胚胎干細(xì)胞的甲基汞和鉻的胚胎毒性危害評(píng)估。該文章描述胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)作為發(fā)育毒性化合物的工具，尤其是針對(duì)改善甲基汞胚胎毒性的體外預(yù)測(cè)。^ummarm等描述基于三個(gè)終點(diǎn)的預(yù)測(cè)模型，即，除了胚胎干細(xì)胞心臟分化試驗(yàn)外，還描述利用小鼠胚胎干細(xì)胞和3T3成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗(yàn)。然而，該文章未描述毒素或致畸原對(duì)早期或晚期分化生物標(biāo)記對(duì)于特定細(xì)胞發(fā)育途徑的作用作為反映胎兒或細(xì)胞發(fā)育的手段。Clarke等(Regen. Med. 2007，2，947-956)公開用來自不同造血組織的初級(jí)細(xì)胞提
供高內(nèi)容信息。
Paquette等(R印rod. Toxicol. 2008，83，104-111)描述胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)作為制藥工業(yè)中發(fā)育毒性化合物的工具的應(yīng)用和用途。Li等(Biol. Chem. 2008，389，169-177)描述抑制成體干細(xì)胞系的生脂分化的毒劑
(二氧芑)的作用。Miranda 等(Methods Mol. Biol. 2008447，151-156)描述用嚙齒動(dòng)物胎腦皮層衍生的神經(jīng)干細(xì)胞作為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并測(cè)定預(yù)先乙醇暴露對(duì)隨后神經(jīng)元成熟的作用。Adler等(Altern Lab Anim. 2008 36，129-40)公開基于人細(xì)胞類型的細(xì)胞生存能力試驗(yàn)，代表發(fā)育成熟的不同程度，即，包皮成纖維細(xì)胞、人胚胎干細(xì)胞衍生的祖細(xì)胞和人胚胎干細(xì)胞。Adler 等 CToxicology in vitro, 2008 22，200-211)描述基于人胚胎干細(xì)胞和一
些標(biāo)記基因的發(fā)育毒性試驗(yàn)方法。Ahuja等(Toxicology，2007 231,1-10)描述用化學(xué)或物理劑治療特異細(xì)胞類型， 測(cè)量其響應(yīng)提供試驗(yàn)成體生物體不同器官系統(tǒng)中毒性的捷徑。技術(shù)問題如上討論，需要可用于預(yù)測(cè)化學(xué)物質(zhì)對(duì)人發(fā)育的毒性，而不回到漫長(zhǎng)和昂貴的動(dòng)物試驗(yàn)，并且比依賴模型動(dòng)物系統(tǒng)更近地反映人發(fā)育的新試驗(yàn)。具體地講，對(duì)于預(yù)測(cè)哪種發(fā)育途徑和哪種組織受化學(xué)物質(zhì)影響的試驗(yàn)存在未滿足的需求。發(fā)明概述本發(fā)明的第一方面提供一種預(yù)測(cè)化學(xué)物質(zhì)對(duì)樣品中發(fā)育途徑的毒性的方法，所述方法包含以下步驟(i)用一種作用劑處理樣品中的未分化干細(xì)胞的對(duì)照群體，以在第一發(fā)育途徑中產(chǎn)生分化細(xì)胞的第一對(duì)照群體；(ii)測(cè)量在所述未分化干細(xì)胞的對(duì)照群體和/或所述分化細(xì)胞的第一對(duì)照群體中表達(dá)的至少兩種生物標(biāo)記的水平，以測(cè)定表達(dá)的對(duì)照水平，其中至少一種所述生物標(biāo)記在發(fā)育途徑和/或分化的早期階段表達(dá)，并且至少一種生物標(biāo)記在發(fā)育途徑和/或分化的晚期階段表達(dá)；(iii)在用所述作用劑處理之前或之后，使所述樣品中的未分化干細(xì)胞的試驗(yàn)群體暴露于化學(xué)物質(zhì)，以在第一發(fā)育途徑中產(chǎn)生分化細(xì)胞的第一試驗(yàn)群體；(iv)測(cè)量所述未分化干細(xì)胞的試驗(yàn)群體和/或所述分化細(xì)胞的第一試驗(yàn)群體中的所述至少兩種生物標(biāo)記的水平，以測(cè)定表達(dá)的試驗(yàn)水平；(ν)將所述表達(dá)的對(duì)照水平與所述表達(dá)的試驗(yàn)水平比較，其中在暴露于所述化學(xué)物質(zhì)后表達(dá)水平的差異指示化學(xué)物質(zhì)對(duì)所述發(fā)育途徑的毒性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，為避免疑慮，用于本發(fā)明的未分化干細(xì)胞不包括全能干細(xì)胞。在優(yōu)選的方面，方法的步驟(i)包含用一種作用劑處理未分化干細(xì)胞的群體的步驟，以在第η發(fā)育途徑中產(chǎn)生分化細(xì)胞的第η群體；并且重復(fù)步驟(ii)至(ν)，以測(cè)定所述第η群體中表達(dá)的對(duì)照水平與表達(dá)的試驗(yàn)水平的差異，其中在暴露于化學(xué)物質(zhì)后表達(dá)水平的差異指示化學(xué)物質(zhì)對(duì)所述第η發(fā)育途徑的毒性。
一方面，第一和第η發(fā)育途徑為網(wǎng)絡(luò)化發(fā)育途徑。一方面，方法的步驟(i)包含用一種作用劑處理未分化干細(xì)胞的群體的步驟，以在多個(gè)發(fā)育途徑中產(chǎn)生分化細(xì)胞的多個(gè)群體；然后，方法包含重復(fù)步驟(ii)至(ν)，以測(cè)定所述多個(gè)群體中表達(dá)的對(duì)照水平與表達(dá)的試驗(yàn)水平的差異，其中在暴露于化學(xué)物質(zhì)后表達(dá)水平的差異指示化學(xué)物質(zhì)對(duì)所述多個(gè)發(fā)育途徑的毒性。多個(gè)發(fā)育途徑適合為網(wǎng)絡(luò)化發(fā)育途徑。一方面，干細(xì)胞為多能干細(xì)胞。多能干細(xì)胞可以為胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或原始生殖細(xì)胞。另一方面，干細(xì)胞為成體干細(xì)胞。優(yōu)選干細(xì)胞為人干細(xì)胞。一方面，至少一種生物標(biāo)記為胚胎干細(xì)胞生物標(biāo)記。另一方面，至少一種生物標(biāo)記為原始生殖細(xì)胞生物標(biāo)記。另一方面，至少一種生物標(biāo)記為成體干細(xì)胞生物標(biāo)記。胚胎干細(xì)胞生物標(biāo)記適合選自Nanog、S0X2、SSEA4、0ct4、TRA-1-60、TRA-1-81、 Cripto、CD133、A2B5、PAX6、Integran β 1、CEA、Tnkl、ERAS 和 STELLAR。原始生殖細(xì)胞生物標(biāo)記適合選自DDX4、Fragillis、Stella和NAN0S2。一方面，至少一種生物標(biāo)記為中胚層生物標(biāo)記。優(yōu)選中胚層生物標(biāo)記選自 Brachyury、Tbx6、TBR2、EOMES、PH0X2A、PH0X2B、PRRX1、PRRX2、MESDC2、Me sp1、Me sp2、MIERl、 MIER3 和 SNAIL。另一方面，至少一種生物標(biāo)記為外胚層生物標(biāo)記。優(yōu)選外胚層生物標(biāo)記選自EED、 TIFl y、KLH25、EDA、GJB6、ENCU EDAR, SOSTDCU NCAM 和 CD99。另一方面，至少一種生物標(biāo)記為內(nèi)胚層生物標(biāo)記。優(yōu)選內(nèi)胚層生物標(biāo)記選自Ki67、 Rb> CullinK Cullin 2、Cullin 3、Cyclin E 禾口 CyclinE2。一方面，至少一種生物標(biāo)記為心臟干細(xì)胞生物標(biāo)記。優(yōu)選心臟干細(xì)胞生物標(biāo)記選自透明質(zhì)烷合酶1、0SR1和kal。另一方面，至少一種生物標(biāo)記為心肌細(xì)胞前體細(xì)胞生物標(biāo)記。優(yōu)選心肌細(xì)胞前體細(xì)胞選自 ALPK3、Periostin 和 Mesp 1?！矫妫缙谏飿?biāo)記為在發(fā)育途徑和/或分化的早期階段期間表達(dá)的心肌細(xì)胞生物標(biāo)記。優(yōu)選早期心肌細(xì)胞生物標(biāo)記選自Nkx2. 5、心肌素、GATA4、MEF2C、HANDU IRX4、 TBX5、TBX20和轉(zhuǎn)錄因子25。另一方面，晚期生物標(biāo)記為在發(fā)育途徑和/或分化的晚期階段期間表達(dá)的心肌細(xì)胞生物標(biāo)記。優(yōu)選晚期心肌細(xì)胞生物標(biāo)記選自心肌鈣蛋白T抗體、心肌鈣蛋白I抗體、重鏈心肌球蛋白抗體、肌球蛋白輕鏈抗體、心FABP抗體和α肌節(jié)肌動(dòng)蛋白抗體。另一方面，晚期生物標(biāo)記為心室生物標(biāo)記。優(yōu)選心室生物標(biāo)記選自ΒΜΡ10、HAND2 和血清應(yīng)答因子。一方面，早期生物標(biāo)記為在發(fā)育途徑和/或分化的早期階段期間表達(dá)的神經(jīng)干細(xì)胞生物標(biāo)記。優(yōu)選早期神經(jīng)干細(xì)胞生物標(biāo)記選自聚集蛋白聚糖ARGxxx、⑶133、EMX2、巢蛋白(Nestin)禾口 NeuroDl。另一方面，晚期生物標(biāo)記為在發(fā)育途徑和/或分化的晚期階段期間表達(dá)的神經(jīng)干
9細(xì)胞生物標(biāo)記。優(yōu)選晚期神經(jīng)干細(xì)胞生物標(biāo)記選自BRN3A、BRN;3B、Musashi l、Msil、NR2El、 Tailless、核干細(xì)胞因子、0ct6、Pax2、S0X2、S0X4、S0X10、S0X11、S0X22、波形蛋白和 CDw33。另一方面，至少一種生物標(biāo)記為神經(jīng)嵴細(xì)胞生物標(biāo)記。優(yōu)選神經(jīng)嵴細(xì)胞生物標(biāo)記選自神經(jīng)發(fā)生素(Neurogenin) 1、神經(jīng)發(fā)生素2、神經(jīng)發(fā)生素3和MASHl。一方面，至少一種生物標(biāo)記為星形膠質(zhì)細(xì)胞生物標(biāo)記。另一方面，至少一種生物標(biāo)記為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生物標(biāo)記。另一方面，至少一種生物標(biāo)記為浦肯野(purkinja)細(xì)胞生物標(biāo)記。一方面，至少一種生物標(biāo)記為神經(jīng)元或神經(jīng)細(xì)胞生物標(biāo)記。優(yōu)選神經(jīng)細(xì)胞生物標(biāo)記選自海馬神經(jīng)元、端腦神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元、膽堿能神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元、傷害性神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、錐體神經(jīng)元、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌、軸突、施萬(khwarm)細(xì)胞、 樹突、生長(zhǎng)錐、體細(xì)胞和突觸細(xì)胞。另一方面，至少一種生物標(biāo)記為脂肪細(xì)胞生物標(biāo)記。一方面，通過與標(biāo)記的抗體反應(yīng)，并測(cè)量結(jié)合的標(biāo)記，將兩種或更多種生物標(biāo)記的水平定量。兩種或更多種生物標(biāo)記的水平優(yōu)選用定量免疫細(xì)胞化學(xué)定量。另一方面，未分化干細(xì)胞包含可操作連接到至少兩種或更多種生物標(biāo)記的不同報(bào)道基因，兩種或更多種生物標(biāo)記的水平通過測(cè)量不同基因產(chǎn)物定量。優(yōu)選報(bào)道基因選自硝基還原酶、β -半乳糖苷酶、β -內(nèi)酰胺酶、熒光素酶和熒光蛋白報(bào)道基因。另一方面，通過選自定量RT-PCR、定量免疫細(xì)胞化學(xué)、表面等離子共振和微陣列分析的方法將兩種或更多種生物標(biāo)記的水平定量。一方面，所述方法另外包含在步驟(iii)后測(cè)定細(xì)胞增殖。在一個(gè)優(yōu)選的方面，方法為多重方法。本發(fā)明的第二方面提供一種用上述方法預(yù)測(cè)人胎兒發(fā)育期間細(xì)胞生物圖或發(fā)育途徑變化的方法。本發(fā)明第三方面提供一種進(jìn)行上述方法的試劑盒，所述試劑盒包含用于將至少兩種生物標(biāo)記定量的裝置和用于進(jìn)行方法的說明書。在優(yōu)選的方面，用于將生物標(biāo)記定量的裝置選自抗體、酶底物和寡核苷酸弓I物。定義本文所用“干細(xì)胞”定義為特征在于分化成不同范圍?；?xì)胞類型的能力的細(xì)胞。 兩個(gè)寬類型哺乳動(dòng)物干細(xì)胞為從胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離的胚胎干細(xì)胞，和在成體組織中發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞。在發(fā)育中的胚胎中，干細(xì)胞可分化成所有?；咛ソM織。在成年生物體中，干細(xì)胞和祖細(xì)胞充當(dāng)身體的修復(fù)系統(tǒng)，補(bǔ)充?；?xì)胞，而且保持再生器官(如血、皮膚或腸組織)的正常更替。本文所用“胚泡”定義為在形成囊胚腔后但在植入前在早期胚胎發(fā)生中形成的結(jié)構(gòu)。本文所用“祖細(xì)胞”定義為具有分化成特定細(xì)胞類型的能力的細(xì)胞。大多數(shù)祖細(xì)胞描述為單能或多能。本文所用“發(fā)育途徑”定義為用于細(xì)胞分化的途徑(或細(xì)胞分化途徑)，且為祖細(xì)胞藉以變成更專用細(xì)胞類型的過程。在生物體從單一受精卵變?yōu)閺?fù)雜的組織系統(tǒng)和細(xì)胞類型時(shí)，在多細(xì)胞生物體發(fā)育期間發(fā)生很多次分化。分化也是成體中的一般過程在組織修復(fù)期間和在正常細(xì)胞更替期間成體干細(xì)胞分化并產(chǎn)生完全分化的子細(xì)胞。在本文所用“發(fā)育途徑”環(huán)境中的“網(wǎng)絡(luò)化”定義為包含能夠分化成兩種或更多種不同細(xì)胞類型的祖細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)，并且這些細(xì)胞類型自身可具有進(jìn)一步分化的能力。該過程繼續(xù)直到產(chǎn)生最終分化細(xì)胞類型。本文所用“發(fā)育生物學(xué)”定義為生物體藉以生長(zhǎng)和發(fā)育的過程的研究。發(fā)育生物學(xué)家研究細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和形態(tài)發(fā)生的基因控制，產(chǎn)生組織、器官和機(jī)體結(jié)構(gòu)的過程。本文所用“形態(tài)發(fā)生”定義為引起生物體發(fā)育其形狀的生物過程。它隨同細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分化和細(xì)胞發(fā)育控制是發(fā)育生物學(xué)的三個(gè)基本方面之一。形態(tài)發(fā)生過程控制生物體的胚胎發(fā)育和胎兒發(fā)育期間細(xì)胞的組織化空間分布。通過激素，通過由其它生物體產(chǎn)生的物質(zhì)到毒性化學(xué)物質(zhì)或放射性核素、污染物和其它毒劑范圍的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)，或者通過細(xì)胞空間圖形化誘導(dǎo)的機(jī)械應(yīng)力，可在生物體中誘導(dǎo)形態(tài)發(fā)生響應(yīng)。形態(tài)發(fā)生可在胚胎、成熟生物體、細(xì)胞培養(yǎng)物中或腫瘤細(xì)胞團(tuán)內(nèi)進(jìn)行。本文所用“多能性”定義為具有分化成任何以下三種胚層的潛能的干細(xì)胞內(nèi)胚層 (例如，產(chǎn)生胃內(nèi)粘膜、胃腸道、肺、肝、胸腺、甲狀旁腺和甲狀腺)、中胚層(例如，產(chǎn)生肌肉、 骨、血液、泌尿生殖細(xì)胞)或外胚層(例如，產(chǎn)生表皮組織和神經(jīng)系統(tǒng))。本文所用“誘導(dǎo)多能干細(xì)胞”定義為通過誘導(dǎo)某些基因的遍布(ubiquitous)表達(dá)從非多能細(xì)胞(一般為成體體細(xì)胞)人工誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞類型。本文所用“生物標(biāo)記”定義為用作生物學(xué)狀態(tài)標(biāo)記的細(xì)胞分子，如蛋白，但與低分子量代謝物不同。它是客觀測(cè)量并評(píng)價(jià)為正常生物過程、致病過程或?qū)χ委煾深A(yù)或毒劑的藥理學(xué)反應(yīng)的標(biāo)記的特征或分子。在細(xì)胞生物學(xué)中，生物標(biāo)記為由特定細(xì)胞類型表達(dá)的分子(例如，用蛋白Oct-4作為識(shí)別胚胎干細(xì)胞的生物標(biāo)記)。生物標(biāo)記可通過技術(shù)人員公知的多種技術(shù)測(cè)量，如微陣列分析、報(bào)道基因試驗(yàn)、定量RT-PCR或使用定量免疫細(xì)胞化學(xué)。本文所用“早期”或“晚期”生物標(biāo)記定義為分別在細(xì)胞培養(yǎng)或生長(zhǎng)的早期或晚期階段期間表達(dá)的細(xì)胞生物標(biāo)記。在培養(yǎng)或生長(zhǎng)的這些不同階段，這些生物標(biāo)記可上調(diào)或下調(diào)。本文所用“多重試驗(yàn)”或“多重化”定義為測(cè)量來自單一樣品的多重分析物、分子或生物標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)室程序類型。因此，該技術(shù)允許多重探詢活細(xì)胞，從而允許產(chǎn)生高含量信息。多重試驗(yàn)不同于測(cè)量單一分析物或單一生物標(biāo)記的程序。本文所用“第η”表示2至1000的正整數(shù)(例如，第二、第三、第四、第五、第六、第
'^LJ Λ ^J J^K ΛΛ· · ·"P ) O本文所用“作用劑(agent)，，為誘導(dǎo)未分化干細(xì)胞分化的物理刺激(例如，光、熱、 輻射)或化學(xué)處理?；瘜W(xué)處理可包含化學(xué)物質(zhì)(例如激素、生長(zhǎng)因子等)的混合物。該作用劑一般不同于作為潛在毒物評(píng)價(jià)的“化學(xué)物質(zhì)”，在該作用劑和化學(xué)物質(zhì)為一種并且相同時(shí)，它們?cè)诒景l(fā)明的方法中以不同濃度使用。附圖簡(jiǎn)述圖1為顯示干細(xì)胞分化成發(fā)育途徑網(wǎng)絡(luò)的示意性表示(生物標(biāo)記在括號(hào)內(nèi)指示)。圖2為本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案的示意性說明，其中評(píng)價(jià)了化學(xué)物質(zhì)00)對(duì)用刺激物或作用劑(30)處理后對(duì)未分化干細(xì)胞(10)分化成分化細(xì)胞GO)的作用。發(fā)明詳述
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干細(xì)胞和胚胎牛殖細(xì)胞標(biāo)記干細(xì)胞為具有i)不明確體外分化和ii)分化成不同成熟細(xì)胞類型的能力的特征的未分化細(xì)胞?？蓪⑺鼈儦w類為可產(chǎn)生所有三種胚胎生殖細(xì)胞層(即，外胚層、中胚層和內(nèi)胚層)細(xì)胞類型的多能干細(xì)胞。這些包括胚胎原始生殖細(xì)胞(從生殖腺嵴得到)和重編程誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。成體干細(xì)胞為多能，并沿著特定發(fā)育途徑分化。多個(gè)新興技術(shù)有希望提供識(shí)別干細(xì)胞分化不同階段的標(biāo)記的手段。包括干細(xì)胞的各細(xì)胞類型具有獨(dú)特信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)由引起細(xì)胞特異性基因表達(dá)的細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)整體系保持。因此，身體中的274種不同的細(xì)胞類型由人體中存在的 25，000種基因的組合表達(dá)限定(Ahn, S. M.等，2008 Proteomics 8，4946-4957)。胚胎干細(xì)胞分化的初始階段包括產(chǎn)生三種胚胎生殖細(xì)胞層(即，外胚層、中胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞)，所有最終分化細(xì)胞衍生自這三種細(xì)胞類型。圖1顯示干細(xì)胞分化成發(fā)育途徑網(wǎng)絡(luò)。生物標(biāo)記在圖中的括號(hào)中指示，因此，0ct4為用于胚胎干細(xì)胞的生物標(biāo)記，而 Naggin為用于神經(jīng)干細(xì)胞的生物標(biāo)記。也說明了早期和晚期生物標(biāo)記，因此DSS3為在神經(jīng)元發(fā)育的早期階段表達(dá)的生物標(biāo)記，而NeuN在神經(jīng)元發(fā)育的晚期階段表達(dá)。為了評(píng)價(jià)干細(xì)胞群體展示的分化的初始程度，可使用以下胚層生物標(biāo)記。在分化的晚期階段期間，使用更多細(xì)胞/組織特異性標(biāo)記。胚胎干細(xì)胞標(biāo)記[l]Nan0g(抗體ab21603)_對(duì)早期胚和多能干細(xì)胞(包括小鼠和人胚胎干(ES)細(xì)胞和胚胎生殖(EG)細(xì)胞特異。[2] S0X2 (抗體abl2830)-胚胎干細(xì)胞標(biāo)記[3] SSEA4 (抗體abl6^7)-階段-特異性胚胎抗原4早期在胚胎發(fā)育和在多能干細(xì)胞中表達(dá)。W]0ct4(抗體ab27980-由未分化胚胎干細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。[5]TRA-1_60(抗體 abl6^8)_ 與在人丁癌(tetracarcinoma)和胚胎基因和干細(xì)胞的表面表達(dá)的抗原反應(yīng)。[6]TRA-1-81 (抗體abl6^9)-人胚胎干細(xì)胞、生殖細(xì)胞和癌細(xì)胞的標(biāo)記。[7]Cripto (抗體abl9917)_在ES細(xì)胞中和在胚胎發(fā)育早期階段期間兩者中表達(dá)。[8]⑶133(抗體abl9898)_用于干細(xì)胞和祖細(xì)胞(包括神經(jīng)和胚胎干細(xì)胞)的標(biāo)記。[9]A2B5(抗體ab53521)_A2B5為在發(fā)育中的上皮細(xì)胞、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞表面神經(jīng)節(jié)苷脂表位。
[10JPAX6 (抗體ab5790)-轉(zhuǎn)錄因子，在眼、鼻、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胰腺的發(fā)育中重要。[11] Integran β 1 (抗體 ab5185)-干細(xì)胞標(biāo)記[12] CEA癌胚胎抗原(抗體ab46538)-在胎腸發(fā)育期間表達(dá)[13] Tnkl (抗體^7040 -胚胎干細(xì)胞的激酶。[14] ERAS (抗體ab67696)-在胚胎干(EQ細(xì)胞中表達(dá)，并促進(jìn)其體外增殖和致瘤性。[15] STELLAR (抗體ab78559)-生殖細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞富集的蛋白。
原始牛殖細(xì)胞標(biāo)記[1]DDX4(抗體abl3840)_在卵巢和睪丸中表達(dá)的原始生殖細(xì)胞標(biāo)記。[2] Fragi 11 is (抗體ab 15592)-在生殖系細(xì)胞命運(yùn)中涉及。[3]Stella(抗體abl9878)_原始生殖細(xì)胞標(biāo)記，在原始生殖細(xì)胞、卵母細(xì)胞、植入前胚胎和多能細(xì)胞中特異表達(dá)。[4]NAN0S2(抗體abl5731)_在無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物兩者的生殖細(xì)胞發(fā)育中涉及的原始生殖細(xì)胞標(biāo)記。中胚層標(biāo)記[1]Brachyury (抗體ab20680)中胚層標(biāo)記-中胚層形成的最早指示物。用作中胚層分化的標(biāo)記。[2]Tbx6(抗體ab30946)_在原條和體節(jié)前期中胚層中表達(dá)。[3]TBR2/Eomes (抗體ab23345)_T box brain 2為由發(fā)育期間的中間祖細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。[4JPH0X2A和2B (分別為抗體abM847和abl2047)-同源框樣轉(zhuǎn)錄因子，在數(shù)種主要神經(jīng)元群體的發(fā)育中涉及。[5]PRRXl和2(抗體ab67631和ab7765Q-同源框蛋白配對(duì)族的成員[6] MESDC2 (抗體ab68809)-對(duì)小鼠胚胎極性的規(guī)格是必要的。[7]Mespl和2(各自為抗體ab77013和ab2373;3)-中胚層1/2為在前部體節(jié)前期中胚層的分節(jié)/圖案化中具有作用的轉(zhuǎn)錄因子。[8]MIERl和3 (各自為抗體和ab69877)-中胚層誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因族的成員。[9] SNAIL(抗體abl7732)_對(duì)中胚層形成必不可少的轉(zhuǎn)錄因子外胚層標(biāo)記EED (抗體ab4469)-涉及保持基因的轉(zhuǎn)錄阻抑態(tài)的多梳蛋白組族。在ES細(xì)胞分化期間表達(dá)。TIFl γ (抗體ab333475)_在細(xì)胞分化和發(fā)育中起作用，在造血細(xì)胞分化中起作用。KLH25 (抗體ab5595;3)-外胚層神經(jīng)皮質(zhì)蛋白。EDA(abM386)_屬于腫瘤壞死因子族，涉及外胚層器官發(fā)育期間的細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。GJB6 (抗體ab59927)-外胚層發(fā)育不良(其構(gòu)成影響外胚層起源的組織的一組發(fā)育病癥)的缺陷原因。ENCl (抗體ab56348)-外胚層神經(jīng)皮質(zhì)蛋白1EDAR (抗體ab5680;3)-外胚層發(fā)育異常蛋白A受體S0STDC1 (抗體ab56079)_涉及子宮內(nèi)膜對(duì)于蛻膜細(xì)胞反應(yīng)的植入/敏化的感受性的開始。NCAM(抗體ab6123)_在神經(jīng)外胚層衍生細(xì)胞系、組織和瘤(如成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、星細(xì)胞瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤)中表達(dá)。⑶99(抗體ab8855)_⑶99的表達(dá)是來自原始外周神經(jīng)外胚層腫瘤的細(xì)胞的特征。
內(nèi)胚層標(biāo)記[l]Ki67(抗體ab833)_Ki67抗原為原型細(xì)胞周期相關(guān)的核蛋白，由活性細(xì)胞周期所有階段中的增殖細(xì)胞表達(dá)。[2]Rb (抗體2G5，ablll6)_腫瘤阻抑基因，作為細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)節(jié)劑。[3]Cullin 1、2 和 3 (各自為抗體 abl868、abl870 和 abl871)-中胚層標(biāo)記。[4]Cyclin E 和 E2 (各自為抗體 abll08 和 ablllO) Cyclin E 為 Cdk2 的調(diào)節(jié)子單元，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期期間控制G1/S轉(zhuǎn)變。心肌細(xì)胞分化i)完成分化，ii)抑制劑細(xì)節(jié)，和iii)心肌細(xì)胞標(biāo)記的方案。可用良好表征和公開的方案使祖細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞，如McBurney，M.W.等， (1982)，Nature 299,165-167, Smith, S. C 等，(1987)，J.Cell Physiol.131，74-84 和 Puceat, Μ. 2008，Methods，45，168-171 所述。使用這些方案，可從多能(pluri-potent)和多能(multi-potent)祖細(xì)胞(如胚胎癌和干細(xì)胞)產(chǎn)生心肌細(xì)胞。心肌細(xì)胞分化-小鼠P19衍牛心肌細(xì)胞P19細(xì)胞為小鼠多能胚胎癌細(xì)胞，在DMSO存在下生長(zhǎng)時(shí)，體外分化成收縮心肌細(xì)胞[McBumey, M. W. (1993) Int. J. Dev. Biol. 37，135-140]?？赏ㄟ^使用 McBurney, Μ. W.等， (1982), Nature 299，165-167 和 Smith，S. C 等，(1987)，J. Cell Physiol. 131，74-84 所述的方法完成該分化。P19細(xì)胞購自ATCC (cat. no. CRP-1825)。McBurney,Μ. W.等(1982)所述的“大批培養(yǎng)”方法簡(jiǎn)要包括在含有15% (ν/ν)熱失活胎牛血清、50 μ g/ml鏈霉素、50單位/ml青霉素、β-巰基乙醇(IOOnM)和丙酮酸鹽 (ImM)的RPMI培養(yǎng)基中，使Ρ19細(xì)胞在37°C在水飽和氣氛，5. 0-7. 5% CO2中生長(zhǎng)。在IOOmrn 超低結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning Cat. no. 3282)中，使對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞以2 X IO4個(gè)細(xì)胞/ml 傳代培養(yǎng)于分化培養(yǎng)基(含有20%熱失活胎牛血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并補(bǔ)加1%DMS0)中。 4天后，將細(xì)胞集合體轉(zhuǎn)移到含有無DMSO的新鮮分化培養(yǎng)基的100mm Falcon組織培養(yǎng)皿 (Cat no. 353003)。在暴露于分化培養(yǎng)基和DMSO后 6天，跳動(dòng)的心肌細(xì)胞出現(xiàn)在集合體中。Smith, S. C.等(1987)所述的P19細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞的“懸滴”方法類似于 McBurney,M. W.等(1982)的大批培養(yǎng)方法。然而，在暴露于分化培養(yǎng)基和DMSO后，將少量細(xì)胞轉(zhuǎn)移到100mm Corning超低結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)皿的頂部。為了使細(xì)胞保持在潮濕氣氛中，將它們倒置于PBS溶液上。在第4天，交換分化培養(yǎng)基，大約在第6天出現(xiàn)跳動(dòng)的心肌細(xì)胞。心肌細(xì)胞分化-胚胎干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞小鼠胚胎干細(xì)胞系CGR8、Rl和BSl分化的方案以前已描述于Puceat，Μ. 2008， Methods, 45,168-1710 CGR8 和 Rl 分別購自 ECACC(Cat. no. 07032901)和 ATCC(Cat. no. SCRC-1011)。BSl 細(xì)胞系描述并表征于 kineddine，D.等，2006，Dev. Cell 11, 535-546 該方案包括產(chǎn)生細(xì)胞集合體(也稱為胚狀體)，以引發(fā)分化，并用生長(zhǎng)因子改善對(duì)心譜系的分化效率。該方案適用于小鼠和人胚胎干細(xì)胞兩者的分化。小鼠和人胚胎干細(xì)胞繁殖之間的主要差異是，小鼠細(xì)胞可在白血病抑制因子存在下不用成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞繁殖，而人細(xì)胞傳統(tǒng)上需要飼養(yǎng)細(xì)胞和FGF2以保持多能性。在開始分化過程之前M小時(shí)，使對(duì)數(shù)生長(zhǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞暴露于繁殖培養(yǎng)基中的2. 5ng/ml重組體人BMP2 Qnvitrogen)。繁殖培養(yǎng)基由BHK21培養(yǎng)基(Invitrogen)、鏈霉素(50yg/ml)、青霉素(50單位/ml)、非必需氨基酸(ImM)、丙酮酸鈉(ImM)、谷氨酰胺 (ImM)、巰基乙醇(IOOnM)、胎牛血清(7. 5% ν/ν)和重組體白血病抑制因子(1單位/ml)組成。在傳代培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，分散(以促進(jìn)產(chǎn)生胚狀體)，通過低速離心收獲，并以25，000個(gè)細(xì)胞/ml重新懸浮于分化培養(yǎng)基，所述分化培養(yǎng)基由缺少重組體白血病抑制因子的繁殖培養(yǎng)基組成，并補(bǔ)加20% (ν/ν)胎牛血清。所有細(xì)胞操作在37°C和5-7. 5% CO2中進(jìn)行。使細(xì)胞(500)以20 μ 1等分試樣分配到100_ Corning超低結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)皿的下側(cè)。使PBS分配到底部，以防止蒸發(fā)。使胚狀體形成進(jìn)行48小時(shí)。在此時(shí)間后，使所有胚狀體緩和地重新懸浮于IOml分化培養(yǎng)基，并培養(yǎng)另外72小時(shí)。在第5天，將胚狀體平板接種到用0. 明膠涂覆的i^lcon IOOmm組織培養(yǎng)皿上。跳動(dòng)的小鼠心肌細(xì)胞應(yīng)在 7天后出現(xiàn)。人胚胎干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的產(chǎn)生包括以下在E14小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上， 使用以下繁殖培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的1-6人胚胎干細(xì)胞(Technion-Israel Institute of Technology):補(bǔ)加巰基乙醇(IOOnM)、谷氨酰胺(ImM)、非必需氨基酸(ImM) ,15 % (v/v) KOSR 血清替代品(Invitrogen)和 10ng/ml 重組體人 FGF2 (invitrogen)的 KO-DMEM(Invitrogen)。1-6人胚胎干細(xì)胞系由NIH批準(zhǔn)。為了使1-6細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞，使細(xì)胞暴露于繁殖培養(yǎng)基48小時(shí)，所述繁殖培養(yǎng)基具有減小濃度的KOSR血清替代品(5 % ν/ν)，并缺少FGF2，但補(bǔ)加lOng/ml BMP2和 FGF2 受體抑制劑 STO402 (1 μ Μ, Calbiochem Cat. no. 572630)。如上所述使用類似于為分化小鼠細(xì)胞設(shè)計(jì)的那些方案產(chǎn)生人胚狀體。在用膠原酶 CLS2 (Invitrogen)進(jìn)行1_6細(xì)胞酶促解離后，使細(xì)胞重新懸浮于補(bǔ)加5% KOSR血清替代品巰基乙醇(IOOnM)、谷氨酰胺(ImM)和非必需氨基酸(ImM)的KO-DMEM培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)移到 Corning超低結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)皿，以促進(jìn)細(xì)胞集合。在 2星期后觀察到跳動(dòng)的人心肌細(xì)胞。最近，MummeryC. L.等，2007 Curr Protoc Stem Cell Biol 第 1 章第 IF. 2 單元禾口 Mummery C. L. (2007) Cardiomyocyte differentiation in human ES cells ( A ES MM 中的心肌細(xì)胞分化)描述了基于人胚胎干細(xì)胞(hES2和hES3)與小鼠內(nèi)胚層樣END2細(xì)胞共培養(yǎng)的無血清懸浮培養(yǎng)方法。在Culture of Human Stem Cells (人干細(xì)胞培養(yǎng))，第4 章，93-106 頁(Eds. Freshney R. I. , Stacey, G. N.和 Auerbach，J. Μ·)中，此方案進(jìn)一步由 Graichen等2008 Differentiation (分化)76 357-370修改，用于使用END2細(xì)胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基。兩種方法包括如前所述胚狀體的產(chǎn)生。心肌細(xì)胞分化的抑制劑小鼠HSP25的表達(dá)對(duì)P19細(xì)胞的心肌細(xì)胞分化是重要的。已知HSP25通過p38途徑的磷酸化對(duì)其某些功能是重要的。已顯示由特異性抑制劑SB203580 (10 μ Μ)抑制ρ38途徑阻止小鼠 Ρ19 細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞[Davidson, S. Μ. &Norange, Μ. (2000)Dev. Biol, 218, 146-160]。在此研究中，通過免疫組織化學(xué)監(jiān)測(cè)單一心臟標(biāo)記心肌動(dòng)蛋白的存在，并通過 RT-PCR監(jiān)測(cè)心肌動(dòng)蛋白和心房鈉尿肽的表達(dá)，來評(píng)價(jià)分化。SB 203580[4-(4'-氟苯基)-2- '-甲基亞磺酰基苯基)-5-G‘-吡啶基) 咪唑]購自Promega (Cat. no. Vl 161)。它是MAP激酶同系物ρ38 α、ρ38 β和ρ38 β 2的特異性細(xì)胞可滲透抑制劑。SB 203580對(duì)ERK、JNK、ρ38 γ或ρ38 δ的活性沒有顯著作用。
Graichen,R.等，Q008) Differentiation (分化)，76，357-370 已證明 SB 203580 在1-10 μ M實(shí)際促進(jìn)來自人胚胎干細(xì)胞的心肌細(xì)胞的產(chǎn)生。然而，濃度增加到15 μ M顯著減少心肌細(xì)胞數(shù)，并在25 μ M完全阻止分化。因此，SB 203580的功能似乎依賴于物種 (specy)和劑量?jī)烧?。這些作者也證明對(duì)另一種P38MAP激酶抑制劑SB202190的類似濃度作用。他們也報(bào)告人胚胎干細(xì)胞心肌細(xì)胞分化的以下抑制劑-SB216763 (10-25 μ Μ, GSK-3 抑制劑)、PD098059(5-25yM，MAPKK 抑制劑)、茴香霉素(0.01-100 μ M，JNK/SAPK 和 ρ38 激活劑)、ATA (0. 01-100 μ Μ, JAK2/STAT5 激活劑)、FTT (0. 01-100 μ Μ, PKC 激活劑)和 OAG (0. 01-100 μ Μ, Ca2+ 依賴性 PKC)。心肌細(xì)胞分化的其它抑制劑包括下列。Lei，L.等，(2008) Shen Wu Gong Xue Bao, 24. (10) ,1790-1795證明，鈉/質(zhì)子交換劑1 (NHEl)抑制劑EMD87580抑制DMSO誘導(dǎo)期間小鼠P19胚胎癌細(xì)胞的心肌細(xì)胞分化。Li，X.等，Q009)Am.J. Wiysiol. Heart Circ. Physiol.，196，1，159-170證明在小鼠胚胎干細(xì)胞系CGR8中的類似結(jié)果。PI-3-激酶抑制劑 LY294002 (50 μ Μ)阻止小鼠胚胎干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞[Klinz，F(xiàn).，等，(1999)，Exp. Cell Res. ,247, (1)，79-83]。這些抑制劑的大部分可以購得，例如SB202190 (Millipore Cat. no. 19-134), LY294002 (Promega V1201)、SB216763 和茴香霉素(各自為 Tocris Bioscience Cat. no.1616 和 1290)。在祖干細(xì)胞分化期間，可監(jiān)測(cè)抑制劑(和化學(xué)物質(zhì)、藥物或化妝品)(如，SB 203580等)對(duì)心臟發(fā)育的作用。使祖細(xì)胞暴露于抑制劑，并通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)，如定量免疫細(xì)胞化學(xué)，通過測(cè)量與經(jīng)分化的細(xì)胞類型相關(guān)的細(xì)胞/組織特異性標(biāo)記的表達(dá)，來監(jiān)測(cè)分化程度，而評(píng)價(jià)對(duì)細(xì)胞發(fā)育過程的作用。圖2說明本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案，其中在用刺激物或作用劑(30)處理后， 通過測(cè)量至少兩種生物標(biāo)記(15、45和47)的水平，評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)00)對(duì)未分化干細(xì)胞 (10)分化成分化細(xì)胞G0)的作用。在暴露于誘導(dǎo)分化的刺激物或作用劑(30)之前或之后，可使干細(xì)胞(10)暴露于化學(xué)物質(zhì)00)。因此，例如，在心肌細(xì)胞發(fā)育環(huán)境下，通過測(cè)量干細(xì)胞(1 或心肌細(xì)胞(45，47)中存在的至少兩種生物標(biāo)記的水平，可評(píng)價(jià)藥物或化學(xué)物質(zhì)00)對(duì)干細(xì)胞(10)分化成心肌細(xì)胞G0)的潛在作用。指示心臟發(fā)育的標(biāo)記包括下列(也描述購自Abeam Inc.的抗體的來源)心臟干細(xì)胞標(biāo)記[1]透明質(zhì)烷合酶1(抗體ab75329)_在心臟發(fā)育中涉及。[2]0SR1 (抗體ab76689)_轉(zhuǎn)錄因子，在中內(nèi)胚層并且隨后在內(nèi)胚層和間介中胚層中表達(dá)。[3] Seal (抗體D7，ab25031)-在多能造血干細(xì)胞中表達(dá)。心肌細(xì)胞前體細(xì)胞的標(biāo)記[1] ALPK3 (抗體ab57526)-在心肌細(xì)胞分化中起作用。[2]Peri0Stin(抗體abl4041)_在胚胎和胎心中表達(dá)，定位到最終使原始心臟管分成四個(gè)室的心內(nèi)膜墊。[3]Mespl (抗體ab77013)-Mespl在心血管系統(tǒng)的很多前體中表達(dá)，已知在心形態(tài)發(fā)生過程中起作用。
心肌細(xì)胞-早期標(biāo)記[l]Nkx2. 5抗體(Abacm_ab35842)-在心肌和心內(nèi)膜兩者中表達(dá)。[2]心肌素抗體(Abeam Inc. _ab22621)-心肌素調(diào)節(jié)一組心臟和平滑肌特異性基因的表達(dá)。它在心臟發(fā)生和平滑肌細(xì)胞譜系的分化中起關(guān)鍵性作用。[3]GATA4抗體(Abeam Inc. _ab61170)-涉及心臟發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子，在心臟和平滑肌細(xì)胞類型中調(diào)節(jié)基部、激動(dòng)劑或應(yīng)激誘導(dǎo)的基因表達(dá)中起作用。[4JMEF2C (抗體ab43796)-轉(zhuǎn)錄激活劑，控制心形態(tài)發(fā)生和肌發(fā)生，也涉及血管發(fā)育。它也可涉及神經(jīng)發(fā)生和皮層結(jié)構(gòu)發(fā)育。 [5]HANDl (抗體ab52767)-轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑，在早期心臟形態(tài)發(fā)生中起重要作用。在成體中，為心特異性基因表達(dá)所需。[6] IRX4 (抗體ab56032)-在發(fā)育期間在心臟中表達(dá)。[7]TBX5(抗體(abl8531) _TB)(5可在心臟發(fā)育中起作用。[8] Tbx20 (抗體ab42468)-在發(fā)育中的心臟中表達(dá)。[9]轉(zhuǎn)錄因子25 (抗體ab67762)-在體外作為SRF的轉(zhuǎn)錄阻抑物，并因此可在心臟發(fā)育中起作用。心肌細(xì)胞-晚期標(biāo)記[1]心肌鈣蛋白T抗體(Abeam Inc. -1C11，ab8295)-只在心肌中表達(dá)，心肌鈣蛋白T是肌鈣蛋白復(fù)合物的原肌球蛋白結(jié)合亞基。[2]心肌鈣蛋白I抗體(Abeam Inc. -28419C7，abl9615)-肌鈣蛋白I是在調(diào)節(jié)骨胳肌和心肌收縮中起重要作用的異側(cè)(heteromeric)復(fù)合體的部分。[3]重鏈心肌球蛋白抗體(Abeam Inc. -3-48，abl5)-心MHC作為兩個(gè)同種型存在， α-心MHC和0-WMHC。兩者均在人心臟中表達(dá)，β-心MHC為主導(dǎo)形式。[4]肌球蛋白輕鏈抗體(&1LC-14，ab50080)-肌球蛋白由兩個(gè)重鏈和四個(gè)輕鏈組成。心室肌球蛋白輕鏈I (Abeam Inc. -MLM527, ab680)和心肌球蛋白輕鏈11LC-14，ab50080[5]肌球蛋白輕鏈2抗體(Abeam Inc. _ab48003)-肌球蛋白輕鏈2與心肌球蛋白 β-重鏈相關(guān)。[6]心FABP抗體(Abeam Inc. -67D3，abl6916)-在心肌組織中表達(dá)，且在骨胳肌中以顯著較低濃度表達(dá)。[7] α-肌節(jié)肌動(dòng)蛋白抗體(5C5，ab7799) - α -肌動(dòng)蛋白為肌動(dòng)蛋白的同種型之一。在脊椎動(dòng)物中有三組肌動(dòng)蛋白同種型α、β和Υ。α-肌動(dòng)蛋白發(fā)現(xiàn)于肌肉組織，并且為收縮器官的主要成分。該抗體與心肌肌動(dòng)蛋白反應(yīng)。心室標(biāo)記[1] BMPlO (抗體ab3496》_在心臟心室發(fā)育期間調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖和成熟的必需成分。[2]HAND2(抗體ab56590)_在發(fā)育中的心室腔中表達(dá)，并在心形態(tài)發(fā)生中起重要作用。肌節(jié)標(biāo)記[1]肌節(jié)α -輔肌動(dòng)蛋白抗體(Abeam Inc. _EA_53，ab9465) -ACTN2編碼在骨胳肌和心肌兩者中表達(dá)的肌肉-特異性α-輔肌動(dòng)蛋白同種型。定位于心肌和骨胳肌中肌管的
17應(yīng)力纖維中的Z線和點(diǎn)。[2]血清應(yīng)答因子(抗體ab36747)_心臟中出現(xiàn)跳動(dòng)的肌節(jié)所需的心臟富集的轉(zhuǎn)錄因子。其它心臟標(biāo)記[1]HEY2(抗體ab70133)_轉(zhuǎn)錄因子，哺乳動(dòng)物心臟發(fā)育的重要決定子。[2JKLF13 (抗體abl5701)-心臟發(fā)育所需的轉(zhuǎn)錄因子。[3]MEF2轉(zhuǎn)錄因子族MEF2A (抗體ab5M47)-在心肌和骨胳肌發(fā)育中具有關(guān)鍵作用。MEF2B (抗體ab5556Q-在發(fā)育期間調(diào)節(jié)很多肌肉相關(guān)基因的表達(dá)。涉及某些神經(jīng)原性細(xì)胞分化。MEF2D (抗體ab43797)-在未分化成肌細(xì)胞中存在表明可在生肌發(fā)育的很早階段起作用。涉及生肌細(xì)胞和一些神經(jīng)原性細(xì)胞的分化。[4]受磷蛋白抗體(Abeam he.-2D12，al^865)-調(diào)節(jié)心臟肌質(zhì)網(wǎng)(SR)的鈣泵。上述方法及其變體常用于使祖細(xì)胞(如胚胎干細(xì)胞)和癌細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞。 該分化過程可受化學(xué)物質(zhì)(如SB 293580)抑制。不同分化方法、特征化抑制劑和抗體的組合形成評(píng)價(jià)化學(xué)損傷后對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞/組織發(fā)育的作用的多重定量免疫細(xì)胞化學(xué)方法的基礎(chǔ)。神經(jīng)分化i)完成分化，ii)抑制劑細(xì)節(jié)，和iii)神經(jīng)標(biāo)記的方案?？捎昧己帽碚骱凸_的方案使祖細(xì)胞分化成神經(jīng)譜系的細(xì)胞，如下面所述的那些方案。使用這些方案，可從多能和多能祖細(xì)胞(如胚胎癌和干細(xì)胞)產(chǎn)生神經(jīng)元細(xì)胞。胚胎干(EQ和癌(EC)細(xì)胞滿足研究神經(jīng)元分化的很多標(biāo)準(zhǔn)，它們快速分裂并能夠分化成包括神經(jīng)元的多種細(xì)胞類型。ES細(xì)胞多能，然而，它們需要要求高的培養(yǎng)條件，通常需要飼養(yǎng)細(xì)胞或昂貴的生長(zhǎng)因子。然而，EC細(xì)胞較容易培養(yǎng)，不需要飼養(yǎng)細(xì)胞，并且可保持在相對(duì)簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基中。EC細(xì)胞的缺點(diǎn)是它們是腫瘤細(xì)胞，基因異常，并且顯示有限的分化能力。然而，它們確實(shí)代表用于分化研究的簡(jiǎn)單且穩(wěn)健的系統(tǒng)。EC細(xì)胞系NTERA2已用于研究神經(jīng)元分化，并且暴露于視黃酸可靠產(chǎn)生神經(jīng)元，所述神經(jīng)元類似于通過培養(yǎng)物中初級(jí)神經(jīng)元產(chǎn)生的那些。視黃酸暴露導(dǎo)致干細(xì)胞標(biāo)記(如 0ct4、SSE3、TRA-1-60和TRA-1-81)的損失和神經(jīng)標(biāo)記(如NeuroDU β -III微管蛋白和神經(jīng)絲)的上調(diào)。此分化過程非?？深A(yù)見和一致。暴露于視黃酸和在有絲分裂抑制劑存在下細(xì)胞的重新接種促進(jìn)產(chǎn)生基本純的神經(jīng)元群體(Leypoldt F.等，2001，Neurochem. 76， 806-814)。這些是基本功能成熟的表達(dá)突觸和神經(jīng)遞質(zhì)表現(xiàn)型，如膽堿能、GABA能和血清素能(sertonergic)受體(Hartley 等，1999，J. Comp. Neurol.，407，1-10)。祖細(xì)胞的神經(jīng)分化由 Leypoldt F.等，2001 (Neurochem. 76，806-814)進(jìn)行的 NTERA2 細(xì)胞的神經(jīng)分化簡(jiǎn)要包括下列。細(xì)胞常規(guī)于37°C在5% CO2中保持在補(bǔ)加5%胎牛血清的 OptiMEManvitrogen)培養(yǎng)基中。在具有10%胎牛血清的高葡萄糖DMEManvitrogen)中在細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞集合(IX IO6個(gè)細(xì)胞/ml)。在過夜后，培養(yǎng)基補(bǔ)加1 μ M反式視黃酸。每3天更換培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿。使視黃酸存在保持21天，隨后，將細(xì)胞集合體轉(zhuǎn)移到集合培養(yǎng)基[補(bǔ)加有絲分裂抑制劑胞嘧啶-D-阿拉伯呋喃糖苷(10 μ g/ml)和尿苷(1 μ g/ ml)]中的聚-D-賴氨酸和層粘連蛋白(兩者均為10yg/ml)細(xì)胞培養(yǎng)物處理的皿。這些條件繼續(xù) 7天，培養(yǎng)基每2-3天更換。該延長(zhǎng)方案(持續(xù) 4星期)促進(jìn)高百分?jǐn)?shù)NTERA2 細(xì)胞有效分化成神經(jīng)元。表達(dá)功能突觸的神經(jīng)元細(xì)胞也已從NTERA2細(xì)胞產(chǎn)生。Hartley等，1999 (J. Comp. Neurol. ,407,1-10)共培養(yǎng)NTERA2細(xì)胞與初級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞，所得神經(jīng)元產(chǎn)生谷氨酸鹽能和GABA能突觸(另外，它們的體外生存能力延長(zhǎng)到> 1年)。根據(jù)Cadelli，D. S.和 Schwab, Μ. Ε.，1991 (Ann. N. Y.Acad.，Sci.，633，234-240)的方法，使初級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞從18-21天大鼠胚胎的腦半球分離。將NTERA2神經(jīng)元(1X105)接種到聚-D-賴氨酸和 Matrigel (BDbiosciences)涂覆的蓋片上，并與(但不接觸)匯合星形膠質(zhì)細(xì)胞一起在 35mm細(xì)胞培養(yǎng)物處理的皿中共培養(yǎng)。使共培養(yǎng)物保持在具有以星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基1 1補(bǔ)加的高葡萄糖的DMEM中。在6星期后，電子顯微圖表明，免疫組織化學(xué)證明突觸和突觸蛋白I表達(dá)的存在。谷氨酸鹽能、GABA能和NMDA傳輸各自用選擇性拮抗劑 CNQX(10 μ M)、荷苞牡丹堿(20 μ Μ)和APV(IOOyM)通過電生理學(xué)證明。未分化的人ES細(xì)胞(如NTERA2細(xì)胞)表達(dá)標(biāo)記0ct4、SSE3、TRA-1-60禾口 TRA-1-81，所有這些標(biāo)記均在分化時(shí)下調(diào)。在利用視黃酸、二甲亞砜(DMSO)或六亞甲基雙乙酰胺的神經(jīng)元分化時(shí)，衍生的ES細(xì)胞顯示ES標(biāo)記的下調(diào)和神經(jīng)神經(jīng)節(jié)苷脂糖脂⑶2、 GD3 和 A2B5 的增加表達(dá)(Draper J.等，2002，J. Anat.，200，249-258)。通常用這些細(xì)胞表面標(biāo)記從早期分化中的細(xì)胞分離有前景的神經(jīng)前體。用于從神經(jīng)譜系分離細(xì)胞的其它有用標(biāo)記包括N-CAM、neuroDl、NSE、巢蛋白β -微管蛋白和musashi-1。少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可用標(biāo)記 01ig-l、-2-3 和-4 識(shí)別(Jackson J. P.等，2007，Culture of human stem cells (人干細(xì)胞;t音養(yǎng))中白勺 Techniques for neural differentiation of human EC and ES cells.(人 EC 和 ES 細(xì)胞的神經(jīng)分化技術(shù))eds. Freshney R. I. ,Stacey,G. D. Muerbach J. M. J. Wiley&Sons，Inc.)。促進(jìn)祖細(xì)胞神經(jīng)分化的方法包括細(xì)胞集合。該方法常規(guī)用于誘導(dǎo)ES和EC細(xì)胞 (包括NTERA2、P19和PC12)的分化。細(xì)胞集合增加細(xì)胞接觸，促進(jìn)細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)，這是體內(nèi)發(fā)育和體外分化的重要方面。早期神經(jīng)分化技術(shù)在含有血清的培養(yǎng)基中利用視黃酸， 但這些現(xiàn)在被更好限定的無血清方法代替。神經(jīng)分化-無血清確定成分培養(yǎng)基用無血清確定成分培養(yǎng)基通過細(xì)胞集合技術(shù)從EC和人ES細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)球已顯示從NTERA2細(xì)胞產(chǎn)生放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(Marchal-Vitorion S.等，2003，Cell Neurosci.，24，198-213)。這是多級(jí)過程，如果培養(yǎng)基補(bǔ)加FGF-2，神經(jīng)球可無限保持。利用人ES細(xì)胞，在FGF-2退出時(shí)，神經(jīng)球分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 (Zhang, S. C.等，2001，Nat. Biotechnol. 19，1129-1130)。為了產(chǎn)生神經(jīng)球，Marchal-VitorionS.等，2003，Cell Neurosci.，24，198-213 使用在25cm2燒瓶中生長(zhǎng)的NTERA2細(xì)胞(1 X IO5個(gè)細(xì)胞/ml)，所述燒瓶含有無血清的確定成分培養(yǎng)基 DMEM/F12 (Invitrogen)，培養(yǎng)基補(bǔ)加 N2 (Life Technologies)、谷氨酰胺 QmM)、 葡萄糖(0. 6 % w/v)、胰島素(20 μ g/ml)、肝素(2 μ g/ml)、EGF (20ng/ml)和 FGF (lOng/ ml)。為了誘導(dǎo)神經(jīng)分化，使所得細(xì)胞集合體或神經(jīng)球離解，并以5X IO5個(gè)細(xì)胞/cm2接種在聚-D-賴氨酸涂覆的皿上，在減去生長(zhǎng)因子的血清確定成分培養(yǎng)基中培養(yǎng)另外10天。這些 NTERA2神經(jīng)球隨后顯示產(chǎn)生高百分?jǐn)?shù)未成熟神經(jīng)元( 50% )與少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞譜系的細(xì)胞。Zhang, S. C.等，2001 (Nat. Biotechnol. 19,1129-1130)用在失活小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)的人ES細(xì)胞系Hl和H9產(chǎn)生神經(jīng)前體細(xì)胞，所述神經(jīng)前體細(xì)胞在無血清存在但在有FGF-2存在下顯示神經(jīng)樣結(jié)構(gòu)。在去除TOF-2時(shí)，它們分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。ES/成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)物的常規(guī)保持在由補(bǔ)加20% ν/ν血清替代培養(yǎng)基(Invitrogen), β-巰基乙醇(0. ImM)、肝素(2 μ g/ml) ^P FGF-2 (4ng/ml)] 的DMEM/F12培養(yǎng)基組成的ES細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行。為了誘導(dǎo)分化，用DispaseTM(0. lmg/ml Invitrogen)去除ES細(xì)胞群體，并重新懸浮于減去FGF-2的確定成分的ES細(xì)胞培養(yǎng)基。利用每日培養(yǎng)基變化，將細(xì)胞作為飄浮胚狀體在25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。4天后，使胚狀體重新懸浮于補(bǔ)加胰島素25 (μ g/ml)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(100μ g/ml)、黃體酮(20nM)、腐胺(60uM)、 亞硒酸鈉(30nM)、肝素O μ g/ml)和FGF-2 (20ng/ml)的DMEM/F12中。將分化中的胚狀體培養(yǎng) 10天，然后轉(zhuǎn)移到用聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)涂覆的新燒瓶中，以阻止附著。為了產(chǎn)生少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(oligodentrocyte)，將ES-細(xì)胞衍生的神經(jīng)前體細(xì)胞在沒有FGF-2存在下在補(bǔ)加附(Invitrogen)和PDGF-1 Qng/ml)的DMEM中培養(yǎng)。在 2星期后，觀察olig4-陽性細(xì)胞，具有一般少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。在FGF-2 QOng/ml)存在下，通過在由 DMEM/F12、N2 (Invitrogen)、cAMP(100ng/ ml)和BDNF(10ng/ml)組成的培養(yǎng)基中在鳥氨酸/層粘連蛋白上培養(yǎng)細(xì)胞，而進(jìn)行神經(jīng)元分化。 10天后，觀察到纖維過程從附著球散發(fā)。大部分細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記MAP2ab和 β-微管蛋白。神經(jīng)分化-共培養(yǎng)增加ES和EC神經(jīng)分化效率的另外的努力利用與其它細(xì)胞系(例如ΡΑ6基質(zhì)細(xì)胞)的共培養(yǎng)(Scwartz 等，2005，Stem Cell Dev.，14，517-534)。作者在 PA6 細(xì)胞的匯合單層上共培養(yǎng)NTERA2細(xì)胞(2000個(gè)細(xì)胞/ml)。用10 μ g/ml絲裂霉素-C使PA6細(xì)胞失活。使共培養(yǎng)物保持在類似于前述的分化培養(yǎng)基中(Leypoldt F.等，200l，Neur0Chem. 76， 806-814)。22天后，在86% NTERA2神經(jīng)元中檢測(cè)到酪氨酸水解酶，指示存在成熟的多巴胺能表現(xiàn)型。使用PA6基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基顯示產(chǎn)生多巴胺能表現(xiàn)型效率較低，因?yàn)榇龠M(jìn)分化過程的因素仍未完全表征。神經(jīng)分化-單層其它神經(jīng)分化方法基于單層中人ES細(xì)胞的分化(Gerrard，L.等，2005，Stem Cell，23，1234-1241)。這些研究已顯示，加入BMP抑制劑量(noggin)到ES細(xì)胞培養(yǎng)物導(dǎo)致產(chǎn)生神經(jīng)祖細(xì)胞。該方法利用在補(bǔ)加FGF-2O0ng/ml)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中在Matrigel (BD Biosciences)上生長(zhǎng)ES細(xì)胞。對(duì)于神經(jīng)分化，在補(bǔ)加100ng/ml 量的N2B27神經(jīng)分化培養(yǎng)基(Invitrogen)中培養(yǎng)匯合ES細(xì)胞。在第3次通過(passage)， 使細(xì)胞離解成單個(gè)細(xì)胞，并在補(bǔ)加FGF-2的N2B27中培養(yǎng)。該方案導(dǎo)致產(chǎn)生神經(jīng)祖細(xì)胞，并且 97%細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)標(biāo)記musashi。通過將N2B27-處理的細(xì)胞接種到聚-L-賴氨酸/ 層粘連蛋白涂覆的皿上，并在補(bǔ)加音猬因子(sonic hedgehog) (300ng/ml)、FGF-8 (lOOng/ ml)和抗壞血酸(160 μ Μ)的Ν2Β27培養(yǎng)基中培養(yǎng)2星期，產(chǎn)生表達(dá)神經(jīng)元和神經(jīng)祖細(xì)胞的酪氨酸水解酶。2星期后，抽出音猬因子，并由BDNFQOng/ml)、⑶NFQOng/ml)、抗壞血酸 (160 μ M)和層粘連蛋白(500ng/ml)代替。在此文獻(xiàn)中描述的很多神經(jīng)分化方法的數(shù)個(gè)方法的詳細(xì)說明提供在Jackson J. P.等，2007，Culture of human stem cells (人干細(xì)胞培養(yǎng))中的 Techniques for neural differentiation of human EC and ES cells.(人EC和ES細(xì)胞的神經(jīng)分化技術(shù)) eds. , Freshney R. I. , Stacey, G. D. Muerbach J. Μ. J. Wiley&Sons, Inc.)。所述實(shí)例方案包括通過視黃酸誘導(dǎo)人EC細(xì)胞神經(jīng)分化，在胚狀體中的人ES細(xì)胞神經(jīng)分化，和神經(jīng)球從人 ES細(xì)胞的衍生和分化。實(shí)施例1-通過視黃酸誘導(dǎo)人EC細(xì)胞神經(jīng)分化于37°C在10% CO2空氣中使NTERA2細(xì)胞保持在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(DMEM，4. 5g/l葡萄糖和10% ν/ν胎牛血清)中。將NTERA2細(xì)胞以IX IO6個(gè)細(xì)胞/75cm2燒瓶接種在分化培養(yǎng)基(補(bǔ)加10 μ M視黃酸的生長(zhǎng)培養(yǎng)基)中。NTERA2細(xì)胞在2-3天內(nèi)投入到神經(jīng)分化，在 10天后出現(xiàn)神經(jīng)元。實(shí)施例2-胚狀體中人ES細(xì)胞神經(jīng)分化(細(xì)胞集合)使對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的ES細(xì)胞重新懸浮于胚狀體(EB)培養(yǎng)基(DMEM knockout，20 % knockout血清替代品、非必需氨基酸、ImM β-巰基乙醇和ImM谷氨酰胺)，并在37 °C在 5% CO2空氣中在100mm Corning超低結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)皿或細(xì)菌培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，以防止細(xì)胞附著。培養(yǎng)基每隔一天更換。在懸浮體中 21天后，存在分化的EB。將這些平板接種到EB 培養(yǎng)基中明膠涂覆的表面上，密度為50個(gè)胚狀體/25cm2。在重新接種后 M小時(shí)，可作為附著的胚狀體向外生長(zhǎng)(outgrowth)看到神經(jīng)分化。實(shí)施例3-神經(jīng)球從人ES細(xì)胞的衍生和分化使匯合ES細(xì)胞重新懸浮于EB培養(yǎng)基，并于37°C在5% CO2空氣中放入25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中4天。培養(yǎng)基每天更換。 4天后，將EB放入由DMEM/F12、N2補(bǔ)充物、FGF-2Q0ng/ ml)、胰島素QO μ g/ml)和動(dòng)物淀粉硫酸鈉鹽O μ g/ml)組成的神經(jīng)球培養(yǎng)基中，并接種到明膠涂覆的25cm2瓶中。培養(yǎng)基每隔一天更換。在 10天后可見神經(jīng)瓣?duì)铙w。用桿菌衍生的中性金屬蛋白酶分散酶TM(100yg/ml-hvitrOgen)分離經(jīng)解聚的神經(jīng)瓣?duì)铙w，使這些重新懸浮于神經(jīng)球培養(yǎng)基，并分配到DMEM/F12涂覆瓶的瓊脂糖上。神經(jīng)球每5天用新鮮的神經(jīng)球培養(yǎng)基處理，并且每2-3星期傳代培養(yǎng)。為了分化研究，將神經(jīng)球接種到神經(jīng)球培養(yǎng)基中的明膠涂覆瓶上，在數(shù)次通過后，神經(jīng)球衍生細(xì)胞為培養(yǎng)物中最主導(dǎo)的細(xì)胞類型。這些細(xì)胞一般對(duì)早期神經(jīng)標(biāo)記(如musashi-Ι和巢蛋白)為陽性，。然后，可用例如上述那些方法使神經(jīng)球有效分化，即 Marchal-Vitorion S.等，2003 (Cell Neurosci.，24，198-213) 和 Zhang，S. C.等，2001 (Nat. Biotechnol. 19,1129-1130)。神經(jīng)分化的抑制劑[1]腺苷二醛S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)是寬范圍生物甲基化反應(yīng)(包括DNA甲基化)的通用甲基給體?；蚩赏ㄟ^CpG部位的甲基化而轉(zhuǎn)錄失活，這有時(shí)與細(xì)胞分化過程相關(guān)，例如， 神經(jīng)分化需要控制階段特異性基因活性的一系列基因程序。這些活性不僅在轉(zhuǎn)錄水平控制，而且通過外遺傳修飾控制，包括DNA甲基化。通過Adomet依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行的甲基化反應(yīng)導(dǎo)致產(chǎn)生兩種產(chǎn)物，甲基化底物和自身為Adomet依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶的潛在抑制劑的副產(chǎn)物Ado-高半胱氨酸(AdoHcy)。 AdoHcy進(jìn)一步通過酶S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)分解成腺苷和高半胱氨酸。因此， SAHH的抑制導(dǎo)致甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑AdoHcy的積累。腺苷二醛(AdOx)為SAHH的潛在抑制齊U，因此間接為Adomet依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶并由此為神經(jīng)分化的潛在抑制劑。
P19為胚胎癌性細(xì)胞，它們可如前所述在視黃酸存在下通過細(xì)胞集合方法分化成神經(jīng)元。然而，在分化過程第一天使細(xì)胞暴露于AdOx(IyM)減少i)觀察到的軸突數(shù)和 ii)神經(jīng)元標(biāo)記β -微管蛋白、NeuroDl和mashl的表達(dá)水平。因此，AdOx通過其間接抑制 Adomet依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶而中斷P19細(xì)胞中的神經(jīng)元分化(Hong，S.等，2008，Biochem. Biophys. Res. Commum. ,377,935-940)。 [2] D-theo-1-苯基_2_癸酰基氨基_3_嗎啉代丙醇(D-PDMP)神經(jīng)節(jié)苷脂已在神經(jīng)發(fā)育中涉及。利用包括P19EC細(xì)胞的體外神經(jīng)元分化模型， Liour S. S. &Yu R. K. ,2002, (Neurochemical Res. 27，1507-1512)證明，神經(jīng)節(jié)苷脂生物合成抑制劑D-theo-Ι-苯基-2-癸?；被?3-嗎啉代-1-丙醇(D-PDMP)抑制軸突向外生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致P19-衍生神經(jīng)元死亡。在補(bǔ)加2. 5%胎牛血清和5%小牛血清的α -MEM(Invitrogen)中培養(yǎng)P19EC細(xì)胞 (1 X IO6個(gè)細(xì)胞/皿)。在細(xì)菌級(jí)皿中在5 μ M視黃酸存在下誘導(dǎo)它們分化4天，隨后使它們分散于減去視黃酸的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并接種到聚-賴氨酸涂覆的細(xì)胞培養(yǎng)皿上。培養(yǎng)基每 3 天更換。神經(jīng)節(jié)苷脂抑制劑D-PDMP (50 μ Μ)在用視黃酸處理之前3天加入，并在整個(gè)分化過程保持。結(jié)果表明，D-PDMP減少i)未分化P19EC細(xì)胞的增殖，沒有任何細(xì)胞死亡跡象， 和減少ii)廢除的軸突伸長(zhǎng)，應(yīng)注意-軸突存在，但它們不能正確發(fā)育。通過使用其它神經(jīng)節(jié)苷脂抑制劑，作者能夠證明，D-PDMP對(duì)神經(jīng)元分化的作用不只與神經(jīng)節(jié)苷脂生物合成抑制相關(guān)。[3]吲哚咔唑抑制素吲哚咔唑抑制素A、D、C和D由鏈霉菌物種產(chǎn)生，并全部證明為大鼠PC12細(xì)胞的 NGF 誘導(dǎo)神經(jīng)元分化的抑制劑(Matsuura N 等 2002，J. Antibiotics 55，355-362 和 Feng, Y.等，J. Antibiotics 57.627-633)。簡(jiǎn)單地講，PC12細(xì)胞生長(zhǎng)于補(bǔ)加0. 35%葡萄糖、10% 胎牛血清和10%馬血清的DMEM中。將PC12細(xì)胞平板接種到96孔膠原型1涂覆板的孔中。 12小時(shí)后，加入吲哚咔唑抑制素，12小時(shí)后加入NGF。通過觀察軸突過程的發(fā)生來監(jiān)測(cè)神經(jīng)元分化。[4]吲哚并咔唑在以上關(guān)于大鼠PC12細(xì)胞的NGF-誘導(dǎo)神經(jīng)元分化的吲哚咔唑抑制素介導(dǎo)的抑制的所述類似試驗(yàn)中，也證明吲哚并咔唑1(-25 和b為神經(jīng)分化的有效抑制劑(Matsuura N 等，2002，J. Antibiotics 55，355-362)。通過抑制pl40trk酪氨酸激酶NGF-受體，這些化合物明顯介導(dǎo)其軸突伸長(zhǎng)的抑制。[5] 2'-氨基 _3'-甲氧基黃酮(PD98O59)PD 98059為MAPK/ERK激酶1 (MAP激酶激酶1或MEK1)的潛在細(xì)胞可滲透和選擇性抑制劑。它阻止MEKl活化，因此，抑制MAP激酶的隨后磷酸化和活化。Pang，L.等，1995 (J. Biol. Chem. 270，13585-13588)證明，PD98059完全阻止PC12細(xì)胞中NGF誘導(dǎo)的軸突形成， 而不影響細(xì)胞生存能力。這表明，MAP激酶途徑似乎對(duì)PC-12細(xì)胞中NGF誘導(dǎo)的神經(jīng)元分
22化重要。[6][7_(苯甲?；被?-4，9_ 二氫-4-甲基_9_氧代-吡唑并[5，l_b]喹唑啉-2-甲酸]PD90780取代的吡唑并喹唑啉酮PD90780與NGF相互作用，由此防止它結(jié)合到pl40trk酪氨酸激酶NGF-受體和共同的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體p75NTR。抑制NGF的結(jié)合廢止PC12細(xì)胞的 NGF-介導(dǎo)神經(jīng)元分化，Spiegel K 等 1995 Biochem. Biophys Res Commun. 217，488-494。[7JAG870AG-879為酪氨酸激酶抑制劑的酪氨酸磷酸化抑制劑族的成員。它選擇性抑制 pl40trk酪氨酸激酶NGF-受體自動(dòng)磷酸化，而不抑制EGF或PDGF受體磷酸化(IC50 = 10 μ M)。象以上化學(xué)物質(zhì)一樣，AG-879也抑制PC12細(xì)胞中的NGF-誘導(dǎo)軸突向外生長(zhǎng)， Ohmichi M 等 1993，Biochemistry 4，32 4650-4658。在祖細(xì)胞分化期間，可監(jiān)測(cè)抑制劑(和化學(xué)物質(zhì)、藥物或化妝品)(如上所述)對(duì)神經(jīng)發(fā)育的作用。使祖細(xì)胞暴露于抑制劑，并通過監(jiān)測(cè)分化的程度評(píng)價(jià)對(duì)細(xì)胞發(fā)育過程的作用。這可通過比如定量免疫細(xì)胞化學(xué)的技術(shù)測(cè)量與經(jīng)分化的細(xì)胞類型相關(guān)的細(xì)胞/組織特異性標(biāo)記的表達(dá)來完成。指示神經(jīng)發(fā)育的特異性神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記包括下列(也描述購自Abeam Inc.的抗體的細(xì)節(jié))。神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記-早期標(biāo)記[1]聚集蛋白聚糖ARGxx (抗體BC_3，ab3773)-在神經(jīng)前體細(xì)胞中檢測(cè)[2]CD133(抗體32AT1672，ab5558)-神經(jīng)和胚胎干細(xì)胞的標(biāo)記。[3]Dlx5(抗體abM729)_在神經(jīng)發(fā)育期間的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑。[4]EMX2(抗體abll849)_Emx2為牽涉0txl/2以確定CNS的發(fā)育中的大腦皮層中細(xì)胞命運(yùn)的同源框蛋白。[5]巢蛋白(抗體10C2，ab22035)_在早期胚胎神經(jīng)上皮干細(xì)胞中表達(dá)。巢蛋白廣泛用作干/祖細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的標(biāo)記。R]NeuroDl抗體(ab60704)-神經(jīng)發(fā)生中的重要分化因子。神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記-晚期標(biāo)記[1] BRN3A (抗體ab30880)-轉(zhuǎn)錄因子，涉及調(diào)節(jié)神經(jīng)元基因。[2]BRN!3B (抗體ab32^4)_發(fā)現(xiàn)于視網(wǎng)膜中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的亞群內(nèi)，在此它決定視覺系統(tǒng)神經(jīng)元的亞組的特性。[3]Musashi Ι/Msil (抗體ab60600)-在神經(jīng)干細(xì)胞中表達(dá)。[4]NR2E1/Tailless (抗體 ab66125)-在腦中表達(dá)。[5]核干細(xì)胞因子(抗體ab52784)-發(fā)現(xiàn)于胚胎和成體CNS干細(xì)胞。W]0ct6(抗體ab72681)_涉及在胚胎干細(xì)胞和發(fā)育中的腦中表達(dá)的早期胚胎發(fā)生和神經(jīng)發(fā)生的轉(zhuǎn)錄因子。[7]Pax2(抗體ab55490)_在神經(jīng)系統(tǒng)(包括中腦、后腦、脊髓、眼、耳)發(fā)育期間需要的轉(zhuǎn)錄因子。[8]S0X2(抗體57CT23. 3.4，ab754^)-在發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活劑。
[9] S0X4 (抗體lMC4a，ab70598)-在CNS中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。表達(dá)在發(fā)育中的CNS 中增加。[10]S0X10 (抗體ab2765Q-轉(zhuǎn)錄激活劑，作為核質(zhì)穿梭蛋白，對(duì)神經(jīng)嵴和外周神
經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育重要。[11] SOXll (抗體ab50194)-SOXll在發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)中重要。[12]S0X22(抗體86C2a，abM371)-在胎腦和腎和成體心中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活劑。[13]波形蛋白(抗體RV202. ab8978)-神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記[14]CDw338(抗體 BXP-21，ab3380)_ 造血 / 神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記。神經(jīng)嵴細(xì)胞-標(biāo)記[1]神經(jīng)發(fā)生素1(抗體ab66498)_在不同的祖群體中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。它調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育和分化。[2]神經(jīng)發(fā)生素2(抗體ab57560)_調(diào)節(jié)新皮質(zhì)發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子。從細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)變到神經(jīng)發(fā)生涉及神經(jīng)發(fā)生素2。[3]神經(jīng)發(fā)生素3(抗體abM74;3)-在從游走神經(jīng)嵴細(xì)胞的神經(jīng)發(fā)生中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。[4]MASHl (抗體ab76987)-在神經(jīng)細(xì)胞早期發(fā)育中表達(dá)。發(fā)現(xiàn)于脊髓、中側(cè)_和前側(cè)前腦的神經(jīng)上皮。后發(fā)現(xiàn)于腦。星形膠質(zhì)細(xì)胞-標(biāo)記[1]星形膠質(zhì)細(xì)胞(抗體10E4/R5，(ab3268)-星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記[2] CaMKII (ab63377)-CNS的激酶，在長(zhǎng)期增強(qiáng)和神經(jīng)遞質(zhì)釋放中起作用。[3]EAATl (抗體ab416)-在額皮質(zhì)、海馬和基底神經(jīng)節(jié)中表達(dá)。[4]早期⑶15抗體08，ab20137)-在星形膠質(zhì)細(xì)胞和某些上皮細(xì)胞中表達(dá)。[5]神經(jīng)節(jié)苷脂⑶3(抗體MB3. 6，ab78361)-所有星細(xì)胞瘤表達(dá)⑶3抗原。[6]GFAP(抗體GF5，abl0062)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記-表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)、外周神經(jīng)節(jié)中的衛(wèi)星細(xì)胞、施萬細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞中。[7]5100(抗體猶4.9，油4066)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記-位于星形膠質(zhì)細(xì)胞、施萬氏細(xì)胞、室管膜細(xì)胞瘤和星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤。[8]存活素(抗體32. I，ab9178)_在星形膠質(zhì)細(xì)胞和一些神經(jīng)元中表達(dá)。[9]其它星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記包括ABCAl 抗體(HJl，ab66217) &ABCA7 抗體(7A1-144，ab48265)ALDH1L1 抗體(ab56777)血小板反應(yīng)素抗體(A4. 1，ab3131)。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞-早期標(biāo)記[l]CNTF(抗體4-68，ab7擬69)-在CNS和PNS內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。CNTF刺激多種神經(jīng)元細(xì)胞類型的分化。[2]Twist (抗體2Cla，ab50887)_Twist為在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。它可在CNS發(fā)育和血管生成中起作用。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞-晚期標(biāo)記[1] c⑶lib (抗體ab8879)- 一般在神經(jīng)組織中用作小神經(jīng)膠質(zhì)標(biāo)記。
[2] Ibal/AIFl (抗體abM749)_由小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的Ca2+結(jié)合肽。[;3]MRP8(抗體2C5/4，abl9860)-由小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。[4]Nfascl55抗體(ab77951)_Nfascl55，在神經(jīng)膠質(zhì)中的無髓鞘軸突中。[5]PAX6(抗體AD2. 38，ab78M5)-轉(zhuǎn)錄因子，涉及眼、鼻、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胰腺的發(fā)育。^]81^卩(抗體&匕27171)BLBP可用作放射狀神經(jīng)膠質(zhì)(主要的神經(jīng)祖細(xì)胞類型和支持神經(jīng)元遷移的支架) 的分子標(biāo)記浦肯野細(xì)胞-早期標(biāo)記[1]L1CAM(抗體2C2，-在神經(jīng)外胚層組織中表達(dá)。涉及軸突生長(zhǎng)、神經(jīng)遷移和介導(dǎo)神經(jīng)元分化。浦肯野細(xì)胞-晚期標(biāo)記[1]ΡΤΡζ (抗體ab78019)_在腦中發(fā)育調(diào)節(jié)，并在CNS中表達(dá)，在此它位于小腦的浦肯野細(xì)胞層、齒狀回和側(cè)腦室的前角的室管膜下層。[2]NSMase2(抗體ab6873Q-限于神經(jīng)元、浦肯野細(xì)胞、錐體細(xì)胞、齒狀回顆粒層的神經(jīng)元和腦橋核中的神經(jīng)元。也存在于下丘腦核、梨狀皮質(zhì)中的神經(jīng)元和腦干的核。[3]醛縮酶(抗體1F8，ab67204)-醛縮酶C在腦和神經(jīng)中表達(dá)。[4]前小腦肽O^recerebellin)(抗體ab36909)-腦特異性小腦肽的前體?；钚孕问礁患谛∧X浦肯野細(xì)胞的突觸后結(jié)構(gòu)和蝸背側(cè)核的車輪神經(jīng)元(cartwheel neuron)。[5]鈣結(jié)合蛋白(抗體CL-300，ab9481)-小腦浦肯野細(xì)胞的標(biāo)記神經(jīng)元-早期標(biāo)記[1]PROXl (抗體ab57746)_在CNS早期發(fā)育中起重要作用。它調(diào)節(jié)有絲分裂期后未分化幼神經(jīng)元的基因表達(dá)和發(fā)育。[2] CD90 (抗體1. BB. 730，ab62009)-在神經(jīng)細(xì)胞、T細(xì)胞、早期造血祖細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)元和枯否(Kupffer)氏細(xì)胞上表達(dá)。[3]UCHLl/3 (抗體^7527 -在調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育中作用。[4]PLAGLl (抗體ab55659)-在早期腦發(fā)育期間在神經(jīng)元-上皮中表達(dá)。[5]HLXB9(抗體EPR3342，ab7卯41)-在發(fā)育中的脊椎動(dòng)物CNS中由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元選擇性表達(dá)的同源框基因發(fā)育性調(diào)節(jié)神經(jīng)元命運(yùn)。[6]NeuroD2抗體(ab66607)-誘導(dǎo)神經(jīng)元分化和生存。[7JNEUR0D4抗體(ab67168)-介導(dǎo)神經(jīng)元分化。[8JNEUR0D6抗體(ab77998)-涉及神經(jīng)元分化和成熟。神經(jīng)元-中間標(biāo)記[1] NNPTX2 (抗體ab69858)-在興奮性突觸發(fā)生中起作用的神經(jīng)元中間早期基因。[2]神經(jīng)多糖C (抗體ab56941)_涉及CNS中的神經(jīng)元回路形成。[3]TBR2(抗體ab58225)_由發(fā)育期間中間祖細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。IPC在心室區(qū)域(VZ)或亞心室區(qū)域(SVZ)內(nèi)分裂，并產(chǎn)生嚴(yán)格神經(jīng)元群體。神經(jīng)元-晚期標(biāo)記[1]SIRP (抗體OX-41，ab9295)-由髓樣細(xì)胞和神經(jīng)元表達(dá)。
[2]共濟(jì)失調(diào)蛋白7(抗體abll434)_位于正常腦神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)中和核膜上。
[3] GIRK2 (抗體ab30738)-神經(jīng)元GIRK2通道涉及調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性，并可有助于靜息電位。[4]肌動(dòng)蛋白2(抗體ab55611)_肌動(dòng)蛋白2為神經(jīng)元特異性。[5]AP180(抗體AP180-I，abll329)-表達(dá)限于神經(jīng)元來源的細(xì)胞。W]PGP9. 5(抗體油2705；3)神經(jīng)元標(biāo)記-PGP9. 5的表達(dá)對(duì)神經(jīng)元高度特異性，并且對(duì)發(fā)散神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)及其腫瘤的細(xì)胞高度特異性。[7] SorCSl (抗體abl6641)神經(jīng)元標(biāo)記-SorCSl免疫反應(yīng)性在整個(gè)腦的神經(jīng)群體中分布廣。[8] Noval (抗體ab77926) -Nova 1為神經(jīng)元特異性RNA結(jié)合蛋白。[9] NSE (抗體ab944)神經(jīng)元標(biāo)記-神經(jīng)元特異性烯醇化酶主要在神經(jīng)元中表達(dá)， 在正常和腫瘤神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)。[10]HB Hu蛋白(抗體16A11，abl4370)-特異性結(jié)合到脊椎動(dòng)物神經(jīng)元蛋白的Hu
族成員中存在的保守肽表位。[11]ELAVL4(抗體16C12，abl4369)-可在神經(jīng)元-特異性RNA處理中起作用。它位于腦組織。[12]SAPAP3(抗體ab67224)_位于神經(jīng)元細(xì)胞中的突觸后區(qū)域。[13]早期Ki67抗體[PP_67，526)_Ki67常規(guī)用作神經(jīng)元標(biāo)記。[14]MAP2(抗體HM-2，ablU67)神經(jīng)元標(biāo)記-MAP2為腦組織的主要微管相關(guān)蛋白。[15]髓鞘堿性蛋白(抗體MBP101，ab62631)_髓鞘膜的豐富蛋白組分?？稍谠缙谀X發(fā)育中起作用。[16]驅(qū)動(dòng)蛋白(抗體ab257M)、驅(qū)動(dòng)蛋白2(抗體1(2.4，ab24626)和驅(qū)動(dòng)蛋白 5A(抗體油5擬8)_涉及神經(jīng)元細(xì)胞中的小泡運(yùn)輸。5A為神經(jīng)元-特異性。[17] NeuN (抗體A60，ab77315)-神經(jīng)元特異性核內(nèi)蛋白為神經(jīng)元的標(biāo)記。NeuN發(fā)現(xiàn)于整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)、小腦、大腦皮層、海馬、丘腦和脊髓。[18]Nfascl86(抗體ab31719)_在朗飛節(jié)的神經(jīng)元中表達(dá)。[19]Pinl (抗體abl2107)_在阿爾茨海默病下的tau病理中涉及。Pinl可對(duì)保持正常神經(jīng)元功能關(guān)鍵。[20]神經(jīng)配蛋白3 (抗體^5737 -神經(jīng)配蛋白3為神經(jīng)元細(xì)胞表面蛋白。[21]PDGF β受體(抗體Υ92，ab32570)-在神經(jīng)元上表達(dá)。[22]肌動(dòng)蛋白(抗體abM53》_肌動(dòng)蛋白普遍存在，但尤其在神經(jīng)元中表達(dá)。海馬神經(jīng)元[1] SynGAP (抗體EPR2883Y，ab7723Q -只在海馬神經(jīng)元中的突觸表達(dá)。端腦神經(jīng)元[1]突觸孔蛋白(抗體ab5048O-對(duì)形成端腦神經(jīng)元的棘器是必要的。涉及突觸
可塑性。多巴胺能神經(jīng)元-早期標(biāo)記[1]PITX3(抗體ab30734)-該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)元分化。[2]Nurrl (抗體在胚胎前側(cè)中腦表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)多巴胺神經(jīng)元的發(fā)育和保持關(guān)鍵。[3] AMSXl (抗體4F11，ab73883)-與fetl平行作用，以建立中腦多巴胺能祖域，產(chǎn)生神經(jīng)元群體。多巴胺能神經(jīng)元-晚期標(biāo)記[1]酪氨酸羥化酶(抗體185，abl0372)神經(jīng)元標(biāo)記-TH在腎上腺素能神經(jīng)元的生理中起作用，并且經(jīng)常用作多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)記。[2]多巴胺D2受體(抗體ab3074!3)-在垂體和腦中表達(dá)。ALDH1A1 (抗體^2337 -在視網(wǎng)膜背側(cè)、前側(cè)中腦(多巴胺能神經(jīng)元)和造血干細(xì)胞中表達(dá)。[3]DOPA脫羧酶(抗體ab3905)-涉及神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺和血清素合成的酶。膽堿能神經(jīng)元[1]膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(抗體abM599)_作為外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)兩者中膽堿能神經(jīng)元的特異性標(biāo)記。感覺神經(jīng)元[1]突觸融合蛋白和2 (分別為抗體4H256，abl8010和abl2369)-神經(jīng)元突觸融合蛋白，定位于到達(dá)小血管的感覺神經(jīng)元和神經(jīng)的末端。傷害件神經(jīng)元[1]外周蛋白(抗體2Q135abl7999)傷害性(疼痛)神經(jīng)元標(biāo)記-發(fā)現(xiàn)于外周神經(jīng)節(jié)及其過程的神經(jīng)元。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元[1] Islet 1(抗體ab20670)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記-在神經(jīng)管運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化和胰島細(xì)胞的胚胎發(fā)生中起作用。[2] Islet 2 (抗體al^6117)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記-限定運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元亞類的轉(zhuǎn)錄因子。錐體神經(jīng)元-早期標(biāo)記[l]Emxl (抗體ab3292Q-特異性表達(dá)錐體神經(jīng)元的同源框基因。Emxl是錐體神經(jīng)元和錐體細(xì)胞譜系的可靠標(biāo)記。[2]TBR1(抗體(ab56994)-在大腦皮層中表達(dá)。在早期胚胎發(fā)生期間，它區(qū)分舊皮質(zhì)、邊緣和新皮質(zhì)域。錐體神經(jīng)元-晚期標(biāo)記[1]海馬鈣結(jié)合蛋白(抗體abM560)_限于CNS，在海馬CAl區(qū)域的錐體細(xì)胞中最
豐_ ο少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞-早期標(biāo)記[1]A2B5(抗體2Q162，ab683^)_在發(fā)育中的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞表面神經(jīng)節(jié)苷脂表位。[2] PDGF α受體(抗體Υ92，ab32570)-在少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞中表達(dá)的α亞基。[3]01igl (抗體ab21943)_01igl促進(jìn)少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形成。[4]01ig2(抗體ab56643)_少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元所需和后腦中的體運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)育所需的轉(zhuǎn)錄因子。
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[5] OSP (抗體ab7474)，少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記-表達(dá)在發(fā)育期間高度調(diào)節(jié)，它可在少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化中起作用。W]01ig3抗體(ab78006)_01ig3在胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同類型祖細(xì)胞中短暫表達(dá)。少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞-中間標(biāo)記[1]選蛋白(sortilin)(抗體abl6640)-在腦、脊髓和肌肉中表達(dá)。選蛋白作為神經(jīng)降壓素的受體。選蛋白在胚胎發(fā)生期間表達(dá)。少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞-晚期標(biāo)記[1]髓鞘少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(抗體F3-87-8，abM022)-MOG發(fā)現(xiàn)于正在髓鞘化的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的表面上。[2]CNPase (抗體11-5B，ab6319)少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記-由少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和施萬細(xì)胞表達(dá)。[3]髓鞘PLP (抗體pipe 1，ab9311)，少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記-CNS中最主導(dǎo)的髓鞘蛋白。涉及少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育和軸突存活。W]CaMKII (抗體ab63377)_在腦中豐富的作為突觸后密集區(qū)主要成分的遍在激酶。神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞嗜鉻粒蛋白A(抗體23A1，ab36997)-在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)。[1]神經(jīng)絲組成神經(jīng)元軸突、交感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和樹突的主要結(jié)構(gòu)元素。200kD 重神經(jīng)絲(抗體 abSl35)I6OkD 中神經(jīng)絲(抗體 3H11，ab7256)145kD 神經(jīng)絲(抗體 2E3O, ab35953)68kDa 神經(jīng)絲(抗體 DA2ab4572)[2] 14-3-3(抗體2QM8，abl4121)-位于神經(jīng)元，軸突輸送到神經(jīng)末梢。[3]Fezl (抗體ab53562)_涉及軸突向外生長(zhǎng)，作為調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)和軸突引導(dǎo)機(jī)構(gòu)的分子網(wǎng)絡(luò)的組分。[4]動(dòng)力蛋白重鏈(抗體440. 4，ab6305) &中鏈1 (抗體70. 1，ab6304)在微管中表達(dá)，動(dòng)力蛋白已涉及軸突輸送。[5]巨軸突蛋白(Gigaxonin)(抗體ab27041)_普遍表達(dá)，對(duì)神經(jīng)元功能和存活是必要的。[6] Lingol (抗體ab23631)-在小鼠和人腦中表達(dá)。[7]MAPla+MAPlb(抗體 HM-1， ab66021)MAP2(抗體 ab32454)MAPlB(抗體 3G5ab3095), MAP^i+MAP2b抗體(AP20，ab3096)-微管由微管蛋白和微管相關(guān)蛋白組成。 MAPI為神經(jīng)元特異性。[8]神經(jīng)生長(zhǎng)因子Gl配體(抗體ab3198;3)-在紋狀體中的丘腦軸突和大腦皮層中高度表達(dá)。NGLl涉及促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。[9]叢蛋白(pleXin)B2(抗體ab41098)_該受體在軸突引導(dǎo)中具有關(guān)鍵作用。[10]Robo2(抗體ab7297》_Slit2和Slitl的受體，其在神經(jīng)元發(fā)育期間引導(dǎo)神經(jīng)管的軸突導(dǎo)航。[ll]Tau(抗體油876；3)神經(jīng)元標(biāo)記-Tau是主要在軸突上發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白。[12]微管蛋白(抗體Y0L1/34，ab6161)微管標(biāo)記-微管蛋白族涉及微管組織。施萬細(xì)胞[1]NGF受體(抗體MLR2，ab61425)_在施萬細(xì)胞和神經(jīng)元中表達(dá)。在發(fā)育期間， NGFR調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長(zhǎng)、遷移、分化和細(xì)胞死亡。[2]髓鞘(抗體pm432B5，ab58513)-髓鞘在CNS中通過少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生， 在外周神經(jīng)系統(tǒng)中通過施萬細(xì)胞產(chǎn)生。[3]神經(jīng)膠質(zhì)蛋白(抗體abM48;3)-通過正在髓鞘化的施萬細(xì)胞表達(dá)，在發(fā)育期間在各髓鞘片斷邊緣積累。W]Lgi4(抗體KT18，ab6M89)-在施萬細(xì)胞中表達(dá)。[5]髓鞘蛋白零(抗體ab31851)_MPZ的表達(dá)限于施萬細(xì)胞。它是外周髓鞘和神經(jīng)的主要結(jié)構(gòu)蛋白。[6] Lgi4 (抗體KT18. ab63289) _Lgi4在施萬細(xì)胞中表達(dá)，控制軸突分離和髓鞘生成。樹突-早期標(biāo)記Arg 3. 1 (抗體ab23382)-即時(shí)早期基因，在腦表達(dá)中富集，通過神經(jīng)元活性而誘導(dǎo)。在海馬、扁桃體、下丘腦、紋狀體和皮層中表達(dá)。樹突-晚期標(biāo)記[1]RRIMS3(抗體ab50198)_位于神經(jīng)元樹突和突觸后密集區(qū)。[2]腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白(drebrin)(抗體M2F6，abl2350)_腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋為涉及控制肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)和神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生的主要神經(jīng)元F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白。[3]神經(jīng)元特異性βΙΙΙ微管蛋白(抗體abl8207)_在胎發(fā)育和出生后發(fā)育期間在CNS和PNS中在其表達(dá)處豐富。[4]SAP102(抗體7D3mAb 119，ab69738)-突觸相關(guān)蛋白102在不對(duì)稱型1突觸的樹突軸和脊柱中檢測(cè)到。[5]其它-濾泡樹突細(xì)胞標(biāo)記(抗體ab8138)樹突細(xì)胞抗體(抗體ab8171)生長(zhǎng)錐-早期標(biāo)記[1] CRMPl (抗體 ab76"5)-CRMP2 (抗體 ab54546) CRMP5 (抗體 abMl58)腦衰蛋白反應(yīng)介導(dǎo)蛋白(mediator protein)涉及神經(jīng)發(fā)育期間神經(jīng)元分化、軸突和生長(zhǎng)錐引導(dǎo)。[2] NRP2 (抗體96009，ab50205) -NRP2為受體蛋白的神經(jīng)氈蛋白族成員，可在心血管發(fā)育和軸突引導(dǎo)中起作用。生長(zhǎng)錐-晚期標(biāo)記[1]聚集蛋白(agrin)(抗體AGR 131，abl2362)-促進(jìn)發(fā)育期間在神經(jīng)肌肉接點(diǎn)煙堿性乙酰膽堿受體(和其它)的群集。[2]BAI1相關(guān)蛋白2同種型3 (抗體ab791)-腦特異性血管生成抑制劑。
[3] BAIAP2 (抗體ab56588)-腦特異性血管生成抑制劑，在神經(jīng)元生長(zhǎng)錐弓丨導(dǎo)中涉及。[4] BASPl (抗體ab79349)-在腦中豐富表達(dá)的蛋白。[5]雙皮層蛋白(抗體at^8941)_微管結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞體，并導(dǎo)致分化中的神經(jīng)元的神經(jīng)元和軸突遷移的過程。B] Eph 受體 Al 蛋白(抗體 ab55900)、A2 (抗體 RM-0051_8F21ab73254)、A3 (抗體 6C1B6、ab76361)、A4 (抗體 7D3D4ab70403)、A5 (抗體 ab54633)、A6 (抗體 ab58022)、A7 (抗體 ab54640)、A8 (抗體 abl0615)、B1 (抗體 5F10A4、ab66326)、B2 (抗體 ab54650)、B3 (抗體 ab54717)、B4 (抗體 4A12G8，5G2F8, ab66336)和 B6 (抗體 2A6B9，ab66325) -EPH 相關(guān)受體已涉及介導(dǎo)神經(jīng)組織發(fā)育事件。發(fā)育中的神經(jīng)組織和成體神經(jīng)組織表達(dá)所有的Eph受體和肝配蛋白配體。Eph受體的作用是介導(dǎo)軸突引導(dǎo)和神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移。[7]肝配蛋白 Al (抗體 ab7040)、A2(抗體 ab65041)、A3(抗體 ab66150)、A4(抗體 ab53062)、B2 (抗體ab75868)和B3 (抗體ab5306;3)-肝配蛋白是涉及介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)中的發(fā)育事件的Eph受體的配體。[8]GAP43(抗體 GAP-7B10，ab50608)-神經(jīng)元生長(zhǎng)錐蛋白。[9]GPRINl (抗體 ab74577)-GPRim 涉及軸突向外生長(zhǎng)。[10] LIM激酶1(抗體ab51200)_在腦和脊髓中有活性，相信在那里涉及神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育。[11]NCAM(抗體123C3，al^8377)-在大多數(shù)神經(jīng)外胚層衍生細(xì)胞中表達(dá)。[12]神經(jīng)絲抑蛋白(抗體ab55587)_由發(fā)育中的腦和成體腦的神經(jīng)元主導(dǎo)表達(dá)。 該絲抑蛋白由CNS和PNS的軸突生長(zhǎng)錐分泌。體細(xì)胞[1]ALK(抗體ALKc ab650)-ALK發(fā)現(xiàn)于在前腦神經(jīng)元中表達(dá)的神經(jīng)系統(tǒng)中。[2]Membralin (抗體ab21818)_在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)。[3]抑蛋白(抗體ab55501)_腦特異性生長(zhǎng)抑制劑。W] STEP (抗體23E5，ab 16967)-為神經(jīng)特異性蛋白-酪氨酸磷酸酶。突觸-早期標(biāo)記內(nèi)居蛋白(抗體abl990;3)-調(diào)節(jié)神經(jīng)元中的發(fā)育分布，在強(qiáng)烈生長(zhǎng)和突觸形成階
段中最豐富。突觸-晚期標(biāo)記[1]EAAT2(抗體ab77039)_對(duì)終止谷氨酸鹽的突觸后作用是必要的。[2]神經(jīng)元表面蛋白II α (抗體油；3似妨)、神經(jīng)元表面蛋白I β (抗體ab77596) 和NRXN3 (抗體abl852;3)-在突觸發(fā)生期間作為細(xì)胞粘著分子的神經(jīng)元蛋白。[3]雙載蛋白(抗體C14-23，ab 16770)-與突觸小泡的細(xì)胞質(zhì)表面相關(guān)。[4]Bassoon (抗體SAP7F407，abl3M9)-定位到突觸前神經(jīng)末梢。[5]SAP102(抗體abl2086)-在不對(duì)稱型1突觸的樹突軸和脊柱中檢測(cè)的突觸蛋白。[6]CASK(抗體abli;343)-定位到神經(jīng)元突觸。[7]CPLX1 (抗體abl5855)和CPLX2 (抗體ab77978)-在突觸小泡胞吐中起作用的胞質(zhì)蛋白。[8] CRIPT (抗體abl6422)-在整個(gè)腦中在興奮性突觸的突觸后密集區(qū)與PSD95共區(qū)域化(colocalise)，但在抑制突觸中檢測(cè)不到。[9]CSP (抗體ab79346)_定位到突觸小泡的細(xì)胞質(zhì)表面。[10JCTBP2 (抗體ab67161)-作為用于專化突觸的支架。[11]小肌營(yíng)養(yǎng)蛋白α (抗體ab7279!3)-定位到肌膜可涉及突觸的形成和穩(wěn)定性。[12]H0MER2(抗體ab75037)_在谷氨酸鹽能突觸保持可塑性中起重要作用。[13] H0MER3 (抗體ab75038)-突觸后密集區(qū)支架蛋白。[14] ICAl (抗體ab55253)_可在神經(jīng)遞質(zhì)分泌中起作用，在胰、心和腦中豐富表達(dá)。[15]Munc 13 (抗體ab27077)-涉及引起突觸小泡。[16]Muncl8(抗體ab3451)_調(diào)節(jié)突觸小泡對(duì)接和融合。對(duì)神經(jīng)傳遞必要，并且結(jié)合突觸融合蛋白。[17]神經(jīng)多糖C(抗體ab31946)_在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)。[18]神經(jīng)配蛋白1(抗體ab5688》、神經(jīng)配蛋白2(抗體ab366(^)_神經(jīng)配蛋白為突觸細(xì)胞粘著分子。[19]PSD93 (抗體abl2097)突觸標(biāo)記-使N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)在突觸群集。[20]PSD95(抗體6G6-lC9，ab2723)_位于突觸后部位，以形成使受體、離子通道和相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白群集的支架。[21] Piccolo (抗體ab20664)突觸標(biāo)記-在突觸接點(diǎn)的突觸前側(cè)聚集的突觸前細(xì)胞基質(zhì)蛋白。[22]RIC8(抗體abM38;3)-陽性調(diào)節(jié)突觸傳遞。[23]SAP97(抗體RPI 197. 4，ab69737)-膜相關(guān)突觸蛋白促進(jìn)離子通道在突觸末
端群集。[24] SAPAP3 (抗體ab67224)-位于神經(jīng)元細(xì)胞中的突觸后密集區(qū)(PSD)。[25]SNAP23(抗體ab57961)_突觸小體相關(guān)蛋白在胞內(nèi)小泡運(yùn)輸中的膜融合過程中起關(guān)鍵作用。口6]SNAP25(抗體ab66066)_在突觸小泡融合和胞吐中起重要作用的突觸前神經(jīng)末梢蛋白。[27] SNAP29 (抗體ab56566)-涉及膜運(yùn)輸步驟，結(jié)合到突觸融合蛋白。[28] SNAPIN(抗體ab37496)-突觸小泡對(duì)接和融合所需的SNARE復(fù)合體的組分。[29] SV2A (抗體 15E11，ab49572)、SV2B (抗體 ab68025)和 SV2C (抗體 ab33892)-在所有突觸小泡中存在的整合膜糖蛋白。[30] SYNPR(抗體ab7505;3)-突觸小泡膜的組分，據(jù)認(rèn)為在突觸小泡運(yùn)輸中起重要作用。[31]突觸蛋白 I、II 和 III 分別為(抗體 ab57468)、(抗體 EPR3277，ab76494)和抗體ab68849)。突觸蛋白為與突觸小泡的細(xì)胞質(zhì)表面相關(guān)的神經(jīng)元磷蛋白。[32]突觸小泡蛋白(synaptobrevin)(抗體4EM0，abl8013)-涉及突觸小泡與突觸前膜的對(duì)接和/或融合。[33]突觸小泡磷酸酶(抗體abl9904)突觸標(biāo)記-在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)。[34]突觸小泡蛋白(synaptophysin)(抗體4E206，abl8008)-存在于腦、脊髓、視網(wǎng)膜、腎上腺髓質(zhì)的小泡、神經(jīng)肌肉接點(diǎn)中神經(jīng)元突觸前小泡的膜。[35]突觸結(jié)合蛋白(抗體ASV30，abl3259)_突觸小泡的整合膜蛋白。[36]肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白相關(guān)蛋白(Utrophin)(抗體DRP3/20C5，ab49174-位于神經(jīng)肌肉突觸和肌腱接點(diǎn)，參與突觸后膜保持和受體群集。[37]VAMP2(抗體克隆3E5，ab53407)-在神經(jīng)元中的突觸小泡中特定發(fā)現(xiàn)的小整
合膜蛋白。[38]突觸結(jié)合蛋白XII (抗體ab76^1)-涉及神經(jīng)系統(tǒng)中遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)，作為囊泡運(yùn)輸和胞吐中的CaQ+)傳感器。其它神經(jīng)標(biāo)記[1]MEF2A(抗體ab5M47)_在整個(gè)突觸發(fā)生中在小腦皮質(zhì)的顆粒神經(jīng)元中豐富。 在心肌和骨胳肌發(fā)育中也具有關(guān)鍵作用。[2]MEF2B (抗體ab55565)_在發(fā)育期間調(diào)節(jié)肌肉相關(guān)基因的表達(dá)。它們也涉及某些神經(jīng)原性細(xì)胞的分化。[3]MEF2C(抗體ab43796)_控制心形態(tài)發(fā)生和肌發(fā)生。它也可涉及神經(jīng)發(fā)生和皮
層結(jié)構(gòu)發(fā)育。[4JMEF2D (抗體ab43797)-涉及肌原性細(xì)胞和一些神經(jīng)原性細(xì)胞的分化。脂肪細(xì)胞分化完成i)分化，ii)抑制劑細(xì)節(jié)，和iii)脂肪細(xì)胞標(biāo)記的方案?？捎昧己帽碚骱凸_的方案使祖細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞，如Dani C等，(1997) J. Cell Sci 110，1279-1 所述。使用這種方案和相關(guān)方案，可從多能和多能祖干細(xì)胞產(chǎn)生脂肪細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞是多能細(xì)胞，并且可在白血病抑制因子(LIF)存在下保持在未分化狀態(tài)。去除LIF并加入適合的分化劑導(dǎo)致ES細(xì)胞投入多種細(xì)胞類型，包括脂肪細(xì)胞、心臟細(xì)胞、骨胳肌細(xì)胞和神經(jīng)元。脂肪細(xì)胞從中胚層干細(xì)胞(肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的共同前體)產(chǎn)生。一旦投入到脂肪細(xì)胞譜系，前脂肪細(xì)胞就在分化過程的晚期階段成熟為脂肪細(xì)胞。因此，兩個(gè)不同相存在于脂肪生成，i)在胚狀體形成后2-5天之間，此階段需要視黃酸，并且為ES細(xì)胞衍生的脂肪生成的投入(committal)階段，和ii)相當(dāng)于最終分化階段。此后一階段需要生脂因子PPAR Y。已用前脂肪細(xì)胞系(如，3T3L1和3T3F442A)研究與脂肪生成的晚期階段相關(guān)的機(jī)制，從而識(shí)別和分離數(shù)個(gè)脂肪細(xì)胞特異性基因。因此，脂肪生成的早期階段為視黃酸依賴性，而晚期階段為PPARy依賴性。在早期暴露于視黃酸，隨后施加經(jīng)典的脂肪形成誘導(dǎo)劑后，可產(chǎn)生從ES細(xì)胞衍生的脂肪細(xì)胞。在這些條件下，在70-80%胚狀體中存在成熟脂肪細(xì)胞大群集。視黃酸以時(shí)間和濃度依賴性方式影響ES細(xì)胞分化的模式。在脂肪細(xì)胞分化期間，視黃酸處理刺激ES細(xì)胞早期投入到脂肪細(xì)胞，但在前脂肪細(xì)胞成熟的晚期階段作為抑制劑。此晚期抑制作用是由于視黃酸對(duì)重要脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑基因PPAR δ和C/EBP的表達(dá)的阻抑物作用(Shao，D.和 Lazar, Μ. Α.，1997，J. Biol. Chem.，272，21473-21478)。ERK信號(hào)傳導(dǎo)似乎對(duì)脂肪生成重要，因?yàn)镋S細(xì)胞與視黃酸和PD980599(ERK途徑的特異性抑制劑)的共處理阻止脂肪細(xì)胞生成。施加PD98059對(duì)ES細(xì)胞分化成神經(jīng)元或心肌細(xì)胞沒有作用(Bost F.等，2002Biochem J.，361，621-627)。胚胎干細(xì)胞體外分化成脂肪細(xì)胞小鼠胚胎干細(xì)胞系ZIN40、E14TG^i*CGR8 由 Dani C 等，(1997) J. Cell Sci 110， 1279-1285用于產(chǎn)生脂肪細(xì)胞。簡(jiǎn)要地講，此過程包括在無喂養(yǎng)劑條件下在明膠涂覆的板上在培養(yǎng)基(含有0. 25%碳酸氫鈉、xlMEM必需氨基酸、2mM谷氨酰胺、ImM丙酮酸鹽、100 μ M 巰基乙醇和10% ν/ν胎牛血清的ΜΕΜ/ΒΗΚ21培養(yǎng)基)中培養(yǎng)未分化細(xì)胞系。加入白血病抑制因子(100單位/ml)，以抑制分化。為了使ES細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞，作為在胚狀體中的集合體培養(yǎng)細(xì)胞。各懸掛滴在20 μ 1培養(yǎng)基中含有1，000個(gè)細(xì)胞。將這些在用PBS填充的細(xì)菌學(xué)板的蓋上保持2天。使形成的胚狀體重新懸浮于補(bǔ)加視黃酸(0.1% ν/ν)的培養(yǎng)基，并保持在細(xì)菌板蓋上。將胚狀體保持?jǐn)?shù)天，然后使之沉降到重新懸浮于分化培養(yǎng)基的明膠涂覆板上，所述分化培養(yǎng)基由補(bǔ)加85ηΜ胰島素、2ηΜ三碘甲腺原氨酸和10%胎牛血清的培養(yǎng)基組成。在10-15天后，出現(xiàn)充滿脂質(zhì)滴的細(xì)胞群集。這些可用油紅0(oil red 0)(甘油三酯的特異性染色劑)染色。結(jié)果表明，通過脂肪形成標(biāo)記降脂蛋白(adipsin)和PPAR γ 表達(dá)測(cè)定，60%胚狀體形成脂肪細(xì)胞陽性集落。Dani, C.等，(1997)，J. Cell Sci.，110，1279-1285 方法的修改由 Rosen, Ε. D.等， (1999)，Molecular Cell，4，611-617在從對(duì)照和PPARy缺陷大鼠衍生的ES細(xì)胞(2天年齡)的分化期間利用。實(shí)際的修改方案簡(jiǎn)要包括從在含有視黃酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生胚狀體。然后，將胚狀體轉(zhuǎn)移到明膠涂覆的六孔板，并暴露于5yg/ml胰島素。在第17天，使胚狀體暴露于地塞米松GOOng/ml)和PDE抑制劑甲基異丁基黃嘌呤(500nM) 經(jīng)歷2天。隨后，使胚狀體重新懸浮于含有胰島素的培養(yǎng)基另外經(jīng)歷10天。通過中性脂質(zhì)的油紅0染色測(cè)定，此方案導(dǎo)致胚狀體中70-90%的細(xì)胞表達(dá)脂肪細(xì)胞表現(xiàn)型。在分化過程弓丨發(fā)后4天，野生型ES細(xì)胞表達(dá)早期標(biāo)記降脂蛋白和PPAR γ。小鼠胚胎干細(xì)胞和人成體干細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞的全面指導(dǎo)描述于Wziekonski B, Villageois P 和 Dani (2007) Curr. Protoc. Cell Biol.第 23 章第 23. 4 單元。這包括小鼠、人多能脂肪衍生和人間質(zhì)干細(xì)胞分化所需的方案。脂肪生成的抑制劑[1]抑制ERK信號(hào)傳導(dǎo)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)涉及調(diào)節(jié)一些細(xì)胞功能(如細(xì)胞增殖和分化)的信號(hào)級(jí)聯(lián)。PPAR γ的Erk介導(dǎo)磷酸化明顯抑制脂肪生成。PD98059為MEKl (負(fù)責(zé)ERK激活的酶) 的特異性抑制劑。用視黃酸和PD68059分化ES細(xì)胞的共處理防止ES細(xì)胞中脂肪細(xì)胞形成和脂肪形成標(biāo)記的表達(dá)兩者(Bost F.等，2002，Biochme J.，361，621-627)。[2] HIV蛋白酶抑制劑利用HIV蛋白酶抑制劑的療法與脂肪代謝變化相關(guān)。Lenhard，J. Μ.等，(2000), Antiviral Res.，47，121-1 研究這些抑制劑對(duì)使用C3H10T1/2間質(zhì)干細(xì)胞的脂肪細(xì)胞分化的影響。在這些細(xì)胞中，脂肪生成分別通過加入200nM胰島素和ΙμΜ PPAR γ和R)(R激動(dòng)劑 BRL49653 和 LGD1069 誘導(dǎo)。在這些條件下，通過脂肪生成減少、油紅0染色和脂肪細(xì)胞標(biāo)記AP2和LPL表達(dá)測(cè)定，HIV蛋白酶抑制劑奈非那韋、沙奎那韋和利托那韋，減小間質(zhì)干細(xì)胞的脂肪細(xì)胞分化。Vernochet, C.等 Q003)，AIDS，17，2177-2180 擴(kuò)展此研究，并評(píng)價(jià)相似范圍 HIV 蛋白酶抑制劑對(duì)四個(gè)小鼠前脂肪細(xì)胞細(xì)胞系(3T3-F442A，3T3-L1，0bl771和胚胎干細(xì)胞)的脂肪細(xì)胞分化的作用。分化的方法類似于Dani，C.等(1997),J. Cell Sci. , 110,1279-1285 所述。蛋白酶抑制劑奈非那韋、洛匹那韋，抑制試驗(yàn)的所有細(xì)胞中的脂肪細(xì)胞分化，而茚地那韋、沙奎那韋和利托那韋只抑制3T3-L1和3T3-F442A細(xì)胞的分化。作者得出結(jié)論，HIV 蛋白酶抑制劑根據(jù)使用的細(xì)胞模型系統(tǒng)抑制脂肪細(xì)胞分化。[3]糖原合成酶激酶3抑制劑還沒有完全表征涉及干細(xì)胞投入到脂肪形成途徑的信號(hào)傳導(dǎo)事件。最近， Mointeiro, M. C.等，(2009), Stem Cells Dev.，18，457-463 使用小鼠胚胎干細(xì)胞和視黃酸的早期處理而展示，視黃酸受體的激活對(duì)ES細(xì)胞投入到脂肪細(xì)胞分化是充分和必要的。作者也證明，在ES細(xì)胞中視黃酸受體β誘導(dǎo)的脂肪生成可通過GSK3抑制劑廢止。在祖干細(xì)胞分化期間，可監(jiān)測(cè)抑制劑(和化學(xué)物質(zhì)、藥物或化妝品)(如上所述的 HIV蛋白酶抑制劑等)對(duì)脂肪細(xì)胞發(fā)育的作用。使祖細(xì)胞暴露于抑制劑，并通過監(jiān)測(cè)分化的程度評(píng)價(jià)對(duì)細(xì)胞發(fā)育過程的作用。這可通過比如定量免疫細(xì)胞化學(xué)的技術(shù)來測(cè)量與分化的細(xì)胞類型相關(guān)的細(xì)胞/組織特異性標(biāo)記的表達(dá)而完成。指示脂肪細(xì)胞發(fā)育的標(biāo)記包括下列(也描述購自Abeam Inc.的抗體的來源)。脂肪細(xì)胞-早期標(biāo)記C20orf3(抗體^6916 -涉及脂肪細(xì)胞分化。FNDC3B (抗體ab69854)-脂肪生成的陽性調(diào)節(jié)劑脂連素(抗體19Fl，ab22554)_脂肪細(xì)胞在脂肪細(xì)胞分化期間產(chǎn)生和分泌脂連素。N0C3L(抗體ab74151)-作為脂肪細(xì)胞分化加速因子。AE結(jié)合蛋白1 (抗體abM820)-脂肪細(xì)胞增強(qiáng)子結(jié)合蛋白1，結(jié)合到脂肪細(xì)胞增強(qiáng)子1調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)錄阻抑物。PPAR α (抗體 ab8934)、y (抗體 abl2409)和 δ (抗體 ab23673)-相信均涉及脂肪細(xì)胞分化。CEBP α (抗體ΕΡ708Υ，ab40761)和β (抗體A16abl8336_重要的脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)
節(jié)基因。降脂蛋白/因子D (抗體ab8841)_脂肪細(xì)胞特異性脂肪細(xì)胞-晚期標(biāo)記瘦素(抗體ab3583)_脂肪細(xì)胞產(chǎn)生并分泌瘦素。脂蛋白脂肪酶(抗體LPL. A4，ab21356)-由脂肪細(xì)胞產(chǎn)生并分泌。AEBP2(抗體2012C4a，ab74517)_AE(脂肪細(xì)胞增強(qiáng)子)結(jié)合蛋白2。FABP4 (抗體ab37458)-發(fā)現(xiàn)于脂肪細(xì)胞的主要脂肪酸結(jié)合蛋白。FABP5(抗體ab37^7)_脂肪酸結(jié)合蛋白FABP-4FABP5密切相關(guān)和在脂肪細(xì)胞中表達(dá)。
PDE3B (抗體ab42091)-在脂肪細(xì)胞組織中表達(dá)。KIAA1881 (抗體ab78602)-涉及三?；视桶胫炯?xì)胞。抵抗素(抗體ab3423)-脂肪細(xì)胞分泌的因子，為脂肪細(xì)胞特異性分泌的細(xì)胞因子。圍脂滴蛋白A(抗體ab61682)_只發(fā)現(xiàn)于脂肪細(xì)胞和類固醇生成細(xì)胞中脂質(zhì)滴的表面。圍脂滴蛋白B(抗體ab3527)_表達(dá)限于脂肪細(xì)胞和類固醇生成細(xì)胞。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT4(抗體ab654)-在脂肪組織中由胰島素刺激葡萄糖攝取需要GLUT4胞內(nèi)部位易位到細(xì)胞表面。TUG (抗體 4A11A6G11，ab32007)-調(diào)節(jié) GLOT4 分布的假定系鏈(tether)。甘油3磷酸酯脫氫酶抗體(ab3449》-通過最終分化脂肪細(xì)胞表達(dá)。檢測(cè)和定量細(xì)胞成像使用細(xì)胞成像儀(例如，IN細(xì)胞分析儀，GE Healthcare)以多重模式，可檢測(cè)系鏈到不同特異性抗體的不同熒光素(例如，菁染料，GEHealthcare)。由于ES沿著特定途徑經(jīng)歷分化，這些熒光素用于檢測(cè)和測(cè)量數(shù)種目標(biāo)分子。因此，可使用定量免疫細(xì)胞化學(xué)用儀器檢測(cè)毒性化學(xué)物質(zhì)對(duì)來自相同樣品的最多三種不同標(biāo)記的作用，因此能夠建立化學(xué)物質(zhì)的毒性分布。另外，在此文獻(xiàn)中所述的方法具有用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)(例如，定量免疫細(xì)胞化學(xué)、報(bào)道基因測(cè)定或RT-PCT和微陣列分析)在早期和晚期胚胎干細(xì)胞選擇性生物標(biāo)記之間區(qū)分的另外的特征。由于祖細(xì)胞經(jīng)歷分化，這些報(bào)道基因可同時(shí)檢測(cè)和測(cè)量不僅在分化的細(xì)胞類型而且在初始祖細(xì)胞中存在的數(shù)種細(xì)胞/組織特異性分子。另外，產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)(無論衍生自免疫細(xì)胞化學(xué)還是基因報(bào)道測(cè)定等)的能力可允許測(cè)定亞致死劑量水平。這可對(duì)藥物開發(fā)或化妝品工業(yè)有重要價(jià)值。雖然已根據(jù)不同方面和優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)了解，本發(fā)明的范圍不應(yīng)認(rèn)為只限于此，并且申請(qǐng)人的意向是其所有變體及等價(jià)也落在附加權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
3權(quán)利要求
1.一種預(yù)測(cè)化學(xué)物質(zhì)對(duì)樣品中發(fā)育途徑的毒性的方法，所述方法包含以下步驟(i)用一種作用劑處理樣品中的未分化干細(xì)胞的對(duì)照群體，以在第一發(fā)育途徑中產(chǎn)生分化細(xì)胞的第一對(duì)照群體；( )測(cè)量在所述未分化干細(xì)胞的對(duì)照群體和/或所述分化細(xì)胞的第一對(duì)照群體中表達(dá)的至少兩種生物標(biāo)記的水平，以測(cè)定表達(dá)的對(duì)照水平，其中至少一種所述生物標(biāo)記在發(fā)育途徑和/或分化的早期階段表達(dá)，并且至少一種生物標(biāo)記在發(fā)育途徑和/或分化的晚期階段表達(dá)；(iii)在用所述作用劑處理之前或之后，使所述樣品中的未分化干細(xì)胞的試驗(yàn)群體暴露于化學(xué)物質(zhì)，以在第一發(fā)育途徑中產(chǎn)生分化細(xì)胞的第一試驗(yàn)群體；(iv)測(cè)量所述未分化干細(xì)胞的試驗(yàn)群體和/或所述分化細(xì)胞的第一試驗(yàn)群體中的所述至少兩種生物標(biāo)記的水平，以測(cè)定表達(dá)的試驗(yàn)水平；并且(ν)將所述表達(dá)的對(duì)照水平與所述表達(dá)的試驗(yàn)水平比較，其中在暴露于所述化學(xué)物質(zhì)后表達(dá)水平的差異指示化學(xué)物質(zhì)對(duì)所述發(fā)育途徑的毒性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(i)包含以下步驟用一種作用劑處理未分化干細(xì)胞的群體，以在第η發(fā)育途徑中產(chǎn)生分化細(xì)胞的第η群體；并且重復(fù)步驟(ii)至(ν)，以測(cè)定所述第η群體中表達(dá)的對(duì)照水平與表達(dá)的試驗(yàn)水平的差巳升，其中在暴露于化學(xué)物質(zhì)后表達(dá)水平的差異指示化學(xué)物質(zhì)對(duì)所述第η發(fā)育途徑的毒性。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述第一和所述第η發(fā)育途徑為網(wǎng)絡(luò)化發(fā)育途徑。
4.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(i)包含以下步驟用一種作用劑處理未分化干細(xì)胞的群體，以在多個(gè)發(fā)育途徑中產(chǎn)生多個(gè)分化細(xì)胞的群體；并且重復(fù)步驟(ii)至(ν)，以測(cè)定所述多個(gè)群體中表達(dá)的對(duì)照水平與表達(dá)的試驗(yàn)水平的差巳升，其中在暴露于化學(xué)物質(zhì)后表達(dá)水平的差異指示化學(xué)物質(zhì)對(duì)所述多個(gè)發(fā)育途徑的毒性。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述多個(gè)發(fā)育途徑為網(wǎng)絡(luò)化發(fā)育途徑。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中所述干細(xì)胞為多能干細(xì)胞。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述多能干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞。
8.權(quán)利要求7的方法，其中多能干細(xì)胞為經(jīng)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
9.權(quán)利要求7的方法，其中多能干細(xì)胞為原始生殖細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中所述干細(xì)胞為成體干細(xì)胞。
11.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其中干細(xì)胞為人干細(xì)胞。
12.權(quán)利要求1至11的方法，其中未分化干細(xì)胞包含可操作連接到至少兩種或更多種生物標(biāo)記的不同報(bào)道基因，兩種或更多種生物標(biāo)記的水平通過測(cè)量不同基因產(chǎn)物定量。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述報(bào)道基因選自硝基還原酶、半乳糖苷酶、內(nèi)酰胺酶、熒光素酶和熒光蛋白報(bào)道基因。
14.權(quán)利要求1到13的方法，其中通過選自定量RT-PCR、定量免疫細(xì)胞化學(xué)、表面等離子共振和微陣列分析的方法將兩種或更多種生物標(biāo)記的水平定量。
15.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，所述方法另外包含在步驟(iii)后測(cè)定細(xì)胞增殖。
16.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中方法為多重方法。
17.一種用任何前述權(quán)利要求的方法預(yù)測(cè)人胎兒發(fā)育期間細(xì)胞生物圖或發(fā)育途徑變化的方法。
18.—種進(jìn)行任何前述權(quán)利要求的方法的試劑盒，所述試劑盒包含用于將至少兩種生物標(biāo)記定量的裝置和用于進(jìn)行所述方法的說明書。
19.權(quán)利要求18的試劑盒，其中所述裝置選自抗體、酶底物和寡核苷酸引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)測(cè)化學(xué)物質(zhì)對(duì)發(fā)育途徑的影響的方法和試劑盒。具體地講，本發(fā)明涉及預(yù)測(cè)化學(xué)物質(zhì)對(duì)人發(fā)育途徑的毒性的方法和試劑盒。本發(fā)明的方法和試劑盒可用于預(yù)測(cè)人胎兒發(fā)育期間細(xì)胞生物圖或發(fā)育途徑的變化。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102483407SQ201080038295
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者J·K·霍爾頓, P·J·塔特內(nèi)爾 申請(qǐng)人:通用電氣醫(yī)療集團(tuán)英國有限公司