專利名稱：用于測量細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的診斷試驗所用的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請概括地涉及診斷試驗，更具體地，涉及用于測量生物樣品中細胞介導(dǎo)的免疫(CMI)反應(yīng)性的試驗。更具體地，本發(fā)明提供了用于測量生物樣品中的細胞-介導(dǎo)的對靶抗原的應(yīng)答的試驗和試劑盒，其中使用轉(zhuǎn)運因子將靶抗原遞送給生物樣品中的細胞。相關(guān)申請的交叉引用本申請在35 U. S. C. § 119(e)下要求2009年6月12日提交的美國臨時申請 61/186，437的利益，其整個內(nèi)容通過引用并入本文。
背景技術(shù)：
流行病學(xué)調(diào)查提示，世界上1/3的人口被結(jié)核分枝桿菌感染。原發(fā)感染會在少數(shù) (約10% )受感染個體中(通常在2年內(nèi))導(dǎo)致活動性結(jié)核(A-TB)。在其它病例中，免疫系統(tǒng)含有感染，且個體是非傳染性的和無癥狀的。該臨床潛伏期可以在個體終生中持續(xù)。 但是，在有些情況下，宿主免疫應(yīng)答被擾亂，潛伏性結(jié)核感染(LTBI)可能發(fā)展成原發(fā)后的 A-TB0在例如人免疫缺陷病毒(HIV)感染、營養(yǎng)不良、使用類固醇或其它免疫抑制藥物以后，或因為老年，可以發(fā)生該過程。新的診斷工具的開發(fā)會改善結(jié)核(TB)的控制，這通過改善A-TB的診斷和通過實現(xiàn)LTBI的更準確鑒別來實現(xiàn)。一個這樣的試驗是結(jié)核菌素皮膚試驗(TST)，該試驗已經(jīng)成為唯一廣泛使用的可用于診斷TB感染的工具。但是，該試驗受到它在診斷A-TB時的低靈敏度(75-90% )和由下述事實造成的它的低特異性的限制用于皮膚試驗的純化的蛋白衍生物(PPD)含有> 200種抗原，所述抗原在環(huán)境分枝桿菌和用于疫苗接種的牛分枝桿菌BCG 菌株之間廣泛地共有。最后，TST不允許辨別A-TB和LTBI。為了檢測病毒病原體，現(xiàn)有的診斷試驗試劑盒會檢測病毒蛋白，且有些會測量針對病毒抗原的抗體。有些試驗允許更定量地測量血流中的病毒。但是，這些試驗都不會測量T-細胞對病原性感染的應(yīng)答。研究已經(jīng)證實，T-細胞應(yīng)答(或引起對病原體表達的靶抗原的CMI應(yīng)答的能力)可以決定感染是否可以被免疫系統(tǒng)控制。已經(jīng)開發(fā)了其它診斷試驗，它們測量針對病原性蛋白的細胞-介導(dǎo)的免疫(CMI) 應(yīng)答。現(xiàn)有的用于檢測CMI應(yīng)答的方法包括測量立即型和延遲型超敏反應(yīng)的皮膚試驗，淋巴細胞增殖試驗，和測量由用抗原培養(yǎng)的純化的單核細胞生產(chǎn)的細胞因子。更老的確定的用于測定CMI應(yīng)答的方法包括增殖試驗，使用分裂中的T-細胞對放射性同位素的攝取作為CMI反應(yīng)性的標志物。更近地，諸如單細胞試驗(ELISpot)等技術(shù)已經(jīng)被用于檢測響應(yīng)于抗原刺激而生產(chǎn)某些細胞因子的T-細胞的數(shù)目。此外，大多數(shù)用于檢測CMI應(yīng)答的體外方法包括從全血純化淋巴細胞，用抗原培養(yǎng)這些淋巴細胞12小時至6天的時段，然后檢測T-細胞對抗原的反應(yīng)性。已經(jīng)開發(fā)了一些CMI試驗，它們檢測對靶抗原的肽或靶抗原的重疊肽的CMI應(yīng)答。 可商業(yè)得到的用于測量對TB靶抗原的CMI應(yīng)答的試驗包括=QuantiFERON TB Gold試驗(來自Cellestis Ltd)和T SPOT TB試驗(來自O(shè)xford Immunotec)。這些試驗檢測對TB 靶抗原的重疊肽的CMI應(yīng)答。除了病原性感染(諸如TB)的診斷以外，CMI診斷試驗也可以用于許多疾病和障礙(包括傳染性疾病和自身免疫病)以及免疫活性標志物的免疫診斷， 和用于檢測對內(nèi)源和外源抗原(即疫苗)的T-細胞應(yīng)答。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于測量受試者中的CMI應(yīng)答的方法，其中用融合蛋白溫育來自受試者的生物樣品，所述生物樣品包含免疫系統(tǒng)的T-細胞或其它細胞，其中所述融合蛋白包含與靶抗原融合的致死因子(LF)多肽的多肽片段。通過測量免疫細胞對融合蛋白的細胞因子應(yīng)答，所述細胞因子應(yīng)答相對于參照細胞因子應(yīng)答的水平會指示受試者對抗原的細胞介導(dǎo)的免疫(CMI)應(yīng)答的水平。本發(fā)明涉及下述發(fā)現(xiàn)，即與靶抗原融合的致死因子(LF)的多肽片段可以用于將靶抗原遞送給在體外的細胞，其可以用于診斷試驗中，以測定受試者的CMI應(yīng)答性水平。通過將靶抗原融合到LF的多肽片段(諸如Un)上，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，該診斷試驗可以測定受試者對大抗原(尤其是完整抗原，而不是以前已經(jīng)實現(xiàn)的抗原片段)的CMI應(yīng)答性。此外， 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這樣將靶抗原偶聯(lián)到LF片段(諸如LFn)上，會產(chǎn)生與以前可能實現(xiàn)的準確度 (當靶抗原沒有偶聯(lián)到LF的多肽片段上時進行的診斷試驗)相比遠遠更高的受試者對抗原的CMI應(yīng)答性準確度。不希望受理論的約束，發(fā)明人以前已經(jīng)證實，與靶抗原融合或偶聯(lián)的Un能夠?qū)锌乖f送至細胞的胞質(zhì)溶膠(在沒有PA存在下)。在本文中，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與靶抗原偶聯(lián)的1^11可以用于診斷試驗中，以測定在沒有PA存在下受試者是否具有對靶抗原的細胞介導(dǎo)的免疫(CMI)應(yīng)答。也不希望受理論的約束，據(jù)信，靶抗原向生物樣品中的完整細胞的胞質(zhì)溶膠的遞送，允許細胞使用MHC分子在它的表面上處理和展示靶抗原，其中處理過的片段可以與生物樣品中可能存在的抗原特異性的細胞(例如，抗原特異性的T細胞)相互作用。因此，本發(fā)明涉及用于測量受試者中的CMI應(yīng)答的方法和用于該方法的組合物，其中所述方法包括用與靶抗原偶聯(lián)的LF片段(諸如LFn或其片段)(例如LFn-靶抗原融合蛋白)溫育來自受試者的生物樣品，所述生物樣品包含能夠處理和呈遞靶抗原的細胞和免疫細胞，以便將靶抗原遞送至生物樣品中的細胞的胞質(zhì)溶膠。如果存在識別處理過的、展示的靶抗原的免疫細胞，它們在這樣的識別以后，會釋放出一種或多種指示CMI應(yīng)答的細胞因子。CMI應(yīng)答指示受試者向靶抗原的暴露，例如，病原體感染或其它暴露。本發(fā)明的一個方面提供了用于檢測受試者對與LFn融合的靶抗原的CMI應(yīng)答的方法和組合物，其中所述靶抗原是完整抗原蛋白，例如，TBl抗原。通過融合到LF上，靶抗原被遞送至生物樣品中的細胞(諸如抗原呈遞細胞(APC))的細胞質(zhì)，所述生物樣品從受試者得到，例如血液樣品。如果受試者具有以前已經(jīng)對抗原(但是可能是獨特的或特殊的抗原組或多種抗原)敏化(即通過暴露于表達靶抗原的病原體或病原體感染)的免疫細胞(諸如T細胞)，所述免疫細胞(諸如T細胞)會釋放出至少一種細胞因子，例如，IFN-g?？梢詼y量釋放的細胞因子，且釋放的細胞因子的水平和/或釋放的細胞因子的特殊特性會指示，受試者已經(jīng)被感染，或曾經(jīng)暴露于表達靶抗原的病原體?？梢允褂糜糜跈z測一種或多種細胞因子的水平的任意方法；作為一個非限制性實例，使用在本文實施例中所述的商業(yè)的IFN-γ ELISA試驗，可以測量IFN-γ的水平。在具體實施方案中，測量細胞因子的獨特的或特殊的特性，會增加對靶抗原的CMI 應(yīng)答的特異性和定性評估。例如，基于從T-細胞釋放的細胞因子集合的獨特的或特殊的特性，可以區(qū)別慢性感染的受試者和攜帶者感染的受試者，或者區(qū)別被病原體的一種亞型 (或變體)感染的受試者和被病原體的不同亞型(即變體)感染的受試者。作為實例，慢性感染的受試者的細胞因子特性會不同于攜帶者受試者的細胞因子特性，同樣地，被一種病原體亞型感染的受試者會不同于被不同病原體亞型(即變體)感染的受試者的細胞因子特性?？梢耘cLFn融合的靶抗原可以是與傳染病或癌癥或免疫病有關(guān)的任意抗原。在有些實施方案中，與Un融合的靶抗原可以由多種傳染物表達，包括病原體、病毒、細菌、真菌或寄生物。因為整個或完整靶抗原可以與Un融合并經(jīng)由LFN遞送至完整活細胞的胞質(zhì)溶膠，本發(fā)明能夠檢測對整個或完整靶多肽抗原的CMI應(yīng)答。以前開發(fā)的CMI試驗使用可以有效地進入細胞中的肽，而不是不能進入細胞中的完整抗原蛋白。因此，本文所述的方法會提供一個優(yōu)點，即可以采用特定抗原的全范圍表位，而不僅僅是單個或選擇的幾個肽表位。 用于本發(fā)明的方法和組合物中來檢測CMI應(yīng)答的靶抗原不是HLA限制的表位。因此，本文描述了用于檢測或監(jiān)測CMI應(yīng)答的試驗所用的方法和組合物，它更靈敏，因為它可以診斷對抗原的暴露，無論哪個表位在個體的免疫應(yīng)答中起作用。在有些實施方案中，為了避免與增加的靈敏度有關(guān)的假陽性，還可以將靶抗原分解成整個靶抗原的片段，例如，3個或4個，這取決于蛋白的大小。通過評估對與LFn融合的靶抗原集合(它們是整個靶抗原的片段)的CMI應(yīng)答，可以證實對與LFn融合的整個靶抗原的陽性CMI應(yīng)答。如果1個或2個片段(而不是所有片段)產(chǎn)生陽性應(yīng)答，則證實真實的CMI應(yīng)答。如果檢測到所有片段的陽性CMI應(yīng)答，對與LFn融合的整個靶抗原的陽性 CMI應(yīng)答可能是假陽性。在另一個方面，CMI試驗的方法和組合物可用于受試者的預(yù)后評價。例如，如上面所討論的，可以使用CMI試驗來區(qū)別慢性感染的受試者、攜帶者受試者或潛伏感染的受試者?；蛘撸梢詤^(qū)別被病原體的不同變體感染的受試者。在另一個實施方案中，可以使用本文公開的CMI試驗來鑒別靶抗原的哪個表位可用于診斷和/或預(yù)后。這可用于幫助治療受試者，例如CMI試驗可以用于測定哪個表位是優(yōu)勢的，且因此可以用作靶物來刺激對該表位做出應(yīng)答的細胞。本發(fā)明提供了許多勝過現(xiàn)有的細胞介導(dǎo)的免疫(CMI)試驗的優(yōu)點。例如，本發(fā)明提供了用于檢測對靶抗原集合(它們是靶抗原的重疊蛋白或重疊多肽，而不是靶抗原的重疊肽)的CMI應(yīng)答的方法。本發(fā)明的使用與Un融合的靶抗原的重疊蛋白的方案，能夠?qū)崿F(xiàn)融合蛋白的更廉價且更快速的生產(chǎn)和增加的穩(wěn)定性，這會顯著降低試驗成本。此外，使用與LFn融合的靶抗原的重疊蛋白，會增加CMI應(yīng)答的特異性。例如，本文公開的CMI試驗?zāi)軌騾^(qū)別已經(jīng)針對病原體免疫的受試者和被病原體感染或已經(jīng)暴露于病原體的受試者之間的差異。在另一個實施例中，本文公開的CMI試驗可以區(qū)別T細胞靶物。因此，本文公開的診斷方法和CMI試驗會提供簡單的、廉價的且快速的方法，用于檢測對靶抗原的CMI應(yīng)答， 和/或檢測受病狀(諸如病原體感染)影響的受試者。
本文公開的診斷方法和CMI試驗的另一個優(yōu)點允許早期檢測對靶抗原的CMI應(yīng)答。例如，在暴露于病原體或靶抗原以后1周或更短，可以檢測出CMI應(yīng)答，而抗體應(yīng)答需要數(shù)月才能達到可測量的水平，這取決于暴露和/或感染的水平和范圍。本文公開的診斷方法和CMI試驗的另一個優(yōu)點是，對于在細菌中難以生成的靶抗原，可以檢測對靶抗原的CMI應(yīng)答。在一個實施方案中，本文所述的方法會提供病原性感染的早期無癥狀篩查系統(tǒng)， 其中使用本文公開的診斷試驗。這樣的篩查可以在例如從受試者采取的生物樣品上進行， 包括、但不限于血液樣品，其中所述受試者已經(jīng)暴露于病原體，或其中受試者處于被病原體感染的風險中。例如，在受試者疑似具有病原性感染的情況下，例如受試者正在表現(xiàn)出特定病原性感染的特有癥狀，或者，受試者已經(jīng)暴露于病原體(即受試者已經(jīng)接觸包含傳染劑的樣品，或受試者已經(jīng)接觸具有病原性感染的人)，可以從受試者獲得生物樣品，并使用本文公開的方法和組合物，評估引起對靶抗原(其由受試者已經(jīng)暴露或處于被該病原體感染的風險中的病原體表達)的CMI應(yīng)答的能力。因為病原體感染或癌癥的早期檢測對于有效治療而言是關(guān)鍵性的，本文公開的病原性感染的鑒別或癌癥的存在(例如，通過對腫瘤標志物的CMI應(yīng)答來鑒別)極大地提高了有效治療的機會。本文描述了用于檢測或監(jiān)測受試者(例如哺乳動物受試者，諸如人受試者)中的 CMI應(yīng)答的組合物。本發(fā)明涉及使用它們來檢測受試者中的CMI應(yīng)答的組合物和方法，其基本上由LF片段(諸如二分的(bipartate)外毒素的N-端致死因子(LFn)或其羧基片段) 組成，其中LFn與靶抗原融合或以其它方式物理地連接，且所述組合物不包含二分的外毒素的保護抗原(PA)。本文所述的組合物和方法的一個方面涉及測量受試者中對靶抗原的細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(CMI)的方法，所述方法包括下述步驟(a)用至少一種融合多肽溫育來自受試者的生物樣品，所述融合多肽包含與靶抗原多肽或與其片段融合的LF多肽的一部分(該部分缺少LF酶活性，但是足以促進融合多肽跨膜遞送給細胞)，其中所述生物樣品包含免疫系統(tǒng)的細胞，所述細胞響應(yīng)于抗原而釋放出至少一種細胞因子；(b)測量在生物樣品中釋放的至少一種細胞因子的水平；和(c)對比生物樣品中的細胞因子的水平和相同細胞因子的參照水平，其中來自受試者的生物樣品中的細胞因子的水平相對于細胞因子參照水平的增力口，指示對靶抗原的細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(CMI)。另一個方面涉及檢測受試者的目標病狀的方法，所述方法包括下述步驟(a)用至少一種融合多肽溫育來自受試者的生物樣品，所述融合多肽包含與靶抗原多肽或與其片段融合的LF多肽的一部分(該部分缺少LF酶活性，但是足以促進融合多肽跨膜遞送給細胞)，其中所述靶抗原在受病狀影響的組織中表達，且其中所述生物樣品包含免疫系統(tǒng)的細胞，所述細胞響應(yīng)于抗原而釋放出至少一種細胞因子；(b)測量在生物樣品中釋放的至少一種細胞因子的水平；和(c)對比生物樣品中的細胞因子的水平和相同細胞因子的參照水平，其中來自受試者的生物樣品中的細胞因子的水平相對于細胞因子參照水平的增加，會將受試者鑒別為具有所述病狀，或具有增加的遭受所述病狀的風險。另一個方面涉及測量受試者中對靶抗原的細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(CMI)的方法，所述方法包括下述步驟(a)用至少一種靶抗原溫育來自受試者的生物樣品，其中所述生物樣品包含免疫系統(tǒng)的細胞，所述細胞在被靶抗原刺激以后釋放出至少一種細胞因子；(b)測量生物樣品中釋放的細胞因子的存在或水平，其中細胞因子的存在或水平指示在來自受試者的生物樣品中存在對靶抗原的細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(CMI)，其中所述改進包括，在溫育步驟(a)中，用與LF多肽的一部分融合的至少一種靶抗原多肽或其片段溫育生物樣品，所述部分缺少LF酶活性，但是足以促進融合多肽跨膜遞送給細胞。在有些實施方案中，所述方法包括使用LF多肽的一部分，該部分是SEQIDN0 3 的至少60個羧基端氨基酸或其保守置換變體，包括促進跨膜遞送的保守置換變體。在有些實施方案中，所述LF多肽片段包含SEQ ID NO :3的至少80個羧基端氨基酸或其保守置換變體，包括促進跨膜遞送的保守置換變體，或SEQ ID NO :3的至少104個羧基端氨基酸或其保守置換變體，包括促進跨膜遞送的保守置換變體。在有些實施方案中，所述LF多肽部分包含與SEQ ID NO :3相對應(yīng)的氨基酸序列或其保守置換變體，包括促進跨膜遞送的保守置換變體。在有些實施方案中，所述LF多肽不結(jié)合PA多肽。在另一個實施方案中，在本文公開的方法和組合物中使用的LF多肽的一部分基本上缺少SEQ ID NO :3的氨基酸1-33。在該背景下使用的術(shù)語“基本上缺少”是指，所述 LF多肽缺少信號肽功能。在另一個實施方案中，在本文公開的方法和組合物中使用的LF多肽的一部分由 SEQ ID NO :4或其促進跨膜遞送的保守置換變體組成。在有些實施方案中，在本文公開的方法和組合物中使用的LF多肽片段偶連至靶抗原上，例如長度為至少15個氨基酸的靶抗原多肽或其片段。在有些實施方案中，這樣的靶抗原多肽或其片段折疊成它的天然構(gòu)象。在有些實施方案中，所述靶抗原多肽或其片段是多分子多肽復(fù)合物的一部分，或者是多分子多肽靶抗原的亞基多肽。在另一個實施方案中，靶抗原多肽是全長靶抗原大小的基本上一半，或者是全長靶抗原大小的基本上1/3或 1/4，或小于全長靶抗原大小的1/4，且其中所述片段的長度是至少15個氨基酸。在有些實施方案中，本文公開的方法和組合物測量生物樣品中的CMI應(yīng)答，所述生物樣品例如但不限于全血樣品或血漿或淋巴結(jié)生物樣品。通常，所述生物樣品包含免疫細胞，包括、但不限于NK細胞；T-細胞；B-細胞；Th細胞；Thl細胞；Th2細胞；Tc細胞；基質(zhì)細胞；內(nèi)皮細胞；白細胞；淋巴細胞；樹突細胞；巨噬細胞；肥大細胞和單核細胞。所述生物樣品包含能夠加工和展示靶抗原的細胞。在有些實施方案中，本文公開的方法和組合物測量響應(yīng)于靶抗原從免疫細胞釋放的細胞因子的水平，例如，這樣的細胞因子可以是下述細胞因子中的任一種，或下述細胞因子的任意組合，包括但不限于=GM-CSF ；IL-I α ；IL-I β ；IL-2 ；IL-3 ；IL-4 ；IL-5 ；IL-6 ； IL-7 ；IL-8 ；IL-10 ；IL-12 ；IFN-α ； IFN-β ； IFN-γ ；MIP-I α ；MIP-I β ； TGF-β ；TNFa 禾口 TNF^。在具體實施方案中，在測量T-細胞細胞因子的情況下，所述細胞因子可以是下述細胞因子中的任一種或組合IFN-g ;TGF3 ；TNF β ；IL-10 ;GM_CSF ;IL_3 ;IL_4 和 IL-5。在具體實施方案中，測量的細胞因子是IFN-γ。本發(fā)明的一個方面涉及CMI應(yīng)答的檢測和/或?qū)⑹茉囌咴\斷為具有目標病狀，包括、但不限于病原性感染或癌癥或自身免疫病。與傳染病有關(guān)的抗原可以源自多種傳染物中的任一種，包括病原體、病毒、細菌、 真菌或寄生物。目標病原體的非限制性實例包括單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、 HBV、巨細胞病毒、非洲淋巴細胞瘤病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、人皰疹病毒6、人皰疹病毒7、人皰疹病毒8、天花病毒、水皰性口炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、 丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、鼻病毒、冠狀病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、麻疹病毒、 多瘤病毒、人乳頭瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯薩奇病毒、登革熱病毒、腮腺炎病毒、 脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病病毒、魯斯肉瘤病毒、黃熱病病毒、埃波拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙熱病毒、東方馬腦炎病毒、日本腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒、Murray山谷熱病毒、西尼羅病毒、立夫特山谷熱病毒、甲型輪狀病毒、乙型輪狀病毒、丙型輪狀病毒、Sindbis病毒、人 T-細胞白血病病毒1型、漢坦病毒、風疹病毒、牛疫、鼻病毒、埃可病毒、乳多泡病毒、棘狀病毒、蟲媒病毒、人免疫缺陷病毒I型或II型和猿免疫缺陷病毒。可以為其提供免疫檢測的細菌的實例包括、但不限于結(jié)核分枝桿菌、分枝桿菌、 支原體、奈瑟球菌和軍團病桿菌。寄生物的實例包括、但不限于立克次氏體和衣原體。傳染病抗原的一個實例是TbH9(也稱作Mtb 39A)，即一種結(jié)核抗原。其它結(jié)核抗原包括、但不限于:DPV(也稱作 Mtb8. 4)、381、Mtb41、Mtb40、Mtb32A、Mtb9. 9A、Mtb9. 8、 Mtbl6、Mtb72f、Mtb59f、Mtb88f、Mtb71f、Mtb46f 和 Mtb31f ( “f” 指示它是融合體或 2 個或更多個蛋白)。因此，在其中診斷或檢測受試者對目標病狀的CMI應(yīng)答的這類實施方案中，靶抗原多肽或其片段是病原體抗原，例如，TB-特異性的抗原。TB-特異性的抗原的一個實例包括包含SEQ ID NO 7的TBI (CFP或CFP-10)多肽或其片段，諸如多肽序列SEQ ID NO 30 至SEQ ID NO :46ο可以使用的另一種TB-特異性的抗原是包含SEQ ID NO :6的ΤΒ2 (ESAT 或ESAT-6)多肽或其片段，諸如多肽序列SEQ ID NO :8至SEQ ID NO :29。在有些實施方案中，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍已知的任意方法，例如，使用抗體、抗體片段、重組抗體、嵌合抗體、適體、肽或其類似物，在蛋白表達水平測量細胞因子?；蛘撸梢允褂眠x自下述的方法，測量細胞因子免疫測定、放射免疫測定(RIA)、免疫放射測定(IRMA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)；酶聯(lián)免疫斑點測定(ELISpot) ；CELISA[細胞的酶聯(lián)免疫吸附測定]；RHPA(反向溶血空斑測定)或激酶受體活化測定(KIRA)。通常，本文公開的方法和組合物可用于診斷或測定受試者(諸如哺乳動物受試者，包括人受試者)的CMI應(yīng)答，但是，所述方法和組合物同樣適用于非人受試者(包括家畜類動物、馴養(yǎng)動物和伴侶動物)和其它獸類和野生型受試者。在有些實施方案中，用融合多肽集合溫育生物樣品，所述融合多肽集合包含與靶抗原多肽或其片段融合的LFn多肽，其中所述融合多肽集合包含靶抗原多肽或其基本上覆蓋靶抗原多肽的整個全長的片段。在有些實施方案中，融合多肽集合是多個與不同靶抗原多肽融合的LFn多肽，所述不同靶抗原多肽為基本上覆蓋靶抗原多肽的整個全長的重疊和 /或鄰近的靶抗原多肽片段。融合多肽集合可以是任意數(shù)目的融合多肽，例如至少2個或至少2-5個或6-10個或11-15個或16-20個或超過20個融合多肽。在一個實施方案中，可用于本文公開的方法和組合物中的融合多肽集合包含與至少2個選自下述的不同靶抗原片段融合的LF多肽SEQ ID NO :8至SEQ ID NO :29。在一個替代實施方案中，可用于本文公開的方法和組合物中的融合多肽集合包含至少2個與選自下述的不同靶抗原片段融合的所述LF多肽SEQ ID NO :30至SEQ ID NO :46。在有些實施方案中，CMI應(yīng)答(即對CMI應(yīng)答的陽性反應(yīng)性)的檢測會鑒別出受試者具有病狀，或處于具有病狀的風險中。通過本文公開的方法和組合物可以鑒別出的這類病狀的實例包括、但不限于癌癥、感染性疾病和自身免疫病。此外，使用本文公開的方法和組合物進行的CMI應(yīng)答(即對CMI應(yīng)答的陽性反應(yīng)性)的檢測，也可用于鑒別這樣的受試者其可能已經(jīng)暴露于靶抗原或表達靶抗原的病原體。在有些其中已經(jīng)將受試者鑒別為具有陽性CMI應(yīng)答的實施方案中，所述受試者被鑒別為，與被鑒別為具有低或否定的引起CMI 應(yīng)答的能力的受試者相比，具有或可能具有更好的預(yù)后。另一個方面涉及用于監(jiān)測受試者的目標病狀的方法，所述方法包括評估受試者的引起對靶抗原的細胞介導(dǎo)的免疫(CMI)應(yīng)答的能力，其中所述方法包括(a)用融合多肽溫育在試驗時間點從受試者收集的生物樣品，所述融合多肽包含LF多肽的一部分(該部分缺少LF酶活性，但是足以促進融合多肽跨膜遞送給細胞)，所述LF多肽與靶抗原多肽或其片段融合，其中所述靶抗原在受病狀影響的組織中表達，且其中所述生物樣品包含免疫系統(tǒng)的細胞，所述細胞響應(yīng)于抗原而釋放出至少一種細胞因子；(b)測量在生物樣品中釋放的至少一種細胞因子的水平；和(c)對比生物樣品中的所述細胞因子的水平和相同細胞因子的參照水平，其中如果檢測到在試驗時間點從受試者得到的生物樣品中的細胞因子的水平相對于所述細胞因子的參照水平的增加，則將所述受試者鑒別為，具有引起對靶抗原多肽或其片段的細胞介導(dǎo)的免疫(CMI)應(yīng)答的能力。在這樣的實施方案中，參照細胞因子水平是從一個或多個沒有受所述病狀影響的受試者得到的至少一個或多個生物樣品中的細胞因子水平。或者，參照細胞因子水平是在比試驗時間點更早的時間點從受試者得到的生物樣品中的細胞因子水平。在受試者被鑒別為具有陽性CMI應(yīng)答(即引起對靶抗原的CMI應(yīng)答)的情況下， 本發(fā)明包括另一個步驟用合適的治療方案，治療被鑒別為具有引起細胞介導(dǎo)的(CMI)應(yīng)答的能力的受試者?；蛘?，本文公開的方法和組合物可用于指導(dǎo)被鑒別為具有陽性CMI應(yīng)答的受試者中的適當治療。例如，從業(yè)人員可以評審來自本文公開的CMI試驗的細胞因子的水平，如果受試者被鑒別為具有引起細胞介導(dǎo)的(CMI)應(yīng)答的能力，關(guān)于在病狀中涉及的該特定的(相對于泛化的)因素做出結(jié)論。從業(yè)人員然后可以指導(dǎo)用適合涉及的特定因素的治療方案來治療受試者。在另一個實施方案中，本文公開的方法和組合物可用于預(yù)測受試者的病狀的預(yù)后，例如，在可以引起細胞介導(dǎo)的(CMI)應(yīng)答的受試者被鑒別為可能具有更好預(yù)后(與被鑒別為具有低或否定的引起CMI應(yīng)答的能力的受試者相比)的情況下。在另一個實施方案中，本文公開的方法和組合物可用于預(yù)測受試者發(fā)展病狀的風險，例如，被鑒別為具有引起細胞介導(dǎo)的(CMI)應(yīng)答的能力的受試者，會被鑒別為發(fā)展病狀的可能性更低(與被鑒別為具有低或否定的引起CMI應(yīng)答的能力的受試者相比)。在這樣的實施方案中，所述病狀可以是任意病狀，包括但不限于病原性感染、癌癥或自身免疫病。在有些實施方案中，本文公開的方法和組合物包含炭疽芽孢桿菌LF多肽的一部分，該部分是SEQ ID NO :3的至少60個羧基端氨基酸或其保守置換變體，包括促進跨膜遞送的保守置換變體?；蛘撸捎糜诒疚乃龅姆椒ê徒M合物中的LF多肽部分是SEQ ID NO 3 (在本文中也稱作片段幻的至少80個羧基端氨基酸或其保守置換變體，包括促進跨膜遞送的保守置換變體，或SEQ ID NO :3(在本文中也稱作片段3)的至少104個羧基端氨基酸或其保守置換變體，包括其促進跨膜遞送的保守置換變體。在一個實施方案中，LF多肽的一部分包含與SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4相對應(yīng)的氨基酸序列或其保守置換變體，包括其促進跨膜遞送的保守置換變體。在另一個實施方案中，可用于本文公開的方法和組合物中的LF多肽部分不結(jié)合炭疽芽孢桿菌PA多肽，例如，所述LFn多肽可以基本上缺少SEQ ID NO 3的氨基酸1_33。在有些實施方案中，與LF多肽(例如，LFn多肽)融合的靶抗原多肽或其片段的長度是至少15個氨基酸。通常，這樣的靶抗原多肽或其片段折疊成它的天然構(gòu)象。在有些實施方案中，靶抗原是多分子多肽復(fù)合物的一部分，例如，靶抗原可以是多分子多肽靶抗原的亞基。在靶抗原片段與LF多肽部分融合的有些實施方案中，所述片段可以是完整抗原的一定范圍尺寸的片段，包括、但不限于基本上是全長靶抗原的大小的1/2的片段，或基本上是全長靶抗原大小的1/3的片段，或基本上是全長靶抗原大小的1/4的片段，或者小于全長靶抗原大小的1/4。通常，與LF多肽部分融合的靶抗原片段是至少20個氨基酸?？捎糜诒疚墓_的方法和組合物中的生物樣品可以是包含免疫細胞的任意生物樣品，包括、但不限于全血樣品或血漿或淋巴結(jié)生物樣品?？捎糜诒疚乃龅姆椒ㄖ械纳飿悠钒辽僖活惷庖呒毎?，例如免疫細胞，例如，但不限于NK細胞、T-細胞、B-細胞、Th 細胞、Thl細胞、Th2細胞、Tc細胞、基質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、白細胞、淋巴細胞、樹突細胞、巨噬細胞、肥大細胞和單核細胞。在具體實施方案中，生物樣品包含T-細胞。在給定的實施方案中，生物樣品包含這樣的細胞其處理和展示遞送至細胞的胞質(zhì)溶膠的抗原。有用的生物樣品包含這樣的免疫細胞其響應(yīng)于靶抗原的識別(例如，通過結(jié)合免疫細胞上的受體)而釋放出至少一種細胞因子。釋放的這類細胞因子的實例可以是任意類型的細胞因子，例如但不限于、GM-CSF, IL-I α、IL-I β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7, IL-8, IL-10, IL—12、IFN- α、IFN- β、IFN- γ、MIP-I α、MIP-I β、TGF- β , TNF α 禾口 TNF^。在有些實施方案中，在本文公開的方法中測量的細胞因子的水平是T-細胞細胞因子的水平，例如至少一種下述細胞因子的水平IFN-γ、TGF β , TNF β , IL-10、GM-CSF, IL-3、IL-4和IL-5。在具體實施方案中，所述測量的細胞因子是IFN-γ。通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍已知的任意方法，例如通過免疫測定、放射免疫測定(RIA)、免疫放射測定 (IRMA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)；酶聯(lián)免疫斑點測定；CELISA[細胞的酶聯(lián)免疫吸附測定；RHPA(反向溶血空斑測定)或激酶受體活化測定(KIRA)，可以測量細胞因子的水平，或使用常見的蛋白檢測劑(諸如抗體、人源化的抗體、抗體片段、重組抗體、嵌合抗體、適體、 肽或其類似物)來測量細胞因子蛋白表達的水平。在有些實施方案中，可用于本文公開的方法和組合物中的與LF多肽融合的靶抗原多肽或其片段是病原體靶抗原。表達用于本文所述發(fā)明中的靶抗原的這類病原體的實例包括、但不限于結(jié)核分枝桿菌(TB)、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、HBV、巨細胞病毒、非洲淋巴細胞瘤病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、人皰疹病毒6、人皰疹病毒7、人皰疹病毒8、 天花病毒、水皰性口炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、 戊型肝炎病毒、鼻病毒、冠狀病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、麻疹病毒、多瘤病毒、人乳頭瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯薩奇病毒、登革熱病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病病毒、魯斯肉瘤病毒、黃熱病病毒、埃波拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙熱病毒、東方馬腦炎病毒、日本腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒、Murray山谷熱病毒、西尼羅病毒、立夫特山谷熱病毒、甲型輪狀病毒、乙型輪狀病毒、丙型輪狀病毒、Sindbis病毒、人T-細胞白血病病毒 1型、漢坦病毒、風疹病毒、牛疫、鼻病毒、埃可病毒、乳多泡病毒、棘狀病毒、蟲媒病毒、人免疫缺陷病毒I型或II型和猿免疫缺陷病毒。
在有些實施方案中，與LFn融合的靶抗原多肽或其片段由病原體結(jié)核分枝桿菌表達。例如，與LFn融合且可用于本文公開的方法和組合物中的一種這樣的靶抗原是TB-特異性的抗原，諸如TB 1 (CFP)多肽或其片段或TB2 (ESAT)多肽或其片段。
本文所述的方法和組合物可用于測定受試者中對靶抗原的CMI應(yīng)答，所述受試者例如哺乳動物受試者，諸如人受試者。
本發(fā)明的另一個方面涉及用于測量來自受試者的生物樣品中對靶抗原多肽的細胞介導(dǎo)的免疫(CMI)應(yīng)答的試劑盒，所述試劑盒包含融合多肽，所述融合多肽包含與靶抗原多肽或其片段融合的LF多肽的一部分，該部分缺少LF酶活性，但是足以促進融合多肽跨膜遞送給細胞。
在這樣的實施方案中，所述試劑盒可以包含LF多肽的一部分，該部分是或包括 SEQ ID NO :3的至少60個羧基端氨基酸或其保守置換變體，包括其促進或介導(dǎo)跨膜遞送的保守置換變體?；蛘?，可用于試劑盒中的LF多肽部分是SEQ ID NO :3(在本文中也稱作片段3)的至少80個羧基端氨基酸或至少104個羧基端氨基酸或其保守置換變體，包括其促進或介導(dǎo)跨膜遞送的保守置換變體。在一個實施方案中，LF多肽的一部分包含與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4相對應(yīng)的氨基酸序列或其保守置換變體，包括其促進或介導(dǎo)跨膜遞送的保守置換變體。
通常，本文公開的試劑盒包含融合多肽集合。例如，融合多肽集合可以包含基本上連續(xù)的靶抗原片段，它們一起基本上覆蓋靶抗原多肽的全長。融合多肽集合可以是任意數(shù)目的融合多肽，例如但不限于至少2個或至少2-5個或6-10個或11-15個或16-20個或超過20個融合多肽。在有些實施方案中，試劑盒可以包含與選自下述的不同靶抗原片段融合的至少2個LF多肽的融合多肽集合SEQ ID NO :8至SEQ ID NO :29。在一個替代實施方案中，可用于本文公開的試劑盒中的融合多肽集合包含與至少2個選自下述的不同靶抗原片段融合的炭疽芽孢桿菌LF多肽SEQ ID NO :30至SEQ ID NO :46。
本發(fā)明的另一個方面涉及用于測量來自受試者的生物樣品中對靶抗原多肽的細胞介導(dǎo)的免疫(CMI)應(yīng)答的試劑盒，所述試劑盒包含(a)LF多肽的一部分，該部分缺少LF 酶活性，但是足以促進所述融合多肽向細胞的跨膜遞送；(b)用于將所述LF多肽部分綴合到靶抗原多肽或其片段上的試劑；和(c)基于抗體的檢測工具，其用于檢測由生物樣品釋放的至少一種細胞因子。
本發(fā)明的另一個方面涉及用于測量來自受試者的生物樣品的對TB抗原多肽的細胞介導(dǎo)的免疫(CMI)應(yīng)答的試劑盒，所述試劑盒包含(a)與TB-特異性的抗原多肽融合的 LF多肽的一部分，該部分缺少LF酶活性，但是足以促進所述融合多肽向細胞的跨膜遞送； 和(b)基于抗體的檢測工具，其用于檢測由生物樣品釋放的至少一種細胞因子。
在有些實施方案中，本文公開的試劑盒可以任選地另外包含陽性和/或陰性生物樣品對照，其中陽性樣品會引起對靶抗原的CMI應(yīng)答，陰性生物樣品會引起可忽略的CMI應(yīng)答或不引起CMI應(yīng)答。一種這樣的本文公開的試劑盒包含TB-特異性的抗原多肽，它是SEQ ID NO 7的TB 1 (CFP)多肽或其片段，和/或SEQ ID NO 6的TB2 (ESAT)多肽或其片段。 在有些實施方案中，所述試劑盒可以包含靶抗原融合多肽集合，其中所述靶抗原是TBI (SEQ ID NO 7)的片段，諸如選自 SEQ ID N0:30 至 SEQ ID NO :46 的片段，或 TB2 (SEQ ID NO 6)的片段，諸如選自SEQ ID NO 8至SEQ ID NO 30的片段。


圖1的圖描繪了 PA-介導(dǎo)的Un進入細胞中(經(jīng)由胞吞作用)，并隨后被MHC I類分子呈遞。
圖2A-B顯示了 CMI試驗的圖示，所述CMI試驗在本文中也稱作“LF-CMI試驗”或 "VTI試驗”或“ASACIR TB試劑盒”。圖2A顯示了本文公開的CMI試驗在病原性感染(例如，HBV感染)的最初階段的應(yīng)用，其可以鑒別將變成慢性HBV攜帶者的受試者(即病毒載量保持較高、具有可檢測的病毒表面抗原的受試者)和非慢性攜帶者的受試者(即具有低病毒載量和低病毒表面抗原的受試者)。受試者的辨別能夠?qū)崿F(xiàn)慢性攜帶者的早期治療和預(yù)防肝病的治療策略。圖2B顯示了用于區(qū)別對下述受試者的靶抗原的CMI應(yīng)答的簡圖慢性攜帶者受試者，和非慢性攜帶者受試者。慢性攜帶者具有針對靶抗原的獨特的或特有的細胞因子特性，而非慢性攜帶者不具有相同的細胞因子特性。
圖3A-3B顯示了使用海口結(jié)核中心(Haikou TB center) 77個樣品進行的 QuantiFERON TB Gold(QTG)和ASACIR TB(AT)試劑盒刺激物的對比。圖3A顯示了在18小時內(nèi)分別用QTG和AT刺激物刺激的、從?？诮Y(jié)核中心得到的77個新鮮的血液樣品。使用 QFT E LISA平板，測試了 IFNy水平。QTG和AT之間的匹配率是 90% (精確地，89. 6%)。 圖3B的表顯示了使用?？诮Y(jié)核中心77個樣品進行的QuantiFERON TB Gold和ASACIR TB 試劑盒刺激物的對比。
圖4的表顯示了來自?？诮Y(jié)核中心的樣品的結(jié)果，分別使用QTG和AT刺激物，證實了測試的共77個結(jié)核中心病例中的8個表現(xiàn)出不同的應(yīng)答。
圖5A-5C顯示了圖4所示的8個病例的使用TBI (CFP)和TB2 (ESAT)的蛋白印跡分析。圖5A顯示了含有TBI、TB2和TB1+TB2蛋白的陽性對照樣品的SDS-PAGE。圖5B顯示了使用在1 100稀釋度的第一抗體，血漿樣品(在PBS刺激以后)的蛋白印跡分析； 將抗-人-IgG-HRP用作在1 1000稀釋度的第二抗體。圖5C顯示了與圖5B所示相同的膜，其中用在1 1000稀釋度的抗-his抗體成帶(strip)和探測，將抗-小鼠-AP用作在 1 1000稀釋度的第二抗體。在每個孔中裝載6ug CFP和ESAT (各自)。在GMP環(huán)境下生產(chǎn)蛋白。在每個泳道中顯示了 M 標志物；泳道1 樣品T0602-2，TB Gold陽性(0. 35IU/ ml)，但是LF-CMI 陰性(0. 30IU/ml)；泳道 2 樣品 T0604-3，TB Gold 陽性(0. 53IU/ml)，但是 LF-CMI 陰性(0. 22IU/ml)；泳道 3 樣品 T0606_2，TB Gold 陰性(-0. 01IU/ml)，但是 LF-CMI 陽性(0. 70IU/ml)；泳道 4 樣品 T0613-3, TB Gold 陽性(2. 64IU/ml)，但是 LF-CMI 陰性 (0. 30IU/ml)；泳道 5 樣品 T0613-4，TB Gold 陽性(0. 84IU/ml)，但是LF-CMI 陰性(0. 20IU/ ml)；泳道6 樣品 T0616-2，TB Gold 陰性(0. 00IU/ml)，但是LF-CMI 陽性(3. 09IU/ml)；泳道 7 樣品 T0619-1, TB Gold 陽性(5. 48IU/ml)，但是 LF-CMI 陰性(0. 20IU/ml)；泳道 8 樣品 T0620-2,TB Gold 陽性(3. 17IU/ml)，但是LF-CMI 陰性(0. 29IU/ml)；泳道9 樣品 T0604-5， TB Gold(0IU/ml)和 LF-CMI 陰性(0. 04IU/ml)；泳道 10 樣品 T0604-2，TB Gold(4. 99IU/ ml)禾口 LF-CMI 陽性 QlU/ml)。
圖6顯示了使用海南省立醫(yī)院(Hainan Provincial Hospital)病例40個樣品進行的QuantiFERON TB Gold(QTB)和ASACIR TB (TB)試劑盒刺激物的對比。在18小時內(nèi)，分別用QTG和AT刺激物刺激從海南省立醫(yī)院得到的40個新鮮的血液樣品。使用QFT E LISA 平板測試了 IFNy水平。使用QTG刺激物，40個病例中的20個表現(xiàn)為陰性，但是，使用AT 刺激物，全部都是陽性，這通過蛋白印跡分析測得。
圖7顯示了來自海南省立醫(yī)院的共40個病例中的20個的表，它顯示了分別使用 QTG和AT刺激物的不同應(yīng)答。
圖8A-8B顯示了圖7所示的20個病例的樣品1_10的使用GMP TBI (CFP)和 TB2 (ESAT)的蛋白印跡分析。圖8A顯示了血漿樣品(使用PBS刺激)的蛋白印跡分析，其中在1 100稀釋度使用第一抗體；使用抗-人-IgG-HRP作為在1 1000稀釋度的第二抗體。 圖8B顯示了與圖8A所示相同的膜，其中用在1 1000稀釋度的抗-his抗體成帶(strip) 和探測，將抗-小鼠-AP用作在1 1000稀釋度的第二抗體。在每個孔中裝載6ug CFP 和ESAT(各自)。在GMP環(huán)境下生產(chǎn)蛋白。在每個泳道中顯示了 M:標志物；泳道1:樣品 T0612-6,TB Gold 陰性(0. 01IU/ml)，但是LF-CMI 陽性(2. 23IU/ml)；泳道 2 樣品 T0603-7， TB Gold 陰性(0. 17IU/ml)，但是 LF-CMI 陽性(9. llIU/ml)；泳道 3 樣品 T0603-10, TB Gold 陰性(-0. 02IU/ml)，但是 LF-CMI 陽性(3. 99IU/ml)；泳道 4 樣品 T0604-6, TB Gold 陰性(0. 01IU/ml)，但是 LF-CMI 陽性(0. 74IU/ml)；泳道 5 樣品 T0604-7，TB Gold 陰性(-0. 01IU/ml)，但是 LF-CMI 陽性(0. 52IU/ml)；泳道 6 樣品 T0604-8, TB Gold 陰性 (0. 03IU/ml)，但是LF-CMI 陽性(1. 50IU/ml)；泳道 7 樣品 T0604-9，TB Gold 陰性(0. OlIU/ ml)，但是 LF-CMI 陽性(0. 47IU/ml)；泳道 8 樣品 T0604-10, TB Gold 陰性(0. 03IU/ml)， 但是 LF-CMI 陽性(2. 81IU/ml)；泳道 9 樣品 T0616-6, TB Gold 陰性(-0. 01IU/ml)，但是 LF-CMI 陽性(4. 08IU/ml)；泳道 10 樣品 T0616_7，TB Gold 陰性(0. 06IU/ml)，但是 LF-CMI 陽性(2. 12IU/ml)；泳道 11 樣品 T0604-5，TB Gold(0IU/ml)和 LF-CMI 陰性(0. 04IU/ml)； 泳道 12 樣品 T0604-2，TB Gold(4. 99IU/ml)和 LF-CMI 陽性 QlU/ml)。
圖9A-9B顯示了圖7所示的20個病例的樣品11_20的使用GMP TB1 (CFP)和 TB2 (ESAT)的蛋白印跡分析。圖9A顯示了血漿樣品(使用PBS刺激)的蛋白印跡分析，其中在1 100稀釋度使用第一抗體；使用抗-人-IgG-HRP作為在1 1000稀釋度的第二抗體。 圖9B顯示了與圖9A所示相同的膜，其中用在1 1000稀釋度的抗-his抗體成帶(strip) 和探測，將抗-小鼠-AP用作在1 1000稀釋度的第二抗體。在每個孔中裝載6ug CFP 和ESAT(各自)。在GMP環(huán)境下生產(chǎn)蛋白。在每個泳道中顯示了 M:標志物；泳道1 樣品 T0605-5,TB Gold 陰性(0. 00IU/ml)，但是LF-CMI 陽性(1. 69IU/ml)；泳道 2 樣品 T0605-8， TB Gold 陰性(0. 00IU/ml)，但是 LF-CMI 陽性(0. 57IU/ml)；泳道 3 樣品 T0605-10，TB Gold 陰性(-0. 01IU/ml)，但是 LF-CMI 陽性(0. 51IU/ml)；泳道 4 樣品 T0604-6, TB Gold 陰性(-0. 14IU/ml)，但是 LF-CMI 陽性(0. 73IU/ml)；泳道 5 樣品 T0604-7，TB Gold 陰性 (0. 00IU/ml)，但是LF-CMI 陽性(1. 24IU/ml)；泳道 6 樣品 T0612-8，TB Gold 陰性(0. OlIU/ ml)，但是 LF-CMI 陽性(1. 76IU/ml)；泳道 7 樣品 T0612-11，TB Gold 陰性(0. 0IU/ml)， 但是 LF-CMI 陽性(0. 46IU/ml)；泳道 8 樣品 T0612-12，TB Gold 陰性(0. 04IU/ml)，但是 LF-CMI 陽性(4. 49IU/ml)；泳道 9 樣品 T0612_13，TB Gold 陰性(0. 01IU/ml)，但是 LF-CMI 陽性(0. 85IU/ml)；泳道 10 樣品 T0612_14，TB Gold 陰性(-0. 02IU/ml)，但是 LF-CMI 陽性 (1. 17IU/ml)；泳道 11 樣品 T0604-5，TB Gold(0IU/ml)和 LF-CMI 陰性(0. 04IU/ml)；泳道 12 樣品 T0604-2，TB Gold(4. 99IU/ml)和 LF-CMI 陽性 QlU/ml)。
圖10的簡圖總結(jié)了在CMI試驗中執(zhí)行的步驟，稱作“LF-CMI試驗”工作。將生物樣品放在包含LFn-靶抗原(A、B、C代表不同的LFn-靶抗原多肽)的容器中，并溫育足以誘導(dǎo)生物樣品中的細胞的CMI應(yīng)答的時間段，然后分析細胞因子的水平。
圖11的表顯示了本文所述的CMI試驗(在圖11中稱作ASCIR)的對比。LF-CMI 試驗的陽性預(yù)測值(PPV)是96. 2% (PPV = 51/(51+2) = 96. 2% )。因而，LF-CMI試驗具有非常高的陽性預(yù)測值，例如，使用LF-CMI試驗檢測到53個TB陽性樣品，使用TB Gold試驗也檢測到它們中的51個是陽性的。LF-CMI試驗的陰性預(yù)測值(NPV)是100% (NPV = 7/ (0+7) = 100% )。因而，LF-CMI試驗具有非常高的陰性預(yù)測值，例如，使用LF-CMI試驗檢測到7個TB陰性樣品，使用TB Gold試驗也檢測到它們都是陰性的。
圖12A-12C顯示了使用TB培養(yǎng)物或TB涂片進行的LF-CMI或VTI試劑盒(例如， ASCHR試驗)的對比。圖12A顯示了使用VTI試劑盒和TB培養(yǎng)物試驗進行的陽性鑒別的樣品的對比。在測試的21個樣品中，使用VTI試劑盒將20個樣品鑒別為陽性，而使用TB培養(yǎng)物試劑盒僅將7個鑒別為TB陽性。圖12B顯示了使用VTI試劑盒和TB涂片試驗進行的陽性鑒別的樣品的對比。使用TB涂片試劑盒將21個樣品鑒別為TB陽性，使用VTI試劑盒也將其中的20個鑒別為陽性，這表明，VTI試劑盒是靈敏的，且與TB涂片試驗相關(guān)聯(lián)。圖 12C顯示了 TB涂片和TB培養(yǎng)物試驗的對比。在相同的21個樣品中，使用TB涂片試驗將所有21個樣品鑒別為陽性，而使用TB培養(yǎng)物試驗僅將7個鑒別為陽性。在圖12A-12B中使用的所有21個樣品都來自TB涂片陽性樣品。
圖13的框圖顯示了用于評估生物樣品中對靶抗原或靶抗原集合的CMI應(yīng)答的存在的系統(tǒng)的一個實例。
圖14的框圖顯示了在計算機可讀介質(zhì)上的示例性指令，其用于評估生物樣品中對靶抗原或靶抗原集合的陽性或陰性CMI應(yīng)答。
圖15顯示了共82位患者的TB陽性結(jié)果的對比，所述患者來自用皮膚試驗或 ASCIR TB試驗(VTI試劑盒)測試的密切接觸組。使用皮膚試驗，90. 的受試者被測試為陽性(++) (45. 1% )或強陽性(+++) (45. 1% )，然而使用ASCIR TB試驗，僅18. 3%被測試為陽性(++),25.6%被測試為強陽性(+++)。
圖16顯示了共149位患者的TB陽性結(jié)果的對比，所述患者來自用皮膚試驗或 ASCIR TB試驗(VTI試劑盒)測試的高危組(在醫(yī)院工作的受試者)。使用皮膚試驗，共 98. 8%的受試者是TB陽性的，其中62. 8%的受試者被測試為陽性(++) (27.1%)或強陽性(+++) (35. 7% )，且76位受試者具有大于強陽性試驗。與此相比，使用ASCIR TB試驗， 71. 的受試者是陽性的，使用ASCIR TB試驗，11位受試者(7. 4% )測試為陽性(++)，20 位受試者(13.4% )測試為強陽性(+++)，60位受試者具有大于強陽性試驗。
圖17A-17B顯示了共166位受試者的TB陽性結(jié)果的對比，所述受試者來自用皮膚試驗或ASCIR TB試驗(VTI試劑盒)測試的大學(xué)新生體檢。圖17A表明，使用皮膚試驗， 100%的受試者是TB陽性的，其中79. 9%的受試者被測試為陽性(++) (53.6% )或強陽性 (+++) (25. 3%) 0與此相比，使用ASCIR TB試驗，30. 的受試者是陽性的，使用ASCIR TB 試驗，30位受試者(18. 1% )被測試為陽性(++)，14位受試者3% )被測試為強陽性 (+++)。圖17B表明，61. 3%的接受體檢的受試者是皮膚試驗陽性的(PPD+)，38. 7%的受測受試者是皮膚試驗(PDD)陰性的。
圖18的直方圖顯示了用3個不同試驗測試的TB患者的對比涂片試驗、培養(yǎng)物陽性試驗和ASCIR TB試驗。在133位作為TB患者治療的受試者中，52 (39. 1% )位被涂片試驗鑒別為陽性，44(33. 1%)位被培養(yǎng)物試驗鑒別為陽性，102(77%)位被本文公開的ASCIR TB試驗鑒別為陽性。
具體實施方式
本發(fā)明提供了使用體外或離體方案來檢測和監(jiān)測受試者的細胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的試驗。
目前可得到的檢測CMI應(yīng)答的實驗室試驗具有嚴重缺點，特別是當應(yīng)用于臨床場合的大疫苗效能試驗時。這樣的缺點包括生產(chǎn)用于基于肽的CMI試驗的試劑的成本和困難，以及對專門設(shè)備和技術(shù)支持的需要。現(xiàn)有的用于檢測CMI應(yīng)答的方法具有限制，諸如僅在檢測對靶抗原的小區(qū)域的免疫應(yīng)答時是有效的，即僅可以檢測到對在試驗中使用的肽的 CMI應(yīng)答。由于在使比肽更大的靶抗原進入細胞中時遇到的困難，現(xiàn)有的方法通常限于檢測對靶抗原肽的CMI應(yīng)答。也就是說，當前的CMI試驗通常不能檢測對靶抗原多肽(其大于肽)的CMI應(yīng)答。
本發(fā)明至少部分地基于下述發(fā)現(xiàn)，即LF多肽的一部分(諸如LFn多肽或其片段) 可以將融合的靶抗原多肽(諸如完整的全長或非肽靶抗原蛋白)遞送進細胞的胞質(zhì)溶膠中。因此，本發(fā)明提供了使用完整的活細胞來測量細胞介導(dǎo)的免疫(CMI)應(yīng)答的方法，其中將細胞暴露于靶抗原，所述靶抗原結(jié)合在LF多肽(諸如LFn多肽)上，其中所述LF多肽將抗原遞送至細胞的胞質(zhì)溶膠。在細胞已經(jīng)預(yù)先對靶抗原致敏的情況下，所述細胞會釋放出細胞因子，所述細胞因子指示這種預(yù)先的致敏或暴露。這樣，本文描述了通過遞送完整全長抗原或其非肽部分，測量活的完整細胞對靶抗原的CMI應(yīng)答的方法和/或檢測受試者的目標病狀的方法。
因此，且如下面更詳細地討論的，本文所述的方法提供了超過現(xiàn)有的測定CMI應(yīng)答的方法的優(yōu)點。例如，本文所述的方法允許更快速地、可靠地和準確地檢測完整細胞中對靶抗原的CMI應(yīng)答，所述靶抗原不限于更大靶抗原的肽。更具體地，且不希望受理論的約束，目前可得到的檢測CMI應(yīng)答的實驗室試驗具有各種缺點。這樣的試驗包括，例如，淋巴細胞增殖試驗，測量立即的和延遲的超敏反應(yīng)的皮膚試驗，和需要純化用于試驗中的細胞的試驗(例如，在抗原刺激之前，從全血樣品純化淋巴細胞或PMBC)。缺點包括，例如，對能夠進入細胞的胞質(zhì)溶膠中的抗原的大小的相當嚴格的限制，需要裂解細胞才能檢測CMI應(yīng)答?，F(xiàn)有的試驗在測定向病原體的暴露時傾向于做出廣闊的(或?qū)兕惖?診斷，而不具有對靶抗原的變體的特異性。通常，當前的CMI試驗將細胞(在純化它以后)暴露于靶抗原的肽，后者足夠小，能夠進入細胞的胞質(zhì)溶膠中。結(jié)果，這樣的CMI試驗限于檢測僅對該肽的CMI應(yīng)答。通過提供檢測對大(和因此，非肽)靶多肽抗原或全長多肽抗原的CMI應(yīng)答的方法，本發(fā)明克服了該限制。通常，使用ELISA或ELISP0T來檢測對抗原刺激產(chǎn)生應(yīng)答的 T-細胞的數(shù)目，但是準確度或特異性不足以提供關(guān)于所述抗原屬于哪個變體的特異性。
以前使用的CMI試驗(其使用靶抗原的肽)也可能經(jīng)常產(chǎn)生不準確的和不可靠的或不一致的結(jié)果，諸如過高估計診斷準確度所產(chǎn)生的假陰性。作為一個實例，使用靶抗原的肽的CMI試驗不可能表現(xiàn)出對使用的特定肽的CMI應(yīng)答，因為免疫細胞不可能識別使用的特定肽，盡管受試者以前已經(jīng)暴露于整個靶抗原。該情況被視作假陰性。相反，在第二種情況下，如果以前暴露于整個靶抗原的免疫細胞產(chǎn)生針對與使用的特定肽相同的靶抗原部分的應(yīng)答，來自相同靶抗原的不同肽可能導(dǎo)致引起或檢測CMI應(yīng)答。因此，使用靶抗原的肽的 CMI試驗在引起或檢測對靶抗原的CMI應(yīng)答時可以產(chǎn)生相反的結(jié)果，即分別陽性和陰性CMI 應(yīng)答，其中靶抗原的一種肽被免疫細胞識別，靶抗原的另一種肽未被免疫細胞識別。本文所述的方法解決了一個、一些或甚至所有這樣的缺點，這取決于測量CMI應(yīng)答所用的確切實施方案。
本發(fā)明的一個方面提供了用于測量免疫細胞應(yīng)答的方法，所述免疫細胞應(yīng)答例如對靶抗原(諸如來自病原體的靶抗原)的T細胞應(yīng)答。這樣的實施方案可用于開發(fā)所有T 細胞依賴性的疫苗或免疫治療。該策略適用于其中CMI應(yīng)答在疾病的預(yù)防和控制中起重要作用的其它研究領(lǐng)域。
本發(fā)明的一個方面涉及測量完整細胞中對靶抗原的細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法， 所述方法包括用與靶抗原融合的LF多肽的一部分(諸如LFn多肽或其片段)，溫育包含完整細胞的生物樣品。在有些實施方案中，所述靶抗原由病原體表達，例如其中所述病原體是病毒，靶抗原可以是在病毒表面上表達的多肽，諸如外殼蛋白或在病毒內(nèi)部的多肽。與本文所述的方法和組合物特別相關(guān)的靶抗原包括由細胞內(nèi)病原體表達的那些。可以用于本文公開的方法中的一種這樣的病原體靶抗原是TBI (CFP)或TB2 (ESAT)或其片段。
在一個具體實施方案中，測量對靶抗原的細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法包括用 LFn-融合多肽集合溫育包含完整(即活)細胞的生物樣品。在這樣的一個實施方案中， LFn-融合多肽集合可以包含與靶抗原的多個不同的子部分或片段融合的LFn多肽，并共同地且累積地，LFn-融合多肽的靶抗原片段部分基本上覆蓋靶抗原多肽的整個長度。檢測對與LFn多肽融合的靶抗原的子部分或片段的CMI應(yīng)答，具有許多優(yōu)點。例如，它能夠更定性地診斷CMI應(yīng)答，而不是能夠檢測對完整的整個靶抗原的CMI應(yīng)答，使用片段集合能夠?qū)ほ欀?home in on)靶病原體的特定菌株和/或變體。僅作為示例性的實施例，使用HIV作為示例性的病原體，并使用gag作為示例性的靶抗原，可以使用本文公開的方法來屬類地檢測CMI應(yīng)答，其中使用與整個gag多肽靶抗原融合的LFn多肽。如果檢測到CMI應(yīng)答，隨后可以如下測定哪個HIV變體產(chǎn)生CMI應(yīng)答使用LFn融合多肽集合來評估CMI應(yīng)答，所述 LFn融合多肽包含gag多肽的不同部分，例如，對HIV的不同變體或菌株特異性的gag蛋白的特定片段，從而測定涉及HIV的哪個菌株、變體或亞型(即HIV1、HIV2等)。因此，本文公開的方法允許更準確地且更定性地測量對靶抗原的CMI應(yīng)答，其清楚水平允許快速地且容易地區(qū)別病原性菌株、變體和亞型之間的差異。
另外，測量對LF-多肽集合(例如，本文公開的Un-融合多肽集合)的CMI應(yīng)答， 可以用于添加CMI應(yīng)答的另外的清楚度和準確度水平，例如以篩選假陽性或不準確的CMI 應(yīng)答。例如，如果檢測到對與LFn多肽融合的整個全長靶抗原的陽性CMI應(yīng)答，可以如下檢查CMI應(yīng)答是否是真陽性或假陽性測定對LFn-融合多肽集合的CMI應(yīng)答，所述LFn-融合多肽集合包含靶抗原的多個片段，所述片段共同地跨靶抗原的基本上整個區(qū)域。如果 LFn-融合多肽集合的所有LFn-融合多肽產(chǎn)生陽性CMI反應(yīng)，對與LFn多肽融合的整個全長靶抗原的陽性CMI反應(yīng)可能是假陽性，其理論基礎(chǔ)是，通常不會針對靶抗原的每個部分產(chǎn)生免疫應(yīng)答。但是，如果僅僅一些(例如大致約至少約10%，或至少約20%，或至少約30%，或至少約40%，或超過40%但是小于100% ) LFn-融合多肽集合產(chǎn)生陽性CMI反應(yīng)， 對與LFn多肽融合的整個全長靶抗原的陽性CMI反應(yīng)可能是真陽性，這基于相同的理論，即通常不會針對靶抗原的每個部分產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
以另一種方式來闡述，并使用TBl作為例證性實施例，如果檢測到對LFn融合多肽 (其包含TBl抗原，諸如本文公開的SEQ ID NO 7)的CMI應(yīng)答，可以如下測定該TBl完整抗原-誘導(dǎo)的CMI應(yīng)答是否是真陽性(并從而消除它作為假陽性)檢測對LFn-融合多肽集合的CMI應(yīng)答，所述LFn-融合多肽包含TBl部分。例如，這樣的LFn-融合多肽集合可以包含TBl靶抗原的多個片段，所述片段共同地跨TBl靶抗原的基本上整個區(qū)域。跨TBl的這樣的LFn-融合多肽集合的一個實例可以包含與LFn多肽或其片段融合的TBl片段(諸如本文公開的SEQ ID N0:30至SEQ ID NO :46)，以建立17個TB 1片段LFn-融合多肽的集合。如果該集合的所有17個TBl片段Un-融合多肽產(chǎn)生陽性CMI反應(yīng)，對與LFn多肽融合的SEQ ID NO 7的全長TBl靶抗原的陽性CMI反應(yīng)可能是假陽性。但是，如果TBl片段LFn-融合多肽集合中的僅僅一些(例如17個TBl片段LFn-融合多肽集合中的2個或 3個或4個或5個或6個或7個或8個或多達15個)產(chǎn)生陽性CMI反應(yīng)，對與LFn多肽融合的SEQ ID NO :7的全長TBl靶抗原的陽性CMI反應(yīng)可能是真陽性?；旧细采w靶抗原的整個長度的融合多肽集合可以是至少2個不同的多肽，最多任意數(shù)目的不同的LF多肽-融合多肽，例如，至少2個不同的多肽，或2-5個或5-10個或11-15個或16-20個或更多個不同的Un-融合多肽。
此外，本發(fā)明可用作表位作圖的高處理量方法。例如，通過測量對Un-融合多肽集合的CMI應(yīng)答，所述LFn-融合多肽包含靶抗原的多個不同的子部分或片段，可以鑒別靶抗原的哪個子部分或片段產(chǎn)生強CMI應(yīng)答，并從而繪制引起強CMI應(yīng)答的靶抗原的表位的圖譜。這樣的表位作圖可用于鑒別用于疫苗開發(fā)的靶抗原區(qū)域，或者它們在針對靶抗原的高度特異性的且準確的診斷性CMI試驗中的應(yīng)用。
本文所述的方法也可以適合診斷和/或監(jiān)測涉及不適當?shù)幕虿怀浞值拿庖吖δ艿募膊』蛘系K。例如，本文所述的方法可以用于監(jiān)測或診斷自身免疫病，其中使用自身抗原作為與LF多肽融合的靶抗原。對這樣的靶抗原的CMI應(yīng)答的檢測，指示受試者已經(jīng)產(chǎn)生或正在維持對自身抗原的細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。這類試驗受益于不依賴于產(chǎn)生的應(yīng)答所針對的具體表位的知識。類似的方案可以用于診斷或監(jiān)測炎性疾病。所述方法也可以適合預(yù)測給定的個體是否是治療疫苗(例如，用于引起針對腫瘤細胞的免疫應(yīng)答的癌癥治療疫苗) 的候選人。
定義
為了方便，在這里收集了在整個申請(包括說明書、實施例和所附的權(quán)利要求書) 中采用的某些術(shù)語。除非另外定義，在本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。
本文使用的術(shù)語“佐劑”表示會增加細胞對靶抗原的抗原應(yīng)答的任意藥劑或?qū)嶓w。
術(shù)語“保護抗原”或“PA”在本文中可互換地用于表示炭疽芽孢桿菌外毒素二分蛋白的一部分，其通過細胞受體結(jié)合到哺乳動物細胞的表面上。術(shù)語“PA”具有它的完整的且有功能的受體結(jié)合位點。美國專利5，591，631和5，677，274(通過引用作為整體并入)描述了這樣的PA融合蛋白其將PA靶向特定細胞，諸如癌細胞和HIV-感染的細胞，使用靶向的細胞上的受體的配體作為融合配偶體。
本文使用的術(shù)語“致死因子”或“LF”泛指二分炭疽芽孢桿菌外毒素的非-PA多肽。野生型的、完整的炭疽芽孢桿菌LF多肽具有在GenBank登錄號M29081 (基因ID No 143143)中所述的氨基酸序列，其對應(yīng)SEQ ID NO :1。SEQ ID NO 1對應(yīng)這樣的LF 所述LF 具有位于它的N-端的殘基1-33處的信號肽。換而言之，未成熟的野生型LF對應(yīng)809氨基酸蛋白，該蛋白包括在N-端處的33氨基酸信號肽。含有以粗體突出顯示的信號肽的未成熟的野生型LF的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)如下
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SILLHGPSKGVELRNDSEGFIHEFGHAVDDYAGYLLDKNQSDLVTNSKKFIDIFKEEGSNLTSYGRTNE A
EFFAEAFRLMHSTDHAERLKVQKNAPKTFQFINDQIKFIINS(SEQ ID NO 1)
未成熟的LF蛋白的切割，會產(chǎn)生長度為776個氨基酸的成熟的野生型LF多肽。成熟的野生型LF多肽(即缺少N-端信號肽)的776個氨基酸多肽序列對應(yīng)下述的SEQ ID NO 2
AGGHGDVGMHVKEKEKNKDENKRKDEERNKTQEEHLKEIMKHIVKIEVKGEEAVKKEAAEKLLEKV
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NDQIKFIINS(SEQ ID NO 2)
術(shù)語“LF多肽”不僅適用于全長野生型LF (具有或沒有信號序列)，而且適用于其片段，所述片段介導(dǎo)融合的或物理結(jié)合的多肽向細胞的細胞內(nèi)遞送。術(shù)語“LF多肽”也包括 LF的保守置換變體，包括介導(dǎo)這種細胞內(nèi)遞送的保守置換變體。
當提及肽時，術(shù)語“置換”表示用氨基酸替換不同的氨基酸部分。置換可以是保守的或非保守的置換，如下文進一步所述。
術(shù)語“LFn多肽”表示這樣的炭疽芽孢桿菌LF的N-端片段其沒有表現(xiàn)出鋅金屬蛋白酶活性，也不會滅活促分裂原活化的激酶活性，或二者兼有，但是介導(dǎo)融合多肽的細胞內(nèi)或跨膜遞送。因而，Un多肽是LF多肽的子集。預(yù)見到本文所述的每個方法和/或試劑盒使用一種或多種LF多肽，所述LF多肽與靶抗原物理結(jié)合，例如融合。在本文中定義和描述的Un多肽是優(yōu)選的。在一個方面，“Un多肽”包括SEQ ID NO :3，其對應(yīng)288氨基酸未成熟的LFn蛋白；該LFn蛋白是“未成熟的”，因為它包括位于N-端的殘基1_33處的信號肽。換而言之，未成熟的LFn對應(yīng)288氨基酸蛋白，其包括在N-端處的33氨基酸信號肽。 SEQ ID NO 3的未成熟的Un蛋白的信號肽切割，會產(chǎn)生長度為255個氨基酸的成熟的LFn 多肽。應(yīng)當強調(diào)的是，為了本文所述的方法和組合物的目的，LF和/或Un多肽可以包括或缺少信號肽——也就是說，預(yù)期信號肽的存在或缺失不會影響LF多肽在本文所述的方法中作為跨膜運輸促進劑的活性。含有以粗體突出顯示的信號肽的未成熟的LFn的氨基酸序列(SEQ ID NO 3)如下
MNIKKEFIKVISMSCLVTAITLSGPVFIPLVQG AGGHGDVGMHVKEKEKNKDENKRKDEERNKTQE
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YMDKFNEQEINLS(SEQ ID NO 3)
成熟的LFn多肽(其缺少N-端信號肽)的多肽序列的長度是255個氨基酸，并對應(yīng)下述的SEQ ID NO 4
AGGHGDVGMHVKEKEKNKDENKRKDEERNKTQEEHLKEIMKHIVKIEVKGEEAVKKEAAEKLLEKV
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在“LFn的功能片段”的背景下使用的術(shù)語“功能片段”表示這樣的LFn多肽的片段其介導(dǎo)、實現(xiàn)或促進跨完整的活細胞的膜的抗原運輸。這樣的LFn多肽片段的一個實例是Un的104氨基酸C-端片段，其對應(yīng)下述的SEQ ID NO :5 (該序列也在美國專利申請 10/473190中公開為SEQ ID NO :3，所述美國專利申請通過引用并入本文)
GKILSRDILSKINQPYQKFLDVLNTIKNASDSDGQDLLFTNQLKEHPTDFSVEFLEQNSNEVQEVFAKA F
AYYIEPQHRDVLQLYAPEAFNYMDKFNEQEINLS(SEQ ID NO 5)
本文使用的術(shù)語“LFn多肽”包括本文所述的每種“未成熟的”LFn和“成熟的”LFn 分子、以及它們的介導(dǎo)、實現(xiàn)或促進物理結(jié)合的(例如融合的)多肽跨完整的活細胞的膜的運輸?shù)钠巍⒆凅w(包括保守置換變體)和衍生物。特別地預(yù)見到用于本文所述的方法、 組合物和試劑盒中的LFn多肽的其它片段包括這樣的片段所述片段包含SEQ ID NO 3的 C-端60、80、90、100或104個氨基酸或其保守置換變體，或任選地基本上由它們組成，所述保守置換變體介導(dǎo)、實現(xiàn)或促進物理結(jié)合的(例如融合的)多肽跨活細胞的完整膜的轉(zhuǎn)移。
作為在本文中使用的術(shù)語，靶抗原的“片段”的長度是至少15個氨基酸，且可以是，例如，至少16、至少17、至少18、至少19、至少20或至少25個氨基酸或更大。因而，在例如制備靶抗原片段-LF多肽集合的情況下，靶抗原片段的長度是至少15個氨基酸。
術(shù)語“細胞毒性的T淋巴細胞”或“CTL”表示誘導(dǎo)靶向的細胞的細胞凋亡的淋巴細胞。經(jīng)由TCR與在靶細胞表面上的加工過的抗原(Ag)的相互作用，CTL與靶細胞形成抗原特異性的綴合物，導(dǎo)致靶向的細胞的細胞凋亡。凋亡小體被巨噬細胞消除。術(shù)語“CTL應(yīng)答”用于表示由CTL細胞介導(dǎo)的初次免疫應(yīng)答。
本文使用的術(shù)語“細胞介導(dǎo)的免疫”或“CMI”表示這樣的免疫應(yīng)答其不涉及抗體或補體，但是涉及巨噬細胞、天然殺傷細胞(NK)、抗原特異性的細胞毒性的T-淋巴細胞 (T-細胞)的活化以及響應(yīng)于靶抗原的各種細胞因子的釋放。換而言之，CMI表示這樣的免疫細胞(諸如T細胞和淋巴細胞)其結(jié)合到展示抗原的其它細胞(諸如抗原呈遞細胞 (APS))的表面上，并觸發(fā)應(yīng)答。所述應(yīng)答可能涉及其它淋巴細胞和/或任意其它白血細胞 (白細胞)以及細胞因子的釋放。因此，細胞-介導(dǎo)的免疫(CMI)是這樣的免疫應(yīng)答其不涉及抗體，但是涉及巨噬細胞和NK-細胞的活化、抗原特異性的細胞毒性的T-淋巴細胞的生產(chǎn)以及響應(yīng)于抗原的各種細胞因子的釋放。細胞免疫通過下述機理保護身體(i)活化抗原特異性的細胞毒性的T-淋巴細胞(CTL)，其能夠破壞在它們的表面上展示外來抗原的表位的身體細胞，諸如病毒感染的細胞、具有細胞內(nèi)細菌的細胞和展示腫瘤抗原的癌細胞；(2)活化巨噬細胞和NK細胞，使它們能夠破壞細胞內(nèi)病原體；和(3)刺激細胞分泌多種細胞因子，所述細胞因子會影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答和先天性免疫應(yīng)答所涉及的其它細胞的功能。不希望受理論的約束，且作為背景，將免疫系統(tǒng)分成2個分支體液免疫，它的免疫保護功能存在于體液(無細胞的體液或血清)中；和細胞免疫，它的免疫保護功能與細胞有關(guān)。
本文使用的術(shù)語“免疫細胞”表示可以響應(yīng)于直接或間接的抗原刺激而釋放出細胞因子的任意細胞。術(shù)語“免疫細胞”在本文中包括淋巴細胞，包括天然殺傷(NK)細胞、T-細胞(CD4+和/或CD8+細胞)、B-細胞、巨噬細胞和單核細胞、Th細胞；Thl細胞；Th2 細胞；Tc細胞；基質(zhì)細胞；內(nèi)皮細胞；白細胞；樹突細胞；巨噬細胞；肥大細胞和單核細胞， 以及能夠響應(yīng)于直接或間接的抗原刺激而生產(chǎn)細胞因子分子的任意其它細胞。通常，免疫細胞是淋巴細胞，例如T-細胞淋巴細胞。
本文使用的術(shù)語“細胞因子”與術(shù)語“效應(yīng)分子”互換使用，并表示免疫細胞響應(yīng)于抗原刺激而釋放出的分子。這樣的細胞因子的實例包括，但不限于GM-CSF ;IL_1 α ； IL-I β ；IL-2 ；IL-3 ；IL-4 ；IL-5 ；IL-6 ；IL-7 ；IL-8 ；IL-10 ；IL-12 ；IFN-α ； IFN-β ； IFN-Y ；MIP-I α ；MIP-I β ；TGF-β ；TNF α 禾口 TNF3。
本文使用的術(shù)語“復(fù)合物”表示2個或更多個分子的集合，其中它們通過除了共價相互作用以外的方式在空間上連接；例如，它們可以通過靜電相互作用(諸如范德華力等) 來連接。
本文使用的術(shù)語“融合蛋白，，表示通過肽鍵相連的2個或更多個蛋白的重組蛋白。 可以如下生產(chǎn)融合蛋白例如，將編碼一種蛋白的核酸序列連接到編碼另一種蛋白的核酸序列上，使得它們構(gòu)成單個開放讀碼框，該開放讀碼框可以翻譯成包含所有目標蛋白的單個多肽。
術(shù)語“轉(zhuǎn)移進細胞”表示，將部分(諸如靶抗原和任選的LFn多肽、LFn同源物或模仿物或它們的變體)從在細胞外的位置跨過質(zhì)膜移動至完整活細胞的內(nèi)部。
術(shù)語“轉(zhuǎn)導(dǎo)”表示將核酸導(dǎo)入細胞中的任意方法，例如，通過轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、電穿孔、 基因槍法、被動吸收、脂質(zhì)核酸復(fù)合物、病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)、注射、接觸裸DNA等。
術(shù)語“體內(nèi)”表示在動物中發(fā)生的試驗或過程。
術(shù)語“離體”表示使用在體外的具有完整膜的活細胞進行的試驗，所述活細胞例如外植體、培養(yǎng)的細胞(包括原代細胞和細胞系、轉(zhuǎn)化的細胞系)和提取的組織或細胞(包括血細胞)以及其它。
本文所述的試驗也可以表征為“體外”試驗，因為它們是在受試者體外的容器中進行。應(yīng)當理解，在術(shù)語“體外”被用于或可能用于本文所述的試驗的情況下，CMI試驗需要完整的活細胞，包括活的免疫細胞。樣品也需要能夠加工和展示靶抗原的細胞。盡管CMI試驗本身需要完整的活細胞，應(yīng)當理解，在這樣的細胞已經(jīng)接觸LF多肽-靶抗原融合體或復(fù)合物以后，通過不一定需要完整細胞的體外方案，可以測量由這些細胞釋放的細胞因子的類型和量。
術(shù)語“哺乳動物”意圖包括包括單個“哺乳動物”和多個“哺乳動物”、且包括但不限于人類；靈長類動物諸如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科動物諸如狗和狼；貓科動物諸如貓、 獅子和虎；馬科動物諸如馬、驢和斑馬、食物動物諸如牛、豬和綿羊；有蹄動物諸如鹿和長頸鹿；嚙齒類動物諸如小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠；和熊。在有些實施方案中、哺乳動物是人。
本文使用的術(shù)語“受試者”表示這樣的任意動物其中診斷CMI應(yīng)答是有用的，例如用于診斷受試者是否具有疾病或病癥，或可能發(fā)展疾病或病癥。所述受試者可以是哺乳動物例如人，或可以是野生動物、馴養(yǎng)動物、商業(yè)動物或伴侶動物。盡管在本發(fā)明的一個實施方案中，預(yù)見到CMI試驗適用于在人類中的診斷用途，它也適用于所有脊椎動物，例如哺乳動物(諸如非人靈長類動物(具體地，高等靈長類動物)、綿羊、狗、嚙齒動物(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、豬、貓、兔、牛)以及非哺乳動物(諸如雞)、兩棲動物、爬行動物等。在一個實施方案中，所述受試者是人。在另一個實施方案中，所述受試者是野生動物，例如鳥， 諸如用于診斷禽流感。在有些實施方案中，所述受試者是作為疾病模型的實驗動物或動物代用品。所述受試者可以是需要獸醫(yī)治療的受試者，包括治療伴侶動物(諸如狗和貓)和馴養(yǎng)動物(諸如馬、矮馬、驢、騾、美洲駝、羊駝、豬、牛和綿羊)或動物園動物(諸如靈長類動物、貓科動物、犬科動物、牛科動物和有蹄動物)或家畜動物(諸如豬、牛和綿羊)，其中對病原體的CMI應(yīng)答的檢測可用于預(yù)防疾病和/或控制疾病的傳播，所述疾病例如SIV、STLU SFV，或在家畜的情況下，口蹄疫和其它這樣的疾病。
術(shù)語“生物樣品”表示生物組織、細胞或流體的樣品，其處于健康和/或病理狀態(tài)， 含有本文所述的免疫細胞以及能夠加工和展示細胞內(nèi)多肽抗原的細胞。這樣的樣品包括、 但不限于全血、培養(yǎng)的細胞、原代細胞制品、痰、羊水、組織或細針吸活組織檢查樣品、腹膜液和胸膜液以及其它。在有些實施方案中，生物樣品取自人患者，在替代實施方案中，生物樣品取自任意哺乳動物諸如嚙齒類動物、疾病的動物模型、商業(yè)動物、伴侶動物、狗、貓、綿羊、牛和豬等。生物樣品可以在必要時預(yù)處理用于保藏或儲存，如果需要，在適當?shù)木彌_液中稀釋或濃縮。但是，樣品必須含有活細胞?？梢圆捎迷S多標準的水性緩沖液中的任一種， 所述緩沖液采用生理PH多種緩沖劑(諸如磷酸鹽、Tris等)之一，處于生理pH。在某些情況下，在用于本文公開的試驗之前，可以將生物樣品儲存?zhèn)溆谩＿@樣的儲存可以是在+4 °C或冷凍，例如在_20°C或_80°C，條件是，使用合適的冷凍保存劑來維持細胞生存(在細胞解凍以后)。
術(shù)語“組織”表示類似地專門化的細胞的群或?qū)?，所述細胞一起?zhí)行某些特殊功能。術(shù)語“組織-特異性的”表示來自特定組織的細胞源。術(shù)語“組織”意圖包括，血液、血液制品諸如血漿和血清、骨、關(guān)節(jié)、肌肉、平滑肌和器官。
本文使用的術(shù)語“病原體”表示在受試者中造成疾病或障礙的生物體或分子。例如，病原體包括、但不限于病毒、真菌、細菌、寄生物和其它傳染性的生物體或源自它的分子，以及在分類藻類、真菌、酵母和原生動物等內(nèi)的分類學(xué)上有關(guān)的大型生物體。
“癌細胞”表示癌性的、癌前的或轉(zhuǎn)化的細胞，無論是在體內(nèi)、離體還是在組織培養(yǎng)物中，其具有自發(fā)的或誘導(dǎo)的表型變化，所述變化不一定涉及新遺傳物質(zhì)的攝入。盡管轉(zhuǎn)化可以源自轉(zhuǎn)化病毒的感染和新基因組核酸的摻入或外源性核酸的攝入，它也可以自發(fā)地產(chǎn)生，或在暴露于致癌物以后產(chǎn)生，由此突變內(nèi)源基因。轉(zhuǎn)化/癌癥與合適的動物宿主(諸如裸鼠)中的下述現(xiàn)象有關(guān)例如，形態(tài)學(xué)變化、細胞的永生化、異常的生長控制、灶性形成、 錨著非依賴性、惡性腫瘤、生長的接觸抑制和密度限制的喪失、生長因子或血清非依賴性、 腫瘤特異性的標志物、侵襲力或轉(zhuǎn)移和腫瘤生長(也參見Freshney，Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique (1994 年第 3 版))。
術(shù)語“野生型”分別表示天然存在的、正常的編碼蛋白的多核苷酸序列或其一部分、或蛋白序列或其一部分，它通常存在于體內(nèi)。因此，如本文公開的，Un蛋白的野生型氨基酸序列對應(yīng)SEQ ID N0:3(具有信號肽)和/或SEQ ID NO 4 (沒有信號肽)，其對應(yīng)致死因子(LF)的N-端片段。
術(shù)語“突變體”表示這樣的生物體或細胞它的遺傳物質(zhì)具有任何變化，尤其是相對于野生型多核苷酸序列的變化(即、刪除、置換、添加或改變)，或相對于野生型蛋白序列的任何變化。術(shù)語“變體”與“突變體”互換使用。盡管經(jīng)常假定遺傳物質(zhì)的變化會導(dǎo)致蛋白的功能的變化，術(shù)語“突變體”和“變體”表示野生型蛋白的序列的變化，無論該變化是否改變蛋白的功能(例如，增加、減少、賦予新功能)，或該變化是否對蛋白的功能沒有影響(例如，突變或變異是沉默的)。
術(shù)語“多肽”和“蛋白”互換地用于表示通過肽鍵相連的氨基酸殘基的聚合物，且對于要求保護的發(fā)明的目的，具有至少15個氨基酸的最小長度。寡肽、寡聚體、多聚體等通常表示更長的氨基酸鏈，且也由通過肽鍵相連的線性排列的氨基酸組成，無論是生物地、重組地還是合成地生產(chǎn)的，也無論是由天然存在的氨基酸還是由非天然存在的氨基酸組成，都包括在該定義中。該定義包括全長蛋白和其片段。該術(shù)語也包括多肽的共翻譯的修飾(例如，信號肽切割)和翻譯后的修飾，例如，二硫鍵形成、糖基化、乙酰化、磷酸化、蛋白水解性裂解(例如，由弗林蛋白酶或金屬蛋白酶切割)等。此外，本文使用的“多肽”表示這樣的蛋白其包括對天然序列的修飾，諸如刪除、添加和置換(通常在性質(zhì)上是保守的，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的)，只要所述蛋白維持希望的活性。這些修飾可以是故意的(如通過定點誘變)，或可以是意外的，諸如通過生產(chǎn)蛋白的宿主的突變，或由PCR擴增或其它重組DNA 方法引起的錯誤。對于本文所述的方法、試劑盒和組合物，術(shù)語“肽”表示肽連接的氨基酸序列，其長度含有至少2個且小于15個氨基酸。
應(yīng)當理解，蛋白或多肽經(jīng)常含有除了通常稱作20種天然存在氨基酸的20種氨基酸以外的氨基酸，可以修飾給定的多肽中的許多氨基酸(包括末端氨基酸)，無論是通過天然的過程諸如糖基化和其它翻譯后修飾，還是通過本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)修飾技術(shù)。可以存在于本發(fā)明肽中的已知修飾包括、但不限于乙酰化、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價連接、血紅素部分的共價連接、多核苷酸或多核苷酸衍生物的共價連接、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價連接、磷脂酰肌醇的共價連接、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、共價交聯(lián)的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸鹽的形成、制劑、Y-羧基化、糖化、糖基化、GPI錨點形成、 羥基化、碘化、甲基化、肉豆蔻?；?、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、轉(zhuǎn)移-RNA介導(dǎo)的氨基酸向蛋白的添加諸如精氨?；头核鼗?br> 術(shù)語“同源性”、“同一性”和“相似性”表示2個多肽之間或2個最佳比對的核酸分子之間的序列相似性程度。同源性和同一性各自可以如下測定對比每個序列中的位置，所述位置可以為了對比目的而比對。例如，可以基于使用處于默認設(shè)置的標準同源性軟件，諸如BLAST2.2. 14版。當對比的序列中的等同位置被相同堿基或氨基酸占據(jù)時，則所述分子在該位置是同一的；當?shù)韧恢帽活愃瓢被釟埢紦?jù)時(例如，在空間和/或電子性質(zhì)方面類似，例如保守氨基酸置換)，則所述分子可以稱作在該位置是同源的(相似的)。同源性 /相似性或同一性的百分比表述表示在對比的序列各自共有的位置處類似或同一氨基酸的數(shù)目的函數(shù)。“無關(guān)的”序列與本文公開的序列具有小于40%同一性，盡管優(yōu)選地小于25% 同一性。
本文使用的術(shù)語“同源的”或“同源物”互換使用，且當用于描述多核苷酸或多肽時，表示2個多核苷酸或多肽或其指定的序列在最佳比對和對比時(例如使用BLAST 2. 2. 14版，使用默認參數(shù)進行比對(參見本文))在至少70%的核苷酸、通常約75% -99% 和更優(yōu)選至少約98-99%的核苷酸中是同一的，并具有適當?shù)暮塑账岵迦牖騽h除或氨基酸插入或刪除。本文使用的術(shù)語“同系物”或“同源的”也表示關(guān)于結(jié)構(gòu)和/或功能的同源性。 也就是說，執(zhí)行與另一個物種中的給定多肽相同的功能的多肽，可以視作給定多肽的同系物。技術(shù)人員可以容易地確定基因或多肽的同系物的測定。
為了序列對比，通常，一個序列作為參照序列，將測試序列與其對比。當使用序列對比算法時，將測試序列和參照序列輸入計算機中，如果必要，指定子序列坐標，并指定序列算法程序參數(shù)。然后，序列對比算法基于指定的程序參數(shù)，計算測試序列相對于參照序列的序列同一性百分比。
在必要時或希望時，可以進行對比的序列的最佳比對，例如，通過Smi th和 Waterman的局部同源性算法(Adv. Appl. Math. 2 :482 (1981)，它通過引用并入本文)， 通過 Needleman 和 Wunsch 的同源性比對算法(J. Mol. Biol. 48 :443-53 (1970)，它通過引用并入本文)，通過Pearson和Lipman的搜索相似性方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:^44-48(1988)，它通過引用并入本文)，通過這些算法的計算機化的執(zhí)行(例如、在 Wisconsin Genetics 軟件包中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group, 575Science Dr.，Madison, Wis·)，或通過目檢(通常參見 Ausubel 等人 (編)，Current Protocols in Molecular Biology,第 4 版，John Wiley and Sons, New York (1999))ο
有用的算法的一個實例是PILEUP。PILEUP采用漸進的逐對序列比對，產(chǎn)生來自一組相關(guān)序列的多重序列比對，以顯示序列同一性百分比。它也繪出一個樹(tree)或枝叉圖 (dendogram)，顯示用來產(chǎn)生所述比對的成簇關(guān)系。PILEUP采用！^ng和Doolittle的漸進比對法的簡化方法(J. Mol. Evol. 25 :351-60(1987)，它通過引用并入本文)。所用的方法類似于 Higgins 和 Sharp 描述的方法(Comput. Appl. Biosci. 5 151-53 (1989)，它通過引用并入本文)。該程序可以比對最多達300個序列，每個序列的最大長度為5，000個核苷酸或氨基酸。多重序列對比法從兩個最相似的序列的逐對比對開始，產(chǎn)生一組(cluster)兩個比對的序列。然后將該組與下一個最相關(guān)的序列或下一組比對的序列進行比對。通過簡單地延伸兩個單獨序列的逐對比對，將兩組序列進行比對。通過一系列漸進的逐對比對，得到最后的比對。通過指定序列對比區(qū)的特定序列及其氨基酸或核苷酸坐標，并且指定該程序的參數(shù)，運行該程序。例如，可以將參照序列與其它測試序列對比，采用以下參數(shù)，測定序列同一性百分比關(guān)系默認間隙加權(quán)值(3. 00)、默認間隙長度加權(quán)值(0. 10)和加權(quán)的末端間隙。
適用于測定序列同一性和序列相似性百分比的算法的另一實例是BLAST算法，其在Altschul等人(J. Mol. Biol. 215 :403-410 (1990)，它通過引用并入本文)中有描述。(也參見 Zhang 等人，Nucleic Acid Res. 26 :3986-90(1998) ；Altschul 等人，Nucleic Acid Res. 25 :3389-402 (1997)，它們通過引用并入本文)。公眾可從國家生物技術(shù)信息中心互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)址得到進行BLAST分析的軟件。該算法包括，通過在查詢序列中鑒別長度為W的短字 (short words)，首先鑒別高計分序列對(HSP)，當與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字進行比對時，它們或者匹配或者滿足某些陽性值的閾值計分Τ。T稱為相鄰字計分閾值(Altschul等人(1990)，同上)。這些起始的相鄰字命中用作種子，用于起始搜尋，以尋找含所述字命中的更長HSP。然后，只要可以增加累積的比對計分，則所述字命中在兩個方向上沿每個序列延伸。在以下情況下，每個方向上所述字命中的延伸停止由于來自其最大得到的數(shù)值的數(shù)量X，累積的比對計分下降；由于一個或多個負計分的殘基比對的累積，累積計分轉(zhuǎn)為零或零以下；或達到兩個序列之一的末端。BLAST算法的參數(shù)W、T和X決定比對的靈敏度和速度。BLAST程序使用下述默認值字長(W)為11，BL0SUM62計分矩陣(參見HenikofT和 Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10915-9 (1992)，它通過引用并入本文)比對(B) 為50，期望值(E)為10，M = 5，N = -4，并且對比兩條鏈。
除了計算序列同一性百分比外，BLAST算法也進行兩個序列之間相似性的統(tǒng)計學(xué)分析(參見，例如，Karlin和Altschul，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 90 :5873-77 (1993)，它通過引用并入本文)。BLAST算法提供的相似性的一種度量是最小總和概率(P(N))，這提供偶然發(fā)生兩個核苷酸序列或氨基酸序列之間匹配的概率的指標。例如，如果在測試氨基酸與參照氨基酸的對比中，最小總和概率小于約0. 1、更通常小于約0. 01、最通常小于約0. 001， 則認為該氨基酸序列與參照氨基酸序列相似。
本文使用的術(shù)語“序列同一性”是指，2個多核苷酸或氨基酸序列在對比窗內(nèi)是同一的(即，在逐個核苷酸或逐個殘基的基礎(chǔ)上)。術(shù)語“序列同一性百分比1Π下計算在對比窗內(nèi)對比2個最佳比對的序列，測定在兩個序列中存在相同核酸堿基(例如、A、T.C、G、U 或I)或氨基酸殘基的位置的數(shù)目，以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以對比窗中的位置總數(shù)(S卩，窗大小)，并將結(jié)果乘以100，得到序列同一性百分比。
本文使用的術(shù)語“變體”表示這樣的多肽或核酸其與天然存在的多肽或核酸相差一個或多個氨基酸或核酸刪除、添加、置換或側(cè)鏈修飾，仍然保留天然存在的分子的一種或多種特定功能或生物活性。氨基酸置換包含這樣的改變其中將一個氨基酸替換為不同的天然存在的或非常規(guī)的氨基酸殘基。這樣的置換可以歸類為“保守的”，在該情況下，在多肽中包含的氨基酸殘基被替換為在極性、側(cè)鏈功能或大小方面具有類似特性的另一個天然存在的氨基酸。本文所述的變體包括的置換也可以是“非保守的”，其中在肽中存在的氨基酸殘基被置換為具有不同性質(zhì)的氨基酸(例如，用丙氨酸置換帶電荷的或疏水的氨基酸)，或者，其中天然存在的氨基酸被置換為非常規(guī)氨基酸。當關(guān)于多核苷酸或多肽來使用時，術(shù)語 “變體”也包括，分別與參照多核苷酸或多肽相比(例如，與野生型多核苷酸或多肽相比)， 一級、二級或三級結(jié)構(gòu)的變異。Un多肽的“變體”表示在結(jié)構(gòu)和功能方面與SEQ ID NO 3 的多肽基本上類似的分子，其中所述功能是介導(dǎo)、實現(xiàn)或促進結(jié)合的或融合的多肽跨來自受試者的活細胞的細胞膜的運輸?shù)哪芰ΑＴ谟行嵤┓桨钢?，SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4的變體是本文公開的SEQ ID NO :3或4的片段，諸如SEQ ID NO :5。
在下述情況下，稱一個分子與另一個分子“基本上類似”兩個分子具有基本上類似的結(jié)構(gòu)(即，通過設(shè)定在默認參數(shù)的BLASTp比對測得，它們的氨基酸序列具有至少50% 相似性)，且在至少一種有關(guān)的功能方面基本上類似(在這里，例如，在介導(dǎo)、實現(xiàn)或促進結(jié)合的或融合的多肽跨完整活細胞的膜的運輸中，具有至少50%活性)。通過本領(lǐng)域已知的方法，可以測量跨膜運輸。為了避免任何混淆，優(yōu)選的方法是在Kushner等人，2003，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 :6652-6657 中描述的方法。
當提及LFn的變體或LFn的功能衍生物來使用時，術(shù)語與由SEQ ID NO 3編碼的 LFn蛋白相比“基本上類似”是指，特定主題序列(例如，LFn片段或LFn變體或LFn衍生序列)與由SEQ ID NO :3編碼的Un多肽的序列相差相對于SEQ ID NO :3的一個或多個置換、 刪除或添加，但是保留由SEQ ID NO :3的Un蛋白表現(xiàn)出的跨膜運輸促進活性的至少50%， 且優(yōu)選更高，例如至少60%、70%、80%、90%或更高(已經(jīng)公認，LFn不會天然存在——“天然的”或“自然的” LFn序列意圖表示，該序列與在本文中命名為LFn的天然存在的LF多肽的部分是相同的)。在測定多核苷酸序列時，所有能夠編碼基本上類似的氨基酸序列的主題多核苷酸序列，都被視作與參照多核苷酸序列基本上類似，不論密碼子序列中的差異。在下述情況下，核苷酸序列與給定的LFn核酸序列“基本上類似”:(a)所述核苷酸序列與天然 1^11序列的編碼區(qū)雜交，或(b)所述核苷酸序列能夠在中等嚴謹條件下與由SEQ ID N0:1編碼的Un的核苷酸序列雜交，并具有與天然Un蛋白類似的生物活性；或(c)作為遺傳密碼的結(jié)果，所述核苷酸序列相對于在(a)或(b)中定義的核苷酸序列是簡并的。通常，基本上類似的蛋白與天然蛋白的對應(yīng)序列具有大于約80%相似性。
變體可以包括保守或非保守的氨基酸變化，如下所述。多核苷酸變化可以導(dǎo)致由參照序列編碼的多肽的氨基酸置換、添加、刪除、融合和截短。變體也可以包括氨基酸的插入、刪除或置換(包括氨基酸和其它分子的插入和置換)，它們通常不發(fā)生于作為變體基礎(chǔ)的肽序列中，例如但不限于在鳥氨酸的插入，這通常不發(fā)生于人蛋白中?！氨Ｊ匕被嶂脫Q” 源自將一個氨基酸置換為另一個具有類似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)性質(zhì)的氨基酸。提供功能上類似的氨基酸的保守置換表，是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，下面的6個組各自含有彼此為保守置換的氨基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸⑴；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、賴氨酸⑷；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)。(也參見Creighton， Proteins, W. H. Freeman and Company(1984).)
基于肽中要置換的氨基酸的位置，例如如果所述氨基酸是在肽的外表上并暴露于溶劑，或在內(nèi)部且不暴露于溶劑，可以選擇保守氨基酸。這樣的保守氨基酸置換的選擇，屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技能，且描述在，例如Dordo等人，J.Mol Biol, 1999,217, 721-739，和 Taylor 等人，J. Theor. Biol. 119(1986) ；205-218，和 S. French 和 B. Robson, J.Mol. Evol. 19(1983) 171。因此，可以選擇適合在蛋白或肽的外表上的氨基酸(即暴露于溶劑的氨基酸)的保守氨基酸置換。這些置換包括、但不限于下述的用F置換Y，用S或K 置換T，用A置換P，用D或Q置換E，用D或G置換N，用K置換R，用N或A置換G，用S或K 置換T，用N或E置換D，用L或V置換I，用Y置換F，用T或A置換S，用K置換R，用N或 A置換G，用R置換K，用S、K或P置換A。
在替代實施方案中，也可以選擇適合在蛋白或肽的內(nèi)部的氨基酸的保守氨基酸置換。例如，對于在蛋白或肽的內(nèi)部的氨基酸(即所述氨基酸不暴露于溶劑)，可以使用合適的保守置換。例如，可以使用下述的保守置換其中用F置換Y，用A或S置換T，用L或V 置換I，用Y置換W，用L置換M，用D置換N，用A置換G，用A或S置換T，用N置換D，用L 或V置換I，用Y或L置換F，用A或T置換S，和用S、G、T或V置換A。在有些實施方案中， 在術(shù)語“變體”內(nèi)也包括含有非保守氨基酸置換的LF多肽。Un多肽的變體(例如SEQ ID N0:3或4的變體)意在表示在結(jié)構(gòu)(即，通過使用默認參數(shù)的BLASTp分析測得，具有至少50%同源性)和功能(即，在跨膜運輸方面，具有SEQ ID NO 3的多肽的有效性的至少 50% )上與SEQ ID NO :3或4的分子基本上類似的任意分子。
本文使用的術(shù)語“非保守的”表示用一個氨基酸殘基置換具有不同化學(xué)性質(zhì)的不同氨基酸殘基。非保守置換的非限制性實例包括用甘氨酸(G)置換天冬氨酸(D)；用賴氨酸(K)置換天冬酰胺(N)；和用精氨酸(R)置換丙氨酸(A)。
本文使用的術(shù)語“衍生物”表示已經(jīng)化學(xué)修飾的肽，例如通過泛素化、標記、聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)或添加其它分子。當一個分子含有通常不是該分子的一部分的額外化學(xué)部分時，它也是另一個分子的“衍生物”。這樣的部分可以改善分子的溶解度、吸收、生物半衰期等。或者，所述部分會降低分子的毒性，或消除或減弱分子的不希望的副作用等。能夠介導(dǎo)這類效應(yīng)的部分，公開在Remington，s Pharmaceutical Sciences，第18 版，A. R. Gennaro,編，MackPub 1. , Easton, PA(1990)。
當與“衍生物”或“變體”結(jié)合使用時，術(shù)語“有功能的”表示這樣的蛋白分子其生物活性與實體或分子的生物活性基本上類似，且其是所述實體或分子的衍生物或變體。 在該背景下，“基本上類似”是指，所述生物活性(例如，結(jié)合的多肽的跨膜運輸)是參照物 (例如，對應(yīng)的野生型多肽)的活性的至少50%，優(yōu)選至少60%活性，70%活性，80%活性， 90%活性，95%活性，100%活性或甚至更高(即，所述變體或衍生物具有比野生型更大的活性)，例如，110%活性、120%活性或更高。
在本文中使用的術(shù)語“插入”或“刪除”通常是在約1-5個氨基酸的范圍內(nèi)?？紤]到維持功能所允許的變異可以實驗地確定，其中合成地生產(chǎn)肽，同時使用重組DNA技術(shù)，在序列中系統(tǒng)地產(chǎn)生核苷酸的插入、刪除或置換。
術(shù)語“特異性地結(jié)合”表示，以10微摩爾或更小、優(yōu)選1微摩爾或更小、更優(yōu)選 IOOnM或更小、IOnM或更小或InM或更小的Kd進行結(jié)合。
“基本上純的”是指這樣的核酸、多肽或其它分子其已經(jīng)與天然地伴隨它的組分分離開。通常，當多肽去除了至少約60 %或至少約70 %、至少約80 %、至少約90 %、至少約 95%或甚至至少約99% (按重量計算)的天然地伴隨它的蛋白和天然存在的有機分子時， 多肽基本上是純的?？梢匀缦碌玫交旧霞兊亩嚯睦纾ㄟ^從天然來源提取，通過在通常不表達該蛋白的細胞中表達重組核酸，或通過化學(xué)合成。
本文使用的術(shù)語“參照水平”表示給定的細胞因子的細胞因子水平，它會提供基線，相對于該基線來測量CMI應(yīng)答。作為一個例證性實例，可以將細胞因子X的參照水平計算為，來自至少一個陰性對照生物樣品的細胞因子X的細胞因子基因和/或蛋白表達的平均水平，所述生物樣品例如，從一個或多個尚未預(yù)先暴露于靶抗原的受試者得到的生物樣品。通常，將參照水平標準化為“0”值，在本文公開的CMI試驗中測得的細胞因子水平相對于參照水平的增加，指示陽性CMI應(yīng)答。參照物可以來自未受給定的病狀影響的個體， 或者，來自待測試的相同個體，其中這樣的樣品在更早的時間采取。參照物也可以是合并的樣品，所述樣品取自未受目標病狀影響的多個個體。在適當時，參照物也可以是給定的細胞因子的固定的閾值水平，大于該閾值水平的值會指示病理狀態(tài)或病原體的存在。優(yōu)選地，參照樣品來自具有與受測個體類似的特征的個體或個體集合，例如，參照物可以取自具有類似年齡、性別、人種(rave)或種族背景等的個體。在有些實施方案中，也可以使用其它參照水平，例如陽性參照水平可以用作CMI反應(yīng)的陽性對照。通常，在使用陽性參照水平的情況下，如果在本文公開的CMI試驗中測量的細胞因子與相同細胞因子的陽性參照水平的值基本上相同或接近，則它指示陽性CMI應(yīng)答。
本文使用的術(shù)語“減少的”或“減小”或“降低”通常是指，與參照相比統(tǒng)計上顯著的量的減少。但是，為了避免疑惑，“減少的”是指，與參照水平相比統(tǒng)計上顯著地減少了至少 10%，例如減少了至少20%、至少30%、至少40%、至少50%或至少60%或至少70%或至少80%、至少90%或更多，最多達到且包括100%減少(即與參照樣品相比不存在水平)，或與參照水平(作為在本文中定義的該術(shù)語)相比在10-100%之間的任何減少。
本文使用的術(shù)語“低”通常是指，減少了統(tǒng)計顯著的量；為了避免疑惑，“低”是指比參照水平降低了至少10%的統(tǒng)計上顯著的值，例如比參照水平低至少20%的值、比參照水平低至少30%的值、比參照水平低至少40%的值、比參照水平低至少50%的值、比參照水平低至少60%的值、比參照水平低至少70%的值、比參照水平低至少80%的值、比參照水平低至少90%的值，最多達到且包括比參照水平低100% (即與參照樣品相比不存在水平)。
本文使用的術(shù)語“增加的”或“增加”通常是指，增加了統(tǒng)計顯著的量；為了避免疑惑，“增加的”是指，與參照水平相比統(tǒng)計上顯著地增加了至少10%，包括增加了至少20%、 至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少100 %或更多，包括例如與參照水平(作為在本文中定義的該術(shù)語)相比增加至至少2倍、至少3倍、 至少4倍、至少5倍、至少10倍或更多。
本文使用的術(shù)語“高”通常是指，與參照水平相比增加了統(tǒng)計顯著的量；為了避免疑惑，“高”是指比參照水平高了至少10%的統(tǒng)計上顯著的值，例如與參照水平相比高了至少20%、高了至少30%、高了至少40%、高了至少50%、高了至少60%、高了至少70%、高了至少80%、高了至少90%、高了至少100%、為至少2倍高、為至少3倍高、為至少4倍高、 為至少5倍高、為至少10倍高或更多。
本文用于描述核酸分子的術(shù)語“重組的”是指，基因組的、cDNA、病毒的、半合成的和/或合成的起源的多核苷酸，因為它的起源或操作，所述多核苷酸不結(jié)合在自然界中它與之結(jié)合的多核苷酸序列的全部或一部分。關(guān)于蛋白或多肽所使用的術(shù)語“重組的”是指， 通過重組多核苷酸的表達所生成的多肽。關(guān)于宿主細胞所使用的術(shù)語“重組的”是指，其中已經(jīng)導(dǎo)入了重組多核苷酸的宿主細胞。當提及物質(zhì)(例如，細胞、核酸、蛋白或載體)時，重組也在本文中用于表示，該物質(zhì)已經(jīng)通過導(dǎo)入異源物質(zhì)(例如，細胞、核酸、蛋白或載體)而進行了修飾。
術(shù)語“載體”表示這樣的核酸分子其能夠?qū)⑵湟呀?jīng)連接的異源核酸運輸給宿主細胞，或介導(dǎo)所述異源核酸的表達；質(zhì)粒是被術(shù)語“載體”包括的屬的一個種。術(shù)語“載體”通常表示這樣的核酸序列其含有在宿主細胞中復(fù)制和/或維持所必需的復(fù)制起點和其它實體。能夠指導(dǎo)它們可操作地連接的基因和/或核酸序列的表達的載體，在本文中稱作“表達載體”。一般而言，有用的表達載體經(jīng)常是“質(zhì)?！钡男问?，所述質(zhì)粒是指環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，當處于它們的載體形式時，它們不會結(jié)合染色體，且通常包括用于穩(wěn)定或短暫表達的實體或編碼的DNA。在本文公開的方法中可以使用的其它表達載體包括、但不限于質(zhì)粒、附加體、 細菌人工染色體、酵母人工染色體、噬菌體或病毒載體，且這樣的載體可以整合進宿主的基因組中，或自主地在特定細胞中復(fù)制。載體可以是DNA或RNA載體。也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的起等效功能的其它形式的表達載體，例如自主復(fù)制的染色體外載體或整合進宿主基因組中的載體。優(yōu)選的載體是能夠自主復(fù)制和/或表達它們所連接的核酸的那些。
冠詞“一個”和“一種”在本文中用于表示一個或超過一個(即，至少一個)該冠詞的語法對象。作為實例，“一個元件”是指一個元件或超過一個元件。
本文使用的術(shù)語“基本上由……組成”表示給定的實施方案必需的那些要素。該術(shù)語允許存在這樣的要素所述要素不會實質(zhì)上影響本發(fā)明的實施方案的基本和新穎或功能的特征。
術(shù)語“由……組成”表示這樣的本文所述的組合物、方法和其各個組分其不含有在實施方案的描述中沒有列舉的任何要素。
除了在工作實施例中以外，或在另外指出的情況下，在本文中使用的表示成分或反應(yīng)條件的量的所有數(shù)字，應(yīng)當理解為在所有情況下被術(shù)語“約”修飾。當與百分比一起使用時，術(shù)語“約”可以表示士 1%。下面的內(nèi)容進一步詳細解釋了本發(fā)明(包括所述實施例)，但是本發(fā)明的范圍不限于它們。
應(yīng)當理解，本發(fā)明不限于本文描述的具體方法學(xué)、方案和試劑等，且它們可以變化。本文使用的術(shù)語僅用于描述具體實施方案的目的，無意限制本發(fā)明的范圍，所述范圍僅由權(quán)利要求書限定。從下面的詳細描述、附圖和權(quán)利要求書中，可以明白本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點。
用于測定CMI應(yīng)答的方法和組合物
本文描述了用于檢測對抗原的CMI應(yīng)答的方法和組合物。所述應(yīng)答可以指示，例如，受試者的感染或其它抗原暴露。本文描述的方法和組合物特別適用于檢測細胞內(nèi)病原體。也描述了監(jiān)測個體的產(chǎn)生針對給定靶抗原的CMI應(yīng)答的能力的方法。所述方案使用從個體得到的生物樣品，所述生物樣品包括免疫細胞和能夠加工和展示遞送至它們的胞質(zhì)溶膠的靶抗原的細胞。通常，從受試者得到這樣的生物樣品，并用靶抗原-LF多肽融合多肽 (例如，本文所述的LFn融合多肽)溫育樣品。
不希望受理論的約束，在用來自個體的細胞樣品溫育以后，LF多肽-靶抗原復(fù)合物(例如，Un多肽-靶抗原融合多肽)在LF多肽輔助下進入樣品中的細胞的胞質(zhì)溶膠中， 并作為抗原片段被加工和展示在這些細胞的表面上(與MHC分子相結(jié)合)。樣品中預(yù)敏化的免疫細胞(例如，對任一種展示的靶抗原片段特異性的CD4+或CD8+T細胞)在它們的特異性T細胞受體與展示的靶抗原片段相互作用以后，會釋放出一種或多種細胞因子。檢測免疫細胞的細胞因子釋放，由此提供下述指示或讀出個體被表達所述靶抗原的病原體感染，或已經(jīng)以其它方式暴露于所述靶抗原。
在一個實施方案中，通過差別表達方法，可以測定在本文所述的試驗中存在陽性 CMI應(yīng)答。也就是說，可以使用細胞因子水平與在參照樣品中顯示的水平的對比。作為本文定義的術(shù)語“增加”，給定的細胞因子或細胞因子集合的成員相對于參照的增加，指示陽性應(yīng)答。
釋放的細胞因子的身份和/或相對量可以進一步指示病原體的性質(zhì)。也就是說， 特定病原體或病癥可以產(chǎn)生這樣的細胞因子釋放特性所述特性是被那些病原體感染或以其它方式暴露或遭受那些病癥(例如，自身免疫病)的個體的特征。
在下面的部分中，描述了執(zhí)行本文所述的方法所需的各種組分和所述方法和組合物的不同方面的考慮。
I. LF 多肽
作為背景且不希望受理論的限制，致死毒素(LF)是2個二分蛋白外毒素(來自炭疽芽孢桿菌的致死毒素(LT)和水腫毒素(ET))之一。LT由保護抗原(PA)和致死因子 (LF)組成，而水腫毒素由PA和水腫因子(EF)組成。這三個組分PA、LF和EF單獨都是無毒的。但是，一旦組合，水腫毒素會造成水腫，且LT會通過全身休克造成動物和人的死亡。與它在形成兩種毒素中的關(guān)鍵作用相一致，已經(jīng)將PA鑒別為針對炭疽的疫苗中的保護性組分。現(xiàn)在假設(shè)炭疽毒素作用的分子機制如下PA是通過細胞受體結(jié)合到哺乳動物細胞表面上的735-氨基酸多肽。一旦結(jié)合，PA會被細胞蛋白酶的蛋白水解性裂解活化成63-kDa分子，該分子能夠在靶向的細胞的質(zhì)膜中形成環(huán)形七聚體(圖1) (Milne等人，(1994) J. Biol, Chem. 269, 20607-20612，Petosa，等人，(1997) Nature (London) 385，833-838)。PA 七聚體然后結(jié)合EF或LF，它們通過胞吞作用內(nèi)化。在內(nèi)體酸化以后，PA使EF或LF能夠進入胞質(zhì)溶膠中，推測是借助于七聚體形成的孔。在胞質(zhì)溶膠內(nèi)，EF起腺苷酸環(huán)化酶的作用(Leppla， S. H. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79，3162-3166)，將 ATP 轉(zhuǎn)化成 cAMP。異常升高的 cAMP水平會擾亂細胞的代謝。
炭疽致死因子或LF是天然地生成的且具有MAPKK蛋白酶活性的蛋白。LF的刪除分析表明，PA結(jié)合域位于LFn的氨基端內(nèi)，且突變研究證實，PA結(jié)合域位于SEQ ID NO 1的LF 多肽的氨基酸:34-2 區(qū)域內(nèi)和SEQ ID NO :2的LF多肽的氨基酸34-288區(qū)域內(nèi)(Arora等 A, ]. Biol. Chem. 268 :33343341(1993) ；Milne，等人，(1995)Mol. Microbiol. 15，661-66)。
LF在胞質(zhì)溶膠中的作用會造成宿主細胞的死亡，其機理尚不很清楚。LF會誘導(dǎo)許多淋巴因子的過量生產(chǎn)(Klimpel，等人，(1994)Mol. Microbiol. 13，1093-1100)，促成宿主動物的致死性全身休克。最近的研究也證實，LF具有2種酶活性它可以起鋅金屬蛋白酶的作用(Duesbery，等人，(1998)kience 280，734-737)，且它會滅活促分裂原活化的蛋白激酶(Harma，等人，.(1994) Mol. Med. 1,7-18)。盡管尚不清楚LF的這兩種酶活性如何關(guān)聯(lián)， 二者都是LF毒性所必需的。以前已經(jīng)報道，炭疽毒素B部分可以用于遞送表位，后者又會在有PA存在下引起免疫系統(tǒng)的抗體應(yīng)答(W0 97/23236)。
LF是一種796氨基酸多肽，兩種酶活性的功能結(jié)構(gòu)域位于SEQ IDNO 1的氨基酸383和796之間。當與PA混合并添加給培養(yǎng)的巨噬細胞時，或當注射進動物中時，沒有該催化結(jié)構(gòu)域的N-端截短的LF完全喪失任何毒性效應(yīng)。但是，它確實仍然有效地結(jié)合PA。Un的PA結(jié)合域存在于SEQ ID NO :2的殘基；34_288內(nèi)(Milne，等人，(1995)Mol. Microbiol. 15,661-66)。
83kDa PA多肽在它的羧基端結(jié)合細胞表面受體，在這里它被蛋白酶(例如，弗林蛋白酶、梭菌蛋白酶或胰蛋白酶)特異性地切割。該酶切割會釋放出20kDa氨基端PA片段，而63kDa羧基端PA片段保持結(jié)合在細胞表面受體上。63kDa片段也稱作“加工過的保護抗原”。加工過的PA含有在它的羧基端的細胞表面受體結(jié)合位點和在它的新氨基端的致死因子結(jié)合位點(參見，例如，Singh等人，J.Biol. Chem. 264 :19103 19107(1989))。加工過的PA可以通過體外、離體或體內(nèi)酶切割或作為重組蛋白來生產(chǎn)。本文使用的術(shù)語PA是指具有致死因子結(jié)合位點的PA分子，例如，重組PA，天然存在的PA，含有致死因子結(jié)合位點的PA的功能等效物以及含有致死因子結(jié)合位點的PA融合蛋白。
II.包含LF多肽和靶抗原的組合物
發(fā)明人已經(jīng)確信，致死因子(LF)的片段可以將融合的外源性的靶抗原遞送至完整細胞的胞質(zhì)溶膠。具體地，發(fā)明人以前已經(jīng)證實，在沒有PA存在下，與LFn或其片段物理地結(jié)合或融合的抗原，可以用于將抗原遞送至完整活細胞的胞質(zhì)溶膠，并引起針對該融合抗原的CTL應(yīng)答。
本文所述的方法和試劑盒采用LF多肽來將靶抗原遞送至來自受試者的細胞的胞質(zhì)溶膠。涉及的LF多肽組合物通常包含LF多肽和靶抗原，其中LF多肽(例如，LFn)與靶抗原融合?；蛘?，所述LF多肽可以以某些方式與靶抗原絡(luò)合或結(jié)合，例如，形成LFn:靶抗原復(fù)合物。在有些實施方案中，所述組合物包含LF多肽靶抗原復(fù)合物，其中LF多肽(例如，Un)通過范德華力或其它非共價相互作用與靶抗原直接結(jié)合。在替代實施方案中，所述組合物包含LF多肽靶抗原復(fù)合物，其中LF多肽(例如，LFn多肽)與靶抗原間接結(jié)合，例如通過LFn多肽與至少一個第三部分的相互作用，且靶抗原與所述相同第三部分(其與LFn 多肽相互作用)相互作用。這樣的相互作用可以是技術(shù)人員已知的任意非共價結(jié)合，包括， 但不限于范德華力、親水相互作用、疏水相互作用和其它非共價相互作用。在有些實施方案中，至少1個或至少2個或至少3個或至少4個或更多個第三實體可以用于使LFn多肽與靶抗原結(jié)合。例如，LF多肽-靶抗原復(fù)合物可以包括這樣的組合物其包含LFn:部分 靶抗原復(fù)合物或Lfn:部分部分靶抗原復(fù)合物、Lfn:部分部分部分靶抗原復(fù)合物等。在有些實施方案中，LP多肽所結(jié)合的部分(例如，LFn)可以與靶抗原所結(jié)合的部分相同或不同，且所有部分可以在復(fù)合物內(nèi)是相同的，或在復(fù)合物內(nèi)是不同的。
A. LFn
如上面所討論的，“LFn多肽”包括由SEQ ID NO 3和4表示的LF多肽片段，以及保留將結(jié)合的或融合的多肽靶抗原遞送至完整細胞(優(yōu)選活細胞)的胞質(zhì)溶膠的功能的重組LFn和功能性LFn等效物、片段和變體。術(shù)語“LFn多肽”因此包括功能性LFn同源物諸如多態(tài)變體、等位基因、突變體和密切相關(guān)的物種間變體，它們與LFn具有至少約60%氨基酸序列同一性，且具有將融合的多肽靶抗原遞送至細胞的胞質(zhì)溶膠的功能(使用本文所述的試驗測得)。在具體實施方案中，所述LFn多肽與本文公開的SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 4的Un基本上相同。在有些實施方案中，通過在美國專利申請10/473，190(它通過引用并入本文)中公開的方法和試驗，可以測定起將多肽靶抗原遞送至完整細胞的功能的LFn的有些功能性多態(tài)變體、等位基因、突變體和密切相關(guān)的物種間變體。
在有些實施方案中，LFn模仿物可用于本文所述的組合物和方法中?！癓Fn模仿物” 表示起LFn的功能將靶抗原遞送至細胞的胞質(zhì)溶膠以誘導(dǎo)針對該抗原的CMI應(yīng)答的化合物或分子，例如，肽、多肽或小化學(xué)分子。Un模仿物因而包括Un同源物。Un模仿物也包括保留LFn的將融合的或結(jié)合的多肽抗原遞送至細胞的胞質(zhì)溶膠的功能的小Un肽，及其保守置換變體，以及保留LFn的將融合的或結(jié)合的多肽抗原遞送至細胞的胞質(zhì)溶膠的能力的截短形式的Un。如下測試LFn模仿物使用在本文中和在美國專利申請10/473，190(其通過引用整體并入本文)的實施例中公開的對靶抗原的CMI應(yīng)答的測定法，例如，對遞送的靶抗原的CTL應(yīng)答的誘導(dǎo)。當測試Un模仿物時，Un通常用作靶抗原向細胞的遞送的陽性對照。
發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，至少約250個氨基酸或更小、或至少約150個氨基酸或更小、或至少約104個氨基酸或更小的LFn片段能夠?qū)⑷诤系陌锌乖f送給細胞，且可用于本文的 CMI應(yīng)答的方法和組合物中。
在有些實施方案中，本文所述的LFn多肽包含PA的非功能性結(jié)合位點，因而是不會產(chǎn)生與PA的功能性結(jié)合的LFn突變體。這樣的突變體包括、但不限于在一個或多個與PA相互作用的關(guān)鍵殘基處改變的突變體，諸如在一個或多個下述殘基中的突變Y22 ； L188 ；D187 ；Υ226 ；L235 ；Η229 (參見 Lacy 等人，JBC, 2002 ；277 ；3006-3010) ；D106A ；Υ108Κ ；E135K ；D136K ；N140A 和 K143A (參見 Melnyk 等人，JBC，2006 ；281 ； 1630-1635 和 Cunningham 等人，PNAS，2002 ；99 ；70497052，它們通過引用整體并入本文)。
B.靶抗原
用于本文所述的組合物和方法中的抗原可以是任意靶抗原，包括、但不限于病原性肽、毒素、類毒素、它們的亞基或它們的組合(例如，霍亂毒素、破傷風類毒素)。
可以與LF多肽或LFn多肽融合的靶抗原可以是與傳染病或癌癥或免疫病有關(guān)的任意抗原。在有些實施方案中，與LF多肽融合的靶抗原可以是由多種傳染物(包括病原體、 病毒、細菌、真菌或寄生物)中的任一種表達的抗原。
如本文所討論的，完整的(即整個的或全部的)靶抗原可以與LF多肽融合。在該背景下，“完整”是指，靶抗原是與在自然界中存在的抗原多肽相同的全長靶抗原。這與僅遞送靶抗原的小部分或肽形成直接對比。通過向細胞遞送完整靶抗原，LF多肽能夠?qū)崿F(xiàn)或促進針對完整靶抗原的整個范圍的表位(而不是僅單個或選擇的幾個肽表位)的CMI應(yīng)答的檢測。因此，本文所述的方法和組合物會提供用于檢測CMI應(yīng)答的試驗，所述試驗比使用基于肽的靶抗原更靈敏，且具有更高的特異性，因為當使用整個靶抗原來測定CMI應(yīng)答時，更可能檢測到基本上針對完整抗原的任意表位產(chǎn)生的應(yīng)答。
在有些實施方案中，為了避免與本文所述的方法提供的增加的靈敏度有關(guān)的假陽性，也可以將完整靶抗原分成整個靶抗原的片段或部分，例如，至少2個、或至少3個、或至少4個、或至少5個或更多個靶抗原片段，這取決于完整靶抗原蛋白的大小。整個靶抗原的這些片段可以用作治療控制，以濾出針對與LF多肽融合的整個靶抗原的陽性CMI應(yīng)答的假陽性。僅作為一個實例，通過評估與LFn (它們是整個靶抗原的片段)融合的靶抗原集合的 CMI應(yīng)答，可以證實針對與LFn融合的整個靶抗原的陽性CMI應(yīng)答。如果1個或2個片段 (但是并非所有片段)產(chǎn)生陽性應(yīng)答，則證實真實的CMI應(yīng)答。如果檢測到所有片段的陽性 CMI應(yīng)答，則針對與LFn融合的整個靶抗原的陽性CMI應(yīng)答可能是假陽性。
在有些實施方案中，可以將完整靶抗原分成許多部分(這取決于起始靶抗原的大小)，用作亞靶抗原集合。通常，在整個靶抗原是多聚體多肽的情況下，可以將整個靶蛋白分成亞基和/或結(jié)構(gòu)域，它們可以各自單獨地與LF多肽(例如，LFn多肽)融合，以建立靶抗原的LF多肽-融合多肽集合，它們可以用于本文公開的試驗方法和組合物中?；蛘撸梢詫⑼暾锌乖殖烧麄€靶抗原的片段或部分，例如，至少2個、或至少3個、或至少4個、或至少5個、或至少6個、或至少7個、或至少8個、或至少約9個、或至少約10個、或至少約 11個、或至少約12個、或至少約13個、或至少約15個、或至少約20個、或至少約25個、或超過25個片段，且每個片段單獨地與LF多肽融合，以建立靶抗原的LF多肽-融合多肽集合，它們可以用于本文公開的試驗方法和組合物中。
全長靶抗原多肽的片段化或分隔可以是全長靶抗原多肽的均等分隔，或者，在有些實施方案中，所述片段化是不對稱的或不等的。作為一個非限制性實例，在將靶抗原分成2個重疊片段的情況下，可以將靶抗原分成大致相同(相等)大小的片段，或者，一個片段可以是整個靶抗原的約45%，且另一個片段可以是約65%。作為其它非限制性實例，可以將整個靶抗原分成不同大小的片段的組合，例如，在將靶抗原分成2個片段的情況下，可以將片段分成整個靶抗原的約40 %和約70 %、或約45 %和約65 %、或約35 %和約75 %、或約25%和約85%。包括全長完整靶抗原的重疊片段的任意組合，用于制備靶抗原的重疊LFn-融合多肽的集合。僅作為一個例證性實施例，在將靶抗原分成5部分的情況下，可以均等地(即每個重疊片段是靶抗原的整個全長的約21-25% )或不均等地(即可以將靶抗原分成下述5個重疊片段片段1是全長靶抗原大小的約25%、片段2是約5%、片段3是約 35 %、片段4是約10 %且片段5是約25 %，條件是，每個片段與至少1個其它片段重疊)分隔所述部分。
通常，含有靶抗原片段的LFn-融合體集合基本上涵蓋了整個(或完整)靶抗原多肽的整個長度。因此，本文描述了一種用于檢測對靶抗原集合的CMI應(yīng)答的方法，所述靶抗原是靶抗原的重疊蛋白或重疊多肽，而不是靶抗原的重疊肽。由于與LFn融合的片段是整個靶抗原的重疊蛋白(相對于重疊肽)，它們可以用于鑒別整個靶抗原的那些多肽片段引起CMI應(yīng)答。與在CMI試驗中使用單獨的肽(未融合LFn)相比，可以更快速地且更廉價地生產(chǎn)與LFn融合的靶抗原的重疊蛋白片段，并具有增加的穩(wěn)定性，從而與使用肽的其它CMI 試驗相比，顯著降低本文公開的試驗的成本。此外，使用本文所述的LF多肽融合體，可以導(dǎo)入比簡單的肽更大的多肽。在構(gòu)象對于表位識別而言是重要的情況下，更大的片段會提供勝過肽片段的益處。
如本文所討論的，使用與LFn融合的靶抗原的重疊蛋白，會增加CMI應(yīng)答的特異性。例如，本文公開的CMI試驗?zāi)軌騾^(qū)別已經(jīng)針對病原體免疫的受試者和被病原體感染或已經(jīng)暴露于病原體的受試者之間的差異。在另一個實施例中，本文公開的CMI試驗可以區(qū)別T細胞靶物。因此，本文公開的診斷方法和CMI試驗會提供簡單的、廉價的且快速的檢測對靶抗原的CMI應(yīng)答和/或檢測受病狀(諸如病原體感染)影響的受試者的方法。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以將整個靶抗原分成靶抗原的重疊蛋白，它們可以與LFn 融合，以建立靶抗原的LFn-融合多肽集合。僅作為示例性的實施例，可以將包含SEQ ID NO :7的TB-特異性的靶抗原TB 1 (CFP也稱作培養(yǎng)物濾液-10或CFP-10)分成，例如至少 17個片段，諸如在表1中所示的SEQ ID NO 30-46的那些，以制備17種不同的LFn-融合多肽的集合，每種Un-融合多肽包含與LFn融合的不同的、但是重疊的TB-特異性的靶抗原TBI (CFP)片段。培養(yǎng)物濾液蛋白(CFP-10) (Genbank AAC83445)是一種來自結(jié)核分枝桿菌的IOkDaUOO氨基酸殘基蛋白片段。它也稱作L45抗原同源蛋白(LHP)。其氨基酸序列是
MAEMKTDAATLAQEAGNFERISGDLKTQIDQVESTAGSLQGQffRGAAGTAAQAAVVRFQEAANKQK
QELDEISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALSSQMGF(SEQ. ID. NO. 7)。
在另一個實施例中，可以將包含SEQ ID NO :6的TB-特異性的靶抗原TB2 (ESAT，也稱作“早期分泌的抗原靶物-6多肽”或“ESAT-6” )分成，例如至少23個片段，諸如在表1 中所示的SEQ ID NO 8-29的那些，以制備23種不同的LFn-融合多肽的集合，每種LFn-融合多肽包含與Un融合的不同的、但是重疊的TB-特異性的靶抗原TB2(ESAT)片段。早期分泌的抗原靶物(ESAT-6)是一種來自結(jié)核分枝桿菌的95個氨基酸殘基的蛋白片段。其氨基酸序列是
MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELN
NALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA(SEQ. ID. NO. 6)。
在有些實施方案中，整個靶抗原的片段是全長靶抗原大小的基本上約一半，或全長靶抗原大小的基本上約1/3，或全長靶抗原大小的基本上約1/4，或小于全長靶抗原大小的基本上1/4。在所有情況下，全長完整靶抗原的片段應(yīng)當與整個靶抗原的至少1個(但是優(yōu)選地超過1個)其它片段重疊。作為一個實例，17種不同的LFn-融合多肽的集合包含TBI (CFP)多肽的不同片段，每個片段與至少2個或3個其它片段重疊。重疊量可以隨片段的大小和全長靶抗原已經(jīng)分成的片段的數(shù)目而變化。片段之間的典型的重疊量可以是約 10%、或約20%或約30%或約40%或約50%或約60%或約70%或約80%或更多，或在約 10%至約80%之間的任意重疊。作為一個實例，對于表1所示的TBI (CFP)靶抗原多肽的每種不同片段，每種片段中的大約73%與每個鄰近的片段重疊(即每個片段與在它前面和在它后面的片段重疊約73%)。
表1.整個TB-特異性的靶抗原TB-I (CFP)和TB_2 (ESAT)的片段
權(quán)利要求
1.一種測量受試者中對靶抗原的細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(CMI)的方法，所述方法包括下述步驟a.用至少一種融合多肽溫育來自所述受試者的生物樣品，所述融合多肽包含LF多肽的一部分，該部分缺少LF酶活性，但是足以促進所述融合多肽向細胞的跨膜遞送，所述部分與靶抗原多肽或其片段融合，其中所述生物樣品包含免疫系統(tǒng)的細胞，所述細胞響應(yīng)于抗原而釋放出至少一種細胞因子；b.測量在所述生物樣品中釋放的至少一種細胞因子的水平；和c.對比所述生物樣品中所述細胞因子的水平和相同細胞因子的參照水平，其中來自受試者的所述生物樣品中所述細胞因子的水平相對于細胞因子參照水平的增加，指示對靶抗原的細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(CMI)。
2.一種檢測受試者的目標病狀的方法，所述方法包括下述步驟a.用至少一種融合多肽溫育來自所述受試者的生物樣品，所述融合多肽包含LF多肽的一部分，該部分缺少LF酶活性，但是足以促進所述融合多肽向細胞的跨膜遞送，所述部分與靶抗原多肽或其片段融合，其中所述靶抗原在受該病狀影響的組織中表達，且其中所述生物樣品包含免疫系統(tǒng)的細胞，所述細胞響應(yīng)于抗原而釋放出至少一種細胞因子；b.測量在所述生物樣品中釋放的至少一種細胞因子的水平；和c.對比所述生物樣品中所述細胞因子的水平和相同細胞因子的參照水平，其中來自受試者的所述生物樣品中所述細胞因子的水平相對于細胞因子參照水平的增加，會將受試者鑒別為具有所述病狀，或具有增加的遭受所述病狀的風險。
3.一種測量受試者中對靶抗原的細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(CMI)的方法，所述方法包括下述步驟a.用至少一種靶抗原溫育來自所述受試者的生物樣品，其中所述生物樣品包含免疫系統(tǒng)的細胞，所述細胞在被靶抗原刺激以后釋放出至少一種細胞因子；b.測量在所述生物樣品中釋放的細胞因子的存在或水平，其中細胞因子的存在或水平指示對靶抗原的細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(CMI)在來自受試者的生物樣品中的存在；其中所述改進包括，在溫育步驟(a)中，用與LF多肽的一部分融合的至少一種靶抗原多肽或其片段溫育生物樣品，所述部分缺少LF酶活性，但是足以促進所述融合多膚向細胞的跨膜遞送。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述LF多肽部分包含SEQID NO 3的至少60個羧基端氨基酸或其促進跨膜遞送的保守置換變體。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述LF多肽部分包含SEQID NO 3的至少80個羧基端氨基酸或其促進跨膜遞送的保守置換變體。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述LF多肽部分包含SEQID NO 3的至少104個羧基端氨基酸或其促進跨膜遞送的保守置換變體。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述LF多肽部分包含與SEQID N0:3相對應(yīng)的氨基酸序列或其促進跨膜遞送的保守置換變體。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述LF多肽部分不結(jié)合炭疽芽孢桿菌 PA多肽。
9.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述LF多肽部分基本上缺少SEQID NO 3的氨基酸1-33。
10.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述LF多肽部分由SEQID NO 4或其促進跨膜遞送的保守置換變體組成。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述靶抗原多肽或其片段的長度是至少15個氨基酸。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項所述的方法，其中所述靶抗原多肽或其片段折疊成它的天然構(gòu)象。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項所述的方法，其中所述靶抗原多肽或其片段是多分子多肽復(fù)合物的一部分。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法，其中所述靶抗原多肽是多分子多肽靶抗原的亞基多肽。
15.如權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全長靶抗原的大小的1/2。
16.如權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全長靶抗原大小的1/3。
17.如權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全長靶抗原大小的1/4。
18.如權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段小于全長靶抗原大小的1/4，且其中所述片段的長度是至少15個氨基酸。
19.如權(quán)利要求1-18中任一項所述的方法，其中所述生物樣品是全血樣品。
20.如權(quán)利要求1-18中任一項所述的方法，其中所述生物樣品是血漿或淋巴結(jié)生物樣
21.如權(quán)利要求1-20中任一項所述的方法，其中所述免疫細胞選自下述的一種或多種NK細胞、T-細胞、B-細胞、Th細胞、Th 1細胞、Th2細胞、Tc細胞、基質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、 白細胞、淋巴細胞、成纖維細胞、樹突細胞、巨噬細胞、肥大細胞和單核細胞。
22.如權(quán)利要求1-21中任一項所述的方法，其中所述免疫細胞是T-細胞。
23.如權(quán)利要求1-22中任一項所述的方法，其中所述細胞因子選自GM-CSF、IL-Iα、 IL-I β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN- α、IFN- β、IFN- γ、 MIP-I α、MIP-I β、TGF- β , TNF α 禾口 TNF β。
24.如權(quán)利要求1-23中任一項所述的方法，其中所述細胞因子是選自下述的T-細胞細胞因子:IFN-y ,TGF^ , TNF β , IL-10、GM-CSF、IL-3, IL-4 和 IL-5。
25.如權(quán)利要求I-M中任一項所述的方法，其中所述細胞因子是IFN-γ。
26.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述目標病狀是病原性感染。
27.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述目標病狀是癌癥。
28.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述目標病狀是自身免疫病。
29.如權(quán)利要求1- 中任一項所述的方法，其中所述靶抗原多肽或其片段是病原體的抗原。
30.如權(quán)利要求2或四中任一項所述的方法，其中所述病原體選自結(jié)核分枝桿菌 (TB)、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、HBV、巨細胞病毒、非洲淋巴細胞瘤病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、人皰疹病毒6、人皰疹病毒7、人皰疹病毒8、天花病毒、水皰性口炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、鼻病毒、冠狀病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒.麻疹病毒、多瘤病毒、人乳頭瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯薩奇病毒、登革熱病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病病毒、魯斯肉瘤病毒、黃熱病病毒、埃波拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙熱病毒、東方馬腦炎病毒、日本腦炎病毒、 圣路易斯腦炎病毒、Murray山谷熱病毒、西尼羅病毒、立夫特山谷熱病毒、甲型輪狀病毒、乙型輪狀病毒、丙型輪狀病毒、Sindbis病毒、人T-細胞白血病病毒1型、漢坦病毒、風疹病毒和猿免疫缺陷病毒。
31.如權(quán)利要求2或四中任一項所述的方法，其中所述病原體是結(jié)核分枝桿菌。
32.如權(quán)利要求1力6或四-31中任一項所述的方法，其中所述靶抗原多肽是TB-特異性的抗原。
33.如權(quán)利要求146或四-32中任一項所述的方法，其中所述靶抗原多肽是包含SEQ ID NO 7的TBI (CFP)多肽或其片段。
34.如權(quán)利要求1-26- 或32中任一項所述的方法，其中所述靶抗原多肽是包含SEQ ID NO 6的TB2 (ESAT)多肽或其片段。
35.如權(quán)利要求1-34中任一項所述的方法，其中在蛋白表達水平測量所述細胞因子。
36.如權(quán)利要求1-35中任一項所述的方法，其中使用抗體、人源化的抗體、抗體片段、 重組抗體、嵌合抗體、適體、肽或其類似物，測量所述細胞因子。
37.如權(quán)利要求1-35中任一項所述的方法，其中使用選自下述的方法，測量所述細胞因子免疫測定、放射免疫測定(RIA)、免疫放射測定(IRMA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)； 酶聯(lián)免疫斑點測定；CELISA (細胞的酶聯(lián)免疫吸附測定)；RHPA (反向溶血空斑測定)或激酶受體活化測定(KIRA)。
38.如權(quán)利要求1-37中任一項所述的方法，其中所述受試者是哺乳動物受試者。
39.如權(quán)利要求1-38中任一項所述的方法，其中所述受試者是人受試者。
40.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段選自SEQID NO :8至SEQ ID NO 丨9。
41.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段選自SEQID NO :30至SEQ ID NO :46。
42.如權(quán)利要求1-39中任一項所述的方法，其中所述溫育包括用融合多肽集合溫育所述生物樣品，所述融合多肽集合包含與靶抗原多肽或其片段融合的LFn多肽，其中所述融合多肽集合包含靶抗原多肽或其基本上覆蓋靶抗原多肽的整個全長的片段。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述融合多肽集合包含多個與靶抗原多肽或其片段融合的LFn多肽，其中所述靶抗原多肽或其片段是重疊的和/或鄰近的靶抗原多肽片段， 其基本上覆蓋靶抗原多肽的整個全長。
44.如權(quán)利要求42或43中任一項所述的方法，其中所述融合多肽集合是至少2種融合多肽。
45.如權(quán)利要求42或43中任一項所述的方法，其中所述融合多肽集合是2-5種融合多肽。
46.如權(quán)利要求42或43中任一項所述的方法，其中所述融合多肽集合是6-10種融合多肽。
47.如權(quán)利要求42或43中任一項所述的方法，其中所述融合多肽集合是11-15種融合多肽。
48.如權(quán)利要求42或43中任一項所述的方法，其中所述融合多肽集合是16-20種或更多種融合多肽。
49.如權(quán)利要求42-48中任一項所述的方法，其中所述融合多肽集合包含至少2種所述 LF多肽，所述LF多肽與選自下述的不同靶抗原片段融合SEQ ID NO :8至SEQ ID NO :29。
50.如權(quán)利要求42-48中任一項所述的方法，其中所述融合多肽集合包含至少2種所述LF多肽，所述LF多肽與選自下述的不同靶抗原片段融合SEQ ID NO 30至SEQ ID NO 46。
51.如權(quán)利要求1或3中任一項所述的方法，其中CMI應(yīng)答將受試者鑒別為具有病狀或處于具有病狀的危險中。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述病狀選自病理學(xué)感染；癌癥；傳染??；和自身免疫病。
53.如權(quán)利要求1或3中任一項所述的方法，其中CMI應(yīng)答會將受試者鑒別為可能已經(jīng)暴露于所述靶抗原或表達所述靶抗原的病原體。
54.如權(quán)利要求1或3中任一項所述的方法，其中CMI應(yīng)答將受試者鑒別為，與被鑒別為具有低或否定的引起CMI應(yīng)答的能力的受試者相比，其具有或可能具有更好的預(yù)后。
55.一種用于監(jiān)測受試者的目標病狀的方法，所述方法包括評估受試者的引起對靶抗原的細胞介導(dǎo)的免疫(CMI)應(yīng)答的能力，其中所述方法包括a.用多肽溫育在試驗時間點從受試者收集的生物樣品，所述多肽包含LF多肽的一部分，該部分缺少LF酶活性，但是足以促進所述融合多肽向細胞的跨膜遞送，所述多肽與靶抗原多肽或其片段融合，其中所述靶抗原在受所述病狀影響的組織中表達，且其中所述生物樣品包含免疫系統(tǒng)的細胞，所述細胞響應(yīng)于抗原而釋放出至少一種細胞因子；b.測量在所述生物樣品中釋放的至少一種細胞因子的水平；和c.對比所述生物樣品中所述細胞因子的水平和相同細胞因子的參照水平，其中如果檢測到在試驗時間點從受試者得到的所述生物樣品中的所述細胞因子的水平相對于所述細胞因子的參照水平的增加，則將所述受試者鑒別為，具有引起對所述靶抗原多肽或其片段的細胞介導(dǎo)的免疫(CMI)應(yīng)答的能力。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其中所述參照細胞因子水平是從沒有受所述病狀影響的受試者得到的至少一個或多個生物樣品中的細胞因子水平。
57.如權(quán)利要求55或56中任一項所述的方法，其中所述參照細胞因子水平是在比所述試驗時間點更早的時間點從受試者得到的生物樣品中的細胞因子水平。
58.如權(quán)利要求55所述的方法，所述方法另外包括用合適的治療方案，治療被鑒別為具有引起細胞介導(dǎo)的(CMI)應(yīng)答的能力的受試者。
59.如權(quán)利要求55所述的方法，所述方法另外包括指導(dǎo)被鑒別為具有引起細胞介導(dǎo)的(CMI)應(yīng)答的能力的受試者的治療，其中從業(yè)人員評審細胞因子的水平，如果受試者被鑒別為具有引起細胞介導(dǎo)的(CMI)應(yīng)答的能力，則從業(yè)人員指導(dǎo)用合適的治療方案治療受試者。
60.如權(quán)利要求55所述的方法，所述方法另外包括預(yù)測受試者的病狀的預(yù)后，其中如果受試者被鑒別為具有引起細胞介導(dǎo)的(CMI)應(yīng)答的能力，則將所述受試者鑒別為，與被鑒別為具有低或否定的引起CMI應(yīng)答的能力的受試者相比，可能具有更好預(yù)后。
61.如權(quán)利要求55所述的方法，所述方法另外包括預(yù)測受試者發(fā)展病狀的風險，其中如果受試者被鑒別為具有引起細胞介導(dǎo)的(CMI)應(yīng)答的能力，將所述受試者鑒別為，與被鑒別為具有低或否定的引起CMI應(yīng)答的能力的受試者相比，其發(fā)展病狀的可能性更低。
62.如權(quán)利要求55-61中任一項所述的方法，其中所述目標病狀是病原性感染。
63.如權(quán)利要求55-61中任一項所述的方法，其中所述目標病狀是癌癥。
64.如權(quán)利要求55-61中任一項所述的方法，其中所述目標病狀是自身免疫病。
65.如權(quán)利要求55-64中任一項所述的方法，其中所述LF多肽部分包含SEQID NO 3 的至少80個羧基端氨基酸或其促進跨膜遞送的保守置換變體。
66.如權(quán)利要求55-65中任一項所述的方法，其中所述LF多肽部分包含SEQID NO 3 的至少80個羧基端氨基酸或其促進跨膜遞送的保守置換變體。
67.如權(quán)利要求55-66中任一項所述的方法，其中所述LF多肽部分包含SEQID NO 3 的至少104個羧基端氨基酸或其促進跨膜遞送的保守置換變體。
68.如權(quán)利要求55-67中任一項所述的方法，其中所述LF多肽部分包含與SEQID NO 3相對應(yīng)的氨基酸序列或其促進跨膜遞送的保守置換變體。
69.如權(quán)利要求55-68中任一項所述的方法，其中所述LF多肽部分不結(jié)合炭疽芽孢桿菌PA多肽。
70.如權(quán)利要求55-69中任一項所述的方法，其中所述LF多肽部分基本上缺少SEQID NO 3的氨基酸1-33。
71.如權(quán)利要求55-70中任一項所述的方法，其中所述LF多肽部分由SEQID NO :4或其促進跨膜遞送的保守置換變體組成。
72.如權(quán)利要求55-71中任一項所述的方法，其中所述靶抗原多肽或其片段的長度是至少15個氨基酸。
73.如權(quán)利要求55-72中任一項所述的方法，其中所述靶抗原多肽或其片段折疊成它的天然構(gòu)象。
74.如權(quán)利要求55-73中任一項所述的方法，其中所述靶抗原是多分子多肽復(fù)合物的一部分。
75.如權(quán)利要求55-74中任一項所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段是多分子多肽靶抗原的亞基多肽。
76.如權(quán)利要求55-75中任一項所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全長靶抗原的大小的1/2。
77.如權(quán)利要求55-75中任一項所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全長靶抗原大小的1/3。
78.如權(quán)利要求55-75中任一項所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全長靶抗原大小的1/4。
79.如權(quán)利要求55-75中任一項所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段小于全長靶抗原大小的1/4，且其中靶抗原的非肽片段是至少20個氨基酸。
80.如權(quán)利要求55-79中任一項所述的方法，其中所述生物樣品是全血樣品。
81.如權(quán)利要求55-80中任一項所述的方法，其中所述生物樣品是血漿或淋巴結(jié)生物樣品。
82.如權(quán)利要求55-81中任一項所述的方法，其中所述免疫細胞選自下述的一種或多種NK細胞、T-細胞、B-細胞、Th細胞、Thl細胞、Th2細胞、Tc細胞、基質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、 白細胞、淋巴細胞、成纖維細胞、樹突細胞、巨噬細胞、肥大細胞和單核細胞。
83.如權(quán)利要求55-82中任一項所述的方法，其中所述免疫細胞是T-細胞。
84.如權(quán)利要求55-83中任一項所述的方法，其中所述細胞因子選自GM-CSF、IL-la、 IL-I β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN- α、IFN- β、IFN_g、 MIP-I α、MIP-I β、TGF- β , TNF α 禾口 TNF β。
85.如權(quán)利要求55-84中任一項所述的方法，其中所述細胞因子是選自下述的T-細胞細胞因子:IFN-g、TGF3、TNF3、IL-10、GM-CSF、IL-3, IL-4 和 IL-5。
86.如權(quán)利要求55-85中任一項所述的方法，其中所述細胞因子是IFN-g。
87.如權(quán)利要求55-86中任一項所述的方法，其中所述靶抗原多肽或其片段是病原體的抗原。
88.如權(quán)利要求87所述的方法，其中所述病原體選自結(jié)核分枝桿菌(TB)、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、HBV、巨細胞病毒、非洲淋巴細胞瘤病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、人皰疹病毒6、人皰疹病毒7、人皰疹病毒8、天花病毒、水皰性口炎病毒、甲型肝炎病毒、 乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、鼻病毒、冠狀病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒.麻疹病毒、多瘤病毒、人乳頭瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯薩奇病毒、登革熱病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病病毒、魯斯肉瘤病毒、黃熱病病毒、埃波拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙熱病毒、東方馬腦炎病毒、日本腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒、Murray山谷熱病毒、西尼羅病毒、立夫特山谷熱病毒、甲型輪狀病毒、乙型輪狀病毒、 丙型輪狀病毒、Sindbis病毒、人T-細胞白血病病毒1型、漢坦病毒、風疹病毒和猿免疫缺陷病毒。
89.如權(quán)利要求87所述的方法，其中所述病原體是結(jié)核分枝桿菌。
90.如權(quán)利要求55-62或65-87中任一項所述的方法，其中所述靶抗原是TB-特異性的抗原。
91.如權(quán)利要求55-62或65-87中任一項所述的方法，其中所述靶抗原是TBI(CFP)多肽或其片段。
92.如權(quán)利要求55-62或65-87中任一項所述的方法，其中所述靶抗原是TB2(ESAT)多肽或其片段。
93.如權(quán)利要求55-92中任一項所述的方法，其中在蛋白表達水平測量所述細胞因子。
94.如權(quán)利要求1-83中任一項所述的方法，其中使用抗體、人源化的抗體、抗體片段、 重組抗體、嵌合抗體、適體、肽或其類似物，測量所述細胞因子。
95.如權(quán)利要求55-94中任一項所述的方法，其中使用選自下述的方法，測量所述細胞因子免疫測定、放射免疫測定(RIA)、免疫放射測定(IRMA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)； 酶聯(lián)免疫斑點測定；CELISA[細胞的酶聯(lián)免疫吸附測定；RHPA (反向溶血空斑測定)或激酶受體活化測定(KIRA)。
96.如權(quán)利要求55-95中任一項所述的方法，其中所述受試者是哺乳動物受試者。
97.如權(quán)利要求55-96中任一項所述的方法，其中所述受試者是人受試者。
98.一種測量來自受試者的生物樣品中對靶抗原多肽的細胞介導(dǎo)的免疫(CMI)應(yīng)答的試劑盒，所述試劑盒包含融合多肽，所述融合多肽包含與靶抗原多肽或其片段融合的LF多肽的一部分，該部分缺少LF酶活性，但是足以促進所述融合多肽向細胞的跨膜遞送。
99.如權(quán)利要求98所述的試劑盒，其中所述LF多肽部分包含SEQID NO 3的至少60 個羧基端氨基酸或其促進跨膜遞送的保守置換變體。
100.如權(quán)利要求98或99中任一項所述的試劑盒，其中所述LFn多肽部分包含SEQID NO 3的至少80個羧基端氨基酸或其促進跨膜遞送的保守置換變體。
101.如權(quán)利要求98-100中任一項所述的試劑盒，其中所述LFn多肽部分包含SEQID NO 3的至少104個羧基端氨基酸或其促進跨膜遞送的保守置換變體。
102.如權(quán)利要求98-101中任一項所述的試劑盒，其中所述Un多肽部分包含與SEQID NO 3相對應(yīng)的氨基酸序列或其促進跨膜遞送的保守置換變體。
103.如權(quán)利要求98-102中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒包含所述融合多肽集合，其中所述融合多肽集合包含基本上連續(xù)的靶抗原片段，所述片段一起基本上覆蓋靶抗原多肽的全長。
104.如權(quán)利要求103所述的試劑盒，其中所述融合多肽集合是至少2種融合多肽。
105.如權(quán)利要求103所述的試劑盒，其中所述融合多肽集合是2-5種融合多肽。
106.如權(quán)利要求103所述的試劑盒，其中所述融合多肽集合是6-10種融合多肽。
107.如權(quán)利要求103所述的試劑盒，其中所述融合多肽集合是11-15種融合多肽。
108.如權(quán)利要求103所述的試劑盒，其中所述融合多肽集合是16-20種或更多種融合多肽。
109.如權(quán)利要求103所述的試劑盒，其中所述融合多肽集合包含至少2種所述融合多肽，所述融合多肽包含不同的靶抗原多肽片段，所述片段選自SEQ ID NO :8至SEQ ID NO 29。
110.如權(quán)利要求103所述的試劑盒，其中所述融合多肽集合包含至少2種所述融合多肽，所述融合多肽包含不同的靶抗原多肽片段，所述片段選自SEQ ID NO :30至SEQ ID NO 46。
111.一種用于測量來自受試者的生物樣品中對靶抗原多肽的細胞介導(dǎo)的免疫(CMI) 應(yīng)答的試劑盒，所述試劑盒包含a.LF多肽的一部分，該部分缺少LF酶活性，但是足以促進所述融合多肽向細胞的跨膜遞送；b.用于將所述LF多肽部分綴合到靶抗原多肽或其片段上的試劑；和c.基于抗體的檢測工具，其用于檢測由生物樣品釋放的至少一種細胞因子。
112.一種用于測量來自受試者的生物樣品對TB抗原多肽的細胞介導(dǎo)的免疫(CMI)應(yīng)答的試劑盒，所述試劑盒包含a與TB-特異性的抗原多肽融合的LF多肽的一部分，該部分缺少LF酶活性，但是足以促進所述融合多肽向細胞的跨膜遞送；和b基于抗體的檢測工具，其用于檢測由生物樣品釋放的至少一種細胞因子。
113.如權(quán)利要求98-112中任一項所述的試劑盒，其任選地另外包含陽性和陰性生物樣品對照，其中陽性樣品會引起對靶抗原的CMI應(yīng)答，且陰性生物樣品不引起CMI應(yīng)答。
114.如權(quán)利要求112所述的試劑盒，其中所述TB-特異性的抗原多肽是SEQID NO 7 的TBI (CFP)多肽或其片段。
115.如權(quán)利要求112所述的試劑盒，其中所述靶抗原多肽是SEQIDNO :6的TB2 (ESAT) 多肽或其片段。
116.如權(quán)利要求98、106或112中任一項所述的試劑盒，其中所述靶抗原多肽的片段選自SEQ ID NO 8 至 SEQ ID NO :29。
117.如權(quán)利要求98、106或112中任一項所述的試劑盒，其中所述靶抗原多肽的片段選自SEQ ID NO 30 至 SEQ ID NO :46。
全文摘要
描述了用于檢測或監(jiān)測個體的產(chǎn)生對靶抗原的細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力的組合物和方法。所述方法部分地依賴于致死因子(LF)多肽與靶抗原的物理結(jié)合，例如，融合。LF多肽部分(包括，例如，LFn多肽部分)起轉(zhuǎn)運因子的作用，將靶抗原(包括全長靶多肽)遞送至來自個體的完整活免疫細胞的胞質(zhì)溶膠。測量來自個體的免疫細胞的細胞因子應(yīng)答，會提供細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的讀出。所述的方法和組合物會提供診斷以及預(yù)后信息，且可以引導(dǎo)治療的方向。
文檔編號G01N33/50GK102549425SQ201080038639
公開日2012年7月4日 申請日期2010年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月12日
發(fā)明者H·郭, N·托斯簡, W·鄭, 呂亦晨 申請人:疫苗技術(shù)公司