專利名稱：用于糖基化分析的糖肽的es-ms的制作方法
用于糖基化分析的糖肽的ES-MS本文報(bào)告了用于免疫球蛋白糖基化分析的質(zhì)譜方法，所述方法不需要層析分離步
馬聚ο
背景技術(shù)：
對(duì)于很多重組產(chǎn)生的治療多肽，多肽的糖基化是重要的特征。糖基化多肽，也稱作糖蛋白，在真核生物例如人和一些原核生物中介導(dǎo)許多必需的功能，所述功能包括催化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞-細(xì)胞間的通訊、免疫系統(tǒng)的活動(dòng)、分子識(shí)別和關(guān)聯(lián)。在真核生物中糖蛋白占非胞質(zhì)蛋白質(zhì)的大多數(shù)(Lis, H.，等人，Eur. J. Biochem. 218(1993) 1-27)。糖基化的引入是共翻譯和翻譯后修飾并且，因此不是遺傳控制的。寡糖的生物合成是涉及一些酶的多步驟過程，所述酶為底物彼此之間競爭。因此，糖基化的多肽包含寡糖的微多相系列，產(chǎn)生一套含有相同的氨基酸主鏈的不同的糖形。已經(jīng)報(bào)告了例如糖基化多肽的末端唾液酸化來增加治療劑的血清半壽期，并且含有末端半乳糖殘基的寡糖結(jié)構(gòu)的糖基化多肽顯示從循環(huán)中增加的清除(Smith, P. L.，等人，J.Biol. Chem. 268(1993)795-802)。因此，在治療多肽，例如免疫球蛋白的生物技術(shù)生產(chǎn)中，寡糖微多相性和它的批次與批次之間的一致性的評(píng)估是重要的任務(wù)。免疫球蛋白在它們的糖基化上明顯地與其他的重組多肽不同。例如免疫球蛋白 G(IgG)是分子量約150kDa的對(duì)稱的多功能的糖基化多肽。它由兩個(gè)相同的負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的Fab部分和負(fù)責(zé)效應(yīng)功能的Fc部分組成。IgG分子在Asn-297處的糖基化傾向于高度保守，所述Asn-297埋藏在重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域之間，與CH2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸殘基形成廣泛的接觸(Sutton, B. J.和 Phillips, D. C.，Biochem. Soc. Trans. 11 (1983) 130-132)。Asn-297 連接的核心寡糖結(jié)構(gòu)是多相加工的，以致特定的IgG存在多種糖形。在Asnj97位的位點(diǎn)占據(jù)上存在變化(宏多相性)或者在糖基化位點(diǎn)處的寡糖結(jié)構(gòu)存在變化(微多相性)，見例如 Jenkins, N.，等人，Nature Biotechnol. 14(1996)975-981。通常，在 IgG 單克隆抗體中更豐富的寡糖組是無唾液酸雙觸角復(fù)雜類型聚糖，主要是無半乳糖基化(GO)，單-半乳糖基化 (Gl)，或雙半乳糖基化(G2)類型(Ghirlandaio，R.，等人，Immunol. Lett. 68(1999)47-52)?？紤]到糖基化在重組的糖基化多肽的功能性質(zhì)上的重要性和成熟的并且一致的產(chǎn)品生產(chǎn)方法的必要性，在發(fā)酵過程中在線或者ad-line分析重組產(chǎn)生的糖基化多肽的糖基化譜是非常期望的。Kuhlmann (Kuhlmann, F. E.，等人，J. Am. Soc. Mass Spec. 6 (1995) 1221-1225)報(bào)告了后反相高效液相層析柱，其中將75%的丙酸溶液和25%的2-丙醇按照1 2的比例加入到柱體流中。具有電噴射電離質(zhì)譜(LCIMQ的高效液相層析和具有串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MS/MS)的液相層析被應(yīng)用到促紅細(xì)胞生成素(EPO)中位點(diǎn)特異性的糖類多相性分析中(Kawasaki， N.，等人，Anal. Biochem. 285 (2000) 82-91)。在US 2006/0269979中報(bào)告了用于診斷和監(jiān)測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他的自身免疫性疾病的高通量的聚糖分析。在WO 2009/048196中報(bào)告了糖蛋白的鑒定方法。在US 7，351，540中報(bào)告了蛋白質(zhì)的分離和分析。Siaw等人報(bào)告了用于人激肽釋放酶15的免疫熒光測(cè)定的發(fā)展(Clin. Biochem. 40 (2007) 104-110)。
發(fā)明_既述一方面本文報(bào)告了確定免疫球蛋白的糖基化的方法，其包括以下步驟-酶促消化免疫球蛋白，-將免疫球蛋白片段吸收到瓊脂糖(kpharose)珠上，-用包含三氟乙酸的溶液洗滌具有吸收的免疫球蛋白片段的瓊脂糖珠，-從瓊脂糖珠中回收免疫球蛋白片段，-對(duì)回收的免疫球蛋白片段進(jìn)行電噴射質(zhì)譜，并且-從質(zhì)譜數(shù)據(jù)中確定免疫球蛋白的糖基化。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用ES-MS確定免疫球蛋白糖基化的方法，所述方法不需要在免疫球蛋白的酶促消化之后和質(zhì)譜分析之前的層析純化步驟。人免疫球蛋白主要在297位的天冬酰胺殘基(ASM97)處糖基化，所述Asn297具有核心巖藻糖基化的雙觸角復(fù)雜寡糖(根據(jù)Kabat編號(hào))。Asn297指的是位于免疫球蛋白的Fc區(qū)域(Fe區(qū)域殘基的Eu編號(hào))約297位的天冬酰胺殘基。然而，由于免疫球蛋白中出現(xiàn)的微小的序列變化，Asn297也可能位于297位的上游或者下游的約士3個(gè)氨基酸，即在294位和300位之間。哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白通常包含分支的雙觸角的寡糖，所述寡糖通常通過N-連接附著到Fc區(qū)域的CH2結(jié)構(gòu)域的Asn297上(見，例如，Wright, Α.和 Morrison, S. L.，Trend. Biotechnol. 15 (1997) 26-32) 寡糖可以包括多種糖類，例如甘露糖，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖和唾液酸，以及在雙觸角寡糖結(jié)構(gòu)的“莖”中附著到GIcNAC的巖藻糖。每支臂中雙觸角糖結(jié)構(gòu)，即雙觸角寡糖以多達(dá)兩個(gè)半乳糖殘基結(jié)束。根據(jù)與中央的甘露糖殘基的鍵將臂表示為(1，6)和(1，3)。表示為GO的糖結(jié)構(gòu)不包含末端半乳糖殘基。表示為Gl的糖結(jié)構(gòu)在一支臂中包含一個(gè)或者多個(gè)半乳糖殘基。 表示為G2的糖結(jié)構(gòu)在每支臂中包含一個(gè)或者多個(gè)半乳糖殘基(Raju，Τ. S.，Bioprocess Int. 1 (2003)44-53)ο Kabat, Ε. Α.,等人’ Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)，和 Brueggemann，Μ.，等人，J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361 ；以及 Love，Τ. W.， 等人，Methods Enzymo 1. 178 (1989) 515-527 詳細(xì)報(bào)告了人恒定重鏈區(qū)。例如 Routier，F(xiàn). H.， Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207描述了抗體Fc部分的CHO類型的糖基化。術(shù)語“免疫球蛋白”包含多種形式的免疫球蛋白如人免疫球蛋白、人源化的免疫球蛋白、嵌合免疫球蛋白或者T-細(xì)胞抗原缺失的免疫球蛋白(見例如WO 98/33523， WO 98/52976,和 WO 00/34317)。例如在 Morrison，S. L.，等人，Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984)6851-6855 ；US 5，202，238 和 US5, 204，244 ；Riechmann, L.，等人，Nature 332 (1988) 323-327 ；Neuberger, M. S.，等人，Nature 314 (1985) 268-270 ；Lonberg, N.，Nat. Biotechnol. 23(2005) 1117-1125中描述了免疫球蛋白的基因改造。通常免疫球蛋白包含兩個(gè)所稱作的全長輕鏈多肽(輕鏈)和兩個(gè)所稱作的全長的重鏈多肽(重鏈)。每個(gè)全長重鏈多肽和輕鏈多肽包含可變結(jié)構(gòu)域(可變區(qū))(一般全長多肽鏈的氨基末端部分)，所述可變結(jié)構(gòu)域包含與抗原相互作用的結(jié)合區(qū)。每個(gè)全長重鏈和輕鏈多肽包含恒定區(qū)(一般羧基末端部分)。全長重鏈的恒定區(qū)介導(dǎo)抗體與i)具有Fc γ受體(Fe y R)的細(xì)胞(Fe y R)，如吞噬細(xì)胞結(jié)合，或者與ii)具有新生的Fc受體(Fcfoi)(也已知為Brambell受體)的細(xì)胞結(jié)合。它也介導(dǎo)與一些因子的結(jié)合，所述因子包括經(jīng)典的補(bǔ)體系統(tǒng)因子如成分(Clq)。全長免疫球蛋白的輕鏈或重鏈的可變結(jié)構(gòu)域依次包含不同的區(qū)段，即四個(gè)構(gòu)架區(qū)(FR)和三個(gè)高變區(qū)(CDR)?！叭L的抗體重鏈”是由N-端至C-端方向的抗體重鏈可變區(qū)(VH)、抗體恒定區(qū)1 (CHl)、抗體鉸鏈區(qū)、抗體恒定區(qū)2 (CH2)、抗體恒定區(qū) 3(CH3)以及在IgE亞類的抗體的情況下任選地抗體恒定區(qū)4(CH4)組成的多肽?！叭L的抗體輕鏈”是由N-端至C-端方向的抗體輕鏈可變區(qū)(VL)、抗體輕鏈恒定區(qū)(CL)組成的多肽。全長的抗體鏈通過CL-結(jié)構(gòu)域和CHl結(jié)構(gòu)域之間以及全長的抗體重鏈的鉸鏈區(qū)之間的鏈間二硫鍵連接到一起。近年來已經(jīng)報(bào)告了免疫球蛋白的糖基化，即糖組成和多種附著的糖結(jié)構(gòu)，對(duì)生物學(xué)性質(zhì)具有強(qiáng)烈的影響(見例如 Jefferis, R.，Biotechnol. Prog. 21 (2005) 11-16) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白包含以質(zhì)量計(jì)2-3%的寡糖(Taniguchi，Τ.，等人， Biochem. 24(1985)5551-5557)。這例如在G類(IgG)的免疫球蛋白中相當(dāng)于在小鼠來源的 IgG 中 2. 3 個(gè)寡糖鏈(Mizuochi，Τ.，等人，Arch. Biochem. Biophys. 257(1987)387-394) 和在人源的 IgG 中 2. 8 個(gè)寡糖鏈(Parekh, R. B.，等人，Nature 316 (1985) 452-457)，其中一般兩個(gè)寡糖鏈位于Fc-區(qū)的Asn297上而剩下的位于可變區(qū)(Saba，J. Α.，等人，Anal. Biochem. 305(2002) 16-31)。術(shù)語“羰基化”表示附著到免疫球蛋白全部氨基酸殘基上的全部寡糖的總和。由于細(xì)胞糖基化的異質(zhì)性，重組產(chǎn)生的免疫球蛋白不僅在特定的氨基酸殘基上包含單個(gè)的、 確定的N-或者0-連接的寡糖，還是多肽的混合物，所述多肽每種具有相同的氨基酸序列但是在各自特定的氨基酸位置上包含不同組成的寡糖。因此，上述術(shù)語表示一組寡糖，其附著到重組產(chǎn)生的免疫球蛋白的特定的氨基酸位置上，即附著的寡糖的異質(zhì)性。在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語“寡糖”表示多聚糖，其包含兩個(gè)或者多個(gè)共價(jià)連接的單糖單位。為表示不同的N-或者0-連接的寡糖，列舉了從寡糖殘基的非還原端至還原端的單個(gè)糖殘基。為了表示，選擇最長的糖鏈作為基本鏈。N-或者0-連接的寡糖的還原端是單糖殘基，其與免疫球蛋白的氨基酸主鏈的氨基酸直接結(jié)合，然而位于作為基本鏈的還原端的相反末端的N-或者0-連接的寡糖的末端，被稱為非還原端。一方面本文報(bào)告了確定免疫球蛋白的糖基化的方法，其包括以下步驟-酶促消化免疫球蛋白，-將免疫球蛋白片段吸收到瓊脂糖珠上，-用包含三氟乙酸的溶液洗滌具有吸收的免疫球蛋白片段的瓊脂糖珠，-從瓊脂糖珠中回收免疫球蛋白片段，-對(duì)回收的免疫球蛋白片段進(jìn)行電噴射質(zhì)譜，并且
-從質(zhì)譜數(shù)據(jù)中確定免疫球蛋白的糖基化。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過用包含三氟乙酸的溶液洗滌被吸附的免疫球蛋白片段可以實(shí)現(xiàn)免疫球蛋白糖基化的改進(jìn)的電噴射質(zhì)譜確定。在一個(gè)實(shí)施方案中，三氟乙酸的濃度從0.01% 至(體積/體積)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，三氟乙酸的濃度從0.05%至0.5% (體積/ 體積)。在再一個(gè)實(shí)施方案中，三氟乙酸的濃度是約0.1% (體積/體積)。此外，在酶促消化后可以進(jìn)行層析純化步驟但不是必需的。從以下的表1中可以看出用三氟乙酸洗滌明顯地提高了定量確定的準(zhǔn)確性并且同時(shí)降低了分析結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(VK)。表1 比較示例性的抗-CCR5抗體的糖基化測(cè)定的示例性結(jié)果。一式三份進(jìn)行該測(cè)定。通過具有脈沖電流檢測(cè)的離子交換層析已經(jīng)確定了參考值(Fuc =巖藻糖)。
糖結(jié)構(gòu)參！ ^M三氟乙酸洗漆[%] K三氟乙酸洗漆[%]
I /oj
__值標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)
甘露糖_
JVZ 23.4 0.6 2.7 22.4 0.3 1.3 $藻糖28.4______
^^^10.9 1.09.3 10.8 1.0 9.3
G(O) 44.3 40.1 3.07.5 43.4 0.41.0
G(I) 25.2 19.4 1.79.0 19.9 0.21.1
G(2) 2.1 6.2 3.861.1 3.4 0.7 21.9術(shù)語“瓊脂糖”(kpharose)表示交聯(lián)形式的瓊脂糖(agarose)。瓊脂糖(agarose) 是包含作為單體結(jié)構(gòu)單元的瓊脂二糖的線性多糖，所述瓊脂二糖又是由糖苷鍵連接的 D-半乳糖和3，6-去水-L-吡喃半乳糖組成的二糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，酶促消化通過與酶溫育進(jìn)行，所述酶選自胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、IdeS和內(nèi)切蛋白酶Arg C, Lys C以及Glu C。在另一個(gè)實(shí)施方案中，酶促消化通過與胰蛋白酶溫育進(jìn)行。已經(jīng)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在洗滌步驟使用含有78%至88% (體積/體積)濃度乙腈的溶液是有利的。在一個(gè)實(shí)施方案中，乙腈濃度是從80%至85% (體積/體積)。在另一個(gè)實(shí)施方案中乙腈濃度是約83% (體積/體積)。術(shù)語“約”表示其后的值是該值的+/-10%的范圍中心。在該范圍之外的值對(duì)定量確定具有負(fù)的影響。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中洗滌步驟的溶液包含約0. (體積/體積)三氟乙酸和約83% (體積/體積)的乙腈。在一個(gè)實(shí)施方案中包括用78%至88% (體積/體積)的乙腈和水組成的溶液洗滌瓊脂糖珠的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中方法包括用80%至85% (體積/體積)的乙腈和水組成的溶液洗滌瓊脂糖珠的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中用約83% (體積/體積)的乙腈和水組成的溶液洗滌。在又一個(gè)實(shí)施方案中方法包括將酶促消化的溶液調(diào)整至78%至88% (體積/體積) 的乙腈的步驟。在又一個(gè)實(shí)施方案中方法包括將酶促消化的溶液調(diào)整至80%至85% (體積/體積)的乙腈的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中調(diào)整至約83% (體積/體積)的乙腈。在另一個(gè)實(shí)施方案中方法包括用78%至88% (體積/體積)的乙腈的第二次洗滌步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中方法包括用80%至85% (體積/體積)的乙腈的第二次洗滌步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中第二次洗滌是用約83% (體積/體積)的乙腈。如果在本申請(qǐng)中參考的是體積比(體積/體積)，應(yīng)用以下-取決于預(yù)期的終體積，從預(yù)期的終體積計(jì)算乙腈級(jí)分的相對(duì)體積，例如83%，-提供計(jì)算的乙腈相對(duì)體積并且加入水直到得到預(yù)期的終體積，
-其后加入三氟乙酸的相對(duì)體積級(jí)分，所述相對(duì)體積基于預(yù)期的終體積計(jì)算。例如，通過提供830ml乙腈(1000ml的83% )，另外加入水直到達(dá)到IOOOml的體積，并且其后加入Iml (1000ml的0. (體積/體積))的三氟乙酸得到由0. 1 % (體積/ 體積)的三氟乙酸，83% (體積/體積)的乙腈和水組成的一升(1000ml)溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中方法包括用變性劑使免疫球蛋白變性的第一步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中在PH 8. 5時(shí)變性。在一個(gè)實(shí)施方案中溶液由0.1% (體積/體積)三氟乙酸， 83% (體積/體積)的乙腈和水組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中瓊脂糖珠是瓊脂糖CL-4B珠。 在一個(gè)實(shí)施方案中應(yīng)用到瓊脂糖珠持續(xù)5分鐘。在另一個(gè)實(shí)施方案中方法包括用水洗滌瓊脂糖珠的步驟。在此步驟中從瓊脂糖珠中回收了免疫球蛋白片段。已經(jīng)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)不加入含有25% /75% (體積/體積)的2_丙醇/丙酸溶液，純化的糖肽的離子化非常差。因此，盡管方法中沒有加入，通過額外加入含有25%/75% (體積/體積)的2-丙醇/丙酸溶液可以進(jìn)一步改進(jìn)它。另外，如果加入含有25%/75% (體積/體積)的2-丙醇/丙酸溶液，可以增加存在更高的帶電狀態(tài)的糖肽，其可以用于不同的糖肽種類的正確定量。這可從表2的巖藻糖基化和GQ)形式看出。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括將免疫球蛋白片段與由25% (ν/ν)的2-丙醇和75% (ν/ν)的丙酸組成的溶液混合的步驟。表2 示例性的抗-CCR5抗體的糖基化測(cè)定的示例性結(jié)果的比較。一式三份進(jìn)行該確定。通過具有脈沖電流檢測(cè)的離子交換層析已經(jīng)確定了參考值(Fuc =巖藻糖)。
權(quán)利要求
1.確定免疫球蛋白的糖基化的方法，所述方法包括-酶促消化免疫球蛋白，-將免疫球蛋白片段吸收到瓊脂糖(kpharose)珠上，-用包含三氟乙酸的溶液洗滌具有吸收的免疫球蛋白片段的瓊脂糖珠，-從瓊脂糖珠回收免疫球蛋白片段，-對(duì)回收的免疫球蛋白片段進(jìn)行電噴射質(zhì)譜，和-從質(zhì)譜數(shù)據(jù)確定免疫球蛋白的糖基化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于洗滌步驟中三氟乙酸的濃度是從0.05%至 0.5% (體積/體積)。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于通過將溶液中的免疫球蛋白與酶溫育來進(jìn)行酶促消化，所述酶選自胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、IdeS, ArgC, Lys C和 Glu C。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于包括將酶促消化物的溶液調(diào)節(jié)到 78%至88% (體積/體積)乙腈的步驟。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于包括在包含三氟乙酸、78%至88% (體積/體積)的乙腈和水的溶液中將免疫球蛋白片段吸收到瓊脂糖珠的步 驟。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于包括使用由78%至88%(體積/體積)的乙腈和水組成的溶液對(duì)瓊脂糖珠的第二次洗滌步驟。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于包括通過用水洗滌瓊脂糖珠回收免疫球蛋白片段的步驟。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于包括回收步驟之后將免疫球蛋白片段與包含25% (體積/體積)的2-丙醇和75% (體積/體積)的丙酸的溶液混合的步驟。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法在分析免疫球蛋白的糖基化中的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其特征在于所述分析是ad-line分析或者高通量分析。
全文摘要
本文報(bào)告了用電噴射質(zhì)譜確定免疫球蛋白糖基化的方法，所述方法在免疫球蛋白的消化之后和質(zhì)譜分析之前不需要層析純化步驟。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102483408SQ201080039061
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月7日
發(fā)明者D·羅伊施, M·烏萊爾, M·哈伯格, M·塞爾曼 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司