專利名稱：生物發(fā)光體內(nèi)評價的組合物和方法
技術領域：
本公開涉及用于評估活體生物體中生物發(fā)光的試劑領域。具體地，本文所述的組合物和方法用于標準化含生物發(fā)光蛋白的生物體中觀察到的生物發(fā)光信號，采用熒光染料。
背景技術：
攜帶產(chǎn)生光的蛋白編碼基因的轉基因動物中光的檢測是診斷、藥物發(fā)現(xiàn)和醫(yī)療中的有力工具，其可在活體動物中鑒定疾病路徑、檢測作用機制、評價藥物化合物的效力并監(jiān)控引導候選物對疾病發(fā)展的影響。參見例如，美國專利號7，449，615 ；7, 255，851 ； 7，198，774 ；6，939，533 ；6，923，951 ；6，916，462 ；6，908，605 ；6，890，515 ；6，649，143 ； 6，217，847 ；和 5，650，135。在生物發(fā)光蛋白的情況中，底物通常在評價前給予所述動物。例如，在ATP存在下熒光素酶(如真核Iuc基因編碼的)催化D-熒光素(D-(-)-2-(6’ -羥基-2’苯并硫唑基)噻唑啉-4-羧酸)的氧化以產(chǎn)生光信號。所述底物的可利用性顯示影響光子發(fā)射效率。參見例如 Lee 等· (2003)Nuclear Medicine Communications 24 :1003-1009 ；Berger 等.Q008)Eur. J. Nuclear Medicine and Mol. Imaging 35(12) :2275-22850 已制備熒光素的各種衍生物，包括其中熒光素共價結合靶向部分(參見例如美國專利號4，665, 022)或熒光標記(參見例如獲自普洛麥格公司(!Iomega)的5_氟熒光素)以及6_取代D-熒光素酯的制劑用于評價殺蟲劑(參見例如美國專利號5，374，534)。盡管生物發(fā)光成像技術廣泛使用，但仍需要改良的檢測、定量和驗證活體動物生物發(fā)光的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過提供與給予所述動物的生物發(fā)光底物共分布的示蹤染料，包括評價和確定活體動物中生物發(fā)光的組合物和方法。因此，在一個方面，本文所述的組合物含生物發(fā)光底物和示蹤染料。在某些實施方式中，所述生物發(fā)光底物包含熒光素且所述示蹤染料包含熒光染料。另一方面，本發(fā)明描述了對含生物發(fā)光蛋白的活體動物中檢測的生物發(fā)光信號標準化的方法，通過將本文所述含生物發(fā)光底物(如熒光素)和示蹤染料(如熒光示蹤染料) 的組合物給予動物、檢測所述生物發(fā)光底物和蛋白的反應產(chǎn)生的生物發(fā)光信號、檢測所述示蹤染料的信號(如熒光)并將所述生物發(fā)光信號相對所述示蹤染料的信號標準化。所述標準化可包括發(fā)現(xiàn)平均熒光信號并檢測個體動物中的熒光信號與平均熒光信號的偏差。若所述偏差大于設定量(如大于或小于平均30% )，則所述動物可重新成像。在某些實施方式中，通過下示一個或多個公式(1)、(幻和C3)來完成所述標準化。在某些實施方式中，通過計算機程序(如軟件)完成標準化。在另一個方面，本文描述了驗證生物發(fā)光底物(如熒光素)是否通過血流注入活體動物的方法，通過將本文所述含生物發(fā)光底物(如熒光素)和示蹤染料(如熒光示蹤染料)的組合物給予所述動物，定位所述示蹤染料發(fā)出的信號，其中若所述示蹤染料信號定位在注射位置，則所述生物發(fā)光底物不通過所述血流分布。在另一方面，本文提供含用于進行本文所述方法的任何本文所述組合物的試劑盒。在某些實施方式中，所述試劑盒獨立或在同一容器中含生物發(fā)光底物和示蹤染料。所述試劑盒還可包括有關試劑重建、將試劑注射入活體動物和/或成像、標準化和驗證方案的說明。根據(jù)本文的公開內(nèi)容，本領域技術人員容易理解這些及其他實施方式。附圖簡要說明

圖1是注射熒光素/熒光染料制劑的小鼠中生物發(fā)光的概圖。感興趣區(qū)域(ROI) 的生物發(fā)光用圓圈標注。圖2的圖A和B描述注射熒光素/染料制劑的小鼠中熒光的背面觀(圖2A)和腹面觀(圖2B)。感興趣區(qū)域(ROI)的熒光用圓圈標注。圖3顯示注射熒光素/染料制劑的動物中的生物發(fā)光(上圖，BLI標記)和熒光 (下圖，F(xiàn)LI標記)。動物編號示于圖上方。圖4顯示所示個體動物中與所述平均熒光(FLI)信號的改變百分比。圖5顯示用熒光(FLI)信號標準化的生物發(fā)光(BLI)。發(fā)明詳述除非另有說明，本發(fā)明的實施將采用本領域技術之內(nèi)的化學、生物化學和重組DNA技術的常規(guī)方法。這些技術在文獻中已有充分描述。參見例如A.L.Lehninger， Biochemistry (《生物化學》)(沃斯出版公司(Worth Publishers, Inc.)，最新增補)； Sambrook，等.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (《分子克隆實驗室手冊》)(第二版，1989) ；Short Protocols in Molecular Biology (《精編分子生物實驗指南》)，第四版.(Ausubel 等編，1999，約翰威立出版公司(John Wiley & Sons) ；Molecular Biology Techniques =An Intensive Laboratory Course (《分子生物學技術強化實驗室課程》)， (Ream 等編，1998，學院出版社(Academic Press)) ；PCR(Introduction to Biotechniques Series) ( ((PCR(生物技術入門系列)》)，第二版· (Newton和Graham編·，1997，施普林格出版社(Springer Verlag))；和 Methods In Enzymology (《酶學方法》)(S. Colowick 和 N. Kaplan 編·，學術出版社公司(Academic Press, Inc.))。本文之前和之后引用的所有出版物、專利和專利申請通過引用全文納入本文。1 定義本發(fā)明的描述中會使用下述術語且旨在如下所示定義。必須注意，除非上下文另外明確說明，否則在本說明書和所附權利要求中使用的單數(shù)形式的“一個”、“一種”和“所述”包括復數(shù)指代物。因此，例如“一種核酸”包括兩種或更多核酸的混合物等。
如本文所用，“發(fā)光”指可檢測的電磁(EM)輻射，一般為放能的化學過程的激發(fā)產(chǎn)物回到其基態(tài)時發(fā)出光所產(chǎn)生的UV、頂或可見光?；瘜W發(fā)光是由于化學反應產(chǎn)生的發(fā)光。 生物發(fā)光是用生物分子(或其合成形式或類似物)作為底物和/或酶的化學反應產(chǎn)生的化學發(fā)光。因此，“生物發(fā)光”指生物分子，具體是蛋白發(fā)出的光。生物發(fā)光的必需條件是在加氧酶、熒光素酶和ATP存在時結合或游離的分子氧在底物熒光素上作用。通過酶或其他蛋白(如熒光素酶)產(chǎn)生生物發(fā)光，所述酶或其他蛋白是在底物(如熒光素)上作用并使所述底物轉化為激發(fā)態(tài)的加氧酶，該底物在回到低能量水平時以光的形式釋放能量。用于產(chǎn)生生物發(fā)光的底物和酶分別包括例如熒光素和熒光素酶。所述熒光素和熒光素酶可來自任何物種。除非另有說明，“熒光素酶”包括原核和真核熒光素酶，以及具有變化或改變的光學性質(zhì)的變體，如產(chǎn)生不同顏色光的熒光素酶(如Kajiyama和Nakano (1991) Protein Engineering 4(6) :691693)?！盁晒馑亍敝笩晒馑孛傅牡孜铩晒馑厥怯杀讲⑧邕虿糠诌B接噻唑羧酸部分組成的低分子量有機化合物。在螢火蟲和其他動物中發(fā)現(xiàn)熒光素，其在ATP和所述酶即熒光素酶存在時發(fā)光。熒光素可穿過血腦屏障、血液胎盤屏障和血液睪丸屏障而在動物中快速分布且毒性看起來較低。熒光素在動物體內(nèi)容易快速分布。熒光素對動物沒有有害影響(沒有毒物學和免疫學影響的證據(jù))。“產(chǎn)生光”定義為通過化學反應或輻射吸收能產(chǎn)生光?！爱a(chǎn)生光的蛋白”或“發(fā)射光的蛋白”是能產(chǎn)生光的蛋白。通常，所述光在可見范圍內(nèi)(約350nm-800nm之間)。例子包括生物發(fā)光蛋白如熒光素酶，例如細菌和螢火蟲熒光素酶。本文所用的“動物”通常指非人哺乳動物，包括但不限于農(nóng)場動物如牛、綿羊、豬、 山羊和馬；家養(yǎng)哺乳動物如狗和貓；實驗室動物包括嚙齒類如小鼠、大鼠和豚鼠；包括家養(yǎng)、野生和狩獵鳥類在內(nèi)的禽類如雞、火雞和其他鶉雞類禽、鴨、鵝等。該術語不表示特定年齡。因此，旨在涵蓋成年和新生個體。“轉基因動物”指遺傳工程改造動物或遺傳工程改造動物的后代。轉基因動物通常含來自至少一種不相關生物體的物質(zhì)，如來自病毒、植物或其他動物。本發(fā)明的“非人動物”包括脊椎動物如嚙齒類、非人靈長類、綿羊、狗、牛、兩棲類、鳥、魚、昆蟲、爬行動物等。術語“嵌合動物”用于表示含異源基因的動物或所述異源基因在該動物的一些但并不是全部細胞中表達的動物。如本文所用，術語“示蹤染料”指任何分子，將所述分子與所述生物發(fā)光底物一起注入時，其以與所述發(fā)光底物相同或相似的方式分布于整個動物中?！笆聚櫲玖稀钡姆窍拗菩岳影ǖ幌抻诜派湫酝凰亍晒夥肿?、化學發(fā)光素、發(fā)色團、酶、酶底物、酶輔助因子、酶抑制劑、半導體納米顆粒、染料、金屬離子、金屬溶膠等。術語“熒光劑”指能發(fā)出可檢測范圍熒光的物質(zhì)或其部分。2.概述在詳細描述所述組合物和方法之前，應理解，本發(fā)明不限于具體制劑或方法參數(shù)， 因為它們當然可能變化。還應當理解本文所使用的術語僅為了描述特定的實施方式而不是限制性的。
盡管可使用許多與本文所述的相似或等價的方法和材料，本文描述示例性的優(yōu)選材料和方法。本發(fā)明涉及含生物發(fā)光底物和一種或多種示蹤染料的組合物(如試劑)。配制這些試劑用于注入活體動物從而所述示蹤染料和底物在該動物體內(nèi)相似分布。因此，來自所述示蹤染料的信號可在提供發(fā)光信號的組織中檢測，所述示蹤染料的信號用于審核和標準化所述試劑中的底物與所述動物中的熒光素酶的反應產(chǎn)生的生物發(fā)光信號。根據(jù)生物發(fā)光信號標準化所述示蹤染料信號使所述生物發(fā)光檢測具有更好的統(tǒng)計效力。此外，本文所述組合物和方法可用于驗證所述生物發(fā)光底物是否注射入生物體內(nèi)所需的靶標中。例如，若所述生物發(fā)光底物旨在注射入腹腔中從而通過血流在整個動物中分布，但其被錯誤的注射入小腸中，存在的示蹤染料能使研究人員確認所述底物沒有被捕獲到該動物中不需要的位置。試劑本文所述組合物(試劑)包括生物發(fā)光蛋白的底物和示蹤染料。生物發(fā)光底物和含這些底物的制劑在本領域熟知且市售可得。在某些實施方式中，本發(fā)明的生物發(fā)光底物含熒光素(如D-熒光素)。對于本文所述的試劑，所述熒光素通常提供為限定重量的鉀鹽。也可使用液體試劑。在優(yōu)選的實施方式中，在合適的緩沖液 (如DPBQ中于所述動物成像前即刻制備含熒光素試劑的新鮮儲液，并將所述儲液過濾滅菌，例如通過0.2μΜ濾膜。 干燥的熒光素可以需要的濃度重建，通常為10-50mg/ml。在某些實施方式中，重建所述熒光素從而所述儲存試劑為30mg/ml。技術人員可容易地確定劑量。通常對于給藥，熒光素以約150mg/kg的劑量給藥。因此，對于30g動物，應給予150 μ 1的30mg/ml熒光素溶液以遞送4. 5mg熒光素給該動物。含熒光素的試劑可通過任何合適方法給予活體動物，包括但不限于通過靜脈內(nèi)、 皮下、腹膜內(nèi)、肌肉途徑等。通常，熒光素經(jīng)腹膜內(nèi)給予活體動物，任選地用麻醉劑。熒光素動力學研究可按照生產(chǎn)商(如卡鉗生命科學公司(Caliper Life Sciences))提供的說明實施。如上所述，本文所述組合物還含示蹤染料?？墒褂萌魏畏嵌拘郧矣谏锇l(fā)光底物 (如熒光素)一起在動物體內(nèi)分布的示蹤染料。在某些實施方式中，所述示蹤染料是熒光團。本領域熟知熒光染料，包括但不限于6-FAM(熒光素)(發(fā)射綠光)、Cy 3 (發(fā)射紅光)、 Cy 3.5(發(fā)射紫紅光)、Cy 5 (發(fā)射紫光),Cy 5.5(發(fā)射藍光)、Cy 7 (發(fā)射近紅外光)、吲哚菁綠、DyLight 350 (發(fā)射紫光)、DyLight 405 (發(fā)射紫光)、DyLight 488 (發(fā)射綠光)、 DyLight 549 (發(fā)射黃光)、DyLight 594 (發(fā)射橙光)、DyLight 633 (發(fā)射紅光)、DyLight 649 (發(fā)射紅光)、DyLight 680 (發(fā)射遠紅光)、DyLight 750 (發(fā)射近紅外光)、DyLight 800(發(fā)射近紅外光)Alexa Fluor 488 (發(fā)射青綠光)、Alexa Fluor 568 (發(fā)射橙光)、Alexa Fluor 750(發(fā)射紅光)、CF 488(發(fā)射綠光)、CF 555(發(fā)射橙光)、CF 750(發(fā)射紅光)。熟知所選熒光染料的最大激發(fā)光和最大發(fā)射光，且顯而易見選擇所述示蹤染料以在與所述生物發(fā)光蛋白不同的波長發(fā)射從而區(qū)分所述生物發(fā)光信號和來自所述示蹤染料的信號。所述示蹤染料可在所述熒光素前或后添加到所述含熒光素的溶液中。因此，所述示蹤染料可在所述熒光素于合適緩沖液中重建后添加。
顯而易見本文所述組合物中包括的示蹤染料的濃度按照所選的染料在一定范圍內(nèi)變化。成像用本文所述的熒光素和示蹤染料組合物處理的動物如美國專利號5，650，135和 7，449，567所述以及如IVIS 成像系統(tǒng)的生產(chǎn)商卡鉗生命科學公司提供的材料所述成像。體內(nèi)成像可用肉眼或任何類型照相機(或錄像機)進行。在某些實施方式中，用靈敏度足以檢測所述生物發(fā)光信號且動態(tài)范圍寬到足以檢測所述熒光信號的加強CCD照相機來成像。合適的照相機在本領域已知且包括但不限于用Livinglmage 軟件(卡鉗生命科學公司)控制的整合成像系統(tǒng)(IVIS 成像系統(tǒng)，卡鉗生命科學公司)。含所述生物發(fā)光底物(如熒光素)和示蹤染料的試劑通常以150mg/kg體重 (30mg/ml熒光素儲液)的熒光素劑量在成像前約1分鐘_1小時之間注射到腹膜內(nèi)腔中， 優(yōu)選在成像前1-10分鐘之間，包括約1、2、3、4、5、6、7、8或9分鐘。小鼠通常需麻醉(如戊巴比妥鈉(Nembutal) (25_50mg/kg體重)或在含異氟烷/氧氣混合物的氣室中且將異氟烷管置于動物鼻子上)，并在麻醉下置于成像臺上。動物一側或多側生物發(fā)光通常成像約1-5 分鐘之間，熒光為0. 5-5秒鐘。熒光信號成像時，根據(jù)所選染料可使用745nm的激發(fā)光和 SOOnm的發(fā)射光。生物發(fā)光(光子發(fā)射)和熒光可用Livinglmage 軟件(卡鉗生命科學公司)定量°方法本文所述組合物可標準化生物發(fā)光信號且可實時驗證所述生物發(fā)光底物的合適分布。為了標準化值，按照前述的標準方案檢測感興趣區(qū)域的生物發(fā)光信號。對于熒光檢測，從遠離注射的位置選擇感興趣的區(qū)域以確定所述染料和底物的全身分布。按照標準方案定量所述感興趣的區(qū)域并以效率單位記錄。個體動物的熒光信號可與動物組在具體時間點檢測的平均信號或縱向研究中不同時間點檢測的單一動物的平均值相比較。與所述平均信號偏離大于預定百分比(如大于10%之間，更優(yōu)選約20%之間，更加優(yōu)選大于30%)的熒光信號表示異常的底物注射，相關生物發(fā)光檢測應棄去或重復。與所述平均值偏離百分比較小的熒光信號可指示注射差異且所述偏離百分比用于校正所述生物發(fā)光信號?？赏ㄟ^計算機或人工進行標準化計算。此外，本文所述的組合物還可驗證所述生物發(fā)光底物在對象動物中的分布。具體地，若試圖讓所述生物發(fā)光底物通過血流分布(如通過IP注射到腹部)，則監(jiān)控所述熒光團定位的能力可提供注射的實時信息，例如所述生物發(fā)光底物是否定位于身體區(qū)域或部分之內(nèi)(如小腸)。試劑盒本發(fā)明還包括含本文所述試劑并用于進行本文所述方法的試劑盒。具體地，這些試劑盒通常包括預制的熒光素/示蹤染料試劑或熒光素和示蹤染料的單獨元件。所述試劑盒任選地包括緩沖液和容器以及進行本文所述方法的書面說明。在預包裝試劑的情況中， 所述試劑盒任選地包括可納入本方法而不用測量的預先測量或預先定劑量的試劑，如預先測量的液體等分試樣，或者預先稱重或預先測量的固體試劑，其可被所述試劑盒的最終使用者容易地重建。3.實驗以下為實施本發(fā)明的具體實施方式
的示例。實施例僅提供用于說明目的，并非旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1 制備牛物發(fā)光/熒光組合物和成像如下制備熒光素/染料制劑。IOmL的DPBS加入IOmg的DL800以溶解所述染料， 并等分為Iml儲液(DL800儲液)。99mL的DPBS加入3g的D-熒光素(螢火蟲)鉀鹽。ImL 的DL800儲液加入99mL的D-熒光素以制備最終熒光素/染料，熒光染料濃度為9. 7ug/mL 且D-熒光素濃度為30mg/mL。含原位腫瘤的小鼠腹膜內(nèi)(i. p.)注射150 μ L的熒光素/熒光染料工作溶液。注射后6分鐘將該小鼠放入IVIS 成像系統(tǒng)(卡鉗生命科學公司)的干凈Plexiglas麻醉盒 (2. 5-3.5%異氟烷)中，其可無障礙目測監(jiān)控該動物(如目測確定呼吸)。給所述盒提供所述麻醉的管垂直于所述成像室內(nèi)部的麻醉總管。該小鼠完全麻醉后，將其從所述盒轉移到連接成像室中總管的鼻錐處并關門，啟動計算機屏幕上的“獲取(Acquire)”按鈕(Living ImageIM序部分)。對于生物發(fā)光成像，根據(jù)所述實驗，每側的成像時間至多5分鐘(背/腹)。當所述小鼠從背面轉到腹面(或反之亦然)，可明顯地觀察其生命力的任何變化。生物發(fā)光成像采用所述成像室中的阻斷和開放(Block and Open)濾器。對于熒光成像，根據(jù)所述實驗，每側的成像時間為0. 5-5秒鐘(背/腹)。熒光信號成像時，使用745nm激發(fā)光和SOOnm發(fā)射光。用Living ImageE程序選擇所述過濾對。用Living ImageK程序如下定量生物發(fā)光和熒光信號。對于生物發(fā)光，在表達發(fā)光信號的區(qū)域周圍畫出感興趣的區(qū)域(ROI)(圖1)。該信號記錄為光子/秒。對于熒光定量， 感興趣的區(qū)域遠離i. P.注射所述底物的腹部區(qū)域以更好的讀取底物的全身分布(參見圖 2A和2B)。對于背面圖，在頸背(頸部背后)區(qū)域周圍畫出ROI用于定量所述參比熒光信號(圖2A)，而對于腹面圖，在胸腔區(qū)域周圍畫出ROI (圖2B)。以效率單位記錄熒光信號。成像結果示于表1和圖3中。在圖3中，上圖顯示生物發(fā)光，下圖顯示熒光。在各組圖上方提供動物編號。表 權利要求
1.一種含生物發(fā)光底物和示蹤染料的組合物。
2.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述生物發(fā)光底物包括熒光素。
3.如權利要求1或2所述的組合物，其特征在于，所述示蹤染料包括熒光染料。
4.一種對含生物發(fā)光蛋白的活體動物中檢測的生物發(fā)光信號標準化的方法，所述方法包括將如權利要求3所述的組合物給予多種活體動物；檢測各動物中所述生物發(fā)光底物和生物發(fā)光蛋白的反應產(chǎn)生的生物發(fā)光信號；檢測各動物中的所述示蹤染料信號；和根據(jù)各動物中所述示蹤染料信號標準化所述生物發(fā)光信號。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述示蹤染料的信號用下述公式確定為熒光標準化因子(FLI)百分比公式(1):(熒光(FLI)信號-平均熒光(FLI)信號)/平均FLI信號。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述標準化步驟包括步驟(a)用下述公式確定生物發(fā)光(BLI)標準化值公式O) BLI標準化值=BLIXFLI標準化因子；和(b)用下述公式確定標準化的生物發(fā)光信號公式(3)標準化BLI = BLI-BLI標準化值
7.如權利要求4-6中任一項所述的方法，其特征在于，所述標準化步驟用計算機程序?qū)崿F(xiàn)。
8.—種驗證生物發(fā)光底物經(jīng)血流注射入活體動物的方法，所述方法包括步驟將如權利要求3所述的組合物給予動物；定位所述示蹤染料發(fā)射的信號，其中若所述示蹤染料信號定位于注射位置，則所述生物發(fā)光底物不在所述血流中分布。
9.一種試劑盒，所述試劑盒包含如權利要求1-3中任一項所述的組合物。
10.如權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括選自下組的說明重建所述組合物的說明、給予所述組合物的說明、進行活體動物成像的說明、進行標準化的說明、進行驗證的說明及其組合。
全文摘要
描述用于標準化活體動物中生物發(fā)光信號的組合物和方法。
文檔編號G01N21/76GK102575282SQ201080041867
公開日2012年7月11日 申請日期2010年9月16日 優(yōu)先權日2009年9月18日
發(fā)明者D·安薩爾迪, N·張, R·辛格, S·奧德菲爾德 申請人:卡鉗生命科學公司