專利名稱：臨床前測試免疫調(diào)節(jié)藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測試用于T-細(xì)胞活化的預(yù)期或已知免疫調(diào)節(jié)藥物的方法，包括以下步驟在體外使外周血單核細(xì)胞(PBMC)培養(yǎng)物與預(yù)定量的所述預(yù)期或已知免疫調(diào)節(jié)藥物接觸；以及當(dāng)與所述預(yù)期或已知免疫調(diào)節(jié)藥物接觸時(shí)，使用讀出系統(tǒng)觀察用于T-細(xì)胞活化的所述PBMC培養(yǎng)物，其中調(diào)節(jié)PBMC預(yù)培養(yǎng)物的細(xì)胞密度使得所述PBMC能夠細(xì)胞-細(xì)胞接觸，并且其中培養(yǎng)所述PBMC預(yù)培養(yǎng)物至少12h。本發(fā)明進(jìn)一步涉及在體外測試減弱細(xì)胞因子風(fēng)暴的藥物的方法。在本說明書中，引用了包括專利申請和廠家手冊在內(nèi)的許多文獻(xiàn)。在不考慮這些文獻(xiàn)公開的內(nèi)容與本發(fā)明的可專利性相關(guān)的情況下，將其公開的全部內(nèi)容在此都以引用的方式并入本文。尤其是，以引用的方式并入的所有引用文獻(xiàn)的程度與將各個(gè)單獨(dú)的文獻(xiàn)具體地且單獨(dú)地指出將以引用的方式并入的程度是相同的。
背景技術(shù)：
在兩種系統(tǒng)中臨床前評價(jià)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞活性的免疫治療藥物動物模型，通常為嚙齒動物，并且如果可能，為靈長類動物；和人外周血單核細(xì)胞(PBMC)的培養(yǎng)物。通常使用PBMC，這是因?yàn)?，首先，它們包含所有亞型的淋巴?xì)胞和單核細(xì)胞，其次，它們可以很容易地從健康供體或從患者抽取的靜脈血中得到。對這些PBMC的體外刺激被認(rèn)為是預(yù)期免疫調(diào)節(jié)藥物的體內(nèi)活性的有用指示劑。某些T-細(xì)胞活化劑，尤其是針對T-細(xì)胞抗原受體(TCR)的單克隆抗體(mAb)，例如，0KT3 (第一個(gè)用于臨床免疫抑制的mAb)，誘發(fā)促炎細(xì)胞因子的系統(tǒng)性釋放(Abramowicz等，1989)。它們中最危險(xiǎn)是TNF、干擾素-γ (IFN-γ)和IL-2。在接受mAb治療的患者中，這種細(xì)胞因子釋放綜合征或“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的控制通常通過高劑量的皮質(zhì)類固醇治療來實(shí)現(xiàn)。TGN1412是對通過人T-細(xì)胞表達(dá)的共刺激分子⑶觀具有特異性的lgG4亞類的人源化單克隆抗體(mAb)。由于與典型的CD28-特異性mAb不同，所以它被稱作“CMS超拮抗劑”(CD^SA)，在沒有T-細(xì)胞抗原受體(TCR)的協(xié)同作用的情況下它可以活化T-淋巴細(xì)胞(Hunig，2007)。TGN1412 由現(xiàn)已不存在的 iTeGenero AG，Wiirzburg 開發(fā)。2006年3月13日，在倫敦的Norttiwick Park醫(yī)院由獨(dú)立的Parexel臨床試驗(yàn)單位(Clinical Trial Unit)進(jìn)行的第一次人體試驗(yàn)中，對健康人類志愿者靜脈施用100 μ /kg體重的TGN1412，導(dǎo)致了威脅生命的細(xì)胞因子釋放綜合征，只有將志愿者轉(zhuǎn)移到醫(yī)院的重癥監(jiān)護(hù)室后才控制住這種癥狀(Suntharal ingam等，2006)。由贊助者TeGenero AG提供的臨床前研究顯示，在使用鼠-⑶觀-特異性超拮抗劑的類似鼠模型中以及在接受比人類志愿者高至50倍劑量的自身TGN1412的獼猴中，沒有發(fā)現(xiàn)所述“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的證據(jù)(Duff，2006)。此外，向人PBMC的培養(yǎng)物中加入TGN1412也沒有導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放。所有關(guān)鍵的猴子和PBMC培養(yǎng)物試驗(yàn)由代表政府專家科學(xué)組行動的英國國家生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和控制協(xié)會(British National Institute for BiologicalStandards and Control,NIBSC)在I期臨床試驗(yàn)中重復(fù)進(jìn)行，并證實(shí)了 TGN1412在這些體系中的無毒特性(Duff，2006)。在TGN1412試驗(yàn)失敗后三年，仍沒有澄清為什么這種體外試驗(yàn)沒有對人類志愿者經(jīng)歷的細(xì)胞因子風(fēng)暴作出警告。在注射CMSSA以后，嚙齒動物和獼猴沒有釋放有毒的系統(tǒng)性細(xì)胞因子，顯然是由于完整免疫系統(tǒng)對這種藥劑的反應(yīng)性的種間差異造成的，并且已經(jīng)給出了針對這種差異的具體意見(Gogishvili 等，2009 ；Nguyen 等，2006 ；Schraven 和 Kalinke, 2008)。這些發(fā)現(xiàn)表明，由于物種特異性反應(yīng)模式不同，即使靈長類動物模型對于人類對新藥的反應(yīng)性來說也不總是安全的預(yù)測者。人類具有大約IO12個(gè)τ-淋巴細(xì)胞，在任何給定時(shí)刻在血液中循環(huán)的淋巴細(xì)胞還不到上述的百分之一。因此，培養(yǎng)的PBMC沒有應(yīng)答TGN1412，或者是由于與位于淋巴組織中的那些細(xì)胞(在志愿者中明顯以細(xì)胞因子釋放應(yīng)答)相比在這些細(xì)胞中的功能缺陷導(dǎo)致的，或者是由于存在于淋巴器官中而不是血液中的細(xì)胞類型對TGN1412介導(dǎo)的T-淋巴細(xì)胞的活化的要求導(dǎo)致的。因此，急需在TGN1412細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中再現(xiàn)在倫敦人類志愿者中觀察到的細(xì)胞因子風(fēng)暴以了解其機(jī)制并測試其對藥理學(xué)抑制的敏感性。從一個(gè)較廣泛的觀點(diǎn)來看，已知的人PBMC培養(yǎng)物沒有以細(xì)胞因子釋放應(yīng)答可溶性TGN1412，表明這個(gè)體系沒有以與人體內(nèi)的完整免疫系統(tǒng)應(yīng)答相同的方式應(yīng)答激活所有淋巴細(xì)胞的藥劑。修正這些缺陷不僅可以詳細(xì)分析人⑶觀超拮抗劑(SA)(例如TGN1412)的作用，而且還可以在臨床前開發(fā)中揭示其他似乎無毒藥物的反應(yīng)性。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的技術(shù)問題是針對潛在的細(xì)胞因子風(fēng)暴，提供一種用于體外測試免疫調(diào)節(jié)藥物(尤其是CMSSA)的改進(jìn)方法。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種測試適于減弱細(xì)胞因子風(fēng)暴的藥物的方法。為了解決上述第一個(gè)提及的技術(shù)問題，本發(fā)明教導(dǎo)了一種測試用于T-細(xì)胞活化的預(yù)期或已知免疫調(diào)節(jié)藥物的方法，包括以下步驟在體外使外周血單核細(xì)胞(PBMC)培養(yǎng)物與預(yù)定量的所述預(yù)期或已知免疫調(diào)節(jié)藥物接觸；以及當(dāng)與所述預(yù)期或已知免疫調(diào)節(jié)藥物接觸時(shí)，使用讀出系統(tǒng)觀察用于T-細(xì)胞活化的所述PBMC培養(yǎng)物，其中調(diào)節(jié)PBMC預(yù)培養(yǎng)物的細(xì)胞密度使得所述PBMC能夠細(xì)胞-細(xì)胞接觸，并且其中培養(yǎng)所述PBMC預(yù)培養(yǎng)物至少12h。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述讀出系統(tǒng)觀察所述PBMC培養(yǎng)物從PBMC釋放至少一種細(xì)胞因子，觀察細(xì)胞增殖，或者為另一種合適的讀出系統(tǒng)，如基因表達(dá)的變化、蛋白質(zhì)表達(dá)的變化和/或翻譯后修飾的變化。術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)藥物”優(yōu)選是指例如通過活化或抑制淋巴細(xì)胞功能(尤其是T-細(xì)胞功能，如T-細(xì)胞抑制或活化)能夠活化或抑制免疫系統(tǒng)的任何治療藥劑。在下文中提供免疫調(diào)節(jié)藥物的具體實(shí)例。術(shù)語“T-細(xì)胞活化”優(yōu)選是指可以在不同類型的T-細(xì)胞之間稍微改變的T-細(xì)胞活化的機(jī)制。然而，在CD4+T細(xì)胞中的“雙信號模型”可應(yīng)用于大多數(shù)類型的T-細(xì)胞。更具體地講，CD4+T細(xì)胞的活化通常通過如下途徑進(jìn)行分別用在抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面上的主要組織相容性編碼的抗原呈遞分子和其結(jié)合的抗原肽以及B7家族成員結(jié)合在T細(xì)胞表面上的T細(xì)胞受體和CD^ 二者。為了產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，兩種細(xì)胞-細(xì)胞接觸通常都需要。例如，在沒有CD^共刺激的情況下，單獨(dú)的T-細(xì)胞受體信號會導(dǎo)致T-細(xì)胞無反應(yīng)性。CD28和T細(xì)胞受體兩者下游的其他信號途徑包括許多本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其他蛋白質(zhì)。如在下文中描述的，通過細(xì)胞因子釋放和/或細(xì)胞增殖，尤其是T-細(xì)胞的增殖，可以測定T-細(xì)胞的活化。術(shù)語“外周血單核細(xì)胞(PBMC) ”優(yōu)選限定具有圓形核的任何血細(xì)胞，例如，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。這些血細(xì)胞在組織和血液之問再循環(huán)，并且為免疫系統(tǒng)中抵抗感染和適應(yīng)入侵者的關(guān)鍵成分。PBMC的淋巴細(xì)胞群通常由T細(xì)胞(⑶4和⑶8陽性 75% )、B細(xì)胞和NK細(xì)胞(合計(jì) 25%)組成?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域熟知的方法從全血樣品中獲得PBMC。例如，利用蔗聚糖梯度可以從全血中提取PBMC。蔗聚糖是根據(jù)密度將血液分層的親水性多糖，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞形成在血漿和蔗聚糖溶液之間的層。除了全肝素化血液作為原料以外，可以使用血沉棕黃層(通過離心全血得到的在紅細(xì)胞之上的白細(xì)胞層)和作為血庫中血小板濃縮液的副產(chǎn)物得到的白細(xì)胞減少室(leukoreduction chamber)內(nèi)容物。術(shù)語“預(yù)培養(yǎng)的”是指在沒有免疫調(diào)節(jié)藥物的情況下并且在與這些要測試的藥物接觸之前對PBMC培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)PBMC的方法在本領(lǐng)域中是已知的并且還將在下文中描述。術(shù)語“觀察”包括用本領(lǐng)域已知的方法對至少一種細(xì)胞因子或(細(xì)胞)增殖(優(yōu)選T-細(xì)胞增殖)濃度的定性、半-定量和定量測量，或者其他的細(xì)胞應(yīng)答，如基因表達(dá)的變化、蛋白質(zhì)表達(dá)的變化和/或翻譯后修飾的變化，的定性、半-定量和定量測量。本發(fā)明是基于以下令人驚奇的發(fā)現(xiàn)通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備的PBMC培養(yǎng)物，只是在與免疫調(diào)節(jié)藥物接觸之前進(jìn)一步預(yù)培養(yǎng)預(yù)定的一段時(shí)間，就對通過與免疫調(diào)節(jié)藥物接觸引起的細(xì)胞因子釋放突然顯示敏感性，但在沒有預(yù)培養(yǎng)過程的情況下與免疫調(diào)節(jié)藥物接觸不會引起細(xì)胞因子釋放。本發(fā)明進(jìn)一步基于以下的發(fā)現(xiàn)通過使PBMC的細(xì)胞-細(xì)胞接觸預(yù)定的一段時(shí)間可以提高這種預(yù)培養(yǎng)物的效果。換句話說，在加入免疫調(diào)節(jié)藥物時(shí)，PBMC培養(yǎng)物不應(yīng)是新制備的。因此，本發(fā)明可用于預(yù)測個(gè)體對免疫調(diào)節(jié)藥物(如TGN1412，將在后面作進(jìn)一步詳細(xì)解釋)的反應(yīng)性，以及預(yù)測免疫抑制藥物(例如，皮質(zhì)類固醇)控制不需要的反應(yīng)的能力。本發(fā)明還可用于進(jìn)一步了解CD^SA(g卩，CD^特異性超拮抗單克隆抗體)的作用模式。如上所述，⑶觀在T-細(xì)胞的表面上被表達(dá)，并且在生理?xiàng)l件下T-細(xì)胞活化通常需要通過⑶觀和TCR的共刺激，然而⑶觀的超拈抗抗體也能夠使T細(xì)胞直接活化。此外，本發(fā)明可用于針對預(yù)期免疫調(diào)節(jié)藥物的T-細(xì)胞活化潛能(包括細(xì)胞因子釋放)，篩選預(yù)期免疫調(diào)節(jié)藥物。因?yàn)樵诟呙芏阮A(yù)培養(yǎng)之后回收的PBMC很可能反映在淋巴器官中發(fā)現(xiàn)的T-細(xì)胞反應(yīng)性的狀況，并且上述PBMC應(yīng)當(dāng)與活化劑一起用于測試免疫抑制藥物，這是因?yàn)檠h(huán)的T-細(xì)胞因其“不活潑”的狀態(tài)可以更容易被抑制，導(dǎo)致對這些藥物功效的誤導(dǎo)性結(jié)果。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，在沒有免疫調(diào)節(jié)藥物的情況下，并且在與要測試的免疫調(diào)節(jié)藥物接觸之前，通過在35°C 40°C，優(yōu)選在36°C 38°C，儲存PBMC培養(yǎng)物至少M(fèi)h，優(yōu)選至少36h，更優(yōu)選至少4 來進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)步驟。在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，在預(yù)培養(yǎng)步驟期間，所述PBMC培養(yǎng)物的細(xì)胞密度至少為2女106/ml，優(yōu)選至少為5女106/ml，更優(yōu)選至少為107ml。對于在組織培養(yǎng)容器表面的細(xì)胞密度，其應(yīng)該至少為4 * 105/cm2，優(yōu)選至少為106/cm2，最優(yōu)選至少為2 * 106/cm2。所提供的數(shù)值可直接應(yīng)用于由平孔組成的容器。在圓形孔或圓錐形孔中，總的密度會不同，因?yàn)樵诳椎牡撞考?xì)胞密度高，而在孔的上部細(xì)胞密度低。因此，上述給出的以體積測量的細(xì)胞密度應(yīng)當(dāng)是指任何形式容器的分體積，即給出的密度是以例如存在的總預(yù)培養(yǎng)物體積的至少10 μ 1量的分體積形式提供的。如聲明的，能夠得到活細(xì)胞的細(xì)胞密度的任何其他的方法也包括在本發(fā)明中。在細(xì)胞-細(xì)胞接觸中的細(xì)胞的最低數(shù)量優(yōu)選為至少50. 000。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述免疫調(diào)節(jié)藥物為免疫刺激藥物，如抗體，優(yōu)選單克隆抗體。尤其地，所述單克隆抗體可為人CM8特異性超拮抗單克隆抗體。然而，不限于此，要測試的免疫調(diào)節(jié)藥物還可選自凝集素，如刀豆素A(ConA)，或植物凝集素(PHA)；包含凝集素的天然提取物，如松果菊提取物(echinacea extract)(例如，Echinacin, Madaus，德國)，或槲寄生提取物(例如，Lektinol, Madaus，德國)；超抗原，如葡萄球菌腸毒素B(SEB)，葡萄球菌腸毒素A(SEA)，中毒性休克綜合征毒素_1 (TSST-I)；葡萄球菌生膿原，如葡萄球菌生膿腸毒素B(SPEB)；由支原體產(chǎn)生的超抗原，如支原體arthriditis (Mycoplasma arthriditis)；或者由黑鼠疫細(xì)菌產(chǎn)生的超抗原，如假結(jié)核耶爾森氏菌；由某些致病病毒產(chǎn)生的超抗原，如EBV或HIV-I。在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所觀察的細(xì)胞因子選自TNF、IFN-Y、IL-I-β ,IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL12p70、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-21、IL-35 和 LT,以及它們的組合。任選地，可以觀察細(xì)胞的增殖，其中，如果在單位時(shí)間內(nèi)細(xì)胞的數(shù)目增加了預(yù)定的量，就說明增殖了。本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過常規(guī)的考慮可以選擇所述量。在這個(gè)測定中增殖的細(xì)胞優(yōu)選為PBMC，并且更優(yōu)選T-細(xì)胞。在測試用于T-細(xì)胞活化的預(yù)期或已知免疫調(diào)節(jié)藥物的方法的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述PBMC培養(yǎng)物包含記憶T細(xì)胞。如在本領(lǐng)域中所熟知的，記憶T細(xì)胞為已經(jīng)預(yù)先遭遇和應(yīng)答過它們的同源抗原的抗原-特異性T細(xì)胞的亞型。因此，在本領(lǐng)域中也使用術(shù)語抗原體驗(yàn)過的(antigen-experienced) T細(xì)胞。在這方面，進(jìn)一步優(yōu)選記憶T細(xì)胞為CD45R0+T細(xì)胞。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的方法中由PBMC釋放的細(xì)胞因子主要是由包含在PBMC中的記憶T細(xì)胞釋放的。在與第二個(gè)提及的目的特別相關(guān)的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，在將所述PBMC培養(yǎng)物與已知的免疫調(diào)節(jié)藥物，尤其免疫刺激藥物，接觸的同時(shí)，或者隨后在預(yù)定的一段時(shí)間之后，或者在預(yù)定的一段時(shí)間之前，使所述預(yù)培養(yǎng)的PBMC培養(yǎng)物另外地與用于減弱至少一種細(xì)胞因子釋放的預(yù)期藥物(免疫抑制藥物)接觸，其中進(jìn)一步觀察細(xì)胞因子釋放。所述預(yù)定的一段時(shí)間可以在IOs至12h的范圍內(nèi)，優(yōu)選在IOs至Ih的范圍內(nèi)。在PBMC培養(yǎng)物另外接觸免疫抑制藥物的情況下，應(yīng)該了解，與將其中PBMC培養(yǎng)物單獨(dú)地與預(yù)期或已知免疫調(diào)節(jié)藥物接觸的情形相比，可以測定免疫抑制效果。所述免疫抑制藥物還可以單獨(dú)地與預(yù)培養(yǎng)的PBMC培養(yǎng)物接觸以例如測定其對天然的潛伏T細(xì)胞活化或非天然的提高的T細(xì)胞活化(例如，由免疫紊亂或環(huán)境因素引起)的抑制效果。所述用于減弱細(xì)胞因子釋放的預(yù)期藥物優(yōu)選選自皮質(zhì)類固醇，包括，但不限于，地塞米松或者甲潑尼龍。所述用于減弱細(xì)胞因子釋放的預(yù)期藥物可進(jìn)一步為選自納巴霉素或者鈣神經(jīng)素抑制劑(如環(huán)胞素A、V0Cl0Sp0rin或他克莫司)的另外的免疫抑制藥物。在這個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，可以在體外測試打算用于減弱細(xì)胞因子風(fēng)暴的具體藥物(免疫抑制藥物)是否適于這一目的，尤其是，雖然免疫調(diào)節(jié)藥物的施用濃度初步看來被認(rèn)為能夠防止細(xì)胞因子風(fēng)暴，但在體內(nèi)發(fā)生細(xì)胞因子風(fēng)暴的情況。尤其地，本發(fā)明的這種變化使得能夠創(chuàng)建免疫調(diào)節(jié)藥物和減弱藥物的匹配對，并且提供用于管理在體內(nèi)試驗(yàn)中(尤其是對人的臨床試驗(yàn)中)未預(yù)料的細(xì)胞因子風(fēng)暴的安全手段。在這方面，術(shù)語“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，在本領(lǐng)域中也被稱作“超高細(xì)胞因子血癥”，優(yōu)選限定對除了其它癥狀以外以低血壓、發(fā)熱和/或發(fā)冷為特征并可能導(dǎo)致死亡的在患者體內(nèi)的系統(tǒng)性炎癥應(yīng)答。細(xì)胞因子風(fēng)暴據(jù)推測是由于在細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞之間的未控制的正反饋回路引起的，導(dǎo)致高度提高的各種細(xì)胞因子水平。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及皮質(zhì)類固醇、納巴霉素和/或鈣神經(jīng)素抑制劑，其在施用抗人CD^特異性超拮抗單克隆抗體時(shí)用于治療、減弱或防止細(xì)胞因子風(fēng)暴的用途。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗體為TGW412。所述抗體TGN1412的氨基酸序列已描述在W0-A22006/050949中。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述皮質(zhì)類固醇為地塞米松和/或甲潑尼龍。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述鈣神經(jīng)素抑制劑為環(huán)胞素A、Voclosporin和/或他克莫司。


以下通過實(shí)例和附圖來詳細(xì)解釋本發(fā)明。附圖顯示圖1 通過⑶3-特異性mAb 0KT3和來自人PBMC的⑶觀超拈抗劑TGN1412誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放。圖2 通過2天的預(yù)培養(yǎng)從TGN1412不反應(yīng)狀態(tài)到TGN1412反應(yīng)狀態(tài)的連續(xù)轉(zhuǎn)化。圖3 在預(yù)培養(yǎng)期間TGN1412-反應(yīng)性的獲得需要高細(xì)胞濃度。圖4 高密度預(yù)培養(yǎng)物中的TGN1412-反應(yīng)性的獲得需要兩天的孵育。圖5 高密度培養(yǎng)物中的TGN1412-反應(yīng)性的獲得需要細(xì)胞-細(xì)胞接觸。圖6 預(yù)培養(yǎng)的、但不是新鮮的PBMC以增殖應(yīng)答TGN1412。圖7 ⑶45R0 (記憶)⑶4T-細(xì)胞為由0KT3和TGN1412兩者釋放的促炎性細(xì)胞因子的主源。圖8 由0KT3和TGN1412誘導(dǎo)的從高密度預(yù)培養(yǎng)的PBMC中的釋放TNF的可比較動力學(xué)。圖9 :TGN1412-反應(yīng)性的獲得被HLA抗原的mAb阻斷。圖10 由0KT3和TGN1412誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放對皮質(zhì)類固醇介導(dǎo)的抑制的可比較敏感性。圖11 在預(yù)培養(yǎng)的PBMC中增殖T-細(xì)胞應(yīng)答ConA和PHA的增強(qiáng)。圖12 在預(yù)培養(yǎng)的PBMC中對破傷風(fēng)/白喉類毒素的回憶應(yīng)答的增強(qiáng)㈧，資料匯編來自六個(gè)單獨(dú)供體(B)。圖13 在預(yù)培養(yǎng)的PBMC中增殖T細(xì)胞應(yīng)答病毒肽的增強(qiáng)。圖14 在預(yù)培養(yǎng)的PBMC中增殖T細(xì)胞應(yīng)答葡萄球菌腸毒素B的增強(qiáng)。圖15 在預(yù)培養(yǎng)的PBMC中增殖T細(xì)胞應(yīng)答高CsA劑量的降低的抑制。圖16 通過TGN1412和0KT-3刺激誘導(dǎo)在新鮮的(A)和預(yù)培養(yǎng)的(B) T-細(xì)胞上的活化標(biāo)志物。使用新鮮的(A)或者在高密度條件下預(yù)培養(yǎng)兩天的(B)PBMC，收獲以及使用1 μ g/ml 0KT-3(黑線)、1 μ g/ml TGN1412(灰線)或者不使用刺激抗體(填充直方圖)在標(biāo)準(zhǔn)(低密度)條件下重新刺激PBMC。18小時(shí)后，收獲細(xì)胞并用對⑶4、⑶8、⑶25和⑶69具有特異性的mAb染色。顯示了在CD4(左)或CD8(右)T-細(xì)胞上設(shè)門的CD25(頂部)和⑶69 (底部)的直方圖。
具體實(shí)施例方式以下用實(shí)施例闡述本發(fā)明。實(shí)施例1 比較實(shí)施例為了誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放，本發(fā)明以及該比較實(shí)施例使用PBMC刺激的標(biāo)準(zhǔn)體系，因?yàn)樵擉w系被全世界的研究者用于研究人PBMC對免疫調(diào)節(jié)藥劑的應(yīng)答。該體系采用新鮮制備的PBMC，其是根據(jù)廠家的說明書在一個(gè)密度梯度(Lymphocyte Separation Medium LSM1077，PAA Laboratories, Pasching，德國)上通過離心從肝素化的靜脈血中分離的?；蛘?，使用新鮮的白血球濃縮物作為蔗聚糖純化的原料，基本上得到同樣的結(jié)果，其中，新鮮的白血球濃縮物是作為在制備血小板濃縮物中作為副產(chǎn)物從白細(xì)胞減少體系室O^ridianGambro BCT，Lakewood，⑶，美國)得到的(Dietz 等，2006)。在 96 孔組織培養(yǎng)板(Greinerbio-one, Frickenhausen，德國)中培養(yǎng)PBMC，其中，在0. 2ml的補(bǔ)充有10%自體血清或者市售可得的混合AB血清(PAA Laboratories)的富集RPMI 1460培養(yǎng)基(GIBC0/hvitrogen，長島，紐約，美國)中刺激h IO5個(gè)細(xì)胞，結(jié)果基本上是一樣的。當(dāng)使用市售可得的混合AB血清時(shí)，為了確保獲得可比較的結(jié)果，與自體血清相比，應(yīng)該對混合AB血清進(jìn)行預(yù)測試。在這種組織培養(yǎng)體系中，使用由TheraMab GmbH, Wurzburg提供的可溶性TGN1412對新分離的PBMC進(jìn)行刺激。這與倫敦試驗(yàn)(Suntharalingam等，2006)期間使用的GMP-質(zhì)量批次是相同的。作為誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放的陽性對照，使用臨床級的0KT3 ("MuromonomabJanssen-Cilag，Neuss，德國)，眾所周知，其既能在體外也能在患者體內(nèi)引起細(xì)胞因子釋放(Abramowicz等，1989)。M小時(shí)后，根據(jù)廠家的說明書通過細(xì)胞因子微球分析(CBA)技術(shù)(Becton Dickinson, Moutain View，CA，美國)分析在 TGN1412 試驗(yàn)(Suntharalingam 等，2006)的志愿者的血漿中檢測到的包括主要促炎因子和抗炎因子的一組細(xì)胞因子。使用的0KT3和TGN1412兩者的濃度都為1 μ g/ml，這落入在倫敦TGN1412試驗(yàn)期間在志愿者的循環(huán)中達(dá)到的估計(jì)濃度范圍內(nèi)(Duff，2006)。沒有在此示出的兩種抗體的多次滴定顯示所述濃度在生物應(yīng)答的最佳范圍內(nèi)。圖IA顯示在新鮮的PBMC中可溶性TGN1412不能誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放。相反，0KT3能非常有效地誘導(dǎo)TNF、IFN-γ和IL-2(已知它們均導(dǎo)致了細(xì)胞因子釋放癥狀的病理表現(xiàn))以及抗炎細(xì)胞因子IL-10。通過蔗聚糖密度離心分離從健康供體分離PBMC并以106/ml在96孔平底組織培養(yǎng)板中在0. 2ml的補(bǔ)充有10% AB血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)M小時(shí)。在M小時(shí)孵育后通過細(xì)胞因子微球分析技術(shù)分析在上層清液中的細(xì)胞因子。使用終濃度為lyg/ml的單克隆抗體。顯示了三次試驗(yàn)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。TGN1412不能而0KT3能夠在這種標(biāo)準(zhǔn)PBMC培養(yǎng)物中誘導(dǎo)這些和其他的細(xì)胞因子(未顯示)的釋放已被10個(gè)以上的單獨(dú)供體重現(xiàn)，這與由TeGeneroAG提交并在關(guān)于I期臨床試驗(yàn)的安全性的科學(xué)專家組的報(bào)告中重現(xiàn)的數(shù)據(jù)相符(Duff，2006)。實(shí)施例2 在預(yù)培養(yǎng)后通過TGN1412應(yīng)答對于圖IB的試驗(yàn)，在M孔平底組織培養(yǎng)板中將從健康供體得到的PBMC在1. 5ml培養(yǎng)基中以107ml培養(yǎng)2天，然后再沖洗和重新調(diào)整到106/ml。使用這些細(xì)胞進(jìn)行與實(shí)施例1描述的相同的試驗(yàn)。圖IB顯示，令人驚奇地，在沒有明顯刺激的情況下，通過簡單地預(yù)培養(yǎng)PBMC 2天可以恢復(fù)對TGN1412的應(yīng)答性。當(dāng)在2008年12月4日制備細(xì)胞時(shí)，得到的PBMC的數(shù)目超過了用于本試驗(yàn)的所需數(shù)目，將過剩的細(xì)胞在37°C下在培養(yǎng)基中儲存兩天。當(dāng)使用這些儲存的細(xì)胞進(jìn)行與先前使用新鮮細(xì)胞完全相同的試驗(yàn)時(shí)(圖1A)，令人完全意想不到的事情發(fā)生了 現(xiàn)在TGN1412誘導(dǎo)了如0KT3可比較級別的細(xì)胞因子釋放。圖IB提供了這種試驗(yàn)的實(shí)例。因此進(jìn)一步研究了重現(xiàn)性和機(jī)理基礎(chǔ)。實(shí)施例3 關(guān)鍵觀察的重現(xiàn)性圖2概括了對于7個(gè)單獨(dú)健康供體，預(yù)培養(yǎng)對對TGN1412的反應(yīng)性的影響。顯示了來自7個(gè)單獨(dú)健康供體的數(shù)據(jù)，每個(gè)用一個(gè)符號表示?？贵w刺激和預(yù)培養(yǎng)的條件如圖1。當(dāng)對0KT3應(yīng)答和TGN1412應(yīng)答兩者都存在供體-特異性的變化時(shí)，很明顯，在所有的情況下，新鮮的供體細(xì)胞不能以細(xì)胞因子釋放應(yīng)答TGN1412刺激，而在2天預(yù)培養(yǎng)以后這種不應(yīng)狀態(tài)消失了。如通過由倫敦TGN1412試驗(yàn)的志愿者所經(jīng)歷的細(xì)胞因子風(fēng)暴的級別的巨大差異所闡述的(Simtharalingam等，2006)，可以預(yù)期供體-特異性的變化。 實(shí)施例4 新方法的優(yōu)化圖3-5描述了確定在外周血T-細(xì)胞中獲得對TGN1412的敏感性的參數(shù)。對于圖3的試驗(yàn)，將PBMC以106/ml (左柱)或者107ml (右柱)培養(yǎng)2天，然后如圖1所述在以107ml用TGN1412進(jìn)行刺激。對于圖4的試驗(yàn)，在圖1給出的條件下用0KT3或TGN1412刺激新鮮的PBMC(三柱中的左柱)和以107ml預(yù)培養(yǎng)M小時(shí)(三柱中的中柱)或48小時(shí)(三柱中的右柱)的PBMC 24 小時(shí)。對于圖5的試驗(yàn)，在1. 5ml培養(yǎng)基中以高密度(107ml，三柱中的右柱)或以低密度(106/ml，三柱中的左柱或中柱)培養(yǎng)PBMC兩天。如在三柱中的中柱顯示的組中，這些低密度培養(yǎng)物另外包含具有半透膜的插入物，在所述插入物上以高密度培養(yǎng)另外的PBMC(膜下106/ml，膜上107ml，三柱中的中柱)。按照圖1所描述的條件重新刺激和分析細(xì)胞。如上所示，通過在具有10%自體血清或者市售可得的AB血清的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，PBMC獲得了對TGN1412的敏感性。我們測試了以下參數(shù)在獲得TGN1412敏感性中的作用。細(xì)胞密度。與其中以106/ml或2X 105/cm2的培養(yǎng)孔中培養(yǎng)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)PBMC刺激分析不同，在10倍高的密度下“放置(parking) ”2天。圖3顯示，在繼代培養(yǎng)中在高密度(107/ml ^ 2XlOVcm2)而不是在低密度(106/ml或2X 105/cm2)預(yù)培養(yǎng)的PBMC誘導(dǎo)了對TGN1412的反應(yīng)性。由于需要細(xì)胞密度和兩天的培養(yǎng)，為了給細(xì)胞提供充足的養(yǎng)分，在對小時(shí)以后用新鮮的預(yù)熱的培養(yǎng)基謹(jǐn)慎地替換一半的培養(yǎng)基。時(shí)間。圖4顯示，經(jīng)過2天的預(yù)培養(yǎng)之后取得了對TGN1412的完全反應(yīng)性(可與對0KT3的反應(yīng)性相比較)。1天的預(yù)培養(yǎng)僅導(dǎo)致了反應(yīng)性適中的提高。對細(xì)胞-細(xì)胞接觸的要求。為獲得對TGN1412的反應(yīng)性，在PBMC的預(yù)培養(yǎng)期間對高細(xì)胞密度的要求可能是由于對細(xì)胞-細(xì)胞接觸的需要和/或由于對需要達(dá)到某一濃度來促進(jìn)反應(yīng)狀態(tài)成熟的可溶性因子的作用的需要。使用transwell系統(tǒng)(Corningincorporated，Lowell，MA，美國)，其中通過允許可溶性因子擴(kuò)散的8 μ m-孔的膜使在高密度培養(yǎng)的細(xì)胞與在低密度培養(yǎng)的細(xì)胞分離，圖5顯示需要細(xì)胞-細(xì)胞接觸。實(shí)施例5 新方法的其他特征圖6顯示預(yù)培養(yǎng)的、但不是新分離的PBMC在應(yīng)答TGN1412時(shí)增殖。如圖IA和B所描述的分別制備和培養(yǎng)新鮮的和預(yù)培養(yǎng)的PBMC。在第3天，加入1 μ Ci的3H-胸苷，16小時(shí)后收獲培養(yǎng)物并進(jìn)行液體閃爍計(jì)數(shù)。除了細(xì)胞因子釋放之外，多克隆T-細(xì)胞活化還導(dǎo)致增殖，這可以以引入(在此以氚化胸苷引入)的放射性來衡量。從圖6可以看出，0ΚΤ3刺激兩者(新鮮的和預(yù)培養(yǎng)的PBMC)的增殖，而TGN1412僅能夠誘導(dǎo)預(yù)培養(yǎng)的PBMC的增殖。因此，增殖也可用作讀出。圖7顯示，在預(yù)培養(yǎng)的PBMC中，TGN1412從⑶4記憶細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子。用1 μ g/ml的0KT3或TGN1412刺激2天高密度預(yù)培養(yǎng)的PBMC18小時(shí)。一般來說，用15至20小時(shí)(優(yōu)選16至18小時(shí))之間的時(shí)段來代替18小時(shí)也是可以的。在培養(yǎng)的最后4小時(shí)期間，加入5yg/ml的布雷菲德菌素A來阻斷細(xì)胞因子的細(xì)胞輸出。在用結(jié)合有熒色物的⑶4和⑶45R0(記憶標(biāo)志物)mAb對細(xì)胞表面進(jìn)行染色以后，將細(xì)胞固定、透化和用TNF-左板-或 IFN-γ-右板-的mAb (全部來自 BD Pharmingen, Mountain View，CA，美國)染色。在BD Calibur流式細(xì)胞儀上獲得15. 000活門事件(live-gated events)并且使用FlowJo軟件(Three Star Inc.，Ashland, 0R，美國)分析數(shù)據(jù)。在患者中由0KT3誘發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴是眾所周知的現(xiàn)象，并且這種藥物提供的附加信息(Muromonomab，Janssen-C I LAG)明確地警告了這種綜合征。為了比較兩種重要的促炎細(xì)胞因子TNF和IFN-Y在應(yīng)答0KT3和TGN1412時(shí)的細(xì)胞源，使用藥物布雷菲德菌素A (Sigma Aldrich，Meinheim，德國)通過Golgi儀器封鎖它們的傳輸將它們保留在細(xì)胞中，并通過將固定和透化后的細(xì)胞分別用熒光 TNF-和 IFN-γ -特異性 mAb (Becton Dickinson,Mountain View，CA，美國)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色來展現(xiàn)。同時(shí)，測定刺激后的PBMC的細(xì)胞表面的表型。因此鑒定出主要的產(chǎn)生細(xì)胞因子的T-細(xì)胞亞型，⑶4T-細(xì)胞，并進(jìn)一步細(xì)分為原初(⑶45R0-)和記憶(⑶45R0+)亞型。圖7顯示，在新鮮和預(yù)培養(yǎng)的兩種PBMC中，0KT3和TGN1412主要在⑶4記憶亞型中引起細(xì)胞因子產(chǎn)生。圖8顯示，當(dāng)用0KT3或TGN1412誘導(dǎo)時(shí)，TNF從預(yù)培養(yǎng)PBMC中的釋放遵循同樣的動力學(xué)。高密度預(yù)培養(yǎng)的PBMC按照圖IB中的方法制備并用lyg/ml的0KT3或TGN1412刺激。在指示的時(shí)間收獲上層清液并按照圖1中的方法分析TNF含量。在體內(nèi)，當(dāng)用0KT3或TGN1412誘導(dǎo)時(shí)，TNF( “細(xì)胞因子風(fēng)暴”最重要的促炎細(xì)胞因子)的釋放遵循同樣的動力學(xué)(Abramowicz 等，1989 ；Suntharalingam 等，2006)。因此，在兩種 mAb 之間將 TNF 在預(yù)培養(yǎng)PBMC中的釋放動力學(xué)進(jìn)行比較并發(fā)現(xiàn)實(shí)質(zhì)上是一致的。實(shí)施例6 在高密度預(yù)培養(yǎng)期間誘導(dǎo)對TGN1412的反應(yīng)性的機(jī)理基礎(chǔ)自體-MHC識別不受限于理論，本實(shí)施例提供關(guān)于本發(fā)明的功能信息。根據(jù)對大鼠進(jìn)行的研究，有人已經(jīng)提出，通過在淋巴器官(淋巴結(jié)，脾臟等)中的T-細(xì)胞抗原受體(TCR)對主要組織相容性復(fù)合物(MHC ；人類的HLA)的分子識別激發(fā)(prime) TCR以在稍后抗原遭遇期間提高信號(Mefanova等，200 。這種方法被稱作“MHC-掃描”并且描述組織固有T-細(xì)胞的TCR與在它們相鄰細(xì)胞上的HLA分子的不斷相互作用，其與它們包含的肽無關(guān)(Mefanova等，2002)。當(dāng)合適的抗原肽遇到TCR時(shí)，這種相互作用導(dǎo)致TCR的激發(fā)(priming)以及有利于全T-細(xì)胞活化的信號平臺的組裝。該方法在本領(lǐng)域中也被稱作“增強(qiáng)的(tonic) ”TCR信號。因?yàn)榘l(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室早先已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CD^超拮抗劑信號通過放大弱TCR信號起作用(Dermehy等，2007)，所以猜測正是這種激發(fā)信號(priming signals)的喪失使循環(huán)的T-細(xì)胞(其與淋巴器官中情形不同，沒有細(xì)胞-細(xì)胞接觸)對TGN1412的刺激沒有應(yīng)答。這通過在以10μ g/ml的兩天預(yù)培養(yǎng)(mAbs 646-2. 6和TU39，Becton-Dickenson)期間包括阻斷能夠與所有的人HLA I類和II類分子反應(yīng)的mAb進(jìn)行測試。圖9顯示，HLA I類以及在較小程度上HLA II類特異性mAb能夠阻斷TGN1412反應(yīng)性的獲得，說明了細(xì)胞的TCR獲得這種反應(yīng)性需要HLA識別。如圖IB所給出的進(jìn)行PBMC的高密度預(yù)培養(yǎng)。向一些高密度預(yù)培養(yǎng)物中，以10 μ g/ml加入HLA I類或HLA II類的mAb。這個(gè)發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈地建議TCR與在稠密疊集的淋巴器官中的HLA分子的相互作用是如倫敦試驗(yàn)的志愿者所經(jīng)歷的對TGN1412的強(qiáng)烈反應(yīng)性的前提，并且在體外通過高密度培養(yǎng)物模擬了這種情形，因此將已經(jīng)失去細(xì)胞-細(xì)胞接觸的循環(huán)T-細(xì)胞的反應(yīng)性恢復(fù)到淋巴器官中T-細(xì)胞的反應(yīng)性。這還解釋了為什么不但在預(yù)培養(yǎng)的PBMC中而且在新鮮的PBMC中觀察到了對0KT3的應(yīng)答。因?yàn)榕cTGN1412相反，0KT3自身處理TCR，所以不需要通過與HLA-分子的相互作用來“激發(fā)”該受體。HLA I類和II類特異性mAb阻斷獲得對TGN1412反應(yīng)性的能力差別通過以下事實(shí)解釋在PBMC培養(yǎng)物中90%以上的可利用HLA分子是I類。實(shí)施例7 測試皮質(zhì)類固醇控制TGN1412介導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放的能力通常通過使用高劑量的皮質(zhì)類固醇防止或干涉來治療0KT3誘導(dǎo)的細(xì)胞因子風(fēng)暴(Goldman等，1989)。到目前為止，由于沒有分析系統(tǒng)存在，還不能測試TGN1412誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放對皮質(zhì)類固醇的敏感性。因此我們使用所述新方法來比較在新鮮和預(yù)培養(yǎng)的PBMC中的細(xì)胞因子釋放對地塞米松(“Dex”，Sigma-Aldrich)的敏感性。圖10顯示，TGN1412誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放對皮質(zhì)類固醇敏感。如圖IB所描述制備高密度預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞并且用mAb刺激。需要指出的是，以給出的終濃度包括地塞米松，在M小時(shí)培養(yǎng)后測量細(xì)胞因子。所使用的最高劑量(ΙμΜ)完全抑制了通過0ΚΤ3和TGN1412兩者誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放，并且在低十倍劑量(IOOnM)時(shí)也幾乎完全抑制了。這強(qiáng)烈地建議如臨床用于0ΚΤ3-治療的患者那樣通過適當(dāng)?shù)钠べ|(zhì)類固醇藥物治療可以控制TGN1412誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放。實(shí)施例8 對促有絲分裂凝集素的反應(yīng)性通常使用促有絲分裂凝集素刀豆素A(ConA)和植物凝集素(PHA)來測試在PBMC制品中T-細(xì)胞的反應(yīng)性。這些凝集素通過它們結(jié)合到糖部分的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表面糖蛋白起作用。圖11顯示，對于這兩種凝集素，如果按照以上方案將PBMC預(yù)培養(yǎng)兩天，則會極大地提高增殖T-細(xì)胞的應(yīng)答。實(shí)施例9 抗原-特異性回憶應(yīng)答作為有意識的疫苗接種或天然感染的結(jié)果，特異性針對給定的微生物抗原的T-淋巴細(xì)胞頻率增加到其中在體外重新刺激使得能夠檢測增殖應(yīng)答的水平。這種抗原的經(jīng)典例子為白喉毒素和破傷風(fēng)毒素。這類制劑通常被用來評估個(gè)體的疫苗接種狀態(tài)。為此目的，由Sanofi Pasteur以單一制劑提供這兩種毒素。圖12A說明了，的確，通過將PBMC在高密度預(yù)培養(yǎng)兩天極大地提高了對破傷風(fēng)毒素/白喉毒素的回憶應(yīng)答。在圖12B中，匯編了來自六個(gè)個(gè)人供體的數(shù)據(jù)。*表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義P < 0. 05。實(shí)施例10 ⑶8T-細(xì)胞對源自巨細(xì)胞病毒的肽的應(yīng)答對破傷風(fēng)毒素和白喉毒素的回憶應(yīng)答解決了 CD4T-細(xì)胞的疑問。為了測試CD8T-細(xì)胞的回憶應(yīng)答是否也受在高細(xì)胞密度預(yù)培養(yǎng)的影響，對預(yù)先暴露到巨細(xì)胞病毒的HLAA2陽性個(gè)體的PBMC使用用針對該個(gè)體的CD8T-淋巴細(xì)胞的HLAA2呈遞的肽進(jìn)行刺激。作為讀出，選擇分泌IFN- γ的⑶8T-細(xì)胞的數(shù)目，因?yàn)橐阎@種⑶8記憶T-細(xì)胞在通過抗原受體刺激時(shí)快速地分泌IFN-γ。使用所謂的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)進(jìn)行量化，其中在涂敷IFN-Y反應(yīng)性單克隆抗體的過濾膜上培養(yǎng)PBMC。然后，使用第二種、酶標(biāo)記的mAb顯色由此在24h孵育期間捕獲的IFN-Y，并且底物由無色轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩?。如圖13所示，將PBMC在高細(xì)胞密度預(yù)培養(yǎng)兩天極大地提高了分泌IFN-Y的細(xì)胞應(yīng)答病毒肽的頻率。實(shí)施例11 對“超抗原”葡萄球菌腸毒素B的應(yīng)答某些細(xì)菌分泌所謂的超抗原，與常規(guī)的抗原的情況相比(在未免疫的個(gè)體中，1/100. 000)，這種超抗原通過它們的抗原受體能夠刺激大很多部分的T-淋巴細(xì)胞(5-20% )0因此，使用PBMC可以在體外測量對這種超抗原的增殖應(yīng)答。圖14顯示，在高密度預(yù)培養(yǎng)PBMC兩天也極大地提高了這個(gè)分析的敏感性。實(shí)施例12 測試免疫抑制藥物當(dāng)使用新鮮的而不是預(yù)培養(yǎng)的PBMC時(shí)，會錯(cuò)誤判斷免疫調(diào)節(jié)藥物的效力。環(huán)孢素A(CsA)是廣泛使用的免疫抑制藥物，其在T-細(xì)胞抗原-受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起作用。因此，循環(huán)T-細(xì)胞的信號能力的降低可以翻譯為對這種藥物的敏感性的提高。圖15顯示，情況確實(shí)如此當(dāng)新鮮的和預(yù)培養(yǎng)的PBMC(來自相同的原始制劑)都應(yīng)答用0KT3誘導(dǎo)的TCR刺激時(shí)，預(yù)培養(yǎng)的PBMC不像新鮮的PBMC那樣容易被高CsA劑量抑制(ρ < 0. 03)。實(shí)施例13 誘導(dǎo)在細(xì)胞表面上的T細(xì)胞活化標(biāo)志物圖16顯示用TGN1412和0ΚΤ-3刺激在新鮮的(A)和預(yù)培養(yǎng)的(B)T-細(xì)胞上誘導(dǎo)活化標(biāo)志物。使用新鮮的(A)或者在高密度條件下預(yù)培養(yǎng)兩天的(B)PBMC，收獲以及使用1 μ g/ml 0KT-3(黑線)、1 μ g/ml TGN1412(灰線)或者不使用刺激抗體(填充直方圖)在標(biāo)準(zhǔn)(低密度)條件下重新刺激PBMC。18小時(shí)后，收獲細(xì)胞并用⑶4、⑶8、⑶25和⑶69特異性mAb染色。顯示在⑶4 (左)或⑶8 (右)T-細(xì)胞上設(shè)門的⑶25 (頂部)和⑶69 (底部)的直方圖。Abramowicz, D.et al. , Transplantation 47,606-608(1989).Dennehy, K. Μ. et al. , J Immunoll78，1363-1371 (2007).
Dietz, A. B. et al.，Transfusion 46，2083—2089(2006) ·Duff,G. W.C. ,Expert Scientific Group on Phase One Clinical Trials FinalReport(Norwich, UK, Stationary Office 2006).GogishVili, T. et al.，PLoS ONE 4，e4643 (2009).Goldman, M. et al.，Lancet 2，802—803(1989) ·Hunig, Τ. , Adv Immunol 95,111-148 (2007).Nguyen, D. H. et al. , Proc Natl Acad Sci U S A 103,7765-7770(2006).Schraven, B.et al. , Immunity 28,591-595(2008).Stefanova, I. et al.，Nature 420,429-434(2002).Suntharalingam, G. et al. , N EnglJ Med 355,1018-1028(2006).
權(quán)利要求
1.一種測試用于T-細(xì)胞活化的預(yù)期或已知免疫調(diào)節(jié)藥物的方法，包括以下步驟在體外使外周血單核細(xì)胞(PBMC)培養(yǎng)物與預(yù)定量的所述預(yù)期或已知免疫調(diào)節(jié)藥物接觸；以及當(dāng)與所述預(yù)期或已知免疫調(diào)節(jié)藥物接觸時(shí)，使用讀出系統(tǒng)觀察用于T-細(xì)胞活化的所述PBMC培養(yǎng)物，其中調(diào)節(jié)PBMC預(yù)培養(yǎng)物的細(xì)胞密度使得所述PBMC能夠細(xì)胞-細(xì)胞接觸，并且其中培養(yǎng)所述PBMC預(yù)培養(yǎng)物至少12h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述讀出系統(tǒng)觀察所述PBMC培養(yǎng)物從PBMC釋放至少一種細(xì)胞因子，觀察細(xì)胞增殖，或者為另一種合適的讀出系統(tǒng)，如基因表達(dá)的變化、蛋白質(zhì)表達(dá)的變化和/或翻譯后修飾的變化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，在沒有免疫調(diào)節(jié)藥物的情況下，并且在與要測試的免疫調(diào)節(jié)藥物接觸之前，通過在35°C 40°C，優(yōu)選36°C 38°C，儲存PBMC培養(yǎng)物至少M(fèi)h，優(yōu)選至少36h，更優(yōu)選至少4 來進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在預(yù)培養(yǎng)步驟期間，所述PBMC培養(yǎng)物的細(xì)胞密度至少為2 106/ml，優(yōu)選至少為5 106/ml，更優(yōu)選至少為107ml，或者至少為.4 * 105/cm2，優(yōu)選至少為106/cm2，最優(yōu)選至少為2 * 106/cm2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述免疫調(diào)節(jié)藥物為免疫刺激藥物，如抗體，優(yōu)選單克隆抗體，尤其人CD^特異性超拮抗單克隆抗體，或者選自凝集素，如刀豆素A (ConA)，或植物凝集素(PHA)；包含凝集素的天然提取物，如松果菊提取物，或槲寄生提取物；超抗原，如葡萄球菌腸毒素B (SEB)，葡萄球菌腸毒素A(SEA)，中毒性休克綜合征毒素-I(TSST-I)；葡萄球菌生膿原，如葡萄球菌生膿腸毒素B(SPEB)；由支原體產(chǎn)生的超抗原，如支原體anthriditis ；或者由黑鼠疫細(xì)菌產(chǎn)生的超抗原，如假結(jié)核耶爾森氏菌；由某些致病病毒產(chǎn)生的超抗原，如EBV或HIV-I。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所觀察的細(xì)胞因子選自TNF、IFN-γ、IL-I-β、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL12p70、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-21、IL-35 和 LT,以及它們的組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在將所述PBMC培養(yǎng)物與已知免疫調(diào)節(jié)藥物，尤其免疫刺激藥物，接觸的同時(shí)，或者隨后在預(yù)定的一段時(shí)間之后，或者在預(yù)定的一段時(shí)間之前，使所述預(yù)培養(yǎng)的PBMC培養(yǎng)物另外地與用于減弱至少一種細(xì)胞因子釋放的預(yù)期藥物接觸，其中進(jìn)一步觀察細(xì)胞因子釋放。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述預(yù)定的一段時(shí)間在IOs至12h的范圍內(nèi)，優(yōu)選在IOs至Ih的范圍內(nèi)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中，所述用于減弱細(xì)胞因子釋放的預(yù)期藥物為皮質(zhì)類固醇。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中，所述用于減弱細(xì)胞因子釋放的預(yù)期藥物為選自納巴霉素或者如環(huán)胞素A、Voclosporin或他克莫司的鈣神經(jīng)素抑制劑的免疫抑制藥物。
11.皮質(zhì)類固醇、納巴霉素和/或鈣神經(jīng)素抑制劑，其用于治療、減弱或防止在施用抗人CD^特異性超拮抗單克隆抗體時(shí)的細(xì)胞因子風(fēng)暴的用途。
12.用于根據(jù)權(quán)利要求11中所述用途的皮質(zhì)類固醇和/或鈣神經(jīng)素抑制劑，其中，所述抗體為TGN1412。
13.用于根據(jù)權(quán)利要求11或12中所述用途的皮質(zhì)類固醇和/或鈣神經(jīng)素抑制劑，其中，所述皮質(zhì)類固醇為地塞米松和/或甲潑尼龍。
14.用于根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)中所述用途的皮質(zhì)類固醇和/或鈣神經(jīng)素抑制劑，其中，所述鈣神經(jīng)素抑制劑為環(huán)胞素A、Voclosporin和/或他克莫司。
全文摘要
本發(fā)明教導(dǎo)一種測試用于T-細(xì)胞活化的預(yù)期或已知免疫調(diào)節(jié)藥物的方法，包括以下步驟在體外使外周血單核細(xì)胞(PBMC)培養(yǎng)物與預(yù)定量的所述預(yù)期或已知免疫調(diào)節(jié)藥物接觸；以及當(dāng)與所述預(yù)期或已知免疫調(diào)節(jié)藥物接觸時(shí)，使用讀出系統(tǒng)觀察用于T-細(xì)胞活化的所述PBMC培養(yǎng)物，其中調(diào)節(jié)PBMC預(yù)培養(yǎng)物的細(xì)胞密度使得所述PBMC能夠細(xì)胞-細(xì)胞接觸，并且其中培養(yǎng)所述PBMC預(yù)培養(yǎng)物至少12h。
文檔編號G01N33/50GK102597768SQ201080043555
公開日2012年7月18日 申請日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月28日
發(fā)明者托馬斯·許尼希 申請人:希拉麥博股份有限公司