專利名稱：診斷阿爾茨海默病或輕度認(rèn)知損害的新的診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用淀粉樣蛋白β的片段的寡聚狀態(tài)作為生物標(biāo)記檢測(cè)和診斷阿爾茨海默病，進(jìn)一步涉及確定生物學(xué)樣品中淀粉樣蛋白β的片段的寡聚狀態(tài)的新方法。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病是最常見形式的癡呆，其占所有癡呆性疾病的大約65-70%(Blennow et al.，2006)。作為預(yù)期壽命增加的結(jié)果，這種疾病在高度發(fā)達(dá)的工業(yè)化國(guó)家如日本和中國(guó)以及在美國(guó)和歐洲已經(jīng)成為特別關(guān)注的問題。據(jù)估計(jì)阿爾茨海默病患者人數(shù)將從2001年的2千4百萬增加至2040年的8千I百萬(Ferri et al.，2005)。目前在世界范圍內(nèi)治療和護(hù)理AD患者的花費(fèi)每年為大約2500億美元。所述疾病散發(fā)形式的進(jìn)展相對(duì)緩慢，且阿爾茨海默病通常在第一個(gè)癥狀出現(xiàn)之后持續(xù)大約10-12年。目前非常難以對(duì)AD進(jìn)行可靠及早期診斷并將之與其它形式癡呆區(qū)分?？煽啃猿^90%的良好診斷僅在該疾病的晚期才可行。先前僅能推測(cè)可能或大概是阿爾茨海默?。辉\斷依賴于使用 Knopman et al. , 2001、Waldemar et al. , 2007 或 Dubois etal.，2007所述的某些標(biāo)準(zhǔn)。然而，在注意到第一個(gè)臨床癥狀之前20-30年已經(jīng)開始發(fā)生神經(jīng)變性(Blennow et al. , 2006; Jellinger KA，2007)。臨床發(fā)病期通常特征在于所謂的“輕度認(rèn)知損害”(MCI)，患者示出可測(cè)的認(rèn)知缺陷，這不足以能以明確方式診斷癡呆(Petersenet al. , 1999; Chetkow et al.，2008)。許多MCI患者具有AD典型的神經(jīng)病理學(xué)改變，這意味著可能是早期階段AD,但不確定(Scheff et al. , 2006;Markesbery et al. , 2006; Bouwmanet al. , 2007) 0然而，許多MCI病例不進(jìn)展為阿爾茨海默病，在這些情況中，其它因素造成認(rèn)知缺陷(Saito et al. , 2007; Jicha et al.，2006 和 Petersen et al.，2006)。雖然一些MCI患者未示出其病癥的任何惡化或者甚至一些改善，但是對(duì)于大多數(shù)MCI患者而言，認(rèn)知缺陷將持續(xù)進(jìn)展為臨床癡呆。每年這種轉(zhuǎn)變率為大約10_19%(Gauthier etal., 2006; Fischer et al.，2007)。目前有一種組合的臨床、神經(jīng)心理學(xué)和成像方法，其能區(qū)分輕度認(rèn)知損害的各種亞型(Devanand et al. , 2007;Rossi et al.，2007;Whitwell etal. , 2007;Panza et al.，2007)。然而,在這些亞型之間關(guān)于癡呆的進(jìn)一步進(jìn)展無明顯差異(Fischer et al.，2007)。因此，最重要的是開發(fā)一種能明確及可靠地在早期階段、適當(dāng)?shù)卦谄浒l(fā)病或MCI期間診斷阿爾茨海默病的方法。現(xiàn)有摶術(shù)牛物標(biāo)記阿爾茨海默病的生物標(biāo)記已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中描述。與熟知的心理學(xué)測(cè)試如ADAS-cog、MMSE、DemTect、SKT 或畫鐘測(cè)試(Clock Drawing test) 一起，推測(cè)生物標(biāo)記可改善首次診斷以及監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的靈敏性和特異性。關(guān)于目前AD/MCI的生物標(biāo)記的開發(fā)狀況，已提議將所述疾病的將來與其它診斷標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)聯(lián)(Whitwell et al. , 2007;Panza etal., 2007; Hyman SE，2007)。推測(cè)生物標(biāo)記在將來會(huì)支持傳統(tǒng)的神經(jīng)-心理學(xué)測(cè)試。通常認(rèn)為它們將是開發(fā)抗阿爾茨海默病藥物的非常重要的替代標(biāo)記(Blennow K, 2004;BlennowK, 2005;Hampel et al. , 2006;Lewczuk et al. , 2006;Irizarry MC, 2004)。結(jié)構(gòu)性生物標(biāo)記
“磁共振成像”(MRI)是一種可以檢測(cè)腦部退行性萎縮的成像方法(Barnes J etal. , 2007; Vemuri et al.，2008)。因此，內(nèi)側(cè)顳葉(MTA)的萎縮對(duì)在老年患者腦部海馬區(qū)退行性改變敏感；這可以通過MRI非常明確地觀測(cè)，但是非特異于阿爾茨海默病。輕度MTA在其它癡呆中不更常見(Barkhof et al.，2007)，但是其與MCI相關(guān)(Mevel etal.，2007)。由于這個(gè)原因而不能單獨(dú)從MRI數(shù)據(jù)確定神經(jīng)變性是阿爾茨海默病還是阿爾茨海默病早期階段。另一種成像方法是正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(PET)，其觀測(cè)淀粉樣沉積物上檢測(cè)分子(PIB)的積聚。通過硫黃素T-類似物(11C)PIB越來越多地分別積聚在MCI和輕度阿爾茨海默病患者腦部的某些區(qū)域中而可以進(jìn)行檢測(cè)(Kemppainen etal. , 2007;Klunk et al. , 2004;Rowe et al. , 2007);遺憾的是這在不具有癡呆的對(duì)象中也可檢測(cè)出(Pike et al.，2007)。這大概示出通過PET檢測(cè)淀粉樣沉積物使得可以檢測(cè)臨床前階段的阿爾茨海默病，然而，這需要通過進(jìn)一步的研究證實(shí)。除了最常使用的方法MRI和PET之外，還有另外的AD結(jié)構(gòu)性生物標(biāo)記CBF-SPECT，CMRgl-PET (葡萄糖代謝質(zhì)子光譜分析(H-IMRS),高場(chǎng)強(qiáng)功能性MRI,基于體素的形態(tài)測(cè)量學(xué)(voxel-based morphometry),內(nèi)側(cè)基底顳葉的增強(qiáng)激活(經(jīng)用于檢測(cè)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的fMRI，(R) -[ (11) C]PKl1195PET檢測(cè)(Huang et al. , 2007;Kantarci et al. , 2007;Petrella et al.,2007;Hamalainen et al. , 2007;Kircher et al. , 2007;Kropholler et al.，2007)。CSF生物標(biāo)記老年斑(Senile plaques)是阿爾茨海默病的病理學(xué)特征之一。這些斑主要由Αβ (1-42)肽組成(Attems J，2005)。在一些研究中，可以示出在MCI患者的CSF中低水平的Αβ (1-42)與阿爾茨海默病進(jìn)程中的進(jìn)一步發(fā)展特別相關(guān)(Blennow andHampel, 2003;Hansson et al.，2006 和 2007)。CSF 減少可能是由于腦中 A β (1-42)增強(qiáng)的積聚所致(Fagan et al. , 2006; Prince et al. , 2004; Strozyk et al.，2003)。另一種可能是半溶解的Αβ (1-42)寡聚體的出現(xiàn)(Walsh et al.，2005)，其可以導(dǎo)致CSF中較低水平的檢測(cè)。特別是在阿爾茨海默病早期階段中，檢測(cè)到Αβ (1-42)濃度降低，同時(shí)可以檢測(cè)到CSF 中 Tau 蛋白和憐酸-tau 蛋白量分別增加(Ewers et al. , 2007; Lewczuk et al.，2004)。為了提供更好的生物標(biāo)記可預(yù)測(cè)性，通常嘗試使用Tau/Αβ (1-42)比率，并使其與不具有癡呆的老年人(Fagan et al. , 2007;Gustafson et al. , 2007;Hansson et al. , 2007; Liet al. , 2007; Stomrud et al. , 2007)以及 MCI 患者(Hampel et al. , 2004;Maccioni etal. ,2006; Schonknecht et al.，2007)中的認(rèn)知缺陷預(yù)測(cè)相關(guān)聯(lián)。腦中 Αβ (1-42)、Tau、磷酸-Tau-Thr231的死前CSF水平與死后組織病理學(xué)改變之間的進(jìn)一步相關(guān)性可以在AD患者中檢測(cè)到(Clark et al. , 2003;Buerger et al.，2006)。然而，在其它研究中，可以檢測(cè)到在尸檢后CSF生物標(biāo)記和Aβ (1-42)、總Tau及磷酸-Tau與APOE ε 4-等位基因、斑和纏結(jié)負(fù)載(tangle load)無相關(guān)性(Engelborghs et al. , 2007;Buerger et al.，2007)。在多中心研究中檢測(cè)到令人感興趣的方面。其示出總Tau和磷酸-Tau(181)的水平增加與Αβ (1-42)/Αβ (1-40)比率降低相關(guān)，但是與單獨(dú)的Αβ (1-42)不相關(guān)(Wiltfang etal.，2007)。然而，在其它的CNS疾病如Creutzfeldt-Jakob病、腦梗塞和腦血管性癡呆中也檢測(cè)到CSF Tau水平增加，其與神經(jīng)元喪失均相關(guān)(Buerger et al.，2006 (2) ; Bibl etal.，2008)。另一種可能的生物標(biāo)記是CSF中BACEl活性增加作為MCI的指征(Zhong etal. , 2007) 0該研究還論述了增加的BACEl活性將導(dǎo)致A β產(chǎn)生增加及因此所述肽的聚集增加。阿爾茨海默病伴隨神經(jīng)炎癥過程。CSF抗小膠質(zhì)細(xì)胞抗體因此是AD中這些炎癥過程的可能的生物標(biāo)記(McRea et al.，2007)。 盡管推測(cè)許多生物標(biāo)記能早期診斷阿爾茨海默病，但是無一種生物標(biāo)記保證可靠且明確診斷。這通常是由于大多數(shù)研究使用各自的生物標(biāo)記和臨床診斷對(duì)比。更好的方法是使生物標(biāo)記與阿爾茨海默病的病理學(xué)因素相關(guān)聯(lián)。一種可能的方法是重復(fù)分析經(jīng)明確鑒別及定義的神經(jīng)病理學(xué)癡呆疾病的免疫沉淀的CSF樣品以澄清Αβ (1-40)和Αβ (1-42)是否是合適的神經(jīng)化學(xué)性癡呆標(biāo)記(Jellinger et al.，2008)。為了揭示新的迄今為止未知的阿爾茨海默病的生物標(biāo)記，通常通過對(duì)比性蛋白質(zhì)組分析分析CSF樣品，這樣可以增強(qiáng)的靈敏性診斷AD，也能與其它退行性癡呆疾病區(qū)分(Finehout et al. , 2007;Castano et al. , 2006;Zhang etal. , 2005; Simonsen et al. , 2007; Lescuyer et al. , 2004; Abdi et al.，2006)。在蛋白質(zhì)組分析之后，應(yīng)詳細(xì)分析潛在的新的生物標(biāo)記的適合性及與病理學(xué)因素的相關(guān)性。通過蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)記的一個(gè)典型實(shí)例是截短的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C，其作為多發(fā)性硬化癥的生物標(biāo)記；這個(gè)生物標(biāo)記隨后被證實(shí)是儲(chǔ)存假象(storage artefact) (Iraniet al. , 2006;Hansson et al.，2007(2))。血漿生物標(biāo)記除了常用的血漿生物標(biāo)記即Αβ肽之外，另外的炎癥性血漿標(biāo)記也用于癡呆的早期診斷(Ravaglia et al. , 2007;Engelhart et al.，2004),特別用于阿爾茨海默病的診斷(Motta et al.，2007)。所有這些標(biāo)記仍處于討論中。通過來自AD患者和健康對(duì)照的血衆(zhòng)的對(duì)比性蛋白質(zhì)組分析也發(fā)現(xiàn)了其它可能的生物標(biāo)記(German et al. , 2007; Ray etal.，2007)。未來還將示出這些生物分子是否確實(shí)特異于阿爾茨海默病及是否適合作為生物標(biāo)記。還沒有確信或合適的數(shù)據(jù)示出上述任何生物標(biāo)記的特異性或適合性。與分析CSF中淀粉樣蛋白β相反，迄今為止關(guān)于血漿中合適的Αβ生物標(biāo)記的結(jié)果不可靠或者不明確。在一些研究中，發(fā)現(xiàn)血漿中Αβ (1-42)/Αβ (1-40)比率降低與認(rèn)知功能正常人向MCI或阿爾茨海默病患者轉(zhuǎn)化增強(qiáng)之間的相關(guān)性((Graff-Radfordet al. , 2007; van Oijen et al. , 2006; Sundelof et al.，2008)。然而，其它研究檢測(cè)到A β (1-42)血漿水平降低更可能是從MCI轉(zhuǎn)變?yōu)锳D的標(biāo)記(Song et al.，2007)，不適合作為阿爾茨海默病的神經(jīng)變性目的的標(biāo)記(Pesaresi et al.，2006)。然而，大多數(shù)研究未示出健康對(duì)照個(gè)體與散發(fā)性阿爾茨海默病患者之間Αβ血漿水平中的差異(Fukumotoet al. , 2003;Kosaka et al. , 1997;Scheuner et al. , 1996;Sobow et al. , 2005;Tamaokaet al. , 1996;Vanderstichele et al.，2000)。一些研究還不出血衆(zhòng)中Αβ水平與在腦中的水平不相關(guān)(Fagan et al. , 2006; Freeman et al.，2007),與在CSF中的水平也不相關(guān)(Mehta et al. , 2001; Vanderstichele et al.，2000)。在最近的研究中，檢測(cè)到 CSF 和血漿之間Αβ (1-40)與Αβ (1-42)的相關(guān)性，但是只是在健康對(duì)照中。這種相關(guān)性在MCI和AD中不可檢測(cè)到，這通過由于A β沉積在腦中導(dǎo)致CSF與血漿A β之間平衡被破壞而解釋(Giedraitis et al.，2007)。通常，假設(shè)血漿A β (1_42)水平不是MCI或AD的可靠生物標(biāo)記(Blasko et al. , 2008; Mehta et al. , 2000; Brettschneider et al.，2005),而血衆(zhòng)Αβ (1-38)/Αβ (1-40)比率降低被認(rèn)為是血管性癡呆的生物標(biāo)記，且有可能成為預(yù)測(cè)CSF標(biāo)記(Bibl et al. , 2007)。
迄今為止，未考慮A β寡聚體作為阿爾茨海默病的生物標(biāo)記，然而推測(cè)其在起動(dòng)神經(jīng)變性進(jìn)程中起決定性作用(Walsh & Selkoe, 2007) 在一些研究中，示出8kDa的A β二聚體對(duì)于IOOkDa以上的初原纖維點(diǎn)(point of protofbrils)的神經(jīng)毒性作用(Lambertet al.，1998; Walsh et al, 2002;Keayed et al. , 2004; Cleary et al.，2005)。此外，這種 Αβ 寡聚體在人體液中發(fā)現(xiàn)(Pitschke et al. , 1998; Santos et al. , 2007;Klyubin etal. , 2008) ο除了其神經(jīng)毒性之外，寡聚體對(duì)確定人樣品中Aβ濃度也有影響。寡聚體化導(dǎo)致Αβ肽的C末端表位被掩蔽(Roher et al.，2000)，導(dǎo)致通過C末端特異性ELISA檢測(cè)到的Αβ水平被低估(Stenh et al.，2005)。因此，樣品中Αβ寡聚體的存在導(dǎo)致ELISA信號(hào)降低。這對(duì)于精確確定Αβ濃度是一個(gè)問題，然而，這個(gè)事實(shí)也提供了測(cè)量生物學(xué)樣品中寡聚體的量和寡聚體化水平的機(jī)會(huì)。本文展示的數(shù)據(jù)令人驚奇地證實(shí)Aβ寡聚體的含量可以通過在所述寡聚體解聚之前和之后測(cè)量ELISA信號(hào)而間接確定。這兩個(gè)數(shù)值的比率反映出人血漿中可溶Αβ寡聚體的濃度與寡聚體化水平。與本發(fā)明無關(guān)，最近公布了一種相似的方法(Englund et al.，2009)。他們通過在非變性條件下通過ELISA及在變性條件下使用SDS-PAGE及隨后的Western印跡分析測(cè)量A β 1-42濃度確定人CSF樣品中Αβ 1-42寡聚體比率。然而，這種間接確定寡聚體水平的方法具有一些關(guān)鍵問題I. SDS-PAGE不能完全解聚A β 1_42。我們的經(jīng)驗(yàn)也示出SDS凝膠上的反映A β三聚體和四聚體的條帶。2.通過ELISA和通過Western印跡對(duì)比A β濃度是有缺陷的。另一種更常見的方法是直接測(cè)定Aβ寡聚體。然而，這種方法、特別是用寡聚體血漿Αβ作為生物標(biāo)記，由于Αβ肽是極其疏水性的，因此這種方法非常難以建立。目前描述的測(cè)定系統(tǒng)使用在ELISA系統(tǒng)中A β寡聚體特異性抗體(Englund et al. , 2007; Schupfet al, 2008)。然而，基于這種寡聚體特異性抗體的ELISA的使用具有與傳統(tǒng)的A β ELISA系統(tǒng)相同的問題。所述方法僅達(dá)到非常不令人滿意的分析靈敏性，且遇到與分析物與基質(zhì)即血漿之間非常復(fù)雜的相互作用的嚴(yán)重問題。通常，ELISA或ELISA-型系統(tǒng)(Multiplex)用于量化血漿中Αβ，及最近也用于量化Αβ寡聚體。這種檢測(cè)系統(tǒng)的說明書通常僅被不令人滿意地分析或者被完全忽視。例如，關(guān)鍵項(xiàng)目如回收速率未被分析或者在出版物中未提及。然而，回收速率是提供血漿中存在的這些Aβ肽或寡聚體的完整圖像的決定性因素。研究之間的差異也可以得自這些速率中的差異。ELISA或多元系統(tǒng)的另一重要特征是其線性。因此，確定的血漿中分析物的濃度應(yīng)僅非常低程度或者根本不依賴于測(cè)量中使用的稀釋度。然而，這對(duì)于量化血漿中Αβ的ELISA是不可能的，對(duì)于多元系統(tǒng)也是不可能的。因此，計(jì)算的稀釋1-20倍的血漿Αβ (1-42)濃度之間的差異比稀釋1-2倍的相同樣品高3倍(Hansson et al.，2008)。這個(gè)實(shí)例單獨(dú)示出在一些研究中使用不同稀釋度的血衆(zhòng)樣品使得不可以進(jìn)行對(duì)比。 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可以高可靠性地確定、特別是血漿中的寡聚Αβ的新方法。本發(fā)明也使用Αβ寡聚體的間接測(cè)量法，然而與現(xiàn)有技術(shù)相反，使用Aβ特異性ELISA確定這兩個(gè)值(在變性和非變性條件下)，以保證可對(duì)比性。由于分離單體及寡聚體形式的Αβ肽的最開始的免疫沉淀步驟，隨后是我們的新解聚方法，因此隨后的ELISA不受回收和/或線性問題的限制。此外，本發(fā)明目的在于提供診斷標(biāo)記，其可用可靠方法確定并且可用于阿爾茨海默病的可靠及明確的預(yù)測(cè)。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種診斷或監(jiān)測(cè)神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病和輕度認(rèn)知損害的方法，所述方法包括確定來自檢測(cè)對(duì)象的生物學(xué)樣品中靶淀粉樣β肽(Abeta或A β )的寡聚狀態(tài)，特征在于所述方法包括如下步驟(a)確定生物學(xué)樣品中靶A β肽的第一濃度(Ca)；(b)解聚來自步驟(a)的靶Αβ肽；(c)確定解聚的A β肽的第二濃度(Cd);及(d)確定cd/ca比率,其中將第二濃度(Cd)的值除以第一濃度Ca的值；其中cd/ca比率低于I. 5是神經(jīng)變性疾病的陽性診斷的指征。 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種確定生物學(xué)樣品中靶淀粉樣β肽(Abeta或Αβ)的寡聚狀態(tài)的方法，所述方法包括如下步驟(a)確定生物學(xué)樣品中靶A β肽的第一濃度(Ca)；(b)解聚來自步驟(a)的靶Αβ肽；(c)確定解聚的Αβ肽的第二濃度(Cd);及(d)確定cd/ca比率,其中將第二濃度(Cd)的值除以第一濃度Ca的值；其中cd/ca比率超過I是存在寡聚Aβ的指征。定義如本文所用，“寡聚”是指限定數(shù)目的聚集的Αβ肽單體單位。舉例的這種寡聚體包括二聚體、三聚體和四聚體。術(shù)語“解聚”是指寡聚形式的Aβ肽轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w形式Αβ肽的過程。在本申請(qǐng)中“捕獲抗體”是指涵蓋結(jié)合靶Αβ肽的那些抗體。所述捕獲抗體適當(dāng)?shù)匾愿哂H和性結(jié)合所述靶Αβ肽。在本發(fā)明中，高親和性是指親和性的Kd值為10_7Μ或更好，如Kd值為10_8Μ或更好，甚至更特別地Kd值為10_9Μ至10_12Μ。術(shù)語“抗體”以其最廣泛的含義使用，特別涵蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩個(gè)完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，以及呈現(xiàn)出希望的生物學(xué)活性的抗體片段。所述抗體可以例如是IgM、IgG(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)、IgD、IgA或IgE。然而適當(dāng)?shù)兀隹贵w不是IgM抗體。所述“希望的生物學(xué)活性”是指結(jié)合靶Αβ肽。“抗體片段”包含完整抗體的一部分，通常是完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。舉例的抗體片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段雙抗體，單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。如本文所用，術(shù)語“單克隆抗體”是指得自一群基本上均質(zhì)抗體的抗體，即所述抗體群中包含的各個(gè)抗體除了可能以少量存在的可能天然發(fā)生的突變之外是相同的。單克隆抗體是高特異性的，針對(duì)單一抗原性位點(diǎn)。此外，與典型包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的“多克隆抗體”制備物相反，每個(gè)單克隆抗體均針對(duì)抗原上的單一決定簇。除了其特異性之外，單克隆抗體通常是有利的，因?yàn)槠渫ㄟ^雜交瘤培養(yǎng)合成，不被其它免疫球蛋白污染?！皢慰寺　笔侵傅米曰旧暇|(zhì)抗體群的抗體的特征，且不需要通過任何特別方法產(chǎn)生抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過首先由K5hleret al., Nature, 256:495(1975)描述的雜交瘤方法產(chǎn)生，或者可以通過通常熟知的重組DNA方法產(chǎn)生?！皢慰寺】贵w”也可以分離自噬菌體抗體文庫，使用如Clackson etal. , Nature, 352:624-628 (1991)和 Marks etal. , J. Mol. Biol. , 222:581-597(1991)所述技術(shù)進(jìn)行。本文的單克隆抗體特別包括嵌合抗體(免疫球蛋白)以及這種抗體的呈現(xiàn)希望的生物學(xué)活性的片段，其中嵌合抗體的重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或者屬于特定抗體類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而所述鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源?！叭嗽椿毙问降姆侨?例如鼠)抗體是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或者其片段(如Fv、Fab、Fab’、F (ab’)2或者抗體的其它抗原結(jié)合子序列)，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗體的大部分是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自該受體 的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被來自非人物種(供體抗體)如小鼠、大鼠或兔的具有希望的特異性、親和性和容量(capacity)的⑶R的殘基置換。在一些情況中，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架區(qū)(FR)殘基由相應(yīng)的非人殘基置換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體及在輸入的CDR或構(gòu)架序列中未發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步改善和優(yōu)化抗體性能。通常，人源化抗體包含基本上所有的至少一個(gè)及典型兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或者基本上所有CDR區(qū)相應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些區(qū)域及所有或基本上所有FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的那些區(qū)域。人源化抗體最佳還包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)的至少一部分，典型為人免疫球蛋白的。進(jìn)一步的詳細(xì)描述見 Jones et al.，Nature, 321:522-525 (1986)、Reichmann etal, Nature. 332:323-329(1988)及 Presta, Curr. Op. Struct. Biel. , 2:593-596 (1992)。人源化抗體包括Primatized 抗體，其中所述抗體的抗原結(jié)合區(qū)衍生自通過用感興趣的抗原免疫恒河猴產(chǎn)生的抗體或者“駱駝源化(camelized) ”抗體?！皢捂淔v”或“sFv”抗體片段包含抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單一多肽鏈內(nèi)。通常，F(xiàn)v多肽進(jìn)一步包含在Vh與'結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，其使得sFv形成希望的結(jié)構(gòu)以進(jìn)行抗原結(jié)合。關(guān)于sFv的綜述見Pluckthun in The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. ,Springer-Verlagj NewYork, pp. 269-315(1994)。術(shù)語“雙抗體”是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，該片段包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)，其在同一多肽鏈中與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vd)連接(Vh-Vd)。通過使用太短以至于不能使同一鏈上兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的接頭，使得所述結(jié)構(gòu)域與另一鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體在Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sol.USA, 90:6444-6448(1993)中更詳細(xì)地描述?！胺蛛x的”抗體是已經(jīng)從其天然環(huán)境成分中被鑒別及分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染成分是干擾所述抗體的診斷或治療應(yīng)用的材料，可包括酶、激素及其它蛋白質(zhì)樣或非蛋白質(zhì)樣溶質(zhì)。在合適的實(shí)施方案中，所述抗體被純化為(I)通過Lowry方法確定，大于抗體的95%重量，及更特別大于99%重量，(2)足以獲得N末端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個(gè)殘基的程度，通過使用旋轉(zhuǎn)杯測(cè)序儀分析，或者(3)通過SDS-PAGE在還原或非還原條件下均質(zhì)，使用考馬斯藍(lán)或者適當(dāng)?shù)劂y染色進(jìn)行。分離的抗體包括在重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體，因?yàn)椴淮嬖谒隹贵w的天然環(huán)境的至少一種成分。然而，通常分離的抗體是通過至少一個(gè)純化步驟制備的。如本文所用，表述“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”及“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，且這些命名均包括后代。因此，用語“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括最初的目標(biāo)細(xì)胞及衍生自其的培養(yǎng)物，而無關(guān)乎轉(zhuǎn)化次數(shù)。也應(yīng)理解所有后代在DNA含量方面由于有意或無意的突變而可以不完全相同。包括在原始的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選的具有相同功能或生物學(xué)活性的突變后代。在進(jìn)行確切命名的情況中將更加清晰。如本文所用，術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，定義為是指由通過肽鍵連接的氨基酸組成的生物分子。如本文所用，術(shù)語“一個(gè)”和“所述”被定義為是指“一或多個(gè)”，及還包括多個(gè)，除
非語境不當(dāng)。 “淀粉樣蛋白β、Αβ或β淀粉樣蛋白”是本領(lǐng)域公認(rèn)術(shù)語，指淀粉樣β蛋白和肽，淀粉樣β前體蛋白(APP)以及其修飾物、片段及任何功能等價(jià)物。特別地，如本文所用，淀粉樣蛋白β是指通過APP的蛋白酶解產(chǎn)生的任何片段，但特別是參與或者與淀粉樣病變相關(guān)的那些片段，包括但不限于SEQ ID NO. 3的Αβ (1-38)，SEQ ID NO. 2的Αβ (1-40)及SEQ ID NO. I 的 Αβ (1-42)。在本發(fā)明中，“淀粉樣蛋白β的片段”是所有淀粉樣β肽，包括SEQ IDN0. 13的核心淀粉樣蛋白β片段Αβ. (3-38)，對(duì)于本發(fā)明更合適的是所有淀粉樣β肽，其包含SEQID NO. 19的核心淀粉樣蛋白β片段Αβ_(11-38)。這種Αβ·片段包含SEQ ID NO. 19的Αβ. (11-38)的氨基酸序列，特別是Ai3._(x_y)片段，其已經(jīng)示出由于神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病和輕度認(rèn)知損害的結(jié)果而積聚在對(duì)象體內(nèi)。其中X 定義為選自 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 和 11 的整數(shù)，優(yōu)選地，X是選自1、2、3和11的整數(shù)。更優(yōu)選地，X是I。甚至更優(yōu)選地，X是11。y定義為選自38、39、40、41、42和43的整數(shù)。優(yōu)選地，丫是38、40或42，如40或42。更優(yōu)選地，y是40.甚至更優(yōu)選地，y是38。關(guān)于A β . (x-y)片段的合適實(shí)例是Αβ · (1-38) (SEQ ID NO. 3)Αβ · (1-39) (SEQ ID NO. 4)Αβ · (1-40) (SEQ ID NO. 2)Αβ . (1-41) (SEQ ID NO. 5)Αβ · (1-42) (SEQ ID NO. I)Αβ · (1-43) (SEQ ID NO. 6)A β · (2-38) (SEQ ID NO. 7)A β · (2-39) (SEQ ID NO. 8)
A β · (2-40) (SEQ ID NO. 9)Αβ . (2-41) (SEQ ID NO. 10)Αβ · (2-42) (SEQ ID NO. 11)Αβ · (2-43) (SEQ ID NO. 12)Αβ · (3-38) (SEQ ID NO. 13)Αβ · (3-39) (SEQ ID NO. 14)
Αβ . (3-40) (SEQ ID NO. 15)Αβ . (3-41) (SEQ ID NO. 16)Αβ · (3-42) (SEQ ID NO. 17)Αβ · (3-43) (SEQ ID NO. 18)Αβ·_(11_38) (SEQ ID NO. 19)Αβ · (11-39) (SEQ ID NO. 20)Αβ . (11-40) (SEQ ID NO. 21)Αβ · (11-41) (SEQ ID NO. 22)Αβ · (11-42) (SEQ ID NO. 23), RΑβ · (11-43) (SEQ ID NO. 24)。“功能等價(jià)物”涵蓋Αβ. (x-y)的所有那些突變體或變體，其可以是在已經(jīng)被選擇進(jìn)行本發(fā)明所述的檢測(cè)方法或診斷方法的患者群中天然發(fā)生的。更特別地，在本文中“功能等價(jià)物”是指Αβ (x-y)的功能等價(jià)物是其突變體或變體且已經(jīng)示出積聚在阿爾茨海默病中。所述功能等價(jià)物與各自的Αβ . (x-y)肽相比具有不超過30個(gè),如20個(gè)、例如10個(gè)、特別是5個(gè)及更特別是2個(gè)或僅I個(gè)突變。功能等價(jià)物還涵蓋突變的變體，其包含例如以氨基酸Asp-Ala-Glu開始及分別以Gly-Val-Val和Val-Ile Ala結(jié)束的所有Αβ·肽。在本發(fā)明中特別有用的等價(jià)物是Αβ . (1-40) (SEQ ID NO. 2)和Αβ · (1-42) (SEQID NO. I)的那些等價(jià)物，其是由Irie et al.，2005描述的那些，即A β .的Tottori、Flemish、Dutch、Italian、Arctic和Iowa突變。功能等價(jià)物還包含衍生自淀粉樣蛋白前體蛋白的Αβ肽，其攜帶緊鄰β.._或Y -分泌酶裂解位點(diǎn)的突變,如Swedish、Austrian、French、German、Florida、London、Indiana 和 Australian 改變(Irie et al.，2005)?！靶揎椀牡矸蹣拥鞍爪隆ⅵˇ禄蛘擀碌矸蹣拥鞍住焙w在的淀粉樣β蛋白質(zhì)和肽、淀粉樣蛋白β前體蛋白(APP)、其片段和功能等價(jià)物中各個(gè)氨基酸位置的所有修飾?？捎糜诒景l(fā)明中的是在所述淀粉樣β蛋白和肽、淀粉樣β前體蛋白(APP)、片段和功能等價(jià)物的N和/或C末端氨基酸的修飾。特別有用的是在谷氨酰胺和谷氨酸殘基的修飾，如N末端谷氨酰胺或谷氨酸殘基環(huán)化為焦谷氨酸。本發(fā)明適當(dāng)?shù)膶?shí)例是SEQ ID No. 13-24的淀粉樣β肽，其在N末端以谷氨酸殘基開始，其中所述N末端谷氨酸殘基被修飾為焦谷氨酸。更有用的是在天冬氨酸殘基的修飾，如天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫愄於彼?。本發(fā)明適當(dāng)?shù)膶?shí)例是SEQID No. 1-6的淀粉樣β肽，其中在氨基酸位置I和/或7的天冬氨酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)楫愄於彼?。進(jìn)一步適當(dāng)?shù)膶?shí)例是SEQID No. 7-12的淀粉樣β肽，其中在氨基酸位置6的天冬氨酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)楫愄於彼?。此外，適當(dāng)?shù)膶?shí)例是SEQ ID No. 13-18的淀粉樣β肽，其中在氨基酸位置5的天冬氨酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)楫愄於彼??！皧A心ELISA”通常包括使用兩種抗體，每種抗體均能結(jié)合被檢測(cè)的蛋白質(zhì)的不同的免疫原性部分或者表位。在夾心測(cè)定中，檢測(cè)樣品分析物由固定在固體支持物上的第一抗體結(jié)合，之后第二抗體結(jié)合該分析物，因此形成不溶的三部分復(fù)合物。第二抗體自身可用可檢測(cè)部分標(biāo)記(直接夾心測(cè)定)或者可以使用用可檢測(cè)部分標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體測(cè)量(間接夾心測(cè)定)。例如，一種合適類型的夾心測(cè)定是ELISA測(cè)定，其中所述可檢測(cè)部分是酶。附圖
簡(jiǎn)述圖I :二價(jià)免疫沉淀系統(tǒng)改善捕獲效率(A)通過使用不同抗體組合從Cyp18溶液和人血漿回收A β I-40。(B) 二價(jià)捕獲系統(tǒng)示意圖(陰影4G8抗體；灰色x_40抗體；黑色與磁珠綴合的 抗小鼠抗體)。圖2 :確定衍生自人血漿的A β肽的寡聚狀態(tài)在解聚之后確定的濃度與未解聚確定的濃度的比率反映Αβ (1-40/42)的寡聚狀態(tài)。圖3 DemTect 測(cè)試通過DemTect評(píng)分獲得的在AD患者和健康對(duì)象中分類差異結(jié)果的平均值(平均值土SD) (I 組18 - 30 歲，II 組31-45 歲；111 組:46-65 歲)。圖4 :簡(jiǎn)易精神狀態(tài)測(cè)試(Mini-Mental-State Test)通過簡(jiǎn)易精神狀態(tài)測(cè)試獲得的在AD患者和健康對(duì)象中分類差異結(jié)果的平均值(平均值土SD) (I 組18 - 30 歲，II 組31-45 歲；111 組:46-65 歲)。圖5 :畫鐘測(cè)試(Clock-Drawing Test)通過畫鐘測(cè)試獲得的在AD患者和健康對(duì)象中分類差異結(jié)果的平均值(平均值土SD) (I 組18 - 30 歲，II 組31-45 歲；111 組:46-65 歲)。圖6 :寡聚狀態(tài)的平均值，AD組對(duì)比對(duì)照組的T-檢驗(yàn)。**Τ_ 檢驗(yàn)，p〈0. 01檢驗(yàn)，ρ〈0· 001圖7 :反映血漿中總體寡聚量的A β (1-40)+A β (1-42)的寡聚狀態(tài)。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種診斷或監(jiān)測(cè)神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病和輕度認(rèn)知損害的方法，所述方法包括確定來自檢測(cè)對(duì)象的生物學(xué)樣品中靶淀粉樣β肽(Abeta或A β )的寡聚狀態(tài)，其特征在于所述方法包括如下步驟(a)確定生物學(xué)樣品中靶Αβ肽的第一濃度(Ca)；(b)解聚來自步驟(a)的靶Αβ肽；(c)確定解聚的Αβ肽的第二濃度(Cd);及(d)確定cd/ca比率,其中將第二濃度(Cd)的值除以第一濃度Ca的值；其中cd/ca比率低于I. 5是神經(jīng)變性疾病的陽性診斷結(jié)果的指征。本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)令人驚奇地證實(shí)當(dāng)與對(duì)照患者相比時(shí)在阿爾茨海默病患者中Αβ的寡聚狀態(tài)顯著降低。因此，Αβ的寡聚狀態(tài)看起來可以可靠及明確的預(yù)測(cè)阿爾茨海默病。(cd/ca)的比率為I. O提示在樣品中無寡聚體。較高比率的cd/ca(即比率>1.0)反映出樣品中存在較多量的寡聚體或者更緊密的寡聚體(表位可及性較低)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)cd/ca的比率低于I. 5 (即比率在I. 0-1. 5之間)，如低于I. 4、低于I. 3、低于I. 2、低于I. I或者低于I.05是神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病的陽性診斷結(jié)果的指征。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了診斷或監(jiān)測(cè)神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病和輕度認(rèn)知損害的方法，所述方法包括確定來自檢測(cè)對(duì)象的生物學(xué)樣品中靶淀粉樣Αβ肽(Abeta或A β )的寡聚狀態(tài)，其特征在于所述方法包括如下步驟(a)確定生物學(xué)樣品中靶Αβ肽的第一濃度(Ca)；(b)解聚來自步驟(a)的靶A β肽；(c)確定解聚的Αβ肽的第二濃度(Cd);及(d)將Cd和Ca的值相加，其中Cd與Ca的和低于3. O是神經(jīng)變性疾病的陽性診斷結(jié)果的指征。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Cd與Ca的和低于2. 9、低于2. 8、低于2. 7、低于2. 6、低于2. 5、低于2. 4或者低于2. 3是神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病的陽性診斷結(jié)果的指征。在幾乎所有研究中，通過由捕獲抗體和檢測(cè)抗體組成的夾心ELISA系統(tǒng)確定步驟
(a)和(c)中靶Αβ肽的濃度。與抗體(150kDa)的大小相比，Αβ肽(4.5kDa)作為單體是非常小的。由于肽的聚集傾向，它們趨于形成寡聚體，初原纖維形成原纖維點(diǎn)。在這種聚集物內(nèi)，Αβ單體緊密填充，結(jié)果是由于位阻或表位不可及性而導(dǎo)致不是所有單體均可以由檢測(cè)抗體結(jié)合。檢測(cè)的寡聚體A β濃度低于單體的。這將導(dǎo)致在血漿和CSF中低估的A β水平。測(cè)量的濃度與真實(shí)的濃度之間的矛盾取決于寡聚體的量及其密集性。相反，Αβ聚集物的量或者更精確地負(fù)荷表位(burden epitopes)的量可以通過對(duì)比在存在寡聚體條件下檢測(cè)的濃度與在寡聚體完全解聚為單體之后的濃度而確定。該方法的原理在圖2中示出。在一個(gè)實(shí)施方案中，解聚步驟(b)包括使用堿。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于步驟
(b)中解聚的堿是氫氧化鈉，如500mM氫氧化鈉。使用堿及特別是強(qiáng)堿如氫氧化鈉的優(yōu)勢(shì)是實(shí)現(xiàn)更有效的解聚。例如，獲得較高比率的單體，無可觀測(cè)數(shù)量的二聚體、三聚體或者四聚體。在一個(gè)實(shí)施方案中,解聚步驟(b)另外包括使用合適的溶劑,如甲醇,例如50%(v/V)甲醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，解聚步驟(b)包括保溫步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，保溫步驟包括在室溫保溫至少2分鐘。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述保溫步驟包括在室溫保溫至少10分鐘。在通過β-和Y-分泌酶相繼裂解之后，Αβ肽從淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)中釋出。Y分泌酶裂解導(dǎo)致主要的Αβ (1-40)和Αβ (1-42)肽產(chǎn)生，但是顯然在位置38或43結(jié)束，其在C末端不同，且呈現(xiàn)出不同的聚集、原纖維形成及神經(jīng)毒性等效力。同樣，β-分泌酶釋放可產(chǎn)生不同的N末端及隨后由肽酶及其它酶修飾，獲得主要種類，如在如2、3、4和11位置開始的Aβ肽，而在谷氨酸3和11位置開始的種類可以被轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸，使得這些肽是特別疏水性的并且具有快速聚集的傾向(Schilling et al, 2004;Piccini etal. , 2005; Schilling et al, 2006; Schlenzig et al, 2009) A β 的這種 C-和 N-末端變體可作為Αβ (1-40)和Αβ (1-42)肽的功能等價(jià)物。本發(fā)明因此提供了確定Αβ (x-y)肽的寡聚狀態(tài)的方法，其中x和y如上文定義。因此，根據(jù)上述方法的一個(gè)實(shí)施方案，被確定的靶A β肽的寡聚狀態(tài)選自如下組中
Αβ · (1-38) (SEQ ID NO. 3)，Αβ · (1-39) (SEQ ID NO. 4)，Αβ · (1-40) (SEQ ID NO. 2)，Αβ . (1-41) (SEQ ID NO. 5)，Αβ · (1-42) (SEQ ID NO. I)，Αβ · (1-43) (SEQ ID NO. 6)，Αβ · (2-38) (SEQ ID NO. 7)，Αβ · (2-39) (SEQ ID NO. 8)，Αβ · (2-40) (SEQ ID NO. 9)，Αβ · (2-41) (SEQ ID NO. 10)，Αβ · (2-42) (SEQ ID NO. 11)，Αβ · (2-43) (SEQ ID NO. 12)，Αβ · (3-38) (SEQ ID NO. 13)，Αβ · (3-39) (SEQ ID NO. 14)，Αβ · (3-40) (SEQ ID NO. 15)，Αβ · (3-41) (SEQ ID NO. 16)，Αβ · (3-42) (SEQ ID NO. 17)，Αβ · (3-43) (SEQ ID NO. 18)，
Αβ_11_38) (SEQ ID NO. 19)，Αβ · (11-39) (SEQ ID NO. 20)，Αβ · (11-40) (SEQ ID NO. 21)，Αβ · (11-41) (SEQ ID NO. 22)，Αβ· (11-42) (SEQ ID NO. 23),RΑβ · (11-43) (SEQ ID NO. 24)。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，被檢測(cè)的靶Αβ肽的寡聚狀態(tài)是Αβ (1-40) (SEQ IDNo:2)。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，被檢測(cè)的靶Αβ肽的寡聚狀態(tài)是Αβ (1-42) (SEQ IDNo:1)ο在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，被檢測(cè)的靶Αβ肽的寡聚狀態(tài)是Αβ (1-40) (SEQ IDNo :2)和Αβ (1-42) (SEQ ID No: I)。本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)證實(shí)A β (1-40)與Αβ (1-42)肽總和的適合性，其中已經(jīng)示出這兩種寡聚狀態(tài)的總和改善診斷的顯著性。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，被檢測(cè)的靶Αβ肽的寡聚狀態(tài)是選自SEQ IDNO :13-24的至少一種Αβ肽，其以在N末端的谷氨酸殘基起始。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，被檢測(cè)的靶Αβ肽的寡聚狀態(tài)是Αβ (3-38) (SEQ IDNo:13)。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，被檢測(cè)的靶Αβ肽的寡聚狀態(tài)是Αβ (11-38) (SEQ IDNo:19)。在另一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，被檢測(cè)的靶Αβ肽的寡聚狀態(tài)是選自SEQIDNO: 13-24的至少一種A β肽，其中在這些肽N末端的谷氨酸殘基被環(huán)化為焦谷氨酸。
在另一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，被檢測(cè)的靶Αβ肽的寡聚狀態(tài)是選自SEQID No. 1-6的至少一種Aβ肽，其中在氨基酸位置I和/或7的天冬氨酸殘基被轉(zhuǎn)變?yōu)楫愄於彼帷８貏e地，被檢測(cè)的靶A β肽的寡聚狀態(tài)是選自SEQ ID No. 7-12的至少一種A β肽，其中在氨基酸位置6的天冬氨酸殘基被轉(zhuǎn)變?yōu)楫愄於彼帷８貏e地，被檢測(cè)的靶A β肽的寡聚狀態(tài)是選自SEQ ID No. 13-18的至少一種A β肽，其中在氨基酸位置5的天冬氨酸殘基被轉(zhuǎn)變?yōu)楫愄於彼?。?yīng)意識(shí)到確定Αβ的寡聚狀態(tài)的方法構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面，其涉及新的及有創(chuàng)造性的測(cè)定，其非必需限于診斷神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病。因此，根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了一種確定生物學(xué)樣品中靶淀粉樣β肽(Abeta或Αβ)的寡聚狀態(tài)的方法，所述方法包括如下步驟(a)確定生物學(xué)樣品中靶Αβ肽的第一濃度(Ca)； (b)解聚來自步驟(a)的靶Αβ肽；(c)確定解聚的Αβ肽的第二濃度(Cd);及(d)確定cd/ca比率,其中將第二濃度(Cd)的值除以第一濃度Ca的值；其中cd/ca比率超過I是存在寡聚Aβ的指征。在一個(gè)實(shí)施方案中，解聚步驟(b)包括使用如前文定義的堿。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(a)和(C)中確定靶Αβ肽的第一濃度和第二濃度的方法包括i)將生物學(xué)樣品與至少兩種捕獲抗體接觸，ii)檢測(cè)所得免疫復(fù)合物，iii)破壞所述免疫復(fù)合物，及iv)量化捕獲的Αβ肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，量化步驟(iv)包括在Αβ特異性ELISA中分析。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述A β特異性ELISA是夾心-ELISA。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(a)和(c)均包含用Αβ特異性ELISA分析。這個(gè)實(shí)施方案提供了使得可以對(duì)比在步驟(a)和(c)中獲得的第一濃度和第二濃度的優(yōu)勢(shì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物學(xué)樣品選自血液、血清、尿液、腦脊液(CSF)、血漿、淋巴、唾液、汗液、胸膜液、滑膜液、淚液、膽汁和胰腺分泌物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物學(xué)樣品是血漿。生物學(xué)樣品可以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式得自患者。特別地，血液樣品可得自對(duì)象，且血液樣品可通過常規(guī)方法分離成血清和血漿。從中獲得生物學(xué)樣品的對(duì)象懷疑患有阿爾茨海默病，處于發(fā)生阿爾茨海默病的風(fēng)險(xiǎn)中和/或處于其它類型癡呆風(fēng)險(xiǎn)中或具有其它類型癡呆。特別地，所述對(duì)象是懷疑患有輕度認(rèn)知損害(MCI)和/或處于早期阿爾茨海默病的對(duì)象。本發(fā)明的方法具有優(yōu)于本領(lǐng)域已知方法的幾個(gè)優(yōu)勢(shì)，即本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)阿爾茨海默病早期階段以及在疾病發(fā)生和進(jìn)展的早期區(qū)分阿爾茨海默病與其它類型癡呆。一種可能的早期階段是輕度認(rèn)知損害(MCI)。使用本領(lǐng)域目前已知的方法還不能明確及可靠地診斷早期阿爾茨海默病，及特別不能在所述早期階段區(qū)分阿爾茨海默病的發(fā)生與其它形式癡呆。這種方法特別用于患有MCI的患者。相反，本發(fā)明提供的方法適于區(qū)分性診斷阿爾茨海默病。特別地，本發(fā)明提供了一種方法，其中可以在得自任何上述對(duì)象的生物學(xué)樣品中以高度可再現(xiàn)形式檢測(cè)靶A β肽的寡聚狀態(tài)。本發(fā)明方法的高度可再現(xiàn)性通過在最初的免疫沉淀步驟(步驟(a))中使用至少兩種不同的捕獲抗體實(shí)現(xiàn)，所述免疫沉淀步驟與在隨后步驟(C)中使用的方法相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，有至少兩種不同的捕獲抗體針對(duì)靶Αβ肽的不同表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物學(xué)樣品是血漿。上述“靶A β肽”涵蓋如前文定義的A β (x-y) 0本發(fā)明必須克服的一個(gè)特殊問題是使用的生物標(biāo)記在阿爾茨海默病早期階段中例如在輕度認(rèn)知損害期間是被改變的。本發(fā)明人已經(jīng)示出可以可靠方式確定靶Αβ肽的寡聚狀態(tài)，且也首次更明確地指出事實(shí)上Αβ (x-y)的寡聚狀態(tài)特別適于診斷早期發(fā)作的阿爾茨海默病。在步驟(a)和(C)中確定靶A β肽的第一濃度和第二濃度的方法特別包括如下步驟i)在免疫沉淀步驟中將生物學(xué)樣品與至少兩種不同的捕獲抗體接觸。在將生物學(xué)樣品與前述至少兩種不同的捕獲抗體接觸之后，在所述至少兩種不同的捕獲抗體與靶A β肽之間形成免疫復(fù)合物。這個(gè)步驟不特異性分離全長(zhǎng)A β (x-y)，其中X是I，而是捕獲和分離所有A β種類，特別是在38、40和/或42位置結(jié)束的。ii)然后通過二抗檢測(cè)這個(gè)復(fù)合物。適當(dāng)?shù)?，將所述二抗固定在磁珠上。使用磁性分離器，可容易地將所述免疫復(fù)合物與磁珠一起與體液(血漿/血清、CSF等)分離。 iii)將所述免疫復(fù)合物從所述珠中洗脫。適當(dāng)?shù)?，洗脫步驟通過將攜帶所述免疫復(fù)合物的珠在包含50%甲醇/O. 5%甲酸的溶液中在室溫保溫I小時(shí)。從而所有分子間相互作用被破壞，分離自生物學(xué)樣品的所有A β肽分子從溶液中的珠中釋出。iv)將釋出的分離的Αβ肽在隨后的步驟中量化，例如通過夾心ELISA量化，其特異性檢測(cè)全長(zhǎng)(x_y)，其中這個(gè)步驟中全長(zhǎng)Αβ (x-y)最適當(dāng)?shù)厥侵甫ˇ?(1-40)和Αβ (1-42)。適用于本發(fā)明中的進(jìn)行免疫沉淀的可能抗體是如下抗體，但是本發(fā)明不限于這些特別的實(shí)例3D6,表位1-5 (Elan Pharmaceuticals, Innogenetics)pAb_EL16,表位1-72H4,表位1-8 (Covance)IElI,表位1-8 (Covance)20. I,表位1-10 (Covance, Santa Cruz Biotechnology)兔抗_Αβ多克隆抗體，表位1-14(Abeam)AB10,表位:1-16 (Chemicon/Upstate-part of Millipore)82E1，表位1-16 (IBL)pAb 1-42，表位:1-11NAB228,表位1-11 (Covance, Sigma-Aldrich, Cell Signaling, Santa CruzBiotechnology, Zymed/Invitrogen)
DE2，表位1-16 (Chemicon/Upstate-part of Millipore)DE2B4，表位1-17 (Novus Biologicals，Abcam，Accurate，AbD Serotec)6E10，表位:1-17 (Signet Covance, Sigma-Aldrich)10D5，表位3-7 (Elan Pharmaceuticals)W0-2，表位4-10 (The Genetics Company)1A3，表位 5-9 (Abbiotec)pAb-EL21，表位 5-11
310-03，表位 5-16 (Abcam，Santa Cruz Biotechnology)雞抗-人Αβ多克隆抗體，表位12-28 (Abcam)雞抗-人Αβ多克隆抗體，表位25-35 (Abcam)兔抗-人Αβ多克隆抗體，表位N_terminal (ABR)兔抗-人Αβ多克隆抗體(Anaspec)12C3，表位 10-16 (Abbiotec，Santa Cruz Biotechnology)16C9，表位 10-16 (Abbiotec，Santa Cruz Biotechnology)19B8，表位 9-10 (Abbiotec，Santa Cruz Biotechnology)pAb-EL26，表位11-26BAM90. 1，表位13-28 (Sigma-Aldrich)兔抗-β_淀粉樣蛋白(pan)多克隆抗體，表位15_30(MBL)22D12，表位:18-21 (Santa Cruz Biotechnology)266，表位16-24(Elan Pharmaceuticals)pAb-EL17;表位15-244G8，表位17-24 (Covance)兔抗-Αβ多克隆抗體，表位22-35 (Abcam)G2-10，表位31-40 (The Genetics Company)兔抗-A0，aa32-40 多克隆抗體(GenScript Corporation)EP 1876Y，表位x_40 (Novus Biologicals)G2-11，表位33-42 (The Genetics Company)16C11，表位33-42 (Santa Cruz Biotechnology)21F12，表位34-42 (Elan Pharmaceuticals，Innogenetics)1A10，表位35-40 (IBL)D-17 山羊抗-Αβ 抗體，表位C_ 末端(Santa Cruz Biotechnology)對(duì)于免疫沉淀特別的抗體是:3D6(Elan)、BAN50 (Takeda)、82E1 (IBL)、6E10 (Covance)、W0-2 (The Genetics Company)、266 (Elan)、BAM90. I (Sigma)、4G8 (Covance)、G2-10 (The Genetics Company)、1A10 (IBL)、BA27 (Takeda)、11A5-B10(Mi 11ipore)Λ12F4(Millipore)、21F12(Elan)。舉例的A β N3pE特異性抗體是-Pyro-Glu Abeta 抗體 A β 5-5-6 (保藏號(hào) DSM ACC 2923)，A β 6+6 (保藏號(hào) DSMACC 2924)，Αβ 17-4-3 (保藏號(hào) DSM ACC 2925)及 Aβ 24-2-3 (保藏號(hào) DSM ACC 2926)，這些抗體在 PCT/EP2009/058803 (單克隆，小鼠)，Probiodrug AG 中描述；
-Pyro-Glu Abeta 抗體克隆 2-48 (單克隆，小鼠)；Synaptic Systems-Pyro-Glu Abeta 抗體(多克隆，兔)；Synaptic Systems-Pyro-Glu Abeta 抗體克隆 8E1 (單克隆，小鼠)；Anawa-Pyro-Glu Abeta 抗體克隆 8E1 (單克隆，小鼠)；Biotrend-抗-人淀粉樣蛋白β(Ν3ρΕ)兔IgG(多克隆，兔)；IBL-抗-人ΑβΝ3ρΕ(8Ε1)小鼠 IgG Fab (單克隆，小鼠)；IBL舉例的A β isoAsp I特異性抗體是
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-抗-人APisoAsp I 抗體(多克隆，兔)；在 Saido TC, et al. , Neurosci Lett.(1996) 13; 215 (3) : 173-6 中揭示。特別用于免疫沉淀的抗體對(duì)是4G8 與 11A5-B10，3D6 與 4G8，6E10 與 4G8，82E1 與 4G8，4G8 與 12F4，4G8 與 21F12,3D6 與 21F12，6E10 與 21F12，BAN50 與 4G8，3D6 與 11A5_B10，3D6 與 1A10，3D6 與 BA27，6E10與 11A5-B10，6E10 與 1A10，6E10 與 BA27，4G8 與 11A5-B10，4G8 與 1A10，4G8 與 BA27，4G8 與12F4，4G8 與 21F12。舉例的A β Ν3ρΕ特異性抗體是-Pyro-Glu Abeta 抗體 A β 5-5-6 (保藏號(hào) DSM ACC 2923)，A β 6+6 (保藏號(hào) DSMACC 2924) ,Αβ 17-4-3 (保藏號(hào) DSM ACC 2925)及 Aβ 24-2-3 (保藏號(hào) DSM ACC 2926)，這些抗體在 PCT/EP2009/058803(單克隆，小鼠)，Probiodrug AG 中描述；-Pyro-Glu Abeta 抗體克隆 2-48 (單克隆，小鼠)；Synaptic Systems-Pyro-Glu Abeta 抗體(多克隆，兔)；Synaptic Systems-Pyro-Glu Abeta 抗體克隆 8E1 (單克隆，小鼠)；Anawa-Pyro-Glu Abeta 抗體克隆 8E1 (單克隆，小鼠)；Biotrend-抗-人淀粉樣蛋白β(Ν3ρΕ)兔IgG(多克隆，兔)；IBL-抗-人ΑβΝ3ρΕ(8Ε1)小鼠 IgG Fab (單克隆，小鼠);IBL。舉例的Αβ isoAsp I特異性抗體是-抗-人APisoAsp I 抗體(多克隆，兔)；Saido et al.，1996)。除了上述抗體之外，適于進(jìn)行免疫沉淀的所有其它淀粉樣蛋白β特異性抗體(單克隆及多克隆)均可用于濃度確定方法中(其它合適的抗體可例如來自WWW. alzforum.org)。良好捕獲效率的決定因素是使用具有不同表位的兩、三或多種不同抗體。使用一種以上的抗體類型進(jìn)行Αβ肽的免疫沉淀提供了協(xié)同及令人驚奇的協(xié)同結(jié)合作用(親和力)，最終可以實(shí)現(xiàn)極高的捕獲效率(見圖I)。步驟ii)中的二抗特異性抗宿主捕獲抗體的抗體類型。合適的二抗是抗小鼠抗體和抗兔抗體。在步驟iii)中將所述復(fù)合物與磁珠保溫之后，用洗滌緩沖液洗滌該珠(見本發(fā)明實(shí)施例)。含有洗滌劑或者防止非特異性結(jié)合的其它添加劑的洗滌緩沖液可用于這個(gè)步驟。非限制性的洗滌緩沖液的實(shí)例是-含有10mg/ml 親環(huán)蛋白 18 (Cyp 18)和 O. 05%Tween-20 的 D-PBS，-PBS+0. 05%Tween-20,-TBS+0. 05%Tween-20,
-PBS+1%(w/v)BSA+0. 05%Tween_20，-TBS+1% (w/v) BSA+0. 05%Tween_20，以及-Pierce ELISA Blocker (with Tween-20) 在步驟iv)中將所述免疫復(fù)合物與所述珠洗脫之后，將溶液在稀釋緩沖液中稀釋。任何可以防止與表面以及固定化的第一 ELISA抗體非特異性相互作用的稀釋緩沖液均可用于這個(gè)步驟。非限制性的稀釋緩沖液的實(shí)例是-EIA緩沖液(IBL 1-40 (N) ELISA試劑盒的稀釋緩沖液)，-PBS+1%(w/v)BSA+0. 05%Tween_20，-TBS+1%(w/v)BSA+0. 05%Tween_20，及-Pierce ELISA Blocker (及 Tween-20)。能定量全長(zhǎng)Αβ (1-40)的ELISA-試劑盒可商購(gòu)。在本發(fā)明方法中用于定量Αβ (1-40)的合適的ELISA試劑盒是例如淀粉樣蛋白β (1-40) (N)ELISA(IBL, JP27714)；Αβ [1-40]人 ELISA 試劑盒(Invitrogen);人淀粉樣蛋白 β (Amyloid-β ), aa 1-40ELISA試劑盒(Wako Chemicals USA, Inc.);淀粉樣蛋白 β 1-40ELISA 試劑盒(The GeneticsCompany)。能定量全長(zhǎng)Αβ (1-42)的ELISA-試劑盒也可商購(gòu)。在本發(fā)明方法中用于定量Αβ (1-42)的合適的ELISA-試劑盒是例如淀粉樣蛋白β (1-42) (N) ELISA (IBL, JP27712)；Αβ [1-42]人 ELISA 試劑盒(Invitrogen),人淀粉樣蛋白 β (Amyloid-β ), aa 1-42ELISA試劑盒(Wako Chemicals USA, Inc.),淀粉樣蛋白 β 1-40ELISA 試劑盒(The GeneticsCompany)，INNOTEST β -AMYLOID (1-42) (Innogenetics)。所述濃度確定方法不限于舉例的前述可商購(gòu)的Aβ (1-40)或Αβ (1-42)的ELISA試劑盒。全長(zhǎng)Αβ (1-40)或Αβ (1-42)的許多其它夾心ELISA可以在現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域中獲得或者可以由技術(shù)人員開發(fā)。所有這些全長(zhǎng)Αβ 1-40或Αβ 1-42夾心ELISA應(yīng)也包含在所述濃度確定方法中，并且應(yīng)典型包含一對(duì)合適的捕獲抗體和檢測(cè)抗體，其分別特異于Αβ (1-40)和/或Αβ (1-42)的完整N末端及在氨基酸位置40或42結(jié)束的C末端。這種全長(zhǎng)Aβ (1-40)夾心ELISA可包含第一固定化抗體，其特異性識(shí)別Aβ (1-40)的C末端，及包含第二標(biāo)記的檢測(cè)抗體，其特異性識(shí)別A β (1-40)的完整N末端。全長(zhǎng)Αβ (1-42)夾心ELISA可包含第一固定化抗體，其特異性識(shí)別Aβ (1-42)的C末端，及包含第二標(biāo)記的檢測(cè)抗體，其特異性識(shí)別A β (1-42)的完整N末端。全長(zhǎng)Αβ (1-40)夾心ELISA也可包含第一固定化抗體，其特異性識(shí)別Aβ (1-40)的完整N末端，及包含第二標(biāo)記的檢測(cè)抗體，其特異性識(shí)別A β (1-40)的C末端。全長(zhǎng)Αβ (1-42)夾心ELISA也可包含第一固定化抗體，其特異性識(shí)別Aβ (1-42)的完整N末端，及包含第二標(biāo)記的檢測(cè)抗體，其特異性識(shí)別A β (1-42)的C末端。用于所述濃度確定方法中的合適的A β (1-40/42) N-末端特異性抗體例如是 3D6 (Elan)、W0-2 (The Genetics Company)、82E1 (IBL)、BAN-50 (Takeda)。許多其它A β (1-40/42) N-末端特異性抗體在現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域中可獲得或者可以由技術(shù)人員開發(fā)。所有這些A β (1-40/42) N-末端特異性抗體也預(yù)期用于濃度確定方法中。 合適的Αβ (1-40)C_ 末端特異性抗體例如是 G2_10(The Genetics Company)、11A5-B10 (Mi 11 ipore)、1A10(IBL)、BA27 (Takeda)、EP1876Y (Novus Biologicals)。許多其它Αβ (1-40)C-末端特異性抗體可以在現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域中獲得或者由技術(shù)人員開發(fā)。所有這些A β (1-40) C-末端特異性抗體也預(yù)期用于濃度確定方法中。合適的Αβ (1-42)C_ 末端特異性抗體例如是 G2-11 (The Genetics Company)、12F4 (Millipore),抗人 Αβ (38-42)兔 IgG(IBL)、21F12 (Elan)、BC05 (Takeda)、16C11 (Santa Cruz Biotechnology)。許多其它A β (1_42) C-末端特異性抗體可以在現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域中獲得或者由技術(shù)人員開發(fā)。所有這些Αβ (1-42)C-末端特異性抗體也預(yù)期用于濃度確定方法中。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述檢測(cè)抗體是標(biāo)記的。 對(duì)于診斷性應(yīng)用，檢測(cè)抗體典型地由可檢測(cè)部分標(biāo)記?？衫迷S多標(biāo)記，其通?？杀环譃槿缦骂悇e(a)放射性同位素，如35S、14C、125I、3H和131L所述抗體可以用所述放射性同位素標(biāo)記，使用如在 Current Protocols in Immunology, Volumes land 2, Giitigen etal. , Ed. , ffiley-Interscience. New York, New York. Pubs. , (1991)中所述技術(shù)進(jìn)行，放射性可以通過使用閃爍計(jì)數(shù)法測(cè)量。(b)熒光標(biāo)記，如可利用稀土元素螯合物(銪螯合物)或者熒光素及其衍生物，羅丹明及其衍生物，丹酰，Lissamine,藻紅蛋白和Texas Red。所述突光標(biāo)記可以與抗體綴合，使用如在如前述Current Protocols in Immunology中所述技術(shù)進(jìn)行。突光可以通過使用熒光計(jì)量化。(C)可利用各種酶-底物標(biāo)記。所述酶通常催化生色底物的化學(xué)改變，可以使用各種技術(shù)測(cè)量。例如，酶可以催化底物顏色改變，這可以通過分光光度法測(cè)量?；蛘?，酶可以改變底物的熒光或者化學(xué)發(fā)光。量化熒光改變的技術(shù)在上文描述。化學(xué)發(fā)光底物通過化學(xué)反應(yīng)變?yōu)殡娂ぐl(fā)狀態(tài)，然后可以發(fā)射可測(cè)量的光(例如使用化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x)或者將能量供給熒光受體。舉例的酶標(biāo)記包括螢光素酶(如螢火蟲螢光素酶和細(xì)菌螢光素酶；美國(guó)專利4，737，456)，螢光素，2，3- 二氫酞嗪二酮，蘋果酸脫氫酶，脲酶，過氧化物酶，如辣根過氧化物酶(HRPO)，堿性磷酸酶，O-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)，雜環(huán)氧化酶(如尿酸氧化酶和黃嘌呤氧化酶)，乳過氧化物酶，微過氧化物酶等。使酶與抗體綴合的技術(shù)在O’ Sullivan etal. , Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in EnzymeImmunoassay,in Methods in Enzym. (ed Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, NewYork, 73:147-166(1981)中描述。舉例的酶-底物組合包括例如(i)辣根過氧化物酶(HRPO)與過氧化氫酶作為底物，其中過氧化氫酶氧化染料前體(例如鄰苯二胺(OPD)或者3，3’，5，5’ -四甲基鹽酸聯(lián)苯胺(TMB))；(ii)堿性磷酸酶(AP)與對(duì)硝基苯基磷酸酯(para-Nitrophenyl phosphate)作為生色底物；以及(iii) β -D-半乳糖苷酶(β -D-Gal)與生色底物(例如對(duì)硝基苯基_β _D_半乳糖苷酶)或者生熒光底物4-甲基傘形基-β -D-半乳糖苷酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用許多其它酶-底物組合。(d)檢測(cè)抗體的另一可能的標(biāo)記是短核苷酸序列。然后通過RT-PCR系統(tǒng)確定濃度(Imperacer , Chimera Biotech)。有時(shí)所述標(biāo)記與抗體間接綴合。技術(shù)人員已知實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的的各種技術(shù)。例如，抗體可以與生物素綴合，及上述任何三種廣義類別的標(biāo)記可以與抗生素蛋白綴合，或者反之亦然。生物素選擇性結(jié)合抗生物素蛋白，因此所述標(biāo)記可以這種間接方式與抗體綴合。或者，為了實(shí)現(xiàn)標(biāo)記與抗體的間接綴合，將抗體與小的半抗原(如地高辛)綴合，及將上述不同類型的標(biāo)記之一與抗-半抗原抗體(如抗-地高辛抗體)綴合。因此，可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記與抗體的間接綴合。用于本發(fā)明中的抗體可用于任何已知測(cè)定方法中，如競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定，直接和間接夾心測(cè)定以及免疫沉淀測(cè)定。Zola, Monoclonal Antibodies A Manual ofTechniques, pp. 147-158(CRC Press.Inc. , 1987)。
競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定依賴于標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物與檢測(cè)樣品分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合限量抗體的能力。檢測(cè)樣品中Αβ肽的量與結(jié)合抗體的標(biāo)準(zhǔn)物的量成反比。為了便于確定結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物的量，通?？贵w在競(jìng)爭(zhēng)之前或之后是不溶的，以便與所述抗體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物和分析物可方便地與保持未結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物和分析物分離。對(duì)于在人體內(nèi)分析Αβ (1-40)濃度，所有如下體液均可以使用血液、腦脊液(CSF)、尿液、淋巴、唾液、汗液、胸膜液、滑膜液、水相液體、淚液、膽汁以及胰腺分泌物。所述新方法由本發(fā)明人使用血液樣品確立(見本發(fā)明實(shí)施例)。然而本發(fā)明的方法不限于血液樣品。所述方法也可以相同方式使用CSF、腦提取物和尿液樣品，以及其它人體體液，如上述體液。特別的樣品包括血漿樣品。對(duì)于免疫組織化學(xué)分析，組織樣品可以是新鮮或者冷凍的或者可以包埋于石蠟中及用防腐劑如福爾馬林固定?？梢砸庾R(shí)到盡管夾心ELISA系統(tǒng)包含本發(fā)明步驟(a)和(C)中確定Αβ濃度的一個(gè)特殊實(shí)施方案，但是可以使用其它濃度確定方法。確定A β濃度的其它合適方法是I.淀粉樣蛋白 β 1-40 HTRF*8測(cè)定(CisBio Bioassays):這個(gè)測(cè)定原理基于TR-FRET，其是時(shí)間分辨熒光免疫分析與FOrster共振能量轉(zhuǎn)移的組合。與通常夾心ELISA相似，Αβ (1-40)由兩種抗體結(jié)合；然而所述抗體在此不結(jié)合表面，在溶液中發(fā)生相互作用。這兩種抗體均用熒光團(tuán)標(biāo)記。當(dāng)這兩種熒光團(tuán)通過生物分子相互作用聚在一起時(shí)，在激發(fā)期間由供體熒光團(tuán)捕獲的一部分能量通過FRET轉(zhuǎn)移至受體熒光團(tuán)，結(jié)果其被激發(fā)。測(cè)量受體熒光團(tuán)的熒光。測(cè)量信號(hào)與FRET的量相關(guān)，因此確定溶液中Αβ (1-40)的量。相似地，基于相當(dāng)原理，可以使用Lilly的Alphascreen 測(cè)定。2.多元測(cè)定系統(tǒng)多元測(cè)定系統(tǒng)可得自一些廠商，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知及廣泛使用。用于本發(fā)明方法中的合適實(shí)例是INNO-BIA血衆(zhòng)Αβ形式測(cè)定(Innogenetics)。這個(gè)測(cè)定是非常標(biāo)準(zhǔn)化的多參數(shù)基于珠的免疫測(cè)定，同時(shí)量化血漿中人β_淀粉樣肽形式Αβ (1-42)和Αβ (1-40)或者 Αβ (Χ-42)和 Αβ (Χ-40)，使用χΜΑΡ 技術(shù)進(jìn)行(xMAP 是 Luminex Corp.的注冊(cè)商標(biāo))。這個(gè)測(cè)定能同時(shí)量化直至100個(gè)不同分析物。這種方法的基礎(chǔ)是小球形聚苯乙烯顆粒，稱作微球或珠。與ELISA和Western印跡相似，這些珠作為生物化學(xué)檢測(cè)的固相。這些珠以顏色編碼，由此可以區(qū)分100個(gè)不同類別的珠。每個(gè)類別的珠具有一個(gè)特異性抗體(例如抗Αβ (1-40))固定在微球體表面上。如果Αβ (1-40)濃度增加，則更多的肽分子將由這個(gè)類別的珠結(jié)合。檢測(cè)分析物的結(jié)合通過二抗抗-Aβ (1-40)抗體進(jìn)行，其用另一種熒光染料標(biāo)記，發(fā)射綠光。類似于FACS分析處理樣品。通過流體力聚焦使微球單一化(singularized)，并通過基于激光的檢測(cè)系統(tǒng)分析，這樣可以基于綠色熒光進(jìn)行量化及通過珠的特殊顏色鑒別結(jié)合的分析物。因此，可以在一個(gè)樣品中確定多個(gè)分析物的濃度。3.通過質(zhì)譜分析進(jìn)行暈化-對(duì)于量化Αβ(1-40),也可使用SELDI-T0F質(zhì)譜分析術(shù)(Simonsen etal.，2007(2))。、
-使用免疫沉淀與MALDI-T0F質(zhì)譜分析術(shù)量化分析Aβ肽。15N標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)A β肽用于校準(zhǔn)(Gelfanova et al.，2007)。4. Western 印跡分析2D-凝膠電泳結(jié)合Western印跡分析可以是量化Αβ肽的合適方法(Sergeant etal.,2003;Casas et al.，2004)。診斷試劑盒為方便起見，本發(fā)明方法中使用的抗體可以在試劑盒中提供，即包裝的預(yù)定量的試劑組合，附帶進(jìn)行診斷測(cè)定的說明書。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了診斷神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病的試劑盒，所述試劑盒包含合適的堿及根據(jù)本發(fā)明所述方法使用該試劑盒的說明書。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒另外包含如本文定義的至少兩種不同的捕獲抗體。在抗體用酶標(biāo)記的情況中，所述試劑盒還包括所述酶需要的底物和輔因子(例如底物前體，其提供可檢測(cè)的生色團(tuán)或熒光團(tuán))。此外，可以包括其它添加劑，如穩(wěn)定劑、緩沖液(例如阻斷緩沖液或者裂解緩沖液)等等。各種試劑的相對(duì)量可以大大不同，以提供基本上最佳化測(cè)定靈敏性的試劑溶液濃度。特別地，所述試劑可以干粉形式提供，通常是凍干的，包括賦形劑，當(dāng)其溶解時(shí)提供具有適當(dāng)濃度的試劑溶液。本發(fā)明的診斷試劑盒特別用于檢測(cè)和診斷神經(jīng)變性疾病，如淀粉樣蛋白相關(guān)疾病和病癥，例如阿爾茨海默病。應(yīng)用本發(fā)明的方法首次可以以可靠方式檢測(cè)和量化寡聚的靶Αβ肽，特別是Αβ (1-40) ,Aβ (1-42) ,Aβ (3-38)和/或Αβ (11-38)或者其功能等價(jià)物。特別地，本發(fā)明提供了寡聚Aβ (1-40) ,Aβ (1-42) ,Aβ (3-38)和/或Αβ (11-38)作為血漿生物標(biāo)記，其適用于區(qū)分性診斷阿爾茨海默病，特別是在疾病的早期階段。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用確定淀粉樣β肽的寡聚狀態(tài)的方法診斷阿爾茨海默病，如區(qū)分性診斷阿爾茨海默病，特別是在疾病的早期階段。適當(dāng)?shù)?，阿爾茨海默病的早期階段是輕度認(rèn)知損害。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用寡聚靶Αβ肽診斷阿爾茨海默病，如區(qū)分性診斷阿爾茨海默病，特別是在疾病的早期階段。適當(dāng)?shù)?，阿爾茨海默病的早期階段是輕度認(rèn)知損害。特別地，使用本發(fā)明的方法檢測(cè)和量化寡聚靶Αβ肽，其用于診斷阿爾茨海默病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶Αβ肽是如前文定義的Αβ (x-y)或者其功能等價(jià)物。本發(fā)明的方法還具有工業(yè)實(shí)用性以監(jiān)測(cè)對(duì)于神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病給予的治療的效力。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種監(jiān)測(cè)在對(duì)象中的治療效力的方法，所述對(duì)象患有、懷疑患有或者傾向于患有神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病，所述方法包括確定取自檢測(cè)對(duì)象的生物學(xué)樣品中如本文定義的靶淀粉樣β肽(Abeta或Αβ)的寡聚狀態(tài)。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物學(xué)樣品在兩或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)取自檢測(cè)對(duì)象。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，所述方法另外包括對(duì)比在兩或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)取自檢測(cè)對(duì)象的生物學(xué)樣品中存在的靶淀粉樣β肽(Abeta或Αβ)的寡聚狀態(tài)的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法另外包括將檢測(cè)樣品中存在的靶淀粉樣β肽(Abeta或Αβ)的寡聚狀態(tài)的水平與在開始治療之前取自所述對(duì)象的一或多個(gè)樣品和/或在治療早期取自所述對(duì)象的一或多個(gè)樣品中存在的量進(jìn)行對(duì)比。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法另外包括將靶淀粉樣β肽(Abeta或Αβ)的寡聚狀態(tài)的水平與一或多種對(duì)照進(jìn)行對(duì)比。本發(fā)明通過如下實(shí)施例得以進(jìn)一步描述，然而所述實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書定義。本發(fā)明的實(shí)施例I.材料和方法I. I患者和健康對(duì)照經(jīng)臨床診斷為AD的患者及健康對(duì)照由CRO(GALMED GmbH)招募。在預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中，通過一些心理測(cè)試檢測(cè)研究的所有參加者的神經(jīng)心里學(xué)功能(DemTect，簡(jiǎn)易精神狀態(tài)測(cè)試,畫鐘測(cè)試)。DemTect 測(cè)試DemTect評(píng)分是簡(jiǎn)便的癡呆篩選方法，包括五個(gè)短的子測(cè)試(10字表重復(fù)、數(shù)字譯石馬(number transcoding)、語義流中為任務(wù)(semantic word fluency task)、反向數(shù)字廣度(backward digit span)、延遲字表回憶(delayed word list recall)) (Kessleret al. , 2000) 0原始評(píng)分被轉(zhuǎn)化以給出不依賴于年齡和教育程度的評(píng)分，分類為“疑似癡呆”(評(píng)分彡8)，“輕度認(rèn)知損害”(評(píng)分為9-12)和“年齡相適”(評(píng)分為13-18)。MMSE簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查(TheMini-Mental State Examination,MMSE)或 Folstein 測(cè)試是簡(jiǎn)短的30道題問卷測(cè)試，其用于評(píng)估認(rèn)知(見表I)。其在醫(yī)學(xué)中通常用于篩選癡呆。在大約10分鐘時(shí)長(zhǎng)內(nèi)，其抽樣調(diào)查各種功能,包括計(jì)算、記憶和方向。其由Folstein etal.，1975引入，并經(jīng)小改變而廣泛使用。MMSE包括在一些領(lǐng)域的簡(jiǎn)單問題測(cè)試的時(shí)間和地點(diǎn)、重復(fù)單詞表、計(jì)算、語言運(yùn)用和理解以及基本的運(yùn)動(dòng)技能。例如，一個(gè)問題是要求重復(fù)畫兩個(gè)五邊形(見下表)。(30之中)任何超過27的評(píng)分是有效正常的。低于此評(píng)分，20-26表示輕度癡呆；10-19為中度癡呆,低于10為嚴(yán)重癡呆。正常值也根據(jù)教育程度和年齡校正。低到極低評(píng)分與癡呆存在密切相關(guān)，盡管其它精神疾病也可以導(dǎo)致MMST測(cè)試中的異常發(fā)現(xiàn)。

表I :簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查
權(quán)利要求
1.診斷或監(jiān)測(cè)神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病和輕度認(rèn)知損害的方法，所述方法包括確定來自檢測(cè)對(duì)象的生物學(xué)樣品中靶淀粉樣β肽(Abeta或Αβ)的寡聚狀態(tài)，其特征在于所述方法包括如下步驟 (a)確定生物學(xué)樣品中靶Αβ肽的第一濃度(Ca)； (b)解聚來自步驟(a)的靶Αβ肽； (C)確定解聚的A β肽的第二濃度(Cd);及 (d)確定cd/ca比率，其中將第二濃度(Cd)的數(shù)值除以第一濃度Ca的數(shù)值；其中cd/ca的比率低于I. 5是神經(jīng)變性疾病陽性診斷的指征。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述解聚步驟(b)包括使用堿。
3.權(quán)利要求2的方法，其中用于在步驟(b)中進(jìn)行解聚的堿是氫氧化鈉，如500mM氫氧化鈉。
4.權(quán)利要求2或3的方法，其中所述解聚步驟(b)另外包括使用合適的溶劑，如甲醇，特別是50% (v/V)甲醇。
5.前述任ー權(quán)利要求的方法，其中所述解聚步驟(b)包括保溫步驟。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述解聚步驟(b)包括在室溫進(jìn)行至少2分鐘的保溫步驟。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述解聚步驟(b)包括在室溫進(jìn)行至少10分鐘的保溫步驟。
8.前述任ー權(quán)利要求的方法，其中cd/ca的比率低于I.4如低于I. 3是神經(jīng)變性疾病陽性診斷的指征。
9.權(quán)利要求8的方法，其中cd/ca的比率低于I.2如低于I. I是神經(jīng)變性疾病陽性診斷的指征。
10.前述任ー權(quán)利要求的方法，其中所述靶Aβ肽包含SEQID NO. 13的Αβ (3-38)的氨基酸序列。
11.前述任ー權(quán)利要求的方法，其中所述靶Aβ肽包含SEQ ID NO. 19的Αβ (11-38)的氨基酸序列。
12.前述任ー權(quán)利要求的方法,其中所述祀Aβ肽是Αβ (x_y),包括其功能等價(jià)物,其中X被定義是整數(shù)，選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11，y被定義是整數(shù)，選自38、39、40、41、42 和 43。
13.權(quán)利要求10的方法，其中X是選自1、2、3和11的整數(shù)，如1，特別是11。
14.權(quán)利要求10的方法，其中y是選自38、40或42的整數(shù)，如40，特別是38。
15.前述任ー權(quán)利要求的方法，其中所述靶Aβ肽選自SEQ ID NO. 1_24，包括其功能等價(jià)物。
16.前述任ー權(quán)利要求的方法，其中所述靶Aβ肽是SEQID ΝΟ:2的Αβ (1_40)，包括其功能等價(jià)物。
17.權(quán)利要求1-15任ー項(xiàng)的方法，其中所述靶Αβ肽是SEQID ΝΟ:1的Αβ (1-42)，包括其功能等價(jià)物。
18.權(quán)利要求1-15任ー項(xiàng)的方法，其中所述靶Αβ肽包含SEQID NO. 2的Αβ (1-40)及SEQ ID NO. I的Αβ (1-42)，包括其功能等價(jià)物。
19.權(quán)利要求1-15任ー項(xiàng)的方法，其中所述靶Αβ肽選自SEQID NO. 13-24，包括其功能等價(jià)物。
20.權(quán)利要求1-15和19任ー項(xiàng)的方法，其中所述靶Αβ肽是SEQID NO: 13的Αβ (3-38)，包括其功能等價(jià)物。
21.權(quán)利要求1-15和19任ー項(xiàng)的方法，其中所述靶Αβ肽是SEQID ΝΟ:19的Αβ (11-38)，包括其功能等價(jià)物。
22.權(quán)利要求19-21任ー項(xiàng)的方法，其中在所述靶Αβ肽N末端的谷氨酸殘基被環(huán)化為焦谷氨酸。
23.權(quán)利要求1-15任ー項(xiàng)的方法，其中所述靶Αβ肽選自SEQID No. 1_6，包括其功能等價(jià)物，以及其中在氨基酸位置I和/或7的天冬氨酸殘基被轉(zhuǎn)變?yōu)楫愄於彼帷?br> 24.權(quán)利要求1-15任ー項(xiàng)的方法，其中所述靶Αβ肽選自SEQID No. 7_12，包括其功能等價(jià)物，以及其中在氨基酸位置6的天冬氨酸殘基被轉(zhuǎn)變?yōu)楫愄於彼帷?br> 25.權(quán)利要求1-15任ー項(xiàng)的方法，其中所述靶Αβ肽選自SEQID No. 13-18，包括其功能等價(jià)物，以及其中在氨基酸位置5的天冬氨酸殘基被轉(zhuǎn)變?yōu)楫愄於彼帷?br> 26.前述任ー權(quán)利要求的方法，其中所述生物學(xué)樣品選自血液、血清、尿液、腦脊液(CSF)、血漿、淋巴液、唾液、汗液、胸水、滑膜液、淚液、膽汁和胰腺分泌物。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述生物學(xué)樣品是血漿。
28.前述任ー權(quán)利要求的方法，其中確定靶Aβ肽濃度的步驟包括 i)將生物學(xué)樣品與至少兩種不同的捕獲抗體接觸， ii)檢測(cè)所得免疫復(fù)合物， iii)破壞所述免疫復(fù)合物，以及 iv)量化捕獲的Aβ肽。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述至少兩種不同的捕獲抗體各自特異于Αβ肽上的不同表位。
30.權(quán)利要求28或29的方法，其中所述捕獲抗體選自 .3D6，表位:1-5, pAb-EL16，表位:1-7, .2H4，表位:1-8, IElI，表位:1-8, .20.1，表位1-10， 兔抗-Αβ多克隆抗體，表位1-14 (Abeam)， AB10，表位:1-16, .82E1，表位:1-16, pAbl-42,表位:1-11, NAB228，表位1-11， DE2，表位:1-16, DE2B4，表位:1-17, .6E10，表位:1-17, .10D5，表位3-7， WO-2，表位4-10，.1A3，表位 5-9，pAb-EL21，表位 5-11，.310-03，表位 5-16，雞抗-人Αβ多克隆抗體，表位12-28 (Abcam)，雞杭-人Αβ多克隆抗體，表位25-35 (Abeam)，兔杭-人Αβ多克隆抗體，表位Ν-末端(ABR)，兔抗-人Αβ多克隆抗體(Anaspec),.12C3，表位 10-16，.16C9，表位 10-16，.19Β8，表位 9-10，pAb-EL26，表位11-26，BAM90. 1，表位13-28，兔抗-β -淀粉樣蛋白(pan)多克隆抗體，表位15-30 (MBL)，.22D12，表位18-21，.266，表位16-24，pAb-EL17，表位15-24，.4G8，表位17-24，兔抗-Αβ多克隆抗體，表位22-35 (Abeam)，G2-10，表位:31-40，兔抗-A β , aa 32-40 多克隆抗體(GenScript Corporation)，EP1876Y，表位:x-40,G2-11，表位33-42，.16C11，表位33-42，.21F12，表位34-42，.1A10，表位:35-40，及D-17山羊抗-A β抗體，表位C-末端焦谷氨酸A β抗體，Probiodrug AGAβ 5-5-6，Aβ 6-1-6,Αβ 17-4-3，Aβ 24_2_3，焦谷氨酸A β抗體克隆2-48(單克隆，小鼠)，Synaptic Systems,焦谷氨酸A β抗體(多克隆，兔)，Synaptic Systems,焦谷氨酸A β抗體克隆8Ε1 (單克隆,小鼠)，Anawa,焦谷氨酸A β抗體克隆8Ε1 (單克隆,小鼠)，Biotrend,杭-人淀粉樣蛋白β (Ν3ρΕ)兔IgG (多克隆，兔)，IBL，杭-人ΑβΝ3ρΕ(8Ε1)小鼠IgG Fab (單克隆，小鼠)，IBLisoAsp 抗體(T. Saido 小組)。
31.權(quán)利要求28-30任ー項(xiàng)的方法，其中所述捕獲抗體選自3D6、BAN50、82E1、6E10、W0-2、266、BAM90. 1、4G8、G2-10、1A10、BA27、11A5-B10、12F4 和 21F12。
32.權(quán)利要求28-31任ー項(xiàng)的方法，其中如下抗體對(duì)用作捕獲抗體4G8 和 11A5-B10,3D6 和 4G8,6E10 和 4G8,82E1 和 4G8,4G8 和 12F4, 4G8 和 21F12,3D6 和 21F12,6E10 和 21F12,BAN50 和 4G8，3D6 和 11A5-B10,3D6 和 1A10,3D6 和 BA27,6E10 和 11A5-B10,6E10 和 1A10,6E10 和 BA27,4G8 和 11A5-B10,4G8 和 IAlO，4G8 和 BA27, 4G8 和 12F4，及 4G8 和 21F12。
33.權(quán)利要求30-32任ー項(xiàng)的方法，其中所述復(fù)合物的檢測(cè)通過使用與每種捕獲抗體特異性反應(yīng)的ニ抗進(jìn)行。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述ニ抗是抗小鼠抗體或抗兔抗體。
35.權(quán)利要求33或34的方法，其中所述ニ抗是標(biāo)記的。
36.權(quán)利要求33-34任ー項(xiàng)的方法，其中所述ニ抗被固定化在磁珠上。
37.權(quán)利要求36的方法，其中使用磁性分離器使攜帯所述免疫復(fù)合物的磁珠與生物學(xué)樣品分離。
38.權(quán)利要求30-37任ー項(xiàng)的方法，其中所述免疫復(fù)合物的破壞是在存在50%(v/v)甲醇/0. 5%(v/v)甲酸的條件下進(jìn)行的。
39.權(quán)利要求30-38任ー項(xiàng)的方法，其中量化檢測(cè)的免疫復(fù)合物。
40.權(quán)利要求30-39任ー項(xiàng)的方法，其中捕獲的Aβ肽通過選自如下的量化手段量化；夾心ELISA,淀粉樣蛋白βト40 HTRF'llJ定，Alphascreen 測(cè)定,多重測(cè)定系統(tǒng),質(zhì)譜分析法及Western印跡分析法。
41.權(quán)利要求40的方法，其中捕獲的Αβ肽通過夾心ELISA作為量化手段進(jìn)行量化。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述夾心ELISA包括第一抗體，其特異于Aβ (χ-y)的完整N末端，及包括檢測(cè)抗體，其特異于以氨基酸y結(jié)束的Αβ (x-y)的C末端。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述夾心ELISA包含第一抗體，其特異于SEQID NO. 2的Αβ (1-40)的完整N末端；及包含檢測(cè)抗體，其特異于在第40位氨基酸結(jié)束的SEQ ID NO. 2的Αβ (1-40)的C末端。
44.權(quán)利要求42的方法，其中所述夾心ELISA包含第一抗體，其特異于SEQID NO. I的Αβ (1-42)的完整N末端；及包含檢測(cè)抗體，其特異于在第42位氨基酸結(jié)束的SEQ ID NO. I的Αβ (1-42)的C末端。
45.權(quán)利要求42的方法，其中所述夾心ELISA包含第一抗體，其特異于SEQID NO. 2的Αβ (1-40)的C末端；及包含檢測(cè)抗體，其特異于以Asp-Ala-Glu開始的SEQ ID NO. 2的Αβ (1-40)的完整N末端。
46.權(quán)利要求42的方法，其中所述夾心ELISA包含第一抗體，其特異于SEQID NO. I的Αβ (1-42)的C末端；及包含檢測(cè)抗體，其特異于以Asp-Ala-Glu開始的SEQ ID NO. I的Αβ (1-42)的完整N末端。
47.權(quán)利要求42的方法，其中所述夾心ELISA包含第一抗體，其特異于選自SEQIDNO. 13-24的Αβ靶肽的完整N末端；及包含檢測(cè)抗體，其特異于選自SEQ ID NO. 13-24的所述Αβ靶肽的C末端。
48.權(quán)利要求42的方法，其中所述夾心ELISA包含第一抗體，其特異于SEQID NO. 13的Αβ (3-38)的完整N末端；及包含檢測(cè)抗體，其特異于在第38位氨基酸結(jié)束的SEQ IDNO. 13 的 Αβ (3-38)的 C 末端。
49.權(quán)利要求42的方法，其中所述夾心ELISA包含第一抗體，其特異于SEQID NO. 19的Αβ (11-38)的完整N末端；及包含檢測(cè)抗體，其特異于在第38位氨基酸結(jié)束的SEQ IDNO. 19 的 Αβ (11-38)的 C 末端。
50.權(quán)利要求47-49任ー項(xiàng)的方法，其中選自SEQID NO. 13-24的Αβ靶肽的N末端被環(huán)化為焦谷氨酸，以及其中所述第一抗體特異性檢測(cè)焦谷氨酸化形式的選自SEQ IDNO. 13-24的所述Αβ靶肽。
51.權(quán)利要求42-50任ー項(xiàng)的方法，其中所述第一抗體是固定化的。
52.權(quán)利要求42-51任ー項(xiàng)的方法，其中所述檢測(cè)抗體是標(biāo)記的。
53.權(quán)利要求42的方法，其中使用ELISA試劑盒量化Aβ (χ-y)。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述ELISA試劑盒是量化SEQID NO. 2的Αβ (1-40)的試劑盒，選自Amyloid-β (1-40) (N) ELISA (IBL, JP27714)，Αβ [1-40] Human ELISAKit (Invitrogen), Human Amyloid beta(Amyloid-b), aa 1-40ELISA Kit(ffako ChemicalsUSA, Inc.),以及 Amyloid Beta 1-40ELISA Kit (The Genetics Company)。
55.權(quán)利要求53的方法，其中所述ELISA試劑盒是量化SEQID NO. I的Αβ(1_42)的 ELISA 試劑盒，選自Amyloid-β (1-42) (N) ELISA (IBL, JP27712)，Αβ [1-42] HumanELISA Kit (Invitrogen)，Human Amyloid beta(Amyloid-β), aa 1-42 ELISA Kit(ffakoChemicals USA, Inc.), Amyloid Betal-40 ELISA Kit(The Genetics Company),1NN0TEST β-AMYLOID (1-42) (Innogenetics)。
56.前述任ー權(quán)利要求的方法，用于阿爾茨海默病的鑒別診斷。
57.權(quán)利要求1-55任ー項(xiàng)的方法，用于早期阿爾茨海默病的診斷。
58.權(quán)利要求57的方法，用于輕度認(rèn)知損害的診斷。
59.權(quán)利要求10-25任一項(xiàng)定義的寡聚Aβ肽如靶Αβ肽在診斷阿爾茨海默病中的應(yīng)用。
60.權(quán)利要求59的應(yīng)用，用于阿爾茨海默病的鑒別診斷。
61.權(quán)利要求59或60的應(yīng)用，用于早期阿爾茨海默病的診斷。
62.權(quán)利要求61的應(yīng)用，用于輕度認(rèn)知損害的診斷。
63.確定生物學(xué)樣品中靶淀粉樣P肽(Abeta或AP)的寡聚狀態(tài)的方法，包括如下步驟 (a)確定生物學(xué)樣品中靶AP肽的第一濃度(Ca)， (b)解聚來自步驟(a)的靶AP肽， (C)確定解聚的AP肽的第二濃度(Cd)，及 (d)確定cd/ca的比率，其中將第二濃度(cd)的值除以第一濃度(ca)的值，其中cd/ca比率超過I是存在寡聚AP的指征。
64.權(quán)利要求65的方法，其中所述解聚步驟(b)包括使用堿。
65.診斷阿爾茨海默病的體外方法，其中使用權(quán)利要求63或64的確定淀粉樣P肽的寡聚狀態(tài)的方法。
66.診斷神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病的試劑盒，其包括合適的堿及根據(jù)權(quán)利要求.1-55任ー項(xiàng)的方法使用所述試劑盒的說明書。
67.監(jiān)測(cè)在患有、懷疑患有或者傾向于患有神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病的對(duì)象中的治療效カ的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求1-55任一項(xiàng)確定來自檢測(cè)對(duì)象的生物學(xué)樣品中靶淀粉樣P肽(Abeta或者AP )的寡聚狀態(tài)。
68.權(quán)利要求1-55或67任一項(xiàng)的診斷或監(jiān)測(cè)方法，其包括確定來自檢測(cè)對(duì)象的取自兩個(gè)或多個(gè)時(shí)機(jī)的生物學(xué)樣品中靶淀粉樣P肽的寡聚狀態(tài)。
69.權(quán)利要求68的診斷或監(jiān)測(cè)方法，其包括對(duì)比取自兩個(gè)或多個(gè)時(shí)機(jī)的生物學(xué)樣品中靶淀粉樣P肽的寡聚狀態(tài)水平。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用淀粉樣蛋白β的片段的寡聚狀態(tài)作為生物標(biāo)記檢測(cè)和診斷阿爾茨海默病，及進(jìn)一步涉及確定生物學(xué)樣品中淀粉樣蛋白β的片段的寡聚狀態(tài)的新方法。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102666577SQ201080053137
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月24日
發(fā)明者C·格特利希, H-U·德穆特, J-U·拉費(fèi)爾德, M·克蘭施米特 申請(qǐng)人:前體生物藥物股份公司