專利名稱：使用2-甲基吡啶硼烷作為還原劑還原胺化和分析糖類的制作方法
使用2-甲基吡啶硼烷作為還原劑還原胺化和分析糖類本發(fā)明涉及糖類(carbohydrate)的還原胺化。蛋白偶聯(lián)聚糖涉及到重要的生物過(guò)程，例如細(xì)胞間相互作用、受體活化和分子運(yùn)輸(Ohtsubo等人，Cell 2006，126，855-67)。最近的關(guān)于聚糖在藥物治療中的作用的研究和聚糖作為特異性疾病中的生物標(biāo)志物的研究引起了對(duì)快速和靈敏的高通量糖分析方法(glycoanalytical method)的需求(Packer 等人，Proteomics 2008, 8, 8-20 ;和 Wuhrer, MExpert. Rev. Proteomics 2007, 4, 135-36)。這些方法包括HPLC (Royle 等人，Anal. Biochem. 2008, 376, 1-12 ;和 Ruhaak 等人，Anal. Chem. 2008，80，6119-26 )和與UV檢測(cè)、熒光檢測(cè)或質(zhì)譜檢測(cè)相結(jié)合的毛細(xì)管電泳(CE) (Kamoda 等人，J. Chromatogr. A 2006,1133,332-39)。可供選擇地，質(zhì)譜分析法可以用作獨(dú)立的技術(shù)(Qian等人，Anal. Biochem. 2007, 364, 8-18 ；和Jang-Lee等人，Methods Enzymol. 2006，415，59-86)。許多方法涉及用于引進(jìn)紫外吸收或熒光標(biāo)簽 白勺聚糖衍生化(Anumula, K. R. Anal. Biochem. 2006, 350, 1-23 ；和 Shilova 等人，Bioorg.Khim. 2003, 29，339-55)。在說(shuō)明書(shū)中列出或討論的先前公布的文件或任何背景不應(yīng)必然地被認(rèn)為是承認(rèn)文件或背景是現(xiàn)有技術(shù)的部分或者是公知常識(shí)。廣泛使用的標(biāo)記技術(shù)涉及通過(guò)還原胺化使寡糖與胺取代的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)偶聯(lián)。在可逆反應(yīng)中，開(kāi)環(huán)形式的糖類與胺基反應(yīng)并消除水，形成希夫堿。在第二不可逆反應(yīng)中，希夫堿被還原形成仲胺。在該反應(yīng)中最廣泛使用的還原劑是氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)15該試劑的主要缺點(diǎn)是，水解時(shí)其容易形成有毒的揮發(fā)性化合物氰化氫。該試劑另一個(gè)缺點(diǎn)是，其被認(rèn)為是過(guò)于強(qiáng)烈的還原劑，導(dǎo)致寡糖的至少一些直接還原而不是還原胺化。對(duì)于糖類與4-氨基-N-[2-( 二乙氨基)乙基]苯甲酰胺(DEAEAB)的還原胺化，引入了可選的還原劑三乙酰氧基硼氫化鈉(NaBH(OAc)3)并且假定該方法適合于所有的胺標(biāo)記(Dalpathado 等人，Anal. Bioanal. Chem. 2005，381，1130-37)。然而，該還原劑沒(méi)有廣泛地應(yīng)用于聚糖分析。這被認(rèn)為是由于其反應(yīng)不足。本發(fā)明通過(guò)提供2-甲基卩比唳硼燒(2-picoline borane, 2_PB)用于糖類的還原胺化的用途論述了以上和其他的缺點(diǎn)。出人意料地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)2-PB作為糖類標(biāo)記的還原胺化試劑特別有效和有用。因此，本發(fā)明還提供了標(biāo)記糖類的工藝，所述工藝包括在2-PB的存在下，將糖類與標(biāo)記劑接觸，生成標(biāo)記的糖類。在不受理論束縛的情況下，認(rèn)為2-PB用于糖類的還原胺化(例如，標(biāo)記)的用途具有以下意想不到的優(yōu)點(diǎn)(i)與NaBH3CN相比，糖類的還原胺化如果沒(méi)有改進(jìn)，則具有可比較的轉(zhuǎn)化和/或選擇性；和/或(ii)與NaBH(OAc)3相比，糖類的還原胺化具有改進(jìn)的轉(zhuǎn)化和選擇性；和/或(i i i )與NaBH3CN相比降低的毒性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將糖類與標(biāo)記劑在2-PB的存在下反應(yīng)。任何適合的標(biāo)記劑均可以用于本發(fā)明。通常，標(biāo)記劑將包括可以與開(kāi)環(huán)形式的糖類還原末端反應(yīng)的胺基。實(shí)例包括胺取代的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)和其他含有標(biāo)記劑的胺，例如丙氨酸和[13C6]-丙氨酸。目前胺取代的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)是優(yōu)選的標(biāo)記劑。適合的胺取代的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)的實(shí)例包括2-氨基苯甲酸(2-AA)、2_氨基苯甲酰胺(2-AB )、8-氨基芘-1，3，6-三磺酸(APTS )、2-氨基吡啶(2-AP )、[D6] -AP 和[D4] -2-AA。氨基取代的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)可以攜帶進(jìn)一步的反應(yīng)性官能團(tuán)。此種多官能標(biāo)簽的實(shí)例包括2，5- 二氨基吡啶和2-氨基-6-酰氨基生物素基吡啶(BAP)。目前，2-AA、2-AB和APTS是優(yōu)選的胺取代的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)(例如APTS)。其他適合的胺取代的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)對(duì)于技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是明顯的，例如來(lái)自Anumula, K. R. Anal. Biochem. 2006，350，1-23,將其引入本文作為參考。所謂術(shù)語(yǔ)“糖類”，我們包括一種或多種通常含有I至40個(gè)組分糖的單糖、寡糖和多糖，或這些糖的混合物。適合的糖類可以得自人、動(dòng)物或植物源，或者得自重組表達(dá)的蛋白質(zhì)或生物技術(shù) 表達(dá)的蛋白質(zhì)。用于制備糖類的適合的合成方法包括有機(jī)合成以及多糖的完全或部分的水解或者降解。實(shí)例包括已經(jīng)通過(guò)葡聚糖的部分酸水解制備的寡糖(本文也稱之為葡萄糖梯(glucose ladder))。用于合成寡糖的其他方法對(duì)于技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的(參見(jiàn),例如Seeberger, P. H. , Carbohydrate Research 2008, 343, 1889-1896,和 Seeberger, P. H. , ChemSoc Rev. 2008, 37, 19-28.將其引入本文作為參考)。包括那些得自糖蛋白和糖脂的聚糖(例如N-聚糖)是可以用于本發(fā)明的糖類的進(jìn)一步實(shí)例，例如由人血漿制備的N-聚糖。圖I描述了得自葡聚糖的低聚葡萄糖與2-AA標(biāo)記的還原胺化的反應(yīng)機(jī)理。還顯示了沒(méi)有標(biāo)記的低聚葡萄糖的直接還原。如圖I所示，還原胺化分兩步進(jìn)行第一(可逆的)反應(yīng)，其中糖類與伯胺反應(yīng)生成希夫堿；接著是第二 (不可逆的)反應(yīng)，其中還原希夫堿以生成仲胺。本發(fā)明可以采用相當(dāng)于這兩個(gè)反應(yīng)的兩個(gè)分離的步驟進(jìn)行。然而，優(yōu)選地，兩個(gè)反應(yīng)用一鍋法(one-pot)(即用一個(gè)步驟，而不是兩個(gè)分離的步驟)進(jìn)行。這具有加速過(guò)程和減少操作時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)。與現(xiàn)有的還原胺化劑例如NaBH3CN和/或NaBH (OAc) 3相比，在糖類的還原胺化(例如標(biāo)記)中2-PB的使用被認(rèn)為導(dǎo)致對(duì)需要的糖類胺產(chǎn)物(通過(guò)希夫堿亞胺)比不想要的糖類的直接還原產(chǎn)物具有更大的選擇性。 與現(xiàn)有的還原胺化劑例如NaBH3CN和/或NaBH (OAc) 3相比，還認(rèn)為2_PB導(dǎo)致了更多的糖類轉(zhuǎn)化為需要的胺產(chǎn)物(通過(guò)希夫堿亞胺)。由于與已知試劑例如似811((^(3)3和NaBH3CN相比，2-PB在糖類的還原胺化(例如標(biāo)記)中的改進(jìn)的活性和/或選擇性，相對(duì)于這些試劑，可以使用減少量的2-PB。這進(jìn)一步降低了相對(duì)于NaBH3CN, 2-PB的超過(guò)和在固有還原毒性以上的糖類還原胺化(例如標(biāo)記)的毒性(和對(duì)研究者的健康風(fēng)險(xiǎn))和環(huán)境影響。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的工藝中2-PB的濃度小于用于獲得可比較的糖類轉(zhuǎn)化所需要的NaBH (OAc) 3或NaBH3CN (優(yōu)選NaBH3CN)的濃度。例如，為了獲得基本上相同的糖類轉(zhuǎn)化，與NaBH(OAc)3或NaBH3CN (優(yōu)選NaBH3CN)相比，可以使用小于90%，例如小于70%，優(yōu)選小于50%，例如摩爾量小于30%的2-PB。
通常，在本發(fā)明的工藝中使用的2-PB的濃度為約0. 017M至約1M，優(yōu)選約0. 033M至約0. 33M，例如約0. 067M至約0. 25M。也可以使用這些范圍值的組合，例如約0. 017M至約 0. 33M,或約 0. 033M 至約 0. 25M。技術(shù)人員還將理解，使用的2-PB的濃度可以取決于諸如使用的標(biāo)記劑等因素。例如，當(dāng)標(biāo)記劑是APTS時(shí)，2-PB的濃度通常為約0. 017M至約0. 333M，例如約0. 033M至約0. 067M (或這些范圍的組合)。與已知的試劑例如似811((^(3)3和NaBH3CN相比，2-PB在糖類的還原胺化(例如標(biāo)記)中的進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是2-PB可以導(dǎo)致更加穩(wěn)健的標(biāo)記圖譜(參見(jiàn)，例如實(shí)施例2)。在不受理論束縛的情況下，據(jù)認(rèn)為與已知的試劑例如NaBH(OAc)3和NaBH3CN相比，2-PB表現(xiàn)出標(biāo)記效力對(duì)于結(jié)構(gòu)特征例如電荷的降低的依賴性。本發(fā)明允許容易且安全地檢測(cè)樣品中的糖類。因此，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)樣品中的糖類的方法，該方法包括
(i)在2-甲基吡啶硼烷(2-PB)的存在下，使樣品中的糖類與標(biāo)記劑接觸，生成如本文所定義的標(biāo)記的糖類；和(ii)檢測(cè)標(biāo)記的糖類。對(duì)于步驟(ii)，可以使用任何適合的檢測(cè)方法，例如與熒光檢測(cè)、UV吸收檢測(cè)和/或通過(guò)質(zhì)譜分析法的檢測(cè)結(jié)合的液相色譜法。優(yōu)選的方法是親水相互作用色譜法及熒光檢測(cè)(HILIC-HPLC-FL)。(與現(xiàn)有技術(shù)相比)本發(fā)明的緩和、有效、降低的毒性和/或降低的費(fèi)用是指其可適用于高通量分析。因此，本發(fā)明可以對(duì)潛在地含有糖類的多個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行。例如，以上所述的檢測(cè)糖類的方法可以同時(shí)應(yīng)用于多個(gè)樣品。糖類與標(biāo)記劑和2-PB的反應(yīng)可以在任何適合的反應(yīng)溫度下進(jìn)行任何適合的時(shí)間長(zhǎng)度。通常的反應(yīng)時(shí)間是約I分鐘至約10小時(shí)，例如約5分鐘至約5小時(shí)。通常的反應(yīng)溫度為約0°C至約100°C，例如約20°C至約80°C。優(yōu)選地，反應(yīng)通過(guò)一鍋法進(jìn)行。所述反應(yīng)可以在任何適合的溶劑中進(jìn)行，所述溶劑包括水、DMS0、(冰)醋酸、乙腈、乙醇或者一種或多種前述溶劑的混合物。所述反應(yīng)可以在含水或無(wú)水的條件下進(jìn)行。在含水條件下，存在于本發(fā)明工藝中的水的量通常為約l%v/v至約90%v/v，例如約 10%v/v 至約 80%v/v,優(yōu)選約 50%v/v 至約 67%v/v。出人意料地發(fā)現(xiàn)與通常用于還原胺化的其他還原劑(例如NaBH(OAc) 3或NaBH3CN)相比，在本發(fā)明的工藝中在含水條件下2-PB是更加有效的還原劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用酸幫助還原胺化。可以使用任何適合的酸，例如有機(jī)酸(例如乙酸)。在不受理論束縛的情況下，認(rèn)為酸增加了還原胺化的效力。在一個(gè)實(shí)施方案中，所使用的酸選自乙酸、檸檬酸、丙二酸、三氯乙酸(TCA)、三氟乙酸以及它們的混合物。優(yōu)選地，所述酸選自檸檬酸和乙酸?，F(xiàn)將通過(guò)以下非限制性實(shí)例來(lái)舉例說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例I :使用NaBH3CN、NaBH (OAc) 3和2-PB用2-AA和2-AB標(biāo)記來(lái)自人血漿的葡萄糖梯和N-聚糖材料二甲亞砜(DMS0)、氫氧化銨、甲酸、Nonidet P-40 (乙基苯基聚乙二醇)(NP-40)、2-氨基苯甲酸(2-AA)、2-氨基苯甲酰胺(2-AB )、NaBH3CN, NaBH (OAc) 3和2-甲基吡啶硼燒(2-PB)得自 Sigma-Aldrich (Zwi jndrecht, The Netherlands)。十二燒基硫酸鈉(SDS)購(gòu)自 United States Biochemicals (Cleveland, 0H)。妝 N_ 糖苷酶 F (PNGaseF)得自Roche Diagnostics (Mannheim, Germany)。冰醋酸購(gòu)自 Merck (Darmstadt, Germany)。乙臆購(gòu)自 Biosolve (Valkenswaard, The Netherlands)。葡聚糖 10. 000 得自 Pharmacia/GEHealthcare(Uppsala, Sweden)。寡糖的制備葡萄糖梯通過(guò)IOmg葡聚糖10. 000在Iml IM TFA溶液中的部分酸水解(在80°C下I小時(shí))生成。隨后使用4ml的水稀釋樣品。來(lái)自人血衆(zhòng)的N-聚糖采用如Ruhaak等人，Anal. Chem. 2008, 80, 6119-26中所描述的進(jìn)行制備，將其引入本文作為參考。概括地說(shuō)，在添加20iU 2%SDS之后，通過(guò)在60°C下孵育IOmin使來(lái)自10 血漿的蛋白質(zhì)變性。然后，將10 ii I 4%NP-40和0. 5mU PNGase F的10 y I 5 X PBS溶液加入到樣品中。將樣品在37°C下孵育過(guò)夜，用于N-聚糖的釋放。 寡糖的標(biāo)記將50 ill寡糖溶液(沒(méi)有預(yù)先純化的葡萄糖梯或血漿N-聚糖)與25 ill新鮮制備的標(biāo)記溶液(2-AA或2-AB，在含有15%冰醋酸的DMSO中48mg/ml)混合。加入25 U I等份的新鮮制備的還原劑溶液(IM NaBH3CN, 2-甲基吡啶硼烷或NaBH(OAc) 3的DMSO溶液)，接著震搖5min并在65°C下孵育2小時(shí)。由于用寡糖溶液和標(biāo)記溶液稀釋還原劑溶液，在本發(fā)明的以上工藝中還原劑的終濃度為括號(hào)中所顯示的四分之一(即約0. 25M)。這些水標(biāo)記實(shí)驗(yàn)包含約50%的水(v/v)。為了允許與其他研究比較，同樣在無(wú)水條件下進(jìn)行2-AB標(biāo)記，如Bigge等人，Anal. Biochem. 1995，230，229-38中所描述的，將其引入本文作為參考。總的來(lái)說(shuō)，使用真空離心將50 的葡萄糖梯樣品干燥。然后，將寡糖樣品與25iU新鮮制備的96mg/ml2-AB的含有15%冰醋酸的DMSO的溶液混合。加入25 U I等份的新鮮制備的還原劑溶液(2MNaBH3CN,2-甲基吡啶硼烷或NaBH(OAc)3的DMSO溶液)，接著震搖5min并在65°C下孵育2小時(shí)。由于25iU還原劑溶液與25iU的2-AB溶液的組合，在本發(fā)明的以上工藝中每種還原劑的終濃度為1M。使反應(yīng)混合物冷卻至室溫。在通過(guò)親水相互作用色譜法及熒光檢測(cè)(HILIC-HPLC-FL)進(jìn)行分析之前，將樣品用乙腈以l:3(v/v)的比例稀釋。通過(guò)石墨化碳固相提取(PGC-SPE)純化使用多孔石墨化碳SPE從樣品中去除游離的標(biāo)記和還原劑。石墨化碳黑SPE柱體(carbograph SPE cartridge) (Grace, Breda, The Netherlands)以 2ml 80% 的乙臆水溶液為條件，隨后用3ml的水平衡。將樣品與300 Ul的水混合，然后裝載在柱體上。用4ml水沖洗后，使用Iml含有0. 1%TFA的50%的乙腈洗脫寡糖。在通過(guò)親水相互作用色譜法結(jié)合電噴射離子化和離子陷阱MS檢測(cè)(HILIC-ESI-IT-MS(/MS))進(jìn)行分析之前，將洗脫液用乙腈以I: I (v/v)的比例稀釋。HILIC-HPLC-FL使用HILIC-HPLC及熒光檢測(cè)分析標(biāo)記的N-聚糖。Ultimate LC系統(tǒng)(Dionex, Sunnyvale, CA)由Famos自動(dòng)進(jìn)樣器、具有裝載泵的Switchos模塊和Ultimate泵模塊組成。該系統(tǒng)與熒光檢測(cè)器(FP-2020pluS;JaSCO，Easton，MD)連接，所述熒光檢測(cè)器在激發(fā)波長(zhǎng)360nm和發(fā)射波長(zhǎng)420nm下操作。該系統(tǒng)由Chromeleon軟件控制并配備有
2.OmmxlOmm TSK gel-Amide 80 捕獲柱和 2. 0mmx250mm TSK gel-Amide 80 分析柱(TosohBiosciences, Stuttgart, Germany)。將8OOii I、v 形底的聚丙烯 96 孔板(Westburg, Leusden, The Netherlands)中含有樣品的孔用液體娃膠保鮮蓋(silicon lid) (Labservices, Breda, The Netherlands)密封并置于自動(dòng)進(jìn)樣器中。使用全循環(huán)(full loop)注射程序注射20 Ul等份。將標(biāo)記的寡糖轉(zhuǎn)移到捕獲柱并使用乙腈50mM甲酸銨(pH4. 4 ;按體積計(jì)80:20)以150iil/min的流速?zèng)_洗3min。然后，與分析柱一致轉(zhuǎn)換捕獲柱，所述分析柱是使用70%乙腈(溶劑A)、30%甲酸銨(50mM，pH 4.4 (溶劑B))以150iil/min的流速平衡的。應(yīng)用了線性梯度，將溶劑B由30% (Omin)增加至60%(87min)，然后在60%溶劑B下進(jìn)行5min的等度洗脫并在30%溶劑B下重新平衡柱15min。 HILIC-ESI-IT-MS (/MS)HILIC-nanoLC-ESI-離子陷阱(IT) -MS/MS 使用配備有保護(hù)柱(5 y mAmide-80170 u mxlOmm)的 Ultimate 3000 nanoLC 系統(tǒng)(Dionex)在 Amide-80 柱(3 u m 粒子；75 V- mxl50mm; Tosoh Biosciences)上進(jìn)行。使樣品的乙腈含量為75%,并將10 ii I樣品轉(zhuǎn)移至保護(hù)柱中，所述保護(hù)柱使用乙腈50mM甲酸銨(pH 4. 4,90:10, v/v)沖洗5分鐘。然后，將保護(hù)柱與在400nl/min的流速下操作并用17. 5%溶劑A (50mM甲酸銨，pH 4. 4)和82. 5%溶劑B (乙腈50mM甲酸銨，pH 4.4,80:20, v/v)平衡的nano柱一致。在25%溶劑A的直接步驟后，應(yīng)用線性梯度在30min內(nèi)達(dá)到40%溶劑A，接著是以100%溶劑A沖洗4min和以17. 5%溶劑A再平衡另外25min。將nanoLC系統(tǒng)與配備有在陽(yáng)離子模式中操作的在線nano噴射源的Esquire High Capacity Trap (HCTultra) ESI-IT-MS (Bruker Daltonics)直接連接。對(duì)于電噴射(900-1200V),使用了來(lái)自 New Objective (Cambridge, MA, USA)的毛細(xì)管(360iim 0D，具有IOiim開(kāi)口的20 iim ID)。在165°C下，使用61/min的氮?dú)饬髡舭l(fā)溶齊Li。記錄了 m/z400至m/z2000的離子。自動(dòng)化碎片離子分析對(duì)于m/zll70至m/zll80的前體是可行的，導(dǎo)致降低的Glc7-物種(species)的串聯(lián)質(zhì)譜。數(shù)據(jù)處理對(duì)于HILIC-HPLC-FL數(shù)據(jù)，確定了來(lái)自葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的5個(gè)峰的峰強(qiáng)度，mV。平均來(lái)自重復(fù)分析的結(jié)果。重復(fù)之間的差異小于10%。使用數(shù)據(jù)分析4.0版本軟件(BrukerDaltonics)分析了 HILIC-ESI-IT-MS數(shù)據(jù)。對(duì)于標(biāo)記的和未標(biāo)記的物種兩者，均測(cè)定了來(lái)自Glc4至Glc8的質(zhì)子、銨離子、鈉離子和鉀離子的峰強(qiáng)度。考慮了單電荷離子和雙電荷離子兩者。概括所有加合物的強(qiáng)度并計(jì)算標(biāo)記的聚糖對(duì)未標(biāo)記的聚糖的相對(duì)豐度。結(jié)果通過(guò)還原胺化，比較了還原劑三乙酰氧基硼氫化鈉、2-甲基吡啶硼烷和氰基硼氫化鈉的N-聚糖的標(biāo)記。使用前述的三種還原劑來(lái)標(biāo)記來(lái)自葡聚糖的低聚葡萄糖和來(lái)自人血漿的N-聚糖。使用胺2-AA和2-AB兩者來(lái)標(biāo)記低聚葡萄糖，而來(lái)自血漿的N-聚糖僅使用2-AA來(lái)標(biāo)記。所有樣品均使用HILIC-HPLC-FL分析。通過(guò)石墨化碳-SPE額外純化低聚葡萄糖梯并使用HILIC-LC-ESI-IT-MS進(jìn)行分析。
在使用不同的還原劑和標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記之后的葡萄糖梯的HILIC-HPLC-FL色譜圖描述于圖2A、2B和2C中。由這些數(shù)據(jù)測(cè)定了 Glc4至Glc8的低聚體的平均峰高度(參見(jiàn)下表I)。表I :在不同的還原劑的幫助下標(biāo)記的來(lái)自葡聚糖的低聚葡萄糖化合物的強(qiáng)度和它們的標(biāo)記效率。強(qiáng)度用mV顯示。n.d. =未測(cè)定的
權(quán)利要求
1.2-甲基吡啶硼烷(2-PB)用于還原胺化糖類的用途，其中，所述2-PB的濃度小于用于獲得可比較的糖類轉(zhuǎn)化所需要的NaBH(OAc)3或NaBH3CN的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的用途，其中，在2-PB的存在下使所述糖類與標(biāo)記劑反應(yīng)。
3.一種用于標(biāo)記糖類的工藝，所述工藝包括在2-甲基吡啶硼烷(2-PB)的存在下使所述糖類與標(biāo)記劑接觸，以生成標(biāo)記的糖類，其中，所述2-PB的濃度小于用于獲得可比較的糖類轉(zhuǎn)化所需要的NaBH(OAc)3或NaBH3CN的濃度。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的用途或工藝，其中，所述標(biāo)記劑是胺取代的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途或工藝，其中，所述胺取代的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)選自2_氨基苯甲酸(2-AA)、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、8-氨基芘_(tái)1，3，6-三磺酸(APTS)、2_氨基吡啶(2-AP)、[D6]-2-AP、[D4]-2-AA、2，5-二氨基吡啶和2-氨基-6-酰氨基生物素基吡啶(BAP)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的用途或工藝，其中，所述胺取代的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)選自2_氨基苯甲酸 2-AA、2-AB 和 APTS。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途或工藝，其中，為了獲得基本上相同的糖類轉(zhuǎn)化，與NaBH(OAc)3或NaBH3CN相比，使用摩爾量小于90%的2-PB。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途或工藝，其中，所述2-PB的濃度為約0.017M至約1M,優(yōu)選約0. 033M至約0. 33M。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途或工藝，其中，所述用途或工藝是在含水條件下進(jìn)行的。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途或工藝，其中，所述糖類來(lái)自人、動(dòng)物或植物源或者來(lái)自重組表達(dá)或生物技術(shù)表達(dá)的蛋白質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的用途或工藝，其中，所述糖類通過(guò)多糖的完全水解或降解，或者部分水解或降解來(lái)制備。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的用途或工藝，其中，所述糖類通過(guò)完全化學(xué)合成或部分化學(xué)合成來(lái)制備。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的用途或工藝，其中，所述糖類是得自糖蛋白或糖脂的聚糖。
14.一種用于檢測(cè)樣品中的糖類的方法，所述方法包括 (i)在2-甲基吡啶硼烷(2-PB)的存在下，使樣品中的糖類與標(biāo)記劑接觸，以生成如權(quán)利要求3至13中任一項(xiàng)所定義的標(biāo)記的糖類；和 (ii)檢測(cè)標(biāo)記的糖類。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中，所述檢測(cè)步驟包括與熒光檢測(cè)結(jié)合的液相色譜法。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中，所述與熒光檢測(cè)結(jié)合的液相色譜法是親水相互作用色譜法及熒光檢測(cè)(HILIC-HPLC-FL)。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途、工藝或方法，其是對(duì)潛在地含有糖類的多個(gè)樣品同時(shí)實(shí)施的。
18.—般地如本文所述的，任選地參考實(shí)例描述的任何新的工藝、用途或方法。
全文摘要
本發(fā)明提供了2-甲基吡啶硼烷(2-PB)用于糖類尤其是來(lái)自預(yù)定血漿的聚糖的還原胺化的用途，其中所述2-PB的濃度小于用于獲得可比較的糖類轉(zhuǎn)化所需要的NaBH(OAc)3或NaBH3CN的濃度。還描述了用于標(biāo)記糖類的工藝，所述工藝包括在作為還原劑的2-甲基吡啶硼烷的存在下，將所述糖類與標(biāo)記劑，例如2-氨基苯甲酸、2-氨基苯甲酰胺、APTS等接觸。采用這種方式標(biāo)記糖類便于使用HPLC技術(shù)，例如HILIC-HPLC-FL、HILIC-ESI-IT-MS或毛細(xì)管電泳法的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/66GK102770765SQ201080053819
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2010年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月29日
發(fā)明者L·R·拉哈克, M·沃洛爾 申請(qǐng)人:萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心