專利名稱：阿爾茨海默病外周細(xì)胞中pkc同工酶加工的異常改變的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及診斷阿爾茨海默病或確認(rèn)對象是否存在阿爾茨海默病的方法。本發(fā)明還涉及篩選可用于開發(fā)治療或預(yù)防阿爾茨海默病的治療劑的先導(dǎo)化合物的方法。本發(fā)明還涉及用穩(wěn)定或磷酸化的PKC同工酶水平構(gòu)建的算法比來檢測某些PKC同工酶加工的變化從而診斷對象中阿爾茨海默病的方法。本文所述方法用于診斷阿爾茨海默病、監(jiān)控阿爾茨海默病發(fā)展并用于鑒定先導(dǎo)化合物的篩選方法。本發(fā)明還涉及選擇對阿爾茨海默病的治療響應(yīng)提聞的患者的方法。發(fā)明背景 ^ -淀粉樣蛋白(AP)是神經(jīng)炎性斑的主要組分，其與神經(jīng)原纖維團(tuán)一起為阿爾茨海默病(AD)的生理標(biāo)記。Katzman,N Eng J Med. 1986 ；314 :964-973 ;Bush等，PharmacolTher. 1992 ;56 :97-117。淀粉樣前體蛋白(APP)的突變形式促使不同腦區(qū)域中AP的過度釋放，造成其在神經(jīng)炎塊中的積累。Wallace,Biochim Biophys Acta. 1994 ；1227 :183_187。在包括成纖維細(xì)胞在內(nèi)的許多來自AD組織的細(xì)胞類型中，已證明涉及鈣穩(wěn)態(tài)、離子通道滲透性、環(huán)化AMP和磷酸肌醇代謝物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中發(fā)生變化。還顯示A 3的生成改變。此夕卜，AP自身能影響相同轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。蛋白激酶C(PKC)是蛋白激酶的最大基因家族之一。Liu和Heckman，CellularSignalling. 1998 ; 10 (8) :529-42。數(shù)種 PKC 同工酶在腦中表達(dá)，包括 PKC-a、PKC-P 1，、PKC- ^ II、PKC- 6、PKC- e和PKC- y。PKC主要是胞漿蛋白質(zhì)，但刺激后其移位到膜上。已表明PKC參與大量有關(guān)AD的生化過程。PKC活化在學(xué)習(xí)能力和記憶提高中起關(guān)鍵作用，且已表明PKC激活劑提高記憶和學(xué)習(xí)能力。Sun和Alkon，Eur J Pharmacol. 2005 ；512 :43-51 ;Alkon 等，Proc Natl Acad Sci USA. 2005 ；102 :16432-16437。還顯示 PKC 活化誘導(dǎo)大鼠海馬區(qū)的突觸發(fā)生，這表明神經(jīng)變性病癥期間可能發(fā)生PKC介導(dǎo)的抗凋亡和突觸發(fā)生。Sun和 Alkon，Proc Natl Acad Sci USA. 2008 ； 105 (36) :13620-1362511((:激活劑苔蘚抑素-I的缺血/低氧后治療有效地恢復(fù)突觸發(fā)生、神經(jīng)營養(yǎng)活性以及空間學(xué)習(xí)和記憶中缺血誘導(dǎo)的缺陷。Sun和Alkon，Proc Natl Acad Sci USA. 2008。該效應(yīng)伴隨有突觸蛋白樹突棘素(spiniophilin)和突觸小泡蛋白的水平上升和突觸形態(tài)的結(jié)構(gòu)改變。Hongpaisan和Alkon,Proc Natl Acad Sci USA. 2007 ; 104 :19571-19576。用于長期聯(lián)想記憶的苔蘚抑素誘導(dǎo)的突觸發(fā)生也受到PKC活化的調(diào)節(jié)。Hongpaisan和Alkon，PNAS 2007。PKC還活化神經(jīng)營養(yǎng)蛋白生產(chǎn)。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，具體是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)生長因子(NGF)是受損神經(jīng)元和突觸起始修復(fù)和再生長的關(guān)鍵生長因子。一些PKC同工酶，具體是PKC- e和PKC-a的活化能保護(hù)免受神經(jīng)損傷，其最可能是通過上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的生成而實(shí)現(xiàn)。Weinreb 等，The FASEB Journal. 2004 ;18 :1471-1473)。還報(bào)道 PKC 激活劑誘導(dǎo)酪氨酸羥化酶的表達(dá)并誘導(dǎo)神經(jīng)元存活和神經(jīng)突長出。Du和Iacovitti, J Neurochem. 1997 ；68 564-69 ;Hongpaisan 和 Alkon，PNAS 2007 ;Lallemend 等，J Cell Sci. 2005 ;118 :4511_25。PKC基因家族目前由11種基因組成，它們分成以下4個亞組1)經(jīng)典PKC-a、-M、-￠2(0 I和￠2是同一基因的選擇性剪接形式)和_Y，2)新的PKC- S、- e、- n 和-0 ;3)非典型的 PKC- €、-入、-n 和-I ;和 4) PKC- U。PKC- U類似于非典型的PKC同工酶，但不同之處是具有推定的跨膜域。Blohe等，CancerMetast. Rev. 1994 ； 13 :411 ；Ilug 等，Biochem J. 1993 ；291 :329 ；Kikkawa 等，Ann. Rev.Biochem. 1989 ;58 :31。- a、- @ ^ 0 2和-Y同工酶是Ca2+、磷脂和二酰甘油依賴性的，它們代表PKC的經(jīng)典同種型，而其他同工酶能被磷脂和二酰甘油激活，但不依賴Ca2+。所有同工酶均包括5個可變區(qū)(V1-V5)，且a和Y同工酶含有高度保守的四個(C1-C4)結(jié)構(gòu)域。除PKC-a、和-Y-外，所有同工酶均缺少C2結(jié)構(gòu)域，且-X、-n和同工酶也缺少二酰甘油結(jié)合的Cl中兩個富含半胱氨酸鋅指結(jié)構(gòu)域中的九個。Cl結(jié)構(gòu)域也含有所有同工酶中高度保守的假底物序列，它通過阻斷底物結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生該酶的無活性構(gòu)象而起到自身調(diào)節(jié)功能。House 等，Science. 1987 ；238 :1726。由于這些結(jié)構(gòu)特征，認(rèn)為各種PKC同工酶在響應(yīng)生理刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有高度 特化的功能。各種PKC同工酶對刺激的響應(yīng)已在AD中研究。例如，AD患者中PKC主要下游底物Erkl/2的PKC-a / e -介導(dǎo)的憐酸化水平降低。Khan和Alkon, Proc Natl Acad SciUSA. 2006 ；103 :13203-13207。此外，對正常成纖維細(xì)胞的A 3應(yīng)用降低PKC活性，因?yàn)锳 3直接下調(diào)PKC a / e。已提出PKC激活劑，尤其是對PKC a / e特異的那些能抵消A ^的效應(yīng)，從而逆轉(zhuǎn)或阻止AP誘導(dǎo)的改變。還證實(shí)了 PKC調(diào)控APP過程。已顯示PKC激活劑能顯著增加細(xì)胞分泌的非淀粉樣可溶性APP(sAPP)的相對含量。PKC活化還逆轉(zhuǎn)異常的MAP激酶磷酸化和AD成纖維細(xì)胞中
水平的伴隨升高。參見美國專利申請公開號US-2007-0082366。此外，發(fā)現(xiàn)一種有效的PKC激活劑苔蘚抑素降低含人AD基因的轉(zhuǎn)基因小鼠腦中的AP (1-42)水平。相反，還表明々0肽相較非AD成纖維細(xì)胞差異性影響AD成纖維細(xì)胞中的PKC同工酶。Favit 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ；1998. 95 :5562_67。用納摩爾濃度的 A3 (1-40)處理非AD (AC)成纖維細(xì)胞使PKC- a下降75%，其在AD成纖維細(xì)胞中已下降，但不是PKC- y的免疫反應(yīng)性。相反，在AD成纖維細(xì)胞中，(1-40)引起PKC-Y下降70%而非PKC-a的免疫反應(yīng)性。用PKC激活劑處理恢復(fù)了 AC細(xì)胞中的PKC- a信號，但其沒有逆轉(zhuǎn)對AD細(xì)胞中PKC-Y的影響。用蛋白合成抑制劑處理沒有抑制AD細(xì)胞中AP (1-40)的效應(yīng)但抑制PKC激活劑處理的AC細(xì)胞中的效應(yīng)，表明正常細(xì)胞而非AD細(xì)胞中PKC的激活通過蛋白從頭合成發(fā)揮保護(hù)作用。本發(fā)明提供研究外周細(xì)胞中AP誘導(dǎo)的變化對各種PKC同工酶水平的影響的方法。測量水平穩(wěn)定狀態(tài)和/或磷酸化的PKC同工酶以及AP誘導(dǎo)的變化可用于診斷AD、監(jiān)控AD發(fā)展或非AD狀態(tài)到AD的發(fā)展、并用于發(fā)現(xiàn)治療AD療法的篩選方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及確定或證實(shí)對象中是否存在阿爾茨海默病的方法。在一個實(shí)施方式中，本方法包括i)確定有和沒有AP肽時候選對象的細(xì)胞中第一 PKC同工酶的穩(wěn)定狀態(tài)蛋白水平，生成第一比例；ii)確定有和沒有AP肽時第二 PKC同工酶的穩(wěn)定狀態(tài)蛋白水平，生成第二比例，其中所述第二 PKC同工酶是否受AP肽調(diào)節(jié)未知；iii)通過將所述第一比例除以第二比例生成PKC同工酶指數(shù)。在一個實(shí)施方式中，所述AP肽是AP (1-42)，盡管可用任何AP肽。在另一實(shí)施方式中，所述第一 PKC同工酶是PKC-a、和/或PKC-e且所述第二 PKC同工酶是PKC-Y。在一個具體實(shí)施方式
中，穩(wěn)定狀態(tài)的PKC同工酶水平的差分處理，即PKC同工酶指
數(shù)，按照下述公式確定
權(quán)利要求
1.一種確定候選對象有或沒有阿爾茨海默病的方法，所述方法包括 i)確定有和沒有AP肽時候選對象的外周細(xì)胞中第一PKC同工酶的蛋白水平，生成第一比例； ii)確定有和沒有AP肽時候選對象的外周細(xì)胞中第二PKC同工酶的蛋白水平，生成第二比例，其中所述第二 PKC同工酶在AD細(xì)胞中相較非AD細(xì)胞是否受A ^肽的差異調(diào)節(jié)未知； iii)通過所述第一比例除以第二比例生成PKC同工酶指數(shù)，其中約I.O或更低的PKC同工酶指數(shù)表示診斷有阿爾茨海默病，而大于I. O的PKC同工酶指數(shù)表示沒有阿爾茨海默病。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述PKC同工酶指數(shù)用下式I表示的穩(wěn)定狀態(tài)水平的PKC同工酶生成 I [PKC-x]/[PKC-x]^ =pKC_x [PKC-z]/[PKC-z]a/j 其中“x”代表所述第一 PKC同工酶、“z”代表所述第二 PKC同工酶、且AP代表與A 3肽接觸的細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述PKC同工酶指數(shù)用下式II表示的磷酸化水平的PKC同工酶生成 II [P-PKC-xMp-PKC^ pKc_x 指數(shù)[p-PKC-z]/[p-PKC-z]A^ 其中“x”代表所述第一 PKC同工酶、“z”代表所述第二 PKC同工酶、且AP代表與A 3肽接觸的細(xì)胞、且p-PKC-x和p-PKC-z代表磷酸化的PKC同工酶。
4.權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法還包括存在PKC激活劑時確定步驟i和ii中所述第一和第二 PKC同工酶的蛋白水平。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述第一PKC同工酶是PKC-a且所述第二PKC同工酶是PKC-Y。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述第一PKC同工酶是PKC-e且所述第二PKC同工酶是PKC-Y。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一PKC同工酶是PKC-a且所述第二PKC同工酶是PKC-Y。
8.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一PKC同工酶是PKC-e且所述第二PKC同工酶是PKC-Y。
9.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一PKC同工酶是PKC-a且所述第二PKC同工酶是PKC-Y。
10.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一PKC同工酶是PKC-e且所述第二PKC同工酶是PKC-Y。
11.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述A3肽是A3(1-40)或六@ (1-42)。
12.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述外周細(xì)胞是皮膚細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、血液細(xì)胞或口腔頰粘膜細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述外周細(xì)胞是皮膚成纖維細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述AP肽以約I.OnM-IOii M的濃度存在。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述AP肽以約I.Oy M的濃度存在。
16.一種監(jiān)控對象阿爾茨海默病發(fā)展的方法，所述方法包括 i)按照權(quán)利要求I所述的方法在第一時間點(diǎn)從測試對象的外周細(xì)胞中生成PKC同工酶指數(shù)以獲得所述對象的參考PKC同工酶指數(shù)，其中所述測試對象已被診斷患有阿爾茨海默病； ii)在第一時間點(diǎn)后的一個或多個時間點(diǎn)從相同對象的外周細(xì)胞中生成同樣的PKC同工酶指數(shù)； iii)確定獲自第一時間點(diǎn)后的所述一個或多個時間點(diǎn)的PKC同工酶指數(shù)相比所述第一時間點(diǎn)的PKC同工酶指數(shù)是否降低； 其中獲自第一時間點(diǎn)后的所述一個或多個時間點(diǎn)的PKC同工酶指數(shù)相比所述第一時間點(diǎn)的PKC同工酶指數(shù)降低表明阿爾茨海默病的發(fā)展。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述測試對象在所述第一時間點(diǎn)已被診斷為早期阿爾茨海默病。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述測試對象在所述第一時間點(diǎn)已被診斷為輕度阿爾茨海默病。
19.一種監(jiān)控對象從非阿爾茨海默病癥向阿爾茨海默病發(fā)展的方法，所述方法包括 i)按照權(quán)利要求I所述的方法在第一時間點(diǎn)從測試對象的外周細(xì)胞中生成PKC同工酶指數(shù)以獲得所述對象的參考PKC同工酶指數(shù)，其中所述測試對象未被診斷患有阿爾茨海默?。? ii)在第一時間點(diǎn)后的一個或多個時間點(diǎn)從相同對象的外周細(xì)胞中生成同樣的PKC同工酶指數(shù)； iii)確定獲自第一時間點(diǎn)后的所述一個或多個時間點(diǎn)的PKC同工酶指數(shù)相比所述第一時間點(diǎn)的PKC同工酶指數(shù)是否降低； 其中獲自第一時間點(diǎn)后的所述一個或多個時間點(diǎn)的PKC同工酶指數(shù)相比所述第一時間點(diǎn)的PKC同工酶指數(shù)降低表明向阿爾茨海默病的發(fā)展。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述阿爾茨海默病癥是輕度認(rèn)知障礙。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述輕度認(rèn)知障礙是健忘認(rèn)知障礙。
22.一種藥盒，所述藥盒含一種或多種AP肽；至少一種對PKC同工酶特異的抗體，已知所述PKC同工酶在AD細(xì)胞中相較非AD細(xì)胞受到AP肽的差異調(diào)控；至少一種對PKC同工酶特異的抗體，所述PKC同工酶在AD細(xì)胞中相較非AD細(xì)胞是否受到AP肽的差異調(diào)控未知；和用于確定PKC同工酶指數(shù)的說明。
23.如權(quán)利要求22所述的藥盒，其特征在于，所述AP肽是AP(1-40)或八0 (1_42)。
24.如權(quán)利要求22所述的藥盒，其特征在于，所述已知在AD細(xì)胞中受到AP肽差異調(diào)控的PKC同工酶為PKC-a。
25.如權(quán)利要求22所述的藥盒，其特征在于，所述已知在AD細(xì)胞中受到AP肽差異調(diào)控 的PKC同工酶為PKC- e。
26.如權(quán)利要求22所述的藥盒，其特征在于，所述在AD細(xì)胞中是否受到AP肽差異調(diào)控未知的PKC同工酶為PKC- y。
全文摘要
本發(fā)明提供通過用PKC同工酶指數(shù)從非AD病癥中診斷AD的方法，所述指數(shù)通過缺失和存在β-淀粉樣肽及任選存在PKC激活劑時確定測試對象的外周細(xì)胞中不同PKC同工酶之比的比例來獲得。
文檔編號G01N33/68GK102741696SQ201080055143
公開日2012年10月17日 申請日期2010年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月2日
發(fā)明者D·L·阿爾康, T·K·卡恩 申請人:布朗歇特 洛克菲勒神經(jīng)科學(xué)研究所