專利名稱：用非稀有細(xì)胞檢測稀有細(xì)胞的方法
用非稀有細(xì)胞檢測稀有細(xì)胞的方法發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總體涉及醫(yī)學(xué)診斷，更具體地涉及稀有細(xì)胞如循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的檢測和分類。背景信息未被滿足的重要醫(yī)療需要存在于在細(xì)胞水平上對上皮癌癥患者的縱向疾病監(jiān)測。預(yù)測和監(jiān)測治療反應(yīng)和疾病進(jìn)程鑒于自然病程和對治療壓力反應(yīng)的選擇性選擇過程對上皮癌癥患者尤為重要。雖然在對第一和轉(zhuǎn)移性腫瘤在其各自微環(huán)境中的了解中已有所進(jìn)展，但在對流體相期間癌癥行為的了解中存在重大障礙，因?yàn)槠浔椴加谘髦胁⒄紦?jù)血流。癌癥的循環(huán)組分其中包含引起未來轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，因此代表引人注目的研究目標(biāo)。
充分表征此固體腫瘤流體相的臨床意義的研究已由于缺少容易獲得的和可靠的鑒定CTC的實(shí)驗(yàn)工具而被阻礙。血液中CTC未知的特征和低且未知的頻率加上難以區(qū)別癌癥上皮細(xì)胞與正常上皮細(xì)胞，已嚴(yán)重阻礙流體相如何可能具有臨床重要性的研究。理想的流體相活組織檢查應(yīng)在大多數(shù)上皮癌癥患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量特定CTC群，并保留和向病理醫(yī)師和/或研究人員呈現(xiàn)不僅能計(jì)數(shù)而且能進(jìn)行進(jìn)一步分子、形態(tài)和/或表型分析的形式的CTC0此外，其應(yīng)保留其余稀有群，用于進(jìn)一步分析。CTC 一般一雖然并非一定一是以極低的濃度源自固體腫瘤并進(jìn)入不同類型癌癥患者的血流的上皮細(xì)胞。CTC也被認(rèn)為能夠起源于血液中，在整個身體中形成小群落。已存在的腫瘤或轉(zhuǎn)移生成的CTC的脫落通常導(dǎo)致第二腫瘤形成。第二腫瘤一般檢測不到，并導(dǎo)致全部癌癥死亡中的90%。循環(huán)腫瘤細(xì)胞提供第一與轉(zhuǎn)移性腫瘤之間的關(guān)聯(lián)。其導(dǎo)致這樣的前景將循環(huán)腫瘤細(xì)胞的鑒定和表征用于轉(zhuǎn)移性上皮惡性腫瘤的早期檢測和治療處理。癌癥患者的CTC檢測提供在早期診斷第一或第二癌癥生長和確定進(jìn)行癌癥治療的癌癥患者的預(yù)后中有效的工具，這是因?yàn)檫@種患者血液中存在的CTC的數(shù)量和表征已被關(guān)聯(lián)于全部預(yù)后和對治療的反應(yīng)。因此，CTC充當(dāng)臨床癥狀出現(xiàn)前腫瘤擴(kuò)張或轉(zhuǎn)移的早期指示劑。雖然CTC的檢測在癌癥的處理和治療中具有重要的預(yù)后性和潛在的治療性意義，但由于其在血流中隱匿的性質(zhì)，這些稀有細(xì)胞不易被檢測到。1800年代首次描述了 CTCdM是僅近期技術(shù)進(jìn)步允許其可靠的檢測。循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測中的挑戰(zhàn)是其相對于其他有核細(xì)胞以相對低的頻率存在，通常低于1:100，000。為彌補(bǔ)該挑戰(zhàn)，檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞的大多數(shù)常規(guī)方法依賴于實(shí)驗(yàn)富集方法，由此使CTC優(yōu)先地與其他細(xì)胞組分(例如，非CTC)——最重要的是最近似于CTC的其他有核細(xì)胞——分離。目前，對于計(jì)數(shù)/表征CTC應(yīng)用最多的陽性富集方法是靶向表面蛋白EpCAM和“CTC芯片”的免疫磁性富集方法。最廣泛用于檢測CTC的方法，J&J’ s Veridex技術(shù)，利用免疫磁性富集。該技術(shù)依賴于腫瘤細(xì)胞群的免疫磁性富集，利用連接于結(jié)合上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)的抗體的鐵磁流體，該上皮細(xì)胞粘附分子僅在上皮衍生細(xì)胞上表達(dá)。該方法需要7. 5mL血液用于分析，并僅在一些轉(zhuǎn)移性癌癥患者中發(fā)現(xiàn)2個以上CTC。
微流體或“CTC-芯片”技術(shù)，是另一種用于計(jì)數(shù)/表征CTC的陽性富集方法。該方法采用l-3mL血液,其中全血流經(jīng)78，000個EpCAM涂布的微柱(microposts)。EpCAM+細(xì)胞粘附于該柱，并隨后用細(xì)胞角蛋白CD45和DAPI染色。以該方法，CTC以相對高的純度被發(fā)現(xiàn)于幾乎所有的轉(zhuǎn)移性癌癥患者中，而未被發(fā)現(xiàn)于健康對照中。此外，CTC-芯片技術(shù)鑒定出所有患者中的CTC，并且數(shù)量上比兩個近期出版物所報(bào)道的其他技術(shù)高約10至100倍的因數(shù)。唯一的常規(guī)應(yīng)用的CTC檢測技術(shù)基于免疫磁性富集。目前“黃金標(biāo)準(zhǔn)”和FDA認(rèn)可的測試被稱為Cd丨Search ,并且利用免疫磁性富集步驟分離表達(dá)上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)的細(xì)胞。此外，將被確定為CTC的細(xì)胞必須包含核，表達(dá)細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞角蛋白，和具有大于5微米的直徑。該系統(tǒng)已發(fā)現(xiàn)計(jì)數(shù)和監(jiān)測轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸直腸癌患者中CTC計(jì)數(shù)的預(yù)后效用；但是，該系統(tǒng)敏感度低，在大多數(shù)患者中沒有發(fā)現(xiàn)或發(fā)現(xiàn)極少的CTC0大多數(shù)后續(xù)的CTC技術(shù)已報(bào)道較高的敏感度，并繼續(xù)進(jìn)行富集策略的改變，但是其使可檢測的事件直接偏向于最初富集步驟所選蛋白質(zhì)充分表達(dá)的事件。
基于標(biāo)準(zhǔn)化的顯微鏡的方法在前也已在乳腺癌、結(jié)腸直腸癌和肺癌患者的病例研究中被用于鑒定和在形態(tài)上表征和檢驗(yàn)(credential) CTC。雖然目前應(yīng)用多種CTC檢測方法，但當(dāng)前的方法已被確定具有顯著的限制。例如，陽性選擇方法計(jì)數(shù)/表征CTC的一個顯著限制是陽性物理選擇總是導(dǎo)致CTC損失，且效率低于100%。因此，利用當(dāng)前方法檢測到的每個樣本的CTC數(shù)量通常過低，而不能提供對具體樣本有力的解釋或具有臨床意義的含量。當(dāng)前方法另外的限制包括由于CTC異質(zhì)性造成的低CTC檢測。例如，目標(biāo)CTC群中的各個CTC特征的差異進(jìn)一步阻礙利用當(dāng)前方法檢測到的CTC數(shù)量。這種差異可包括各個CTC之間的大小變化，和用于檢測CTC的細(xì)胞表面標(biāo)記的各個CTC之間可變或下調(diào)的表達(dá)?，F(xiàn)有方法的進(jìn)一步限制包括純度水平和可變純度的限制。任何富集均將具有特定數(shù)量的假陽性，例如粘附于富集體的其他有核血液細(xì)胞。例如，Veridex磁體在5至10個陽性的基礎(chǔ)上一般具有5，000至10，000個假陽性。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于創(chuàng)新性方法的發(fā)現(xiàn)以用于分析樣本，以檢測、計(jì)數(shù)和表征稀有細(xì)胞，如CTC。因此，本發(fā)明提供用于改良的檢測和表征的方法，允許進(jìn)行具有臨床意義的樣本分析，用于臨床、研究和開發(fā)環(huán)境。因此，本發(fā)明提供用于樣本中稀有細(xì)胞改良的檢測和表征的方法，該方法通過利用樣本中非稀有細(xì)胞(細(xì)胞存在的濃度相對于稀有細(xì)胞為10、50、100、200、300、400、500、1，000,5, 000,10, 000倍或更高倍)的數(shù)據(jù)進(jìn)行。因此，本發(fā)明的方法利用相似性測量方法評估細(xì)胞的非相似性，其需要最大距離排除，例如明顯是相關(guān)非稀有細(xì)胞的事件；和細(xì)微截止(cutoff)差別，基于周圍非稀有細(xì)胞的相似性。該方法包括提供懷疑具有至少一種稀有細(xì)胞和至少一種以稀有細(xì)胞濃度的至少10倍的濃度存在的細(xì)胞的樣本；使樣本接觸至少一種可檢測劑,如結(jié)合細(xì)胞標(biāo)記的劑；對樣本進(jìn)行細(xì)胞成像，以生成圖像；和通過從圖像分析細(xì)胞，相對于樣本中的其他細(xì)胞檢測至少一種稀有細(xì)胞，從而檢測樣本中的稀有細(xì)胞。在本發(fā)明的多個方面中，該方法進(jìn)一步包括將可疑的稀有細(xì)胞和至少一種細(xì)胞鋪于固體支持體如玻片上，以促進(jìn)細(xì)胞與可檢測劑接觸和細(xì)胞成像。在本發(fā)明的多個方面中，可檢測劑是用于染色細(xì)胞的任何劑，如結(jié)合細(xì)胞標(biāo)記的劑，包括但不限于，陽性標(biāo)記、陰性標(biāo)記、核標(biāo)記、含量標(biāo)記或其任意組合。在本發(fā)明的多個方面中，本文所述的方法在使含有可檢測信號如熒光信號的玻片有效成像的設(shè)備上進(jìn)行。該設(shè)備可一般包括具有至少一個具有圖像處理能力的系統(tǒng)處理器的計(jì)算機(jī)、計(jì)算機(jī)監(jiān)測器、輸入裝置、電源和顯微鏡子系統(tǒng)。因此，該設(shè)備包括這樣的計(jì)算機(jī)具有用于進(jìn)行實(shí)踐本發(fā)明所需的多種分析的可執(zhí)行代碼。顯微鏡子系統(tǒng)包括用于獲得圖像的光學(xué)傳感陣列。樣本移動和焦點(diǎn)調(diào)整的二維移動階段，和多樣本分析和儲存的輸入和輸出機(jī)制。該設(shè)備還可包括透射光源和用于使樣本發(fā)熒光的照明/熒光激發(fā)光源。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，該方法包括建立最佳曝光限值，以用于進(jìn)行細(xì)胞成像，該細(xì)胞成像促進(jìn)檢測到存在的稀有細(xì)胞。一方面，利用來自至少一種細(xì)胞的信號確定可檢測劑的曝光限值。在多方面，可檢測標(biāo)記可以是陽性標(biāo)記、陰性標(biāo)記、核標(biāo)記或含量標(biāo)記。在相關(guān)方面，可利用與從第一圖像獲得的細(xì)胞和/或可疑的稀有細(xì)胞相關(guān)的數(shù)據(jù)設(shè)定曝光限值，使玻片再次成像。
在另一個實(shí)施方式中，該方法包括最小化曝光設(shè)置，從而最小化數(shù)據(jù)收集時間和最大化通量，以促進(jìn)稀有細(xì)胞的檢測。在另一個實(shí)施方式中，該方法包括利用與非稀有細(xì)胞相關(guān)的數(shù)據(jù)以生成促進(jìn)稀有細(xì)胞檢測的性質(zhì)對照參數(shù)(quality control parameter)。在多方面,性質(zhì)對照參數(shù)是至少一種非稀有細(xì)胞在玻片上的分布、多細(xì)胞圖像通過比對非稀有細(xì)胞標(biāo)記的比對、細(xì)胞染色的質(zhì)量、陽性標(biāo)記在全部非稀有細(xì)胞中的分布或重復(fù)處理的細(xì)胞損失。在另一個實(shí)施方式中，該方法包括確定強(qiáng)度截止限值，以最小化假陰性和假陽性，和促進(jìn)稀有細(xì)胞檢測。一方面，可檢測劑是陽性標(biāo)記，對于陽性標(biāo)記的背景信號利用平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)、其他統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)或其任意組合確定強(qiáng)度限值。另一方面，可檢測劑是陽性標(biāo)記，通過鑒定陽性標(biāo)記的最高信號事件并將最高信號與由事件全部或亞組的信號計(jì)算得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行比較，在單個圖像或該圖像的部分中確定強(qiáng)度限值。在再一方面，可檢測劑是陰性標(biāo)記，利用非稀有細(xì)胞(全部非稀有細(xì)胞或特定亞組)的陰性標(biāo)記信號的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差確定陰性標(biāo)記的強(qiáng)度限值。在另一個實(shí)施方式中，非稀有細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)特征，如細(xì)胞和核大小(絕對的和相對的；整體的和表觀的)和分布，被用于促進(jìn)非稀有細(xì)胞的檢測。在另一個實(shí)施方式中，該方法包括利用與非稀有細(xì)胞相關(guān)的數(shù)據(jù)來計(jì)數(shù)稀有細(xì)胞，由此促進(jìn)其檢測。在多個實(shí)施方式中，數(shù)據(jù)可包括但不限于，總強(qiáng)度、平均強(qiáng)度、分段強(qiáng)度、固定圈(fixed circle)、可變?nèi)?variable circle)或其任意組合。在另一個實(shí)施方式中，該方法包括確定含量標(biāo)記在稀有細(xì)胞和非稀有細(xì)胞中的表達(dá)水平，以促進(jìn)稀有細(xì)胞的檢測。在本發(fā)明的多個方面中，稀有細(xì)胞是CTC或其亞群。因此，在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供診斷或預(yù)后個體中的癌癥的方法。該方法包括實(shí)施本文所述改良的CTC檢測和表征的方法，和分析檢測到的CTC ;和提供基于CTC分析的診斷或預(yù)后，從而診斷或預(yù)后個體中的癌癥。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供確定個體對治療方案的響應(yīng)的方法。該方法包括實(shí)施本文所述改良的CTC檢測和表征的方法和分析CTC，從而確定個體對治療方案的響應(yīng)。
在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供確定用于臨床試驗(yàn)的候選個體的方法。該方法包括實(shí)施本文所述改良的CTC檢測和表征的方法和分析CTC，從而確定用于臨床試驗(yàn)的候選個體。附圖
簡述圖I是平均觀測SKBR3相對于預(yù)期SKBR3繪制的圖形表示。四等份正常對照血液中被加入不同數(shù)量的SKBR2細(xì)胞，生成4個玻片，每個玻片具有約10、30、100和300個癌細(xì)胞。顯示每一個的四份平均值和標(biāo)示標(biāo)準(zhǔn)偏差的誤差線。圖2是一系列癌癥患者中發(fā)現(xiàn)的CTC的代表性亞群的照片表示。該亞群中的各CTC為細(xì)胞角蛋白陽性，CD45陰性，包含DAPI核，并在形態(tài)上區(qū)別于圓形的周圍血液白細(xì)胞。圖3是對兩個單獨(dú)的處理器之間的9個不同的癌癥患者樣本的CTC數(shù)量進(jìn)行比較的圖形表示。CTC/mL數(shù)量在0至203的范圍內(nèi)。
圖4是包括在3個月時間過程中取自4個不同的前列腺癌患者的連續(xù)血液的CTC和PSA水平的四個繪圖的圖形表示。2個患者具有增加的CTC和PSA水平，2個患者具有減少/穩(wěn)定的CTC和PSA水平。具有增加的CTC數(shù)量的患者的PSA水平增加，而具有減少/穩(wěn)定的CTC數(shù)量的患者的PSA水平減少。圖5是顯示假定的稀有細(xì)胞群相對于CTC亞群(HD-CTC)在患者中的發(fā)生率的圖形表示。發(fā)明詳述本發(fā)明提供省略從混合群陽性富集稀有細(xì)胞如CTC的物理方法的方法，從而最小化稀有細(xì)胞的損失。該方法進(jìn)一步允許捕獲/確定細(xì)胞群亞組，如CTC亞群或其他稀有群，其通過檢測相同或不同的標(biāo)記進(jìn)行，利用能夠區(qū)別事件和非事件的不同參數(shù)，如截止值(cutoff value)。例如,如本文詳述,不同截止可用于表征不同的細(xì)胞亞群。雖然本公開著重于CTC及其亞群，但同樣的方法可用于發(fā)現(xiàn)非稀有細(xì)胞背景下的任何其他稀有細(xì)胞類型。如本文所述，“稀有細(xì)胞”意為包括如下的細(xì)胞1)低于流體樣本中有核細(xì)胞群總量約5%、4%、3%、2%、1%、0. 1%、0. 01%或0. 001%的細(xì)胞類型；或2)以低于每毫升流體樣本中100萬個細(xì)胞存在的細(xì)胞類型。示例性稀有細(xì)胞包括但不限于CTC、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(CEC )、栓子血液白細(xì)胞、癌癥干細(xì)胞、被激活的或被感染的細(xì)胞——如被激活的或被感染的血液細(xì)胞和胎兒細(xì)胞。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員要理解的是，整個說明書CTC的引用包括對稀有細(xì)胞的引用，反之亦然。本方法能夠利用顯微術(shù)、細(xì)胞計(jì)量術(shù)、自動化和計(jì)算從其他血液細(xì)胞的背景中鑒定出稀有細(xì)胞，如CTC或CTC亞群。本發(fā)明利用這些組分一分別地和共同地一來鑒定稀有細(xì)胞。益處包括如下能力發(fā)現(xiàn)更多稀有細(xì)胞，從而將其以能使隨后分析含量標(biāo)記的形式展示，并以時間和資源高效的方式進(jìn)行。進(jìn)一步，本公開部分基于能夠鑒定癌癥患者CTC亞群的后代分析。一個鑒定的具體亞群來自癌癥患者小組。除利用限定CTC亞群——如一種在本文中被稱為高清-CTC(HD-CTC)亞群的CTC亞群——的特定參數(shù)外，分析方法相比之前的工作對于較少量血液提供較高的敏感度。本分析方法關(guān)鍵的創(chuàng)新性方面來源于對簡易性和最低限度處理血液樣本的需要，并且滿足能以診斷定性成像(diagnostic quality imagery)進(jìn)行專業(yè)解釋的需要。用于鑒定稀有細(xì)胞群如CTC或其亞群的方法的獨(dú)特性在于其不依賴于任何一種蛋白質(zhì)富集策略。所有有核血液細(xì)胞均以多種顏色成像，從而定位和在形態(tài)上評價(jià)稀有事件。此無富集策略導(dǎo)致分析能具有‘可調(diào)的特異性/敏感度’，這允許高敏感度和高特異性，同時還能進(jìn)行對已知異質(zhì)的稀有細(xì)胞群的研究。相對于物理富集關(guān)鍵的優(yōu)勢和差異是一種可‘調(diào)節(jié)’結(jié)果，而物理富集為‘是’或‘否’。本方法另一個關(guān)鍵的優(yōu)勢是一個或多個分析參數(shù)可進(jìn)行鑒定和表征特定的目標(biāo)群。在描述本組成和方法前，要理解的是，本發(fā)明不限于所述具體的組成、方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@些組成、方法和條件可改變。還要理解的是，本文所用命名方法的目的僅為描述具體的實(shí)施方式，并不意為進(jìn)行限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將僅受限于所附權(quán)利要求。如本說明書和所附權(quán)利要求所用，除非上下文另外明確表示，單個形式“一 (a) ”、“一(an)”和“所述(the)”包括復(fù)數(shù)指代。因此，例如，指代“所述方法”包括本文所述類型 的一個或多個方法和/或步驟，在閱讀本公開等后其對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。除非另外限定，本文所用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語均與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的具有相同的含義。雖然任何類似或等同于本文所述的方法和材料均可用于本發(fā)明的實(shí)踐或測試，現(xiàn)對優(yōu)選的方法和材料進(jìn)行描述。一般地，指代“循環(huán)腫瘤細(xì)胞”意指單個細(xì)胞，而指代“循環(huán)腫瘤細(xì)胞(多個)”或“循環(huán)腫瘤細(xì)胞簇”意指一個以上細(xì)胞。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解指代“循環(huán)腫瘤細(xì)胞(多個)”意為包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞群，包括一個或多個循環(huán)腫瘤細(xì)胞。術(shù)語“循環(huán)腫瘤細(xì)胞”(CTC)或CTC “簇”意指個體樣本中發(fā)現(xiàn)的任何癌細(xì)胞或癌細(xì)胞簇。一般，CTC已從固體腫瘤脫落。因此，CTC通常是從固體腫瘤脫落的上皮細(xì)胞，其以極低濃度被發(fā)現(xiàn)于晚期癌癥患者的循環(huán)中。CTC也可以是肉瘤的間皮細(xì)胞或黑素瘤的黑素細(xì)胞。CTC也可以是源自第一、第二或第三腫瘤的細(xì)胞。CTC也可以是循環(huán)癌癥干細(xì)胞。雖然術(shù)語“循環(huán)腫瘤細(xì)胞”(CTC)或CTC “簇”包括癌細(xì)胞，其也意為包括在循環(huán)中不常見的非腫瘤細(xì)胞，例如，循環(huán)上皮或內(nèi)皮細(xì)胞。因此，腫瘤細(xì)胞和非腫瘤上皮細(xì)胞均被包括在CTC的定義內(nèi)。本文所用的術(shù)語“癌癥”包括本領(lǐng)域公知的多種癌癥類型，包括但不限于，發(fā)育異常、超常增生、固體腫瘤和造血性癌癥。已知多種類型的癌癥轉(zhuǎn)移和脫落循環(huán)腫瘤細(xì)胞或具有轉(zhuǎn)移性，例如，第二癌癥源于已經(jīng)轉(zhuǎn)移的第一癌癥。另外的癌癥可包括但不限于如下器官或系統(tǒng)腦、心臟、肺、胃腸、生殖泌尿道、肝、骨、神經(jīng)系統(tǒng)、婦科、血液、皮膚、乳腺和腎上腺。另外的癌細(xì)胞類型包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤(神經(jīng)鞘瘤、惡性膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤)、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤(paraganlioma)、腦膜瘤、腎上腺皮質(zhì)癌、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、腎癌、多種類型的血管癌、成骨骨癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮肌瘤、唾液腺癌、脈絡(luò)叢癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和成巨核細(xì)胞白血??；和皮膚癌癥，包括惡性黑素瘤、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、卡波西(Karposi)氏肉瘤、痣——發(fā)育不良痣、脂肪瘤、血管瘤、皮膚纖維瘤、瘢痕瘤、肉瘤如纖維肉瘤或血管肉瘤和黑素瘤。利用本文所述的方法，可從任何適合的樣本類型檢測和表征稀有細(xì)胞，如CTC。如本文所用，術(shù)語“樣本”指任何適于本發(fā)明所提供方法的樣本。樣本可以是包含適于檢測的稀有細(xì)胞的任何樣本。樣本來源包括全血、骨髓、胸膜液、腹膜液、中央脊髓液、尿液、唾液和支氣管沖洗液。一方面，樣本是血液樣本，包括，例如，全血或其任何部分或組分。適用于本發(fā)明的血液樣本可提取自已知包含血液細(xì)胞或其組分的任何來源，如靜脈、動脈、外周、組織、索(cord)及類似來源。例如，可利用公知和常規(guī)的臨床方法(例如，提取和處理全血的程序)得到和處理樣本。一方面，示例性樣本可以是提取自癌癥個體的外周血。術(shù)語“血液組分”意為包括全血的任何組分，包括血液紅細(xì)胞、血液白細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、間皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞。血液組分還包括血漿組分如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和糖類和任何其他由于妊娠、器官移植、感染、創(chuàng)傷或疾病可存在于血液的細(xì)胞。如本文所用，“血液白細(xì)胞(white blood cell)”是白細(xì)胞，或非網(wǎng)狀細(xì)胞或血小板的造血系細(xì)胞。白細(xì)胞可包括自然殺傷細(xì)胞(“AK細(xì)胞”)和淋巴細(xì)胞如B淋巴細(xì)胞(“B細(xì)胞”)或T淋巴細(xì)胞(“T細(xì)胞”)。白細(xì)胞還可包括吞噬細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞一包括嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。白細(xì)胞還可包括肥大細(xì)胞。如本文所用，“血液紅細(xì)胞(red blood cell)”或“RBC”是紅細(xì)胞。除非指明“有核血液紅細(xì)胞”(“nRBC”)或“胎兒有核血液紅細(xì)胞”，如本文所用，“血液紅細(xì)胞”被用于意 為非有核血液紅細(xì)胞。本發(fā)明提供可以多種不同方式分析或檢查生物樣本從而檢測和表征稀有細(xì)胞的方法。樣本可用一種或多種可檢測標(biāo)記染色或標(biāo)記，并通過熒光顯微鏡和/或光學(xué)顯微鏡進(jìn)行檢查。與目標(biāo)是自評價(jià)中消除非稀有或非CTC的常規(guī)富集方案不同，本發(fā)明依賴于樣本中存在的非稀有細(xì)胞或非CTC，以協(xié)助鑒定和表征稀有細(xì)胞或CTC。在目前描述的非富集方法中，樣本(例如，血液或其他體液，包括尿液、腹膜液、胸膜液、唾液、腦脊液及類似物)被最低限度地處理，稀有細(xì)胞如CTC沒有從其他有核細(xì)胞(例如，非稀有或非CTC)分離。如本文所用，術(shù)語“非稀有細(xì)胞”和“非稀有細(xì)胞(多個)”，一般指不是本文限定的稀有細(xì)胞的任何細(xì)胞。類似地，如本文所用，術(shù)語“非CTC”和“非CTC (多個)”，一般指不是本文限定的CTC的任何細(xì)胞。非稀有細(xì)胞和非CTC可包括有核或去核細(xì)胞，如，在血液的情況下，血液白細(xì)胞(也被稱為白細(xì)胞)包括嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞；血液紅細(xì)胞(也被稱為紅細(xì)胞)；和血小板。在血液情況下，雖然CTC可不與其他有核細(xì)胞分離，但在鋪平前從樣本去除一般僅在新生兒血液中發(fā)現(xiàn)有核的血液紅細(xì)胞。其通常通過裂解血液紅細(xì)胞進(jìn)行，雖然多種可供選擇的方法在文獻(xiàn)中眾所周知，并可用于本方法，例如，通過過濾或密度梯度離心去除細(xì)胞。在去除血液紅細(xì)胞后，可通過將細(xì)胞旋轉(zhuǎn)，再懸浮和鋪平在可用于細(xì)胞成像的固體支持體上處理剩余的細(xì)胞。多種固體支持體在本領(lǐng)域公知，包括可被處理以促進(jìn)細(xì)胞附于玻片表面的玻片。玻片可由多種足以提供進(jìn)行生物分析的支持體的材料構(gòu)成。在示例性方面中，支持體由這樣的材料構(gòu)成其可涂布有促進(jìn)生物材料與支持體的靜電相互作用的化合物。多種基底材料在本領(lǐng)域公知，并適用于本發(fā)明。這種材料可包括下列中的一種或多種玻璃；有機(jī)塑料，如聚碳酸酯和聚甲基丙烯酸甲酯；聚烯烴；聚酰胺；聚酯；有機(jī)硅；聚氨酯；環(huán)氧樹脂；丙烯酸樹脂(acrylics);聚丙烯酸酯；聚酯；聚砜；聚甲基丙烯酸酯；聚碳酸酯；PEEK ;聚酰亞胺；聚苯乙烯；和含氟聚合物。在示例性方面中，玻片由玻璃或塑料制成，并包括一個或多個生物相互作用性涂層。玻片可包括其表面上限定的一個或多個活性區(qū)。活性區(qū)，如本文所述，意為包括這樣的區(qū)域其中玻片已經(jīng)化學(xué)或電處理，如用生物相互作用性涂層處理，以例如促進(jìn)細(xì)胞與玻片粘附。例如，玻片可經(jīng)處理，使得表面帶正電，其允許細(xì)胞通過靜電粘附帶負(fù)電的細(xì)胞而錨定于表面。玻片可包括I個至任何數(shù)量的活性區(qū)，這取決于玻片大小和目的用途。在多方面，玻片包括單個活性區(qū)。粘附于給定玻片的稀有細(xì)胞或CTC的總數(shù)部分取決于初始樣本體積。在多方面，大范圍的初始樣本體積可用于實(shí)踐本方法并提供臨床上顯著的結(jié)果。因此，初始樣本體積可小于約 Iu 1>2 u 1>2. 5 u 1>3 u 1>4 u 1>5 u 1>6 u 1>7 u 1>7. 5 u 1>8 u 1>9 u 1>10 u I、12. 5 u 1> 15 u I、17. 5 u I>20 u 1>25 u 1>50 u 1>75 u 1> 100 u 1>125 u 1> 150 u 1>175 u I、200 uI>225 u I>250 U I>300 U I>400 U I>500 U I>750 u l、lml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml或大于約10ml。在示例性方面中，初始樣本體積在約200至500iil、200至IOOOu I、1000 至 2000 ii I、1000 至 3000 ii I 或 1000 至 5000 y I 之間。在另一示例性方面中，如本文所述處理的樣本包含大于約 1、2、5、7、10、15、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或甚至1000個稀有細(xì)胞或CTC。在粘附最低限度處理的細(xì)胞于固體支持體——例如通過將細(xì)胞鋪在玻片上—— 后，使細(xì)胞接觸一種或多種可檢測標(biāo)記以通過熒光顯微鏡和/或光學(xué)顯微鏡檢查細(xì)胞而促進(jìn)細(xì)胞成像。一般地，可檢測標(biāo)記包括多種可用于檢測和表征細(xì)胞現(xiàn)象的劑。例如，可檢測標(biāo)記可包括如下劑，如多核苷酸、多肽、小分子和/或抗體，其特異性結(jié)合樣本中存在的標(biāo)記，并且其被標(biāo)記以使該劑在結(jié)合或雜交其目標(biāo)標(biāo)記或配體時可被檢測到。例如，可檢測標(biāo)記可包括酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記或放射性核素標(biāo)記。另外的報(bào)告手段和標(biāo)記在本領(lǐng)域公知。標(biāo)記可以是樣本中存在的通過已知的顯微、組織學(xué)或分子生物學(xué)技術(shù)可識別的任何細(xì)胞組分。標(biāo)記可用于，例如檢測和表征稀有細(xì)胞，包括CTC，和從非稀有細(xì)胞和非CTC區(qū)分稀有細(xì)胞。一般地，標(biāo)記可以是，例如，存在于細(xì)胞表面的分子、過表達(dá)的目標(biāo)蛋白質(zhì)、核酸突變或樣本中存在的細(xì)胞的形態(tài)特征。因此，標(biāo)記可包括任何可在細(xì)胞表面內(nèi)或細(xì)胞表面上檢測到的細(xì)胞組分或結(jié)合或聚集于細(xì)胞表面的大分子。因此，標(biāo)記不限于物理地在細(xì)胞表面上的標(biāo)記。例如，標(biāo)記可包括但不限于表面抗原、跨膜受體或輔助受體、結(jié)合于表面的大分子如結(jié)合或聚集的蛋白質(zhì)或糖類、內(nèi)部細(xì)胞組分如細(xì)胞質(zhì)或核組分及類似物。標(biāo)記也可包括優(yōu)先結(jié)合特定細(xì)胞類型的血液組分，如血小板或纖維蛋白。一方面，可檢測標(biāo)記可以是可檢測地標(biāo)記的抗體?？捎糜诒景l(fā)明方法的抗體包括完整的多克隆或單克隆抗體及其任何片段，如Fab和F (ab’)2，以及這種抗體或片段的組合。生成熒光標(biāo)記抗體的方法在本領(lǐng)域公知，例如，熒光分子可直接地或通過利用中間官能團(tuán)間接地結(jié)合免疫球蛋白。在相關(guān)方面中，可檢測標(biāo)記可以是核酸分子(例如，寡核苷酸或多核苷酸)。例如，原位核酸雜交技術(shù)在本領(lǐng)域公知，并可用于識別樣本或子樣本(例如，各個細(xì)胞)中存在的RNA或DNA標(biāo)記。在本發(fā)明的多個方面中，用于染色細(xì)胞的可檢測標(biāo)記包括一種或多種對于特定類型細(xì)胞和/或組織具有組織特異性而因此被用作陽性標(biāo)記的可檢測標(biāo)記。如本文所用，“陽性標(biāo)記”是特異性結(jié)合稀有細(xì)胞如CTC而非非稀有細(xì)胞或非CTC的可檢測標(biāo)記。例如，陽性標(biāo)記可具有上皮和/或組織特異性，例如，可應(yīng)用優(yōu)先結(jié)合上皮細(xì)胞的細(xì)胞角蛋白和/或EpCAM標(biāo)記。類似地,可應(yīng)用具有組織特異性的標(biāo)記。本領(lǐng)域已知多個組織特異性標(biāo)記的實(shí)例，其適用于實(shí)踐本發(fā)明，如PSA和PSMA用于前列腺組織，⑶X2用于結(jié)腸組織以及TTFl用于肺組織(TTF1陽性的肺癌癥患者的亞群)。如本文所用，“陽性標(biāo)記”也可以是特異性結(jié)合稀有細(xì)胞或CTC亞群而非群落中所有稀有細(xì)胞或CTC的可檢測標(biāo)記。例如，“陽性標(biāo)記”可特異性結(jié)合HD-CTC，而非所有CTC。在本發(fā)明的多個方面中，用于染色細(xì)胞的可檢測標(biāo)記包括一種或多種特異性結(jié)合非稀有細(xì)胞或非CTC并可用作陰性選擇劑的可檢測標(biāo)記。如本文所述，“陰性標(biāo)記”是特異性結(jié)合非稀有細(xì)胞或非CTC并且是陰性選擇劑的可檢測標(biāo)記。最常用的非CTC的陰性標(biāo)記是⑶45，其優(yōu)先結(jié)合WBC。存在結(jié)合多種WBC亞群的其他可檢測標(biāo)記或可檢測標(biāo)記的組合。其可以多種組合被應(yīng)用，包括與CD45組合或替代CD45。如本文所用，“陰性標(biāo)記”也可以是特異性結(jié)合非稀有細(xì)胞或非CTC亞群并且是陰性選擇劑的可檢測標(biāo)記。除識別CTC的陽性和陰性可檢測標(biāo)記外，另外的特異性結(jié)合細(xì)胞核的可檢測標(biāo)記可用于染色細(xì)胞，以允許從非細(xì)胞材料區(qū)分細(xì)胞。如本文所用，“核標(biāo)記”是結(jié)合細(xì)胞核組分并允許從非細(xì)胞材料區(qū)分細(xì)胞的可檢測標(biāo)記。用于本發(fā)明的最常見的核標(biāo)記是DAPI。在本發(fā)明的多個方面中，用于染色細(xì)胞的可檢測標(biāo)記包括一種或多種本文中被稱 為“含量標(biāo)記”的可檢測標(biāo)記。含量標(biāo)記一般可包括，可檢測地標(biāo)記的寡核苷酸探針，如FISH探針或免疫組織化學(xué)探針。在一個實(shí)施方式中，含量標(biāo)記與陽性和陰性標(biāo)記同時被施加于玻片，或在陽性和陰性標(biāo)記和在通過成像鑒定稀有細(xì)胞后被施加于玻片。含量標(biāo)記包括靶向如下的可檢測標(biāo)記EGFR、HER2、ERCCl、CXCR4、EpCAM、E-鈣粘素、粘蛋白-I (Mucin-1)、細(xì)胞角蛋白、PSA、PSMA、RRMl、雄激素受體、雌激素受體、黃體酮受體、IGFl、cMET、EML4或白細(xì)胞相關(guān)受體(LAR)。在一些情況下，含量標(biāo)記也可以是陽性標(biāo)記。在一定強(qiáng)度水平上陽性標(biāo)記或任何標(biāo)記的信號強(qiáng)度是可檢測到的，其基于本公開的方法是可高度量化的。該強(qiáng)度水平允許可檢測事件的量化和排序顯著改良，能使進(jìn)一步分類進(jìn)行。例如，發(fā)出低強(qiáng)度細(xì)胞角蛋白信號的CTC可以是癌癥干細(xì)胞；或高/低細(xì)胞角蛋白細(xì)胞的數(shù)量變化可預(yù)測反應(yīng)或是對反應(yīng)(或抵抗過程)的讀取。對于陽性、陰性和含量標(biāo)記同樣是真實(shí)的。本發(fā)明利用可檢測標(biāo)記通過熒光顯微鏡和/或光學(xué)顯微鏡檢查細(xì)胞而促進(jìn)細(xì)胞成像。在示例性方面中，用數(shù)種熒光標(biāo)記使最低限度處理的細(xì)胞染色，然后利用快速自動化的顯微鏡成像。一般，可將制得的玻片裝載于自動化系統(tǒng)上或可將其置于玻片載體中，該玻片載體容納任何數(shù)量的另外的玻片。將玻片載體裝載于自動化系統(tǒng)的輸入送料斗中。然后操作人員可輸入鑒定各玻片上掃描區(qū)域大小、形狀和位置的數(shù)據(jù)，或系統(tǒng)可在玻片處理過程中自動定位各玻片的掃描區(qū)域。玻片的處理參數(shù)可通過存在于玻片或玻片載體上的條形碼鑒定。在系統(tǒng)激活時，玻片載體位于X-Y階段，整個玻片或其部分被快速掃描。其可在低倍或高倍放大下進(jìn)行，并且可在多個放大水平下和/或在玻片的多個區(qū)域重復(fù)。圖像可被儲存于適當(dāng)?shù)膬Υ娼橘|(zhì)，并利用在本領(lǐng)域公知用于進(jìn)行本文所述多種分析的可執(zhí)行代碼進(jìn)行分析。如本文所述，在整個成像處理過程中多個參數(shù)可被調(diào)整以促進(jìn)稀有細(xì)胞如CTC的檢測，利用關(guān)于非稀有或非CTC的數(shù)據(jù)，如曝光限值和強(qiáng)度設(shè)置。如本文所用，術(shù)語“圖像”和“樣本圖像”一般指包含多種細(xì)胞如稀有細(xì)胞和CTC的最低限度處理的樣本的圖像、數(shù)字圖像或其他圖像。一般，樣本圖像是細(xì)胞粘附于其表面并且任選地用一種或多種可檢測標(biāo)記染色的樣本玻片全部或部分的圖像。本發(fā)明的一個優(yōu)勢——其允許可調(diào)的特異性/敏感度并集中于數(shù)據(jù)縮減和分析而不是富集一是預(yù)期最低限度處理使偏離最小化。在可供選擇的需要富集的技術(shù)中，稀有細(xì)胞總是在處理過程中損失。特別是，在免疫捕獲或尺寸過濾以區(qū)分WBC與CTC的應(yīng)用中，在WBC與CTC之間的免疫捕獲或尺寸變化不同的情況下目標(biāo)抗原的表達(dá)變化引起一些CTC在富集階段損失。其可導(dǎo)致(i)不準(zhǔn)確的CTC數(shù)量；(ii)過少CTC用于下游表征或含量分析；和(iii)產(chǎn)生選擇偏離，因?yàn)橐恍╊愋偷腃TC基于其變化類型優(yōu)先損失。最低限度處理方法的挑戰(zhàn)是在非稀有細(xì)胞或非CTC的背景下難以發(fā)現(xiàn)低頻率稀有細(xì)胞或CTC。低頻率可以是I個稀有細(xì)胞或CTC : 1，000個非稀有細(xì)胞或非CTC、1:10，000、I 100, 000,1:1, 000, 000以及甚至1:10, 000, 000或這些比例之間的任意比例。使發(fā)現(xiàn)和表征稀有細(xì)胞的能力復(fù)雜化的是陽性和陰性標(biāo)記，其雖然極具選擇性，但不完美之處在于產(chǎn)生假陽性或假陰性。換句話說，陰性標(biāo)記對稀有細(xì)胞通常具有一些背景染色和/或陽性標(biāo)記對非稀有細(xì)胞通常具有一些背景染色。雖然分析優(yōu)化被用于最小化該背景染色，但用分析優(yōu)化完全消除這個現(xiàn)象仍具挑戰(zhàn)。如之前所述，大多數(shù)其他發(fā)現(xiàn)稀有細(xì)胞的方法試圖去除非稀有細(xì)胞。本發(fā)明利用非稀有細(xì)胞或非CTC以協(xié)助發(fā)現(xiàn)和表征稀有細(xì)胞或CTC。多種可分析非稀有細(xì)胞和非CTC 的方式在本公開中被述及。在本公開中，非稀有細(xì)胞或非CTC 一般被指定為單獨(dú)組，并因此可利用本文所述的方法進(jìn)行分析。但是，本發(fā)明也認(rèn)識到，非稀有細(xì)胞可包含多個離散的亞組。例如，在CTC的情況下，該多個離散的亞組可包括嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞以及不同狀態(tài)如凋亡或細(xì)胞分裂的不同狀態(tài)下的細(xì)胞，該細(xì)胞可利用本文所述的方法通過大小、形狀、核特征和染色特征被區(qū)分。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，利用這些亞組其中之一而非利用整組協(xié)助發(fā)現(xiàn)稀有細(xì)胞或CTC是可用的。本發(fā)明對非稀有細(xì)胞或非CTC的應(yīng)用不意味使本發(fā)明限于僅利用整組，此時一些實(shí)施方式中只利用亞組中的一種或多種可能是適當(dāng)?shù)摹１景l(fā)明能進(jìn)行的一方面是，稀有細(xì)胞或CTC相對于非稀有細(xì)胞或非CTC的低頻率允許處理作為非稀有細(xì)胞或非CTC的多數(shù)細(xì)胞，即便其還未被如此明確地鑒定。稀有細(xì)胞和CTC的低頻率允許忽略這種細(xì)胞并假定該細(xì)胞是非稀有細(xì)胞或非CTC，從而產(chǎn)生性質(zhì)對照、截止、標(biāo)準(zhǔn)化和校準(zhǔn)度量。由于稀有細(xì)胞處于低豐度，因此如果這些度量通過考慮稀有細(xì)胞群而被完善，可應(yīng)用離群點(diǎn)去除技術(shù)。離群點(diǎn)去除技術(shù)在數(shù)學(xué)上確保稀有細(xì)胞群不影響度量。如本文所述，公開的方法允許檢測、計(jì)數(shù)和表征稀有細(xì)胞群或稀有細(xì)胞亞群。該方法利用來自樣本中非稀有細(xì)胞的數(shù)據(jù)通過使用限定參數(shù)來鑒定和表征稀有細(xì)胞，該限定參數(shù)涉及曝光限值、曝光設(shè)置、性質(zhì)對照、強(qiáng)度截止限值、細(xì)胞大小和形狀校準(zhǔn)、細(xì)胞計(jì)數(shù)和含量評價(jià)，依次對其中每一個進(jìn)行進(jìn)一步討論。在多方面，分析允許同時進(jìn)行單通道圖像的熒光圖像細(xì)胞形態(tài)評價(jià)，其利用如下得到增強(qiáng)細(xì)胞-細(xì)胞標(biāo)注(annotation)，連同來自于完整實(shí)驗(yàn)或局部環(huán)境的關(guān)于絕對和相對于非稀有細(xì)胞或候選非稀有細(xì)胞一例如，非CTC或候選非CTC——的對象大小和熒光強(qiáng)度的輔助半定量數(shù)據(jù)。建立曝光限值雖然變化應(yīng)通過分析優(yōu)化和儀器標(biāo)準(zhǔn)化被最小化，但標(biāo)記的染色差異常見于，玻片-與-玻片、批次-與-批次、操作人員-與-操作人員和天-與-天。因此，為具體玻片選擇正確的曝光并非無足輕重，因?yàn)閷⑵湓O(shè)置過低或過高均會使其錯失信息。雖然標(biāo)準(zhǔn)方法對那些玻片上對于多數(shù)事件常見的標(biāo)記起作用，但對于對稀有細(xì)胞或CTC具有特異性的標(biāo)記具有挑戰(zhàn)。在成像系統(tǒng)的動態(tài)范圍內(nèi)，稀有細(xì)胞或CTC的信號和非稀有細(xì)胞或非CTC的背景與曝光時間成比例。但成像系統(tǒng)電子學(xué)引起的信號和背景隨機(jī)變化的噪音在曝光增加時減少。理想地，曝光應(yīng)被設(shè)置以最大化信號，而沒有使成像系統(tǒng)飽和。但這由于對數(shù)據(jù)收集時間的影響是不可實(shí)現(xiàn)的。由于稀有細(xì)胞或CTC以極低頻率存在，在少量樣本圖像中發(fā)現(xiàn)稀有細(xì)胞或CTC是不可能的，這阻止了利用樣本圖像設(shè)置陽性標(biāo)記曝光。使此進(jìn)一步復(fù)雜化，陽性和陰性標(biāo)記的表達(dá)和對其目標(biāo)細(xì)胞的染色均存在天然差異。少量樣本圖像以設(shè)置曝光不可捕獲目標(biāo)稀有細(xì)胞或CTC上的該天然差異。在本發(fā)明一個實(shí)施方式中，非稀有細(xì)胞或非CTC的信號被用于設(shè)置陽性標(biāo)記的曝光限值。其有一些違反直覺，因?yàn)榉窍∮屑?xì)胞或非CTC不是陽性標(biāo)記的選擇目標(biāo)。但在該實(shí)施方式中，曝光被調(diào)整，使得由源自熒光源——如非特異性染色、自動熒光和光學(xué)系統(tǒng)特性——的樣本圖像中的非稀有細(xì)胞或非CTC觀察到可視但低的信號。明亮區(qū)域的成像、核標(biāo)記和陰性標(biāo)記可用于鑒定樣本圖像中的非稀有細(xì)胞或非CTC。在與樣本圖像中的非細(xì)胞區(qū)域比較時，低信號是非稀有細(xì)胞或非CTC可區(qū)分的細(xì)胞信號。該處理提供了在那些標(biāo)記的目標(biāo)處于低頻率時設(shè)置陽性標(biāo)記曝光的方法，并還協(xié)助最大化陽性標(biāo)記的信號/背景， 二者均有助于發(fā)現(xiàn)稀有細(xì)胞或CTC，盡管仍需最小化收集數(shù)據(jù)所需要的總時間。該現(xiàn)象在信號低或弱時尤為如此。一旦細(xì)胞背景在統(tǒng)計(jì)學(xué)上比非細(xì)胞背景顯著時，該特定標(biāo)記的曝光時間針對數(shù)據(jù)收集速度進(jìn)行優(yōu)化。所有隨后的優(yōu)化可在計(jì)算機(jī)芯片上進(jìn)行。一旦設(shè)置了曝光，整個玻片已準(zhǔn)備好在該設(shè)置下成像。雖然上述實(shí)施方式促進(jìn)了陽性標(biāo)記的曝光設(shè)置，但非稀有細(xì)胞或非CTC也可用于以與稀有細(xì)胞或CTC臨床解釋相關(guān)的方式設(shè)置陰性標(biāo)記、核標(biāo)記和含量標(biāo)記的曝光。在一個實(shí)施方式中，樣本圖像中非稀有細(xì)胞或非CTC的核標(biāo)記被設(shè)置至允許評價(jià)細(xì)胞核含量，特別是細(xì)胞被分類為活細(xì)胞還是死細(xì)胞的水平，這通過細(xì)胞類型促進(jìn)細(xì)胞活死比的計(jì)算。非稀有細(xì)胞或非CTC的這些核標(biāo)記曝光水平將滿足稀有細(xì)胞或CTC的相同核標(biāo)記評價(jià)，特別是區(qū)分正常細(xì)胞相對于惡性細(xì)胞的核形狀。在另一個實(shí)施方式中，通過觀察非稀有細(xì)胞或非CTC上標(biāo)記的信號分布，設(shè)置樣本圖像的陰性標(biāo)記曝光，其中曝光被選擇以最大化信號/背景比，特別是在動態(tài)范圍的臨界低端，在此可存在對稀有細(xì)胞或CTC中陰性標(biāo)記的微弱信號。在另一個實(shí)施方式中，設(shè)置非稀有細(xì)胞或非CTC含量標(biāo)記的曝光。利用樣本圖像中非稀有細(xì)胞或非CTC進(jìn)行的含量標(biāo)記信號設(shè)置將取決于具體含量標(biāo)記。例如，一些含量標(biāo)記在非稀有細(xì)胞或非CTC中相對于稀有細(xì)胞或CTC可具有相對高的表達(dá)，在該情況下將利用樣本圖像中非稀有細(xì)胞或非CTC的信息來設(shè)置含量標(biāo)記的上邊界。相反，含量標(biāo)記在非稀有細(xì)胞或非CTC中相對于稀有細(xì)胞或CTC可具有相對低的表達(dá)，在該情況下將利用樣本圖像中非稀有細(xì)胞或非CTC的信息來設(shè)置含量標(biāo)記的下邊界。雖然上述實(shí)施方式利用非稀有細(xì)胞或非CTC在玻片成像前設(shè)置樣本圖像多種標(biāo)記的曝光限值從而發(fā)現(xiàn)稀有細(xì)胞或CTC，但在另一個實(shí)施方式中，利用整個玻片第一次成像事件過程中拍攝的圖像的非稀有細(xì)胞或非CTC和/或稀有細(xì)胞或CTC的信息來設(shè)置在玻片所選區(qū)域再次成像時的曝光限值。所選區(qū)域再次成像有多種原因，包括收集處于最佳焦距或處于較高放大倍數(shù)的圖像。在該實(shí)施方式中，貫穿整個玻片非稀有細(xì)胞或非CTC和稀有細(xì)胞或CTC的不同標(biāo)記的信號分布可用于計(jì)算較好的曝光，其使所需信號或所需動態(tài)范圍最大化。最小化曝光設(shè)置以最小化數(shù)據(jù)收集時間和最大化處理量如上所述，可調(diào)整曝光設(shè)置以優(yōu)化信號或信號背景參數(shù)。但是，在另一個實(shí)施方式中，調(diào)整曝光設(shè)置，目標(biāo)是最小化數(shù)據(jù)收集時間和最大化處理量。例如，可確定其耗費(fèi)5秒曝光時間以充分利用CCD相機(jī)動態(tài)范圍，但僅耗費(fèi)500毫秒以得到非細(xì)胞背景上的細(xì)胞背景，由此節(jié)約IOX的數(shù)據(jù)收集時間。因此，曝光倍數(shù)可被優(yōu)化以最大化信號(或信號背景)或最小化時間。性質(zhì)對照在另一個實(shí)施方式中，利用非稀有細(xì)胞或非CTC協(xié)助鑒定稀有細(xì)胞或CTC還包括其被用作性質(zhì)對照參數(shù)。由于非稀有細(xì)胞或非CTC呈現(xiàn)高得多的頻率，并分布于整個玻片， 其提供可用的資源以評價(jià)玻片的處理和成像性質(zhì)，二者均是相對于具體玻片并且覆蓋整個玻片和覆蓋整個數(shù)據(jù)設(shè)置。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了利用核標(biāo)記觀察非稀有細(xì)胞或非CTC的分布，從而確定非稀有細(xì)胞或非CTC。在該實(shí)施方式中，目標(biāo)是發(fā)現(xiàn)細(xì)胞，沒有必要區(qū)分非稀有細(xì)胞或非CTC與稀有細(xì)胞或CTC，因此可不利用陽性或陰性標(biāo)記來區(qū)分這些分類；但是，由于大多數(shù)細(xì)胞是非稀有細(xì)胞或非CTC，多數(shù)用于確定細(xì)胞在玻片上分布的細(xì)胞是非稀有細(xì)胞或非CTC。細(xì)胞的分布就性質(zhì)對照角度而言是重要的，因?yàn)槔硐氲姆植际羌?xì)胞平均分布，細(xì)胞間具有最低限度的重疊。如果與理想分布的偏差很大，可選擇放棄對玻片進(jìn)行進(jìn)一步處理。雖然本實(shí)例中使用核標(biāo)記，但用于鑒定細(xì)胞的任何方法均將符合，包括明亮區(qū)域成像和常規(guī)染色，如Wright Giemsa0在另一個實(shí)施方式中，核標(biāo)記和陰性標(biāo)記的共同定位被用作評價(jià)不同圖像的比對是否令人滿意的性質(zhì)對照方法。在該實(shí)施方式中，核標(biāo)記和陰性標(biāo)記應(yīng)具有顯著的重疊。在另一個實(shí)施方式中，陰性標(biāo)記事件與核標(biāo)記事件之間的比例是陰性標(biāo)記染色效力的量度，其中不超過12的較高比例是理想的。理想的陰性標(biāo)記可具有0. 8,0. 9,1. 0或
I.I的比。在另一個實(shí)施方式中，整個非稀有細(xì)胞或非CTC群的陰性標(biāo)記的分布——包括平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)(CV)—被用作性質(zhì)對照參數(shù)，其中陰性標(biāo)記的分布與過往實(shí)驗(yàn)預(yù)期分布特征一致，和/或與WBC正常表達(dá)分布特征一致。在另一個實(shí)施方式中，整個非稀有細(xì)胞或非CTC群陽性標(biāo)記的分布——包括平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和CV—被用作性質(zhì)對照參數(shù)，其中陽性標(biāo)記的分布與過往實(shí)驗(yàn)的預(yù)期分布特征一致。雖然上述性質(zhì)對照方法描述了評價(jià)整個玻片性質(zhì)的方法，但相同方法可用于評價(jià)圖像或圖像組。在一些實(shí)例中，可將得自區(qū)域中圖像或圖像組的參數(shù)與對整個玻片計(jì)算的相同參數(shù)進(jìn)行比較。在另一實(shí)例中，上述性質(zhì)對照參數(shù)可在不同玻片之間進(jìn)行比較。在另一個實(shí)施方式中，通過將核標(biāo)記事件或陰性標(biāo)記事件的比例與置于玻片上的非稀有細(xì)胞或非CTC的已知數(shù)量進(jìn)行比較，可計(jì)算處理過程中玻片的細(xì)胞損失，其中非稀有細(xì)胞或非CTC的已知數(shù)量得自實(shí)驗(yàn)所用的WBC數(shù)量和體積。設(shè)置CTC檢測的強(qiáng)度截止限值(最小化假陰性)如上所述，本方法對于稀有細(xì)胞和CTC檢測的挑戰(zhàn)是I)稀有細(xì)胞如CTC相對于非稀有細(xì)胞或非CTC的相對頻率低；和2)陽性和陰性標(biāo)記分別對CTC和非CTC的染色不完美。但是，本方法利用那些挑戰(zhàn)，并將其轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)勢。在一個實(shí)施方式中，陽性標(biāo)記對于高豐度非稀有細(xì)胞或非CTC的背景信號被用于計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和CV。那些度量隨后被用于確定檢測截止以從非稀有細(xì)胞或非CTC分離稀有細(xì)胞如CTC。一方面，因數(shù)10乘以標(biāo)準(zhǔn)偏差并加至非稀有細(xì)胞或非CTC陽性標(biāo)記信號的平均值，被用作截止，以區(qū)分稀有細(xì)胞或CTC，其中假定的稀有細(xì)胞或CTC被確定具有高于截止的陽性標(biāo)記信號。在其他方面，該度量利用因數(shù)5、7.5、12.5、15、17.5、20或更大因數(shù)或那些數(shù)之間的任何數(shù)。度量的計(jì)算可設(shè)置在整個玻片基礎(chǔ)上。或者，其可設(shè)置在圖像基礎(chǔ)或局部基礎(chǔ)上。在另一個實(shí)施方式中，每個圖像內(nèi)的截止可通過如下被動態(tài)確定定位最高陽性標(biāo)記事件信號，然后將該信號與另外的信號事件之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行比較。在示例性方面中，每個圖像內(nèi)的截止可通過如下被動態(tài)確定定位5個最高陽性標(biāo)記事件的信號，然后將該信號與另50個陽性信號事件之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行比較。陽性標(biāo)記事件還可包括多個陽性標(biāo)記或包括陽性標(biāo)記和排除陰性標(biāo)記事件。每個視野的數(shù)量“5”可由I至10變化，假設(shè)IOX放大倍數(shù)(即，假設(shè)每個視野不多于5個稀有細(xì)胞或CTC或相對濃度不高于1/500)。本 方法具有完全數(shù)量化并且不基于形狀分析的優(yōu)勢。預(yù)期大幅且顯著減少可能事件的數(shù)量，并且具有最低限度的損失事件風(fēng)險(xiǎn)。在另一個實(shí)施方式中，陰性標(biāo)記信號的截止是利用非稀有細(xì)胞或非CTC的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差設(shè)置的。在該情況下，截止得自因數(shù)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10乘以非稀有細(xì)胞或非CTC陰性標(biāo)記信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差并從陰性標(biāo)記信號平均值中減去。假定的CTC將具有在該截止以下的陰性標(biāo)記信號。如上所述，該截止可通過利用玻片上所有非稀有細(xì)胞或非CTC的信號整體生成，或在圖像或局部水平上通過僅利用該圖像或該區(qū)域中非稀有細(xì)胞或非CTC的信號生成。大小和形狀校準(zhǔn)在本發(fā)明另一個實(shí)施方式中，將玻片上所測的非稀有細(xì)胞或非CTC的細(xì)胞大小和細(xì)胞大小分布與文獻(xiàn)公開的WBC大小和分布進(jìn)行比較。此外，個別患者差異的分布可通過利用得自自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器的WBC亞組差數(shù)而得到校正。然后非稀有細(xì)胞或非CTC的公開大小與計(jì)算大小之間的比例可被用作校正因子，以通過將該比例乘以玻片上所測稀有細(xì)胞或CTC的大小來確定稀有細(xì)胞或CTC的準(zhǔn)確大小。校準(zhǔn)允許整個玻片和整個血管以及整個患者和整個適應(yīng)癥的標(biāo)準(zhǔn)化和比較。在另一個實(shí)施方式中，我們將圖像或玻片上所測非稀有細(xì)胞或非CTC的核大小、核大小分布和輪廓型式中的一種或多種與假定稀有細(xì)胞或CTC的核大小和輪廓型式進(jìn)行比較，并利用截止值證明假定的稀有細(xì)胞或CTC是有效的稀有細(xì)胞或CTC。計(jì)數(shù)在本發(fā)明的實(shí)施方式中，利用非稀有細(xì)胞或非CTC信息來準(zhǔn)確計(jì)算稀有細(xì)胞或CTC在體液中的濃度。在該實(shí)施方式的一個實(shí)例中，確定CTC與總CTC+非CTC (所有核標(biāo)記事件)的比，然后將其除以該實(shí)驗(yàn)所用的原始體液的體積，最后將其乘以體液中細(xì)胞的原始濃度。后一測量結(jié)果可通過利用標(biāo)準(zhǔn)的自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器(或細(xì)胞計(jì)數(shù)器)得到。含量評價(jià)如上所述，可評價(jià)含量標(biāo)記的稀有細(xì)胞或CTC表達(dá)水平。但是，由于處理和成像差異引起的玻片可變性，難以提供通用的參數(shù)以確定表達(dá)水平。為削弱該挑戰(zhàn)，首先確定含量標(biāo)記的表達(dá)水平及其在患者群非稀有細(xì)胞或非CTC中的分布。然后對于個別癌癥患者，確定含量標(biāo)記在稀有細(xì)胞或CTC和在非稀有細(xì)胞或非CTC中的表達(dá)水平。稀有細(xì)胞或CTC與非稀有細(xì)胞或非CTC之間的表達(dá)水平比變成使玻片-與-玻片差異標(biāo)準(zhǔn)化的相對量度。此夕卜，將該比乘以對照群非稀有細(xì)胞或非CTC表達(dá)水平的平均值，提供了就玻片-與-玻片差異校正的稀有細(xì)胞或CTC表達(dá)的絕對值。核形狀和大小是信息潛在的豐富來源。預(yù)期在血液細(xì)胞的情況下給出關(guān)于細(xì)胞類型的詳細(xì)信息，和在稀有細(xì)胞或CTC的情況下關(guān)于細(xì)胞狀態(tài)的詳細(xì)信息。例如，核形狀可給出對細(xì)胞惡性性質(zhì)的了解，其可給出對細(xì)胞存活和/或細(xì)胞循環(huán)狀態(tài)的了解。例如，進(jìn)行成功的化學(xué)治療的患者可觀察到CTC激增，但核解釋可顯示這些CTC是非活的/凋亡的。另一可能的利用核大小和形狀的機(jī)會將類似于將前向散射和側(cè)向散射用作表征細(xì)胞的方式的FACS分析。其可能能夠搜集足夠的關(guān)于核及其他細(xì)胞組分的詳細(xì)信息，以概括來自FACS的前向和側(cè)向散射信息。 在本發(fā)明多個實(shí)施方式中，單個參數(shù)或參數(shù)組合可用于進(jìn)行分析，其部分取決于所要確定的數(shù)據(jù)和正在考察的稀有細(xì)胞群。此外，可利用公開的方法來鑒定特定稀有細(xì)胞群的亞群。例如，如實(shí)施例I所示，可通過進(jìn)一步限定特定分析參數(shù)來鑒定和區(qū)分CTC亞群。該實(shí)施例公開了被稱為HD-CTC的⑶C亞群的鑒定和分類。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，通過進(jìn)一步限定所公開的分析參數(shù)，建立了 HD-CTC的嚴(yán)格分類。不受制于任何具體理論，認(rèn)為本文分類的HD-CTC亞群包括呈現(xiàn)成為完整腫瘤細(xì)胞的最高潛力的CTC。所有其他CTC均部分符合限定的參數(shù)但缺少一個或多個嚴(yán)格的入選標(biāo)準(zhǔn)。非HD-CTC是可能在進(jìn)一步下游的方法中進(jìn)行的評價(jià)中具有較低依賴性的CTC。在一個實(shí)施方式中，HD-CTC是這樣的細(xì)胞，其a)包含陽性標(biāo)記；b)具有完整的核；和c)在形態(tài)上區(qū)別于正常WBC，其中該細(xì)胞對于陰性標(biāo)記不呈陽性。如本文所述，陽性標(biāo)記可以是優(yōu)先結(jié)合上皮細(xì)胞如細(xì)胞角蛋白和/或EpCAM的標(biāo)記。進(jìn)一步，如本文所述，陰性標(biāo)記可以是任何非癌癥特異標(biāo)記，如⑶45，其優(yōu)先結(jié)合WBC。完整核的確定一般通過DAPI成像確定，但其他適當(dāng)?shù)暮藰?biāo)記在本領(lǐng)域公知。在示例性實(shí)施方式中，HD-CTC是這樣的細(xì)胞，其a)呈細(xì)胞角蛋白陽性；b)呈⑶45陰性；c)具有完整的核；和d)在形態(tài)上區(qū)別于正常WBC。在多個實(shí)施方式中，陽性標(biāo)記可具有比有核血液白細(xì)胞的細(xì)胞角蛋白強(qiáng)度高1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的強(qiáng)度。在多個實(shí)施方式中，陰性標(biāo)記的強(qiáng)度最低是所有細(xì)胞事件的 10%、5%、4%、3%、2% 或更低。在多個實(shí)施方式中，HD-CTC的核是完整的且非凋亡的。細(xì)胞質(zhì)的輕度凋亡變化可被接受，只要核沒有呈現(xiàn)凋亡。在多個實(shí)施方式中，HD-CTC在形態(tài)上區(qū)別于正常WBC。例如，HD-CTC可具有這樣的形態(tài)其基于標(biāo)準(zhǔn)診斷細(xì)胞病理學(xué)所用的標(biāo)準(zhǔn)與惡性上皮細(xì)胞一致，明顯表現(xiàn)為增大的尺寸，但其也可以包括如下細(xì)胞形態(tài)特征核和細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)組織、細(xì)胞質(zhì)形狀以及核形狀。一系列代表性HD-CTC示于圖2中。盡管如通篇所述，本發(fā)明所述方法可用于利用得自非稀有細(xì)胞分析的數(shù)據(jù)檢測稀有細(xì)胞，本發(fā)明也可用于表征稀有細(xì)胞。特別是，用于進(jìn)行細(xì)胞成像和分析的可檢測標(biāo)記和計(jì)算方法的多種組合的應(yīng)用允許有意義的表征，該表征可用于評估癌癥預(yù)后和監(jiān)測治療效力，以早期檢測可導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)的治療失敗。此外，根據(jù)本發(fā)明所述的CTC分析能夠?qū)σ淹瓿莎煶痰某尸F(xiàn)癥狀前的患者進(jìn)行早期復(fù)發(fā)檢測。這是可能的，因?yàn)镃TC的存在已被關(guān)聯(lián)和/或相關(guān)于一段時間的腫瘤進(jìn)程和蔓延、對治療的不良反應(yīng)、疾病復(fù)發(fā)和/或存活降低。因此，暴露的CTC的計(jì)數(shù)和表征提供了基于對治療的反應(yīng)對患者進(jìn)行基線特征分級的方法，該基線特征預(yù)測最初風(fēng)險(xiǎn)和后續(xù)風(fēng)險(xiǎn)。本文所用術(shù)語“個體”指目標(biāo)方法所實(shí)施的任何個體或患者。通常個體是人，盡管如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，個體可以是動物。因此其他動物，包括哺乳動物如嚙齒類(包括小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠)、貓、狗、兔、農(nóng)場動物一包括牛、馬、山羊、綿羊、豬等，并且靈長類動物(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)被包括在對個體的定義內(nèi)。因此，在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了診斷或預(yù)后個體癌癥的方法。該方法包括如本文所述檢測CTC。然后可分析CTC以診斷或預(yù)后個體癌癥。因此，本發(fā)明的方法可用于，例如，評價(jià)癌癥患者和處于癌癥危險(xiǎn)的患者。在本文所述診斷或預(yù)后方法中的任一種中，癌癥如癌細(xì)胞或任何其他疾病的一種或多種指示劑的存在或不存在均可用于生成診斷或預(yù)后。
一方面，如本文所述從患者取血液樣本，并經(jīng)處理以檢測CTC。利用本發(fā)明的方法，確定血液樣本中的CTC數(shù)，并通過分析可檢測標(biāo)記和由細(xì)胞成像得到的其他數(shù)據(jù)表征CTC。例如，可進(jìn)行分析以確定樣本中CTC的數(shù)量和表征，并由該測量結(jié)果可確定最初血液樣本中存在的CTC數(shù)量。在多方面，個體CTC數(shù)量和表征的分析可以多個間隔在一定時間段內(nèi)進(jìn)行，從而評估個體進(jìn)程和病理。例如，分析可以固定間隔進(jìn)行一如I天、2天、3天、I周、2周、I個月、2個月、3個月、6個月或I年，從而作為時間的函數(shù)追蹤循環(huán)上皮細(xì)胞的水平和表征。在現(xiàn)有癌癥患者的情況下，其提供了對疾病進(jìn)程可用的指示，并有助于醫(yī)務(wù)人員基于循環(huán)上皮細(xì)胞的增加、減少或變化缺失如患者血流中CTC的存在做出適當(dāng)?shù)闹委熯x擇。隨時間推移CTC數(shù)量的任何增加——為其2倍、5倍、10倍或更高——減弱患者的預(yù)后，并且是患者應(yīng)改變治療的早期指示劑。類似地，任何增加——為其2倍、5倍、10倍或更高——指示患者應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步測試如成像，以進(jìn)一步評估預(yù)后和對治療的反應(yīng)。隨時間推移CTC數(shù)量的任何減少——為其2倍、5倍、10倍或更高——表示疾病穩(wěn)定和患者對治療的反應(yīng)，并且是不改變治療的指示劑。對于處于癌癥危險(xiǎn)的患者，檢測到的CTC數(shù)量的驟增可提供早期警示——患者已產(chǎn)生腫瘤，因此提供了早期診斷。在一個實(shí)施方式中，對暴露的CTC的檢測增加了癌癥的分期。在本文提供方法的任一種中，也可進(jìn)行另外的分析以表征CTC，從而提供另外的臨床評估。例如，除圖像分析外，可利用基因表達(dá)分析和PCR技術(shù)，如基因芯片分析和利用
對特定癌癥標(biāo)記具有特異性的引物的多重技術(shù)(multiplexing),得到信息如腫瘤類型-
CTC起源于此、轉(zhuǎn)移狀態(tài)和惡性程度。此外，可進(jìn)行細(xì)胞大小、DNA或RNA分析、蛋白質(zhì)組分析或代謝物組分析作為評估關(guān)于患者癌癥表征的另外信息的手段。在多方面，分析包括靶向下列標(biāo)記的抗體或利用對下列標(biāo)記中的一種或多種具有特異性的引物的PCR多重技術(shù)EGFR、HER2、ERCCl、CXCR4、EpCAM、E-鈣粘素、粘蛋白-I、細(xì)胞角蛋白、PSA,PSMA, RRMl、雄激素受體、雌激素受體、黃體酮受體、IGF1、cMET、EML4或白細(xì)胞相關(guān)受體(LAR)。例如，該另外的分析可提供足以確定個體對具體治療方案的響應(yīng)或確定候選劑在癌癥治療中的效力的數(shù)據(jù)。因此，本發(fā)明提供了通過如本文所述檢測個體的CTC和分析檢測到的CTC，確定個體對具體治療方案的響應(yīng)或確定候選劑在癌癥治療中的效力的方法。例如，一旦藥物治療被給予患者，就可利用本發(fā)明的方法確定藥物治療的效力。例如，可利用本發(fā)明的方法處理在藥物治療前取自患者的樣本以及與藥物治療同時或在藥物治療后取自患者的一個或多個細(xì)胞樣本。通過比較各處理樣本的分析結(jié)果，可確定藥物治療的效力或患者對該劑的響應(yīng)。在這種方式下，可對無效化合物進(jìn)行早期鑒定，或可對有前景的化合物進(jìn)行早期確認(rèn)。提供對候選化合物的臨床活性的了解的四種重要指示劑包括HER2、EGFR、CXCR4和EphB4RTK。HER2通過確定mRNA穩(wěn)定性和HER2轉(zhuǎn)錄體的亞細(xì)胞定位提供細(xì)胞惡性的指示劑。EGFR對獲得突變的抗性和/或獲得的突變提供候選化合物——除可與候選化合物聯(lián)合應(yīng)用的可能替代化合物外——活性的重要指示劑。對鉬引起的DNA修復(fù)干擾水平的評估提供了對CXCR4標(biāo)記狀態(tài)和轉(zhuǎn)移性條件的了解。此外，對EphB4受體酪氨酸激酶狀態(tài)的評估提供了對該細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛力的了解。因此，利用本發(fā)明的方法，可通過經(jīng)常采集血液樣本和確定各樣本中循環(huán)上皮細(xì)胞例如CTC的數(shù)量作為時間的函數(shù)監(jiān)測服用這種候選藥物的患者。對Her2、EGFR、CXCR4和EphB4RTK指示劑的進(jìn)一步分析提供關(guān)于癌癥病理和候選藥物效力 的信息。類似地，ERRCl、細(xì)胞角蛋白、PSA、PSMA, RRM1、雄激素受體、雌激素受體、黃體酮受體、IGFl、cMET、EML4等提供了對候選化合物臨床活性的了解。對這些臨床活性指示劑的分析可通過分析本文所述可檢測標(biāo)記(例如，免疫組織化學(xué)和熒光原位雜交(FISH))或進(jìn)一步通過技術(shù)如測序、基因分型、基因表達(dá)或其他分子分析技術(shù)分析進(jìn)行。CTC分析提供了確定具體臨床試驗(yàn)的候選個體的方法。例如，可分析檢測到的候選CTC以確定特定標(biāo)記是否存在，從而確定具體臨床追蹤治療方案是否可能成功。因此，在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了確定臨床試驗(yàn)候選個體的方法。該方法包括檢測本文所述個體的CTC。然后可分析CTC以確定候選個體是否適于該具體臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)過程中的CTC分析將提供關(guān)于患者是否對實(shí)驗(yàn)藥物有反應(yīng)的信息，其中暴露的CTC無顯著變化或減少表示有反應(yīng)，暴露的CTC增加表示反應(yīng)弱。增加或減少可以是2倍、10倍或更高。該信息是藥物效力的早期指示劑，并且可被研究人員用作臨床試驗(yàn)的第二終點(diǎn)。下列實(shí)施例意為示例而非限制本發(fā)明。實(shí)施例ICTC亞群的CTC分析和鑒定本文所示數(shù)據(jù)證明本發(fā)明的方法，其被用于CTC和CTC亞群，如本文限定的HD-CTC。分析通過解決分析可罪性和穩(wěn)固性的有如景的受:控方案和用Cellsearch 進(jìn)行拆分樣本比較進(jìn)行。在該技術(shù)確認(rèn)后，本分析被用于考察轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌患者以及正常對照的CTC和特定CTC亞群的發(fā)生率和流行率。通過分析靶向的特定CTC亞群要求細(xì)胞(一個或多個)具有完整的核、表達(dá)細(xì)胞角蛋白而非CD45，在形態(tài)上區(qū)別于周圍的血液白細(xì)胞(WBC)，并具有與適于下游分析的完整惡性上皮細(xì)胞一致的細(xì)胞學(xué)特征。應(yīng)用下列方法和方案?；颊吆脱簶颖臼占缦逻M(jìn)行。將樣本從轉(zhuǎn)移性癌癥患者收集于抗凝固血液管中，其在 IRB 批準(zhǔn)的協(xié)議下于 Scripps Clinic, University of California, San Diego (圣地亞哥)，和 Billings Clinic, University of California, San Francisco (舊金山)進(jìn)行。將來自非局部位點(diǎn)的樣本(UCSF，Billings Clinic)連夜運(yùn)送，使得樣本在24小時內(nèi)被接收和處理。保持來自局部位點(diǎn)的樣本(Scripps Clinic and UCSD)在室溫16-24小時以模擬來自非局部位點(diǎn)的樣本。同樣從來自TSRI正常血液捐獻(xiàn)服務(wù)站(TSRI Normal BloodDonor Service)的正常對照提取血液樣本。HD-CTC檢測的血液樣本處理如下進(jìn)行。在利用Hemocue 血液白細(xì)胞系統(tǒng)(HemoCue, Sweden)測量血液白細(xì)胞(WBC)數(shù)量前將血液樣本晃動5分鐘?；赪BC數(shù)量，一定體積的血液經(jīng)過紅細(xì)胞溶解(氯化銨溶液)。離心后，將有核細(xì)胞重新懸浮于PBS中，并以單層粘附在常規(guī)制造的玻璃玻片(Marienfeld，Germany)上。該玻璃玻片與標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡玻片大小相同，但具有專有涂層，該涂層允許最大限度保留活細(xì)胞。各玻片可容納約3百萬個有核細(xì)胞，因此每個玻片鋪平的細(xì)胞數(shù)取決于患者WBC數(shù)量。將足夠的血液裂解以產(chǎn)生15個玻片，并隨后在添加細(xì)胞防腐劑后將細(xì)胞干燥在玻片上。將全部15個玻片儲存于-80°C至少24小時。對于本研究的癌癥患者HD-CTC檢測，4個玻片被用作測試。將剩余的對于各患者 產(chǎn)生的玻片儲存于_80°C用于以后的實(shí)驗(yàn)。解凍各患者的4個玻片，然后將細(xì)胞用2%多聚甲醛固定，用冷甲醇滲透，并用山羊血清阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。隨后用單克隆抗泛細(xì)胞角蛋白抗體(Sigma)和⑶45-Alexa 647(Serotec)溫育玻片。經(jīng)PBS洗漆后,用Alexa Fluor555山羊抗鼠抗體(Invitrogen)溫育玻片。將細(xì)胞用DAPI復(fù)染,并用水固定介質(zhì)固定。成像和技術(shù)分析如下進(jìn)行。用常規(guī)制造的熒光掃描顯微鏡掃描各患者的全部4個玻片，該熒光掃描顯微鏡已被開發(fā)和優(yōu)化用于快速可靠的掃描。在本報(bào)告中一臺掃描儀被用于所有患者樣本，從而使結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。此外，在掃描過程中每周校準(zhǔn)光源，并建立算法以標(biāo)準(zhǔn)化各患者玻片上各熒光基團(tuán)暴露。將各玻片以3色以IOX放大整體掃描，并生成超過6900個圖像。將生成的圖像送至分析算法，該分析算法基于多種測量確定可能候選的HD-CTC，該多種測量包括細(xì)胞角蛋白強(qiáng)度、CD45強(qiáng)度以及核和細(xì)胞質(zhì)形狀和大小。然后技術(shù)分析人員檢查算法生成的可能候選并去除明顯不是細(xì)胞的命中(hit)，如染料聚集體。專業(yè)分析和解釋如下進(jìn)行。將所有可能候選的CTC展示給造血病理醫(yī)師以通過基于網(wǎng)絡(luò)的報(bào)告進(jìn)行分析和解釋，其中病理醫(yī)師能夠?qū)⒏骱蜻x細(xì)胞包括或排除為HD-CTC。細(xì)胞被分類為HD-CTC，如果其為細(xì)胞角蛋白陽性，⑶45陰性，包含完整的DAPI核而沒有可識別的凋亡變化(起泡，退化的表觀)或被破壞的表觀，并且在形態(tài)上區(qū)別于周圍的血液白細(xì)胞(通?；谛螤畹奶卣?，雖然有時完全基于大小)。其必須具有細(xì)胞質(zhì)，該細(xì)胞質(zhì)明顯是圓周的，并且其中包含完整的核。細(xì)胞質(zhì)可顯示凋亡變化如起泡和無規(guī)律的密度或外周細(xì)胞質(zhì)邊界輕度破壞，但必須不被破壞到其與核的關(guān)聯(lián)成為問題。圖像表現(xiàn)為具有單熒光通道觀察能力的數(shù)碼圖像和復(fù)合圖像。各細(xì)胞圖像以輔助統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)注釋，該輔助統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)涉及相對核大小、熒光強(qiáng)度和相對熒光強(qiáng)度。各候選HD-CTC連同充足的周圍WBC呈現(xiàn)于視野中，從而允許所討論的細(xì)胞相對于背景血液白細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)特征之間的環(huán)境比較。細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)如下進(jìn)行。將來自捐獻(xiàn)者的4等份(各2ml)添加不同數(shù)量的SKBR-3細(xì)胞，從而生成4個玻片，每個玻片具有約300、100、30和10個癌細(xì)胞。然后由一個操作人員根據(jù)HD-CTC樣本制備方案處理和分析16個玻片。一個儀器被用于對全部16個玻片進(jìn)行成像。
HD-CTC分類將HD-CTC定義為這樣的細(xì)胞a)細(xì)胞角蛋白陽性(強(qiáng)度>6倍有核血液白細(xì)胞的細(xì)胞角蛋白強(qiáng)度);b) CD45陰性(強(qiáng)度最低為全部細(xì)胞事件的2%) ；c)包含完整的非凋亡表觀核——通過DAPI成像；和d)在形態(tài)上區(qū)別于正常WBC。HD-CTC形態(tài)評估的入選要求包括I)核大小比周圍WBC核的平均值大30% ;和2)圓周狀細(xì)胞角蛋白陽性細(xì)胞質(zhì)，具有比周圍有核WBC大600%的平均強(qiáng)度。通常雖非必需的HD-CTC特征包括相當(dāng)大的核直至周圍WBC核平均大小的5倍；核周線，區(qū)別于周圍的WBC核，包括伸長；大細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，具有常常偏心的分布和/或多邊形或細(xì)長形的細(xì)胞質(zhì)形狀；和成對HD-CTC以及3個或更多HD-CTC的簇。其他細(xì)胞狀物質(zhì)——細(xì)胞角蛋白陽性，CD45陰性，并包含核，但不符合入選標(biāo)準(zhǔn)，例如與WBC大小相同或具有非圓周狀的細(xì)胞質(zhì)——不被作為HD-CTC計(jì)數(shù)，但由分析追蹤。本方法的目的是具有嚴(yán)格的特定CTC表型入選標(biāo)準(zhǔn)，同時保留關(guān)于僅滿足其中一些要求但仍可具有臨床意義的事件一如凋亡腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞片段或進(jìn)行上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞——的數(shù)據(jù)。結(jié)果
利用添加(Spike-in)實(shí)驗(yàn)的分析線性和敏感度為測試分析線性和敏感度，范圍在10至300個乳腺癌細(xì)胞系SKBR3的具體稀釋液被加入正常對照血液。實(shí)驗(yàn)一式四份進(jìn)行，并根據(jù)方法章節(jié)所述的HD-CTC分析進(jìn)行處理和分析。將平均SKBR3觀察值相對于預(yù)期SKBR3作圖，并顯示相關(guān)系數(shù)(R2)O. 9997 (圖I)。癌癥患者HD-CTC數(shù)量的分析穩(wěn)固性針對多個處理器和拆分樣本測試HD-CTC分析的分析穩(wěn)固性。重復(fù)測試由兩個單獨(dú)的處理器對9個不同的患者樣本進(jìn)行。兩個處理器之間利用拆分樣本進(jìn)行的HD-CTC/mL數(shù)量比較具有0. 979的相關(guān)系數(shù)(R2)(圖3)。所有數(shù)據(jù)均由一個對實(shí)驗(yàn)不知情的操作人員分析。正常對照樣本的分析特異性對15位來自公共健康捐獻(xiàn)庫(institutionalhealthy donor pool)的健康捐獻(xiàn)者進(jìn)行評價(jià)作為對照群,其由8位女性和7位男性組成，年齡范圍在24至62歲。在除了一個外的全部健康對照中，這種事件的數(shù)量在針對體積進(jìn)行校正時為lHD-CTC/ml或更少。離群者為健康的女性捐獻(xiàn)者，其具有4/ml的HD-CTC數(shù)?；趯ζ浼?xì)胞的明確審查，其約三分之一非常符合所有入選標(biāo)準(zhǔn)，而剩余的三分之二符合所有標(biāo)準(zhǔn)，但一個或多個標(biāo)準(zhǔn)接近入選下限。另外4個健康捐獻(xiàn)者具有l(wèi)HD-CTC/ml。對這些細(xì)胞的明確審查顯示類似的特征，即約三分之一非常符合所有標(biāo)準(zhǔn)，而剩余的三分之二細(xì)胞符合標(biāo)準(zhǔn)，但一個或多個標(biāo)準(zhǔn)接近入選下限。接近入選下限的入選事件實(shí)例是通過形態(tài)評價(jià)測量比周圍WBC大30%但沒有表現(xiàn)出顯著增大的細(xì)胞；和略微離焦并可具有目視不可檢測的凋亡核變化的細(xì)胞，并且最終，具有截止以上的客觀細(xì)胞角蛋白強(qiáng)度測量結(jié)果但通過單通道熒光檢查主觀上不表現(xiàn)出明顯亮于周圍WBC的偶有細(xì)胞。表I :HD-CTC 分析與CeHsearch 的比較
權(quán)利要求
1.檢測個體樣本中的細(xì)胞的方法，包括 a)提供懷疑具有至少ー種稀有細(xì)胞和至少ー種以所述稀有細(xì)胞濃度的至少10倍的濃度存在的細(xì)胞的樣本； b)使所述樣本與至少ー種可檢測劑接觸； c)對(b)所述樣本進(jìn)行細(xì)胞成像，生成細(xì)胞圖像；和 d)通過由(C)所述圖像分析所述細(xì)胞，相對于所述樣本中的其他細(xì)胞檢測所述至少ー種稀有細(xì)胞，從而檢測所述樣本中的所述稀有細(xì)胞。
2.權(quán)利要求I所述的方法，進(jìn)ー步包括(a’)，其中將所述至少一種稀有細(xì)胞和至少ー種非稀有細(xì)胞附于玻片。
3.權(quán)利要求I所述的方法，其中(d)在包括用于進(jìn)行所述分析的可執(zhí)行代碼的計(jì)算機(jī)中進(jìn)行。
4.權(quán)利要求3所述的方法，進(jìn)ー步包括(e)，其中(d)的結(jié)果呈現(xiàn)于圖形用戶界面。
5.權(quán)利要求I所述的方法，其中(c)所述細(xì)胞成像進(jìn)ー步包括優(yōu)化所述至少一種可檢測劑的曝光限值。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述至少一種可檢測劑的曝光限值是利用至少ー種非稀有的信號確定的。
7.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述至少一種可檢測劑結(jié)合細(xì)胞標(biāo)記，并選自陽性標(biāo)記、陰性標(biāo)記、核標(biāo)記、含量標(biāo)記及其任意組合。
8.權(quán)利要求5所述的方法，其中在生成所述圖像前優(yōu)化所述曝光限值。
9.權(quán)利要求5所述的方法，其中在生成所述圖像后優(yōu)化所述曝光限值。
10.權(quán)利要求5所述的方法，進(jìn)ー步包括(c’)，其中所述樣本在進(jìn)行(d)前再次成像。
11.權(quán)利要求I所述的方法，其中(c)所述細(xì)胞成像進(jìn)ー步包括優(yōu)化曝光時間以減少數(shù)據(jù)收集時間。
12.權(quán)利要求I所述的方法，其中利用來自所述至少ー種細(xì)胞的信號來確定性質(zhì)對照參數(shù)。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述性質(zhì)對照參數(shù)是至少一種細(xì)胞在所述玻片上的分布。
14.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述性質(zhì)對照參數(shù)是多細(xì)胞圖像的比對。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述至少ー種可檢測劑是陰性標(biāo)記和核標(biāo)記，并且通過將各自存在于不同圖像的所述核標(biāo)記的信號與所述陰性標(biāo)記的信號進(jìn)行比對來確定所述比對。
16.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述性質(zhì)對照參數(shù)是細(xì)胞染色性質(zhì)。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述至少ー種可檢測劑是陰性標(biāo)記和核標(biāo)記，并且通過計(jì)算所述陰性標(biāo)記的信號與所述核標(biāo)記的信號的比來確定所述細(xì)胞染色性質(zhì)。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述比低于I.2。
19.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述至少ー種可檢測劑是陰性標(biāo)記，并且所述性質(zhì)對照參數(shù)是所述陰性標(biāo)記在整個所述非稀有細(xì)胞中的分布。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中利用平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)或其任意組合而計(jì)算所述分布。
21.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述至少ー種可檢測劑是陽性標(biāo)記，并且所述性質(zhì)對照參數(shù)是所述陽性標(biāo)記在整個所述非稀有細(xì)胞中的分布。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中利用平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)或其任意組合而計(jì)算所述分布。
23.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述性質(zhì)對照參數(shù)是細(xì)胞損失。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述至少ー種可檢測劑是核標(biāo)記或陰性標(biāo)記，并且通過計(jì)算所述核標(biāo)記的信號或所述陰性標(biāo)記的信號與所述玻片上非稀有細(xì)胞數(shù)量的比而確定細(xì)胞損失。
25.權(quán)利要求I所述的方法，其中(c)所述細(xì)胞成像進(jìn)ー步包括優(yōu)化強(qiáng)度限值以與其他細(xì)胞區(qū)分稀有細(xì)胞。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述至少ー種可檢測劑是陽性標(biāo)記，并且利用所述陽性標(biāo)記背景信號的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)或其任意組合來確定所述強(qiáng)度限值。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差或變異系數(shù)在整個玻片基礎(chǔ)上、單個玻片基礎(chǔ)上，單個玻片的區(qū)域上或其任意組合上確定。
28.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述至少ー種可檢測劑是陽性標(biāo)記，并且所述強(qiáng)度限值在單個圖像內(nèi)確定，這通過鑒定所述陽性標(biāo)記的最高信號，并將所述最高信號與由另外的陽性標(biāo)記的信號計(jì)算得到的標(biāo)準(zhǔn)偏差比較進(jìn)行。
29.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述強(qiáng)度限值等于5至20之間的因數(shù)乘以所述標(biāo)準(zhǔn)偏差并加到所述平均值。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述強(qiáng)度限值等于因數(shù)12.5乘以所述標(biāo)準(zhǔn)偏差并加到所述平均值。
31.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述強(qiáng)度限值等于因數(shù)15乘以所述標(biāo)準(zhǔn)偏差并加到所述平均值。
32.權(quán)利要求29所述的方法，其中計(jì)算各個樣本圖像的所述強(qiáng)度限值。
33.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述至少ー種可檢測劑是陰性標(biāo)記，并且利用來自非稀有細(xì)胞的所述陰性標(biāo)記的信號的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差來確定所述陰性標(biāo)記的所述強(qiáng)度限值。
34.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差在整個玻片基礎(chǔ)上，單個玻片基礎(chǔ)上，單個玻片的區(qū)域上或其任意組合上確定。
35.權(quán)利要求I所述的方法，其中(d)進(jìn)ー步包括測量所述至少一種細(xì)胞的細(xì)胞大小、至少ー種細(xì)胞的細(xì)胞大小分布或其組合；和將所述至少ー種細(xì)胞的所述細(xì)胞大小或細(xì)胞大小分布與已知的細(xì)胞大小和分布進(jìn)行比較。
36.權(quán)利要求I所述的方法，其中(d)所述分析進(jìn)ー步包括測量所述至少一種細(xì)胞的核大小、所述至少一種細(xì)胞的核大小分布、所述至少一種細(xì)胞的輪廓型式或其組合；和將所述核大小、核大小分布或輪廓型式與假定的稀有細(xì)胞比較以確定所述可疑的稀有細(xì)胞是稀有細(xì)胞。
37.權(quán)利要求I所述的方法，其中(d)所述分析進(jìn)ー步包括確定所述樣本所取的所述個體的流體中所述稀有細(xì)胞的濃度。
38.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述可檢測劑是含量標(biāo)記，并且(d)所述分析進(jìn)ー步包括確定所述含量標(biāo)記的表達(dá)水平。
39.權(quán)利要求36所述的方法，其中在所述至少一種稀有細(xì)胞和所述至少ー種細(xì)胞中確定所述含量標(biāo)記的表達(dá)水平，并與患者群的所述含量標(biāo)記的表達(dá)水平進(jìn)行比較。
40.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述稀有細(xì)胞是循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)。
41.權(quán)利要求40所述的方法，其中所述CTC表達(dá)陽性標(biāo)記，具有完整的核，并在形態(tài)上區(qū)別于正常WBC，其中所述CTC對陰性標(biāo)記不呈陽性。
42.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述陽性標(biāo)記是細(xì)胞角蛋白或EpCAM。
43.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述陰性標(biāo)記是⑶45。
44.權(quán)利要求40所述的方法，進(jìn)ー步包括向所述個體提供診斷或預(yù)后。
45.權(quán)利要求40所述的方法，其中已知所述個體患有癌癥并正在進(jìn)行癌癥治療。
46.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述治療是化學(xué)治療。
47.權(quán)利要求46所述的方法，其中利用含量標(biāo)記來確定化學(xué)治療劑。
48.權(quán)利要求44所述的方法，其中給予所述個體候選劑。
49.權(quán)利要求44所述的方法，進(jìn)ー步包括確定所述個體對所述癌癥治療的響應(yīng)。
50.診斷或預(yù)后個體癌癥的方法，包括 a)實(shí)施權(quán)利要求40所述的方法；和 b)分析檢測到的CTC以提供診斷或預(yù)后，從而診斷或預(yù)后個體癌癥。
51.確定個體對治療方案的響應(yīng)的方法，包括 a)實(shí)施權(quán)利要求40所述的方法；和 b)分析檢測到的CTC，從而確定所述個體對治療方案的響應(yīng)。
52.權(quán)利要求51所述的方法，其中所述治療方案基于b)的所述結(jié)果而變化。
53.確定用于臨床試驗(yàn)的候選個體的方法,包括 a)實(shí)施權(quán)利要求40所述的方法；和 b)分析檢測到的CTC,從而確定用于臨床試驗(yàn)的候選個體。
全文摘要
本發(fā)明提供了開創(chuàng)性的計(jì)算方法，其利用非稀有細(xì)胞數(shù)據(jù)來檢測稀有細(xì)胞，如循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)。本發(fā)明可用于CTC檢測的兩個不同階段；第一是作出關(guān)于數(shù)據(jù)收集參數(shù)的決定，第二是在數(shù)據(jù)縮減和分析中作出決定。此外，本發(fā)明在作出決定的過程中利用一維和多維參數(shù)化的數(shù)據(jù)。
文檔編號G01N33/574GK102782498SQ201080057853
公開日2012年11月14日 申請日期2010年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月21日
發(fā)明者A·考拉特卡, D·馬里努茨, J·R·史圖爾普納格, J·坤肯, P·昆, X·楊 申請人:Epic 科學(xué)公司, 斯克里普斯研究所