專利名稱：結(jié)合內(nèi)外校準法的分析物定量多重微陣列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于分析物定量的多重微陣列和方法，尤其是，本發(fā)明涉及改進的方法，該方法針對內(nèi)部參考標準化曲線和從已知參考標準獲得的標準化曲線來對分析物濃度進行標準化。本發(fā)明還涉及對用于確定正?；瘶藴屎涂刂频闹眯哦冗M行同時測量的方法和校驗。
背景技術(shù)：
生物標記是可被測量和評價的特性，作為有機體的生物狀態(tài)的指示劑。在醫(yī)學中，生物標記可以是外生的物質(zhì)，其被引入到患者體內(nèi)以檢查生物過程，比如器官功能及生物化學機能和路徑。生物標記也可以是從患者處獲得的生物分子，比如蛋白質(zhì)或核酸，其表示具體的疾病狀態(tài)或者對藥物治療的反應。這樣的生物化學生物標記在新藥的發(fā)現(xiàn)和研發(fā)中也是特別有用的。在這些藥物的早期臨床研究期間，合適的生物標記的量化可以潛在地幫助研究人員更快速地識別最有希望的候選藥物，因此精簡了藥物開發(fā)過程。與疾病有關(guān)的生物標記還可用于疾病的診斷和預后，并用作對療效的測定。因此，這對于識別和驗證新的生物標記(其可以用于評估患者的健康和/或?qū)χ委熃槿氲捻憫?以及提供用于已知生物標記的準確且可復制的確定的方法是非常重要的。生物標記分析高度地依賴于諸如抗體的試劑的完整性，該試劑本身是從生物源得到的并因此可能受到質(zhì)量控制和穩(wěn)定性因素的影響。在許多生物標記分析過程中使用了未核準的標準，比如重組蛋白質(zhì)和替代矩陣，從而導出校準曲線。因此，需要進行平行研究，其中對替代矩陣中組成的一定范圍的校準標準濃度的分析的響應是與對一系列患者樣本稀釋液的分析的響應相當?shù)摹Ｏ♂尵€性度也可能存在問題，因為抗體和配體結(jié)合的親和力可以在不同的介質(zhì)中有很大變化。生物標記分析的開發(fā)和鑒定的目的是為了開發(fā)用于臨床獲益的分析?；谀繕丝乖目贵w的結(jié)合特異性，諸如酶聯(lián)免疫吸附測定(“ELISA”)的免疫分析在本領(lǐng)域中是眾所周知的(參見例如，Engvall等人，免疫化學，1971年，8卷，第871頁；Ljunggren等人,免疫方法雜志，1987年,88卷，第104頁；Kemeny等人,當代免疫學，1986年，7卷，第67頁)。免疫分析對于識別新的生物化學生物標記，比如蛋白質(zhì)或核酸，以及量化已知的生物標記是非常有用的，因為可針對特定的生物標記而產(chǎn)生抗體。通過免疫分析定量確定生物標記的方法的實例在本領(lǐng)域中是已知的。參見例如，Hawkes等人，生物化學分析，1982年，119卷，第142-147頁，和Tobin和Gordon，免疫方法雜志，1984年，72卷，第313-340頁，和Gordon等人的序號為5，486，452、名稱為“用于免疫分析的裝置和工具”的美國專利。以前所采用的免疫分析方法易于受到限制，因為其在每個測試周期中只能在單個反應容器內(nèi)檢測一個目標分析物。已經(jīng)通過將探針分子(例如抗體)附著至固體基底(例如盤上的珠子或孔)、然后將測試樣本、緩沖液和試劑溶液布滿固體基底進行了嘗試，以減少完成每個測試周期的時間，并增加在每個周期中所完成的測試的量。
微陣列是一種裝置，其中大量(例如數(shù)百至數(shù)千)的比如DNA和蛋白質(zhì)的生物分子的樣本被附著或固定于適合的未反應基底表面，比如塑料(例如聚丙烯、聚苯乙烯、環(huán)烯)、硅樹脂和玻璃。如果基底表面相對平直，生物分子可以被“印刷”到表面上，由此通過應用含有已知濃度生物分子的已知體積的“測定點位”的緩沖液來實施印刷。使用固定于已知基底或基底表面上的已知位置的生物分子，基底表面可以被暴露于生物化學/化學試劑，以用于檢測、定性和定量分析的目的。例如，微陣列可以用于實施ELISA型免疫分析，其中固定于基底的生物分子為抗體，然后基底表面被暴露于含有抗原(其上可結(jié)合抗體)的測試溶液。然后可用緩沖溶液布滿基底表面并使其暴露于第二抗體，該第二抗體要么與可檢測標簽(例如放射性標簽或熒光染料)配對，要么與酶(該酶對反應進行催化，對該反應的反應產(chǎn)物進行染色且因此可被檢測到)配對。因此微陣列容許大量樣本的高通量分析。同時，已經(jīng)開發(fā)了計算機軟件程序來分析從微陣列中產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)。

微陣列的大量實例和對由微陣列所提供的數(shù)據(jù)進行處理的方法在本領(lǐng)域中是已知的。參見例如Ghandour等人的序號為6，516，276、名稱為“用于對來自生物分子陣列的數(shù)據(jù)進行分析的方法和設備”的美國專利，Shah的序號為6，916，621、名稱為“用于基于陣列的比較結(jié)合測定的方法”的美國專利，和Minor的序號為7，072，806、名稱為“用于橫跨多個平臺進行數(shù)據(jù)值比較的方法和系統(tǒng)”的美國專利。典型地，若干抗原物質(zhì)或生物標記是與包括疾病的生物過程的檢測和診斷相關(guān)聯(lián)的。為了確定多個生物標記的存在，將需要對測試樣本中的每個標記實施單獨的免疫分析。這大大增加了分析給定測試樣本的時間量，并產(chǎn)生了其它的問題，比如隨著必須實施每一項分析而增加的增大的成本和增大的實驗誤差。因此，希望識別和采用生物標記的定量確定方法，其容許對多個抗原或生物標記同時進行檢測和定量測量，即“多重”檢測和確定。由于微陣列容許同時、多重的生物化學分析，微陣列可適用于執(zhí)行多重分析物的檢測。為了增加現(xiàn)有微陣列的容量，已開發(fā)了“多重”微陣列，其中多個不同的探針生物分子存在于同一個微陣列中。這容許用戶檢測和分析測試樣本中多于一個的目標分析物。這對于多個生物標記的組織液/體液樣本的高通量篩選尤其有用，其可以用于檢測和診斷包括病原和生理功能紊亂的生物過程。在使用微陣列時可產(chǎn)生大量的問題，包括難于獲得準確定量化分析和重現(xiàn)性。在試圖進行多重檢測時，這類問題將更顯著。在已被固定至微陣列表面的生物分子之間可產(chǎn)生交叉雜交。另外，在印刷過程中，并不是所有期望量的生物分子都可以附著至基底表面。例如，在較平直的基底表面的情況下，在基底表面上可以存在生物分子量的不均勻印刷，其會影響量化分析的準確性。而且，在分析過程中，在應用和移除分析試劑時，未知量的生物分子可以被沖掉。因此，在分析過程中基底表面上給定位置內(nèi)的生物分子的實際量可能小于理論印刷量，即基于測試點位緩沖液的已知濃度和應用于表面的測試點位緩沖液的體積所計算得到的量。然而，現(xiàn)有技術(shù)中對測試樣本內(nèi)的分析物量進行量化的方法不考慮固定在微陣列上的生物分子的理論量和實際量之間的差異。因此，需要開發(fā)一種對微陣列中獲得的數(shù)據(jù)進行標準化的方法，以使微陣列方法中固有的實驗誤差最小化，比如，這種誤差可能是由于基于涂層/測試點位緩沖液濃度的微陣列基底表面上的生物分子的理論濃度和存在于基底表面上的生物分子的實際濃度之間的差異。另外，由于多重微陣列的單個測試周期可提供來自多個分析或多批標準的數(shù)據(jù)，需要比較多個分析或多批標準的方法，使得不同分析或標準之間的轉(zhuǎn)換值成為可能，并提供覆蓋所有這些分析的參考基礎。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的廣闊方面，提供了一種用于對測試樣本中一個或多個分析物進行量化的方法，其包括(a)提供多個離散反應基底，每個反應容器具有印制在其上的微陣列，所述微陣列包括含有多個校準點的校準矩陣，每個校準點含有預定量的校準化合物，其中每個校準點對應于所述校準化合物的理論濃度；和分析物捕捉矩陣，其包含多個捕捉點，每個捕捉點含有預定量的試劑，所述試劑可選擇地結(jié)合至所述分析物；(b)將預定體積的測試樣本應用于所述離散反應基底中的一個；(C)提供多個參考標準，每個參考標準具有已知濃度且每個參考標準含有預定量的每個所述分析物；(d)將預定體積的每個參考標準應用于所述離散反應基底中的一個；(e)在來自步驟(b)和步驟(d)的每個離散反應基底上(i)應用被標記的報告化合物，其中所述被標記的報告化合物提供可測量的信號強度，所述信號強度與結(jié)合至每個點的分析物或者校準化合物的量成正比；(ii)測量所述微陣列內(nèi)的每個點的信號強度值；(iii)對步驟(b)中的反應基底生成第一校準曲線，并對步驟(d)中的反應基底生成第二校準曲線，在每種情況下，所述校準曲線是通過將曲線與圖表進行擬合而制備的，所述圖表將信號強度值與校準化合物理論濃度進行對比；(iv)使用所述第一校準曲線，確定所述測試樣本的第一分析物當量濃度，并且使用所述第二校準曲線，確定每個所述參考標準的第二分析物當量濃度；(f)通過將曲線與圖表進行擬合來生成參考標準化曲線，所述圖表將所述第二分析物當量濃度與每個參考標準的已知濃度進行對比；和(g)使用所述參考標準化曲線，對所述測試樣本的第一分析物當量濃度進行標準化，以獲得修正后的分析物濃度。在如上面提供的方法的實施例中，在步驟(e (iii))中，所述第一和第二校準曲線通過以下生成( I)在校準矩陣中，如果所述校準矩陣含有兩個或多個校準點，且該校準點為對應于所述校準化合物的常用理論濃度的復制點，則將每個復制校準點的測量信號強度值標準化為每個所述校準點的平均測量信號強度值；和(2)將曲線與圖表進行擬合，所述圖表將每個所述校準點的平均測量信號強度值與每個校準標準的對應的理論濃度進行對比。 在如上面所提供方法的另一個實施例中，在步驟(e (iv))中，所述測試樣本或者參考標準中的分析物的濃度是由以下確定的(3)在步驟(b)和步驟(d)中的每個反應基底的分析物捕捉矩陣中，如果分析物捕捉矩陣含有兩個或多個作為復制的捕捉點，將每個復制的捕捉點的測量信號強度值標準化為平均測量信號強度值，并且將每個點的測量信號強度值標準化為每個所述捕捉點的平均測量信號強度值；和(4) (i)使用步驟(b)中的反應基底的每個所述捕捉點的平均測量信號強度值和所述第一校準曲線，計算所述測試樣本中的分析物的濃度；和( ii )使用步驟(d)中的反應基底的每個所述捕捉點的平均測量信號強度值和所述第二校準曲線，計算每個所述參考標準中的分析物的濃度。通過采用Tukey Biweight算法來實施對校準矩陣和樣本捕捉矩陣的每個點的測量信號強度值的標準化。在本發(fā)明的方法的一個實施例中，分析物捕捉矩陣的點的總數(shù)至少等于校準矩陣的點的總數(shù)。在所述方法的另一個實施例中，存在3至20個之間的對應于線性稀釋液系列 的分析物的不同理論濃度。在所述方法的另一個實施例中，對于校準標準的每個理論濃度，存在3至15個之間的點。在本發(fā)明的一個實施例中，被標記的報告化合物為熒光標記的抗體。在本發(fā)明的另一個實施例中，多個反應基底采取多孔化驗板的形式。在本發(fā)明的又一個實施例中，多個反應基底采取多個珠子的形式。在本發(fā)明的另一個實施例中，測試樣本為生物樣本。在本發(fā)明的另一方面中，提供了根據(jù)上述任一實施例的方法的應用，其中生物樣本是從患者處獲得的，所述應用包含以下任一種(a)監(jiān)測所述患者疾病的進展；(b)測量對所述疾病的治療效果；和(c)在所述疾病的所述治療期間，測量所述患者的藥物的濃度；其中,有待量化的一個或多個分析物為表示所述疾病的生物標記。在本發(fā)明的又一方面中，提供了一種用于診斷對象的類風濕性關(guān)節(jié)炎的、根據(jù)上述實施例的方法的應用，其包括(I)在從所述對象處獲得的生物樣本中，測量類風濕因子-IgA、類風濕因子-IgG和類風濕因子-IgM中的每一個的濃度水平；和選自由抗環(huán)瓜氨酸肽-IgG、抗環(huán)瓜氨酸肽-IgA和抗環(huán)瓜氨酸肽-IgM構(gòu)成的組中的至少一個抗環(huán)瓜氨酸肽抗體的濃度水平，其中，提供了用于類風濕因子-IgA、類風濕因子-IgG和類風濕因子-IgM中的每一個和所述至少一個選定的抗環(huán)瓜氨酸肽抗體的已知濃度的參考標準；和(2) (i)將類風濕因子-IgA、類風濕因子-IgG和類風濕因子-IgM中的每一個的測量濃度水平與類風濕因子-IgA、類風濕因子-IgG和類風濕因子-IgM的對應指標正常水平進行比較，和(ii)將選定的抗環(huán)瓜氨酸肽抗體的測量濃度水平與選定的抗環(huán)瓜氨酸肽抗體的對應指標正常水平進行比較；其中，將超過指標正常水平的上述生物標記的任何測量濃度水平診斷為類風濕性關(guān)節(jié)炎。
在本發(fā)明的另一方面中，提供了一種根據(jù)上述實施例的方法的應用，其用于監(jiān)測患有類風濕性關(guān)節(jié)炎的對象的類風濕性關(guān)節(jié)炎的治療，其包含測量以下濃度水平類風濕因子-IgA、類風濕因子-IgG和類風濕因子-IgM的濃度水平；和選自由抗環(huán)瓜氨酸肽-IgG、抗環(huán)瓜氨酸肽-IgA和抗環(huán)瓜氨酸肽-IgM構(gòu)成的組中的至少一個抗環(huán)瓜氨酸肽抗體的濃度水平。在治療期間，對上述生物標記的濃度水平的測量被實施多次。在用于診斷類風濕性關(guān)節(jié)炎和/或監(jiān)測類風濕性關(guān)節(jié)炎的治療的方法的上述應用的另一個實施例中，所述微陣列包括校準矩陣，所述校準矩陣包含多個含有預定量的校準化合物的點，每個點對應于校準化合物的理論濃度；第一分析物捕捉矩陣，其包含多個含有預定量的類風濕因子的點；和第二分析物捕捉矩陣，其包含多個含有預定量的環(huán)瓜氨酸肽的點。在用于診斷類風濕性關(guān)節(jié)炎和/或監(jiān)測類風濕性關(guān)節(jié)炎的治療的上述方法的應用的又一個實施例中，所述微陣列還包含以下中的一個或多個 (i)正控制矩陣，其包含多個含有預定量的IgA或其碎片、預定量的IgG或其碎片和預定量的IgM或其碎片的點；(ii)負控制矩陣，其包含多個不含以下的點與被標記的報告化合物相互作用的任何化合物；任意可選擇地結(jié)合至以下選自由類風濕因子-IgA、類風濕因子-IgG和類風濕因子-IgM構(gòu)成的組中的任何一個的化合物；和任意可選擇地結(jié)合至以下選自由抗環(huán)瓜氨酸肽-IgG、抗環(huán)瓜氨酸肽-IgA和抗環(huán)瓜氨酸肽-IgM構(gòu)成的組中的任何一個的化合物；和(iii)樣本控制矩陣，其包含多個含有試劑的點，所述試劑可選擇地結(jié)合有與所述生物樣本相關(guān)的分析物，其中，所述分析物為在所述生物樣本中自然產(chǎn)生的化合物或者為添加到所述生物樣本中的外來化合物；具有以下附加條件所述分析物不是類風濕因子-IgA、類風濕因子-IgG、類風濕因子-IgM、抗環(huán)瓜氨酸肽-IgG、抗環(huán)瓜氨酸肽-IgA或抗環(huán)瓜氨酸肽-I gM。當使用根據(jù)上述實施例的本發(fā)明的方法來診斷或治療類風濕性關(guān)節(jié)炎時，該方法可以在多孔化驗板上實施，其中化驗板的孔包括如上所述的微陣列，且其中多孔化驗板包含一個或多個置信度確認標準化標準和控制。可選地，該方法可以在多個珠子上完成，其中單個珠子包含如上所述的微陣列，且其中多個珠子包含一個或多個置信度確認標準化標準和控制。在用于診斷類風濕性關(guān)節(jié)炎和/或監(jiān)測類風濕性關(guān)節(jié)炎治療的方法的上述使用的另一個實施例中，所述多個反應基底(其要么可以是上述多孔化驗板的一個或多個單獨的孔，要么是上述多個珠子中的一個或多個珠子)可進一步包含一個或多個以下控制*用于類風濕因子-IgA、類風濕因子-IgG、類風濕因子-IgM中的每一個的至少一個正控制；和用于所述被選擇的抗環(huán)瓜氨酸肽的至少一個正控制；*用于類風濕因子-IgA、類風濕因子-IgG、類風濕因子-IgM中的每一個的至少一個負控制；和用于所述被選擇的抗環(huán)瓜氨酸肽的至少一個負控制；*用于類風濕因子-IgA、類風濕因子-IgG和類風濕因子-IgM的參考標準中的每一個的至少一個正控制；和用于所述被選擇的抗環(huán)瓜氨酸肽的每個參考標準的至少一個正控制；
*用于確定矩陣定位、矩陣旋轉(zhuǎn)、矩陣位移和每個陣列的點數(shù)的一個或多個結(jié)構(gòu)控制；*用于確定復制信號強度的一個或多個復制控制；*用于血清確定、背景信號和液體體積轉(zhuǎn)移確定的一個或多個過程控制；*用于確定內(nèi)校準曲線的一個或多個結(jié)構(gòu)控制；和*用于確定標準化曲線的一個或多個結(jié)構(gòu)控制。本發(fā)明的優(yōu)勢在于其提供了一種基于微陣列的、用于量化測試樣本中目標分析物的量的改進的方法，該方法修正了所應用的探針和校準標準的量的固有差異。該方法可以 用于測量單個反應容器內(nèi)的測試樣本中的一個或多個分析物。通過使用多重微陣列，該方法尤其對準確量化測試樣本中的多個目標分析物的量是有用的。本發(fā)明的另一個優(yōu)勢在于其提供了一種更準確地量化生物樣本中與臨床相關(guān)的的生物標記以用于診斷或預后目的的方法。此處所公開的方法也可以用于更準確地監(jiān)測疾病的進程以及疾病治療的效果。從下面結(jié)合所附附圖對其實施例的詳細描述中，本發(fā)明的其它和進一步的優(yōu)勢和特點對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。


根據(jù)下面參考附圖而對本發(fā)明實施例的詳細描述，將會進一步理解本發(fā)明，其中圖I是例示了用于實施多重分析的初始校準和參考標準化步驟的流程圖；圖2是包含多個點矩陣的多重微陣列的示意性圖解，所述點矩陣包括A_校準矩陣第一分析捕捉矩陣；C_第二分析捕捉矩陣；D_用于患者樣本的正控制矩陣；E_第一分析物正控制矩陣；F_負控制矩陣；G_第二分析物正控制矩陣；和H-第三分析物正控制測試矩陣；圖3是初始校準曲線，其是通過繪制被標準化的測量信號強度與12個不同濃度水平處的一系列校準標準的理論濃度的對比而制備的；圖4是參考標準曲線，其繪制了一系列校準標準的復制分析物當量濃度值(AEC2值)與以IU/ml或U/ml表示的已知參考標準濃度的對比，以及，使用所述參考標準曲線由測試點的AECl值(用箭頭表示)來確定修正后的目標分析物濃度；圖5是用于類風濕性關(guān)節(jié)炎的多重微陣列診斷分析的示例性圖解，其含有標記的一系列點矩陣。圖6是柱狀圖，其例示了測得的類風濕因子-IgA (RF-IgA)、類風濕因子-IgG(RF-IgG)、類風濕因子-IgM (RF-IgM)和抗環(huán)瓜氨酸肽-IgG(CCP-IgG)水平和其各自的臨床界限值。
具體實施例方式使用微陣列來檢測和量化測試樣本中，比如從患者處獲得的生物樣本中的目標分析物是公知的。典型地，用于量化測試樣本中目標分析物的量的過程涉及提供包含試劑(也被稱作“探針”)的微陣列，所述試劑可選地結(jié)合至目標分析物，其中探針首先被固定在微陣列的固體表面上(也被稱作“基底”)。在基底是相對平直的表面時，諸如多孔化驗板(也被稱作“微滴定板”或者“微型板”)的孔底部，通過制備含有已知濃度探針的測量點位溶液并且在表面上印刷預定體積的測量點位緩沖液而將探針固定到微陣列表面上，從而提供捕捉點(也被稱作“測試點”)，該捕捉點會結(jié)合測試樣本中的目標分析物(如果存在的話)。類似地，在基底為球形表面時，比如可以在通常用于生物化學分析的珠子上被發(fā)現(xiàn)的球形表面的基底，通過制備含有已知濃度探針的涂覆溶液并將珠子浸入到涂覆溶液中，可以將探針固定至珠子的表面上。已知濃度目標分析物的校準標準可用于構(gòu)建校準曲線的目的。所述校準標準也可以是具有與目標分析物類似的生物化學特性的替代化合物。在基底表面相對平直的實例中，以與含有用于目標分析物的探針的捕捉點相同的方式，可以將校準標準應用于微陣列，以形成“校準點”。因此，微陣列可含有被固定在微陣列的基底表面上的多個校準點，其每一個包括預定量的目標分析物或者替代化合物。提供了一種用于檢測結(jié)合至微陣列的分析物的量的報告系統(tǒng)。例如，通常使用的報告系統(tǒng)為可選擇地結(jié)合至分析物的熒光標記抗體。 通過將曲線與圖表進行擬合而生成校準曲線，該圖表將用于校準點(y軸)的標記報告物的測量信號強度與校準標準的理論濃度(X軸)進行對比。可以通過熟知的數(shù)學和統(tǒng)計方法，比如線性回歸來將曲線與圖表進行擬合。然后基于測得的捕捉點的信號強度，將校準曲線用于確定測試樣本中分析物的濃度，其中將測得的捕捉點的信號強度取為y值繪制在校準曲線上，且將測試樣本中的分析物濃度取為相應的X值。典型地，在印刷過程中，并不是所有的探針和校準標準都會附著至微陣列的基底表面。而且，在分析過程中，小的且未知量的探針和校準標準可以在應用和移除分析試劑期間被沖掉。因此，在分析過程中被固定至表面的探針或校準標準的實際量小于理論印刷量，即基于探針或校準標準在其各自的測量點位緩沖液中的已知濃度和應用于表面的測量點位緩沖液的體積而計算得到的量。然而，現(xiàn)有技術(shù)中用于量化測試樣本中的分析物的量的方法不考慮固定在微陣列上的探針和校準標準的理論量和實際量之間的差異?，F(xiàn)在提供了一種基于微陣列的、用于量化測試樣本中目標分析物的量的改進的方法，其修正了所應用的探針和校準標準的量中的這些固有差異。所述方法也可以用于多重微陣列，以測量在單個反應容器中的測試樣本中的多于一個的目標分析物。參考圖1，根據(jù)下面的描述，可以理解本文發(fā)明的方法的實施例。所述方法含有如圖I (“Fig. I”)例示的兩個階段。
為了實施如下所描述的方法，提供了多個離散反應基底，每個基底具有印刷在其上的微陣列?？梢允褂矛F(xiàn)有技術(shù)中熟知的傳統(tǒng)方法、通過印刷或涂覆而將微陣列固定到每個反應基底的表面上。在本實施例中，假定反應基底是平直的表面，比如由多孔化驗板的孔基底所提供的表面。然而，可以理解的是，也可使用其它類型的反應基底，比如珠子。如在此處所使用的，術(shù)語“微陣列”指的是附著至固體基底的、特定化合物的一系列離散沉淀，也稱作“點”，該特定化合物為比如蛋白質(zhì)或核苷酸序列。每個微陣列含有以下點的組(i) 一個或多個捕捉點(“分析物捕捉矩陣”),每個捕捉點含有探針,該探針特定地結(jié)合至測試樣本中的目標分析物；和(ii)多個校準點(“校準矩陣”)，每個校準點含有預定量的目標分析物，使得每個校準點對應于已知(理論)濃度的校準標準。如上所述，給定校準點的目標分析物的已知濃度實際上為理論值，因為未知量的目標分析物可能已在該校準點的印刷期間和分析試劑的使用和移除期間丟失。此處所使用的術(shù)語“預定量”指的是基于含有校準標準的測量點位緩沖液的已知濃度和印刷在反應容器上的測量點位緩沖液的已知體積而計算得到的校準標準的量。校準標準的識別將取決于目標分析物的性質(zhì)。校準標準可以是目標分析物自身，在這種情況下，校準標準和參考標準將會相同。在這類實施例中，微陣列將包括用于每個目標分析物的單獨的校準標準?？蛇x地，微陣列可以包括具有校準點的單個校準矩陣，該校準點含有每個目標分析物。在可選實施例中，校準標準是替代化合物。例如，如果目標分析物是抗體，可被用于校準標準的 合適的替代化合物可以是不同的抗體，但是具有與目標抗體相同種類的免疫球蛋白。在這類實施例中，可以只需要一個校準矩陣。在根據(jù)圖I的方法中，提供了多個微陣列，其中每個微陣列被印刷在離散反應基底的表面上。該離散反應基底可以采取珠子或多孔化驗板的形式，其中每個單獨的孔具有印刷在其上的一個或多個微陣列。在優(yōu)選的實施例中，使用適合于將微陣列印刷在其上的多孔化驗板來實施所述方法。在每個微陣列內(nèi)，分析物捕捉矩陣和校準矩陣的量將取決于目標分析物的量和目標分析物的性質(zhì)。對每個有待分析的測試樣本和每個參考標準提供了單獨的反應基底。如此處所使用的，術(shù)語“參考標準”指的是含有已知量的目標分析物的溶液，比如可購買到的生物分子的標準溶液。如果可能的話，參考標準是一種這樣建立的標準即其等同于并可追溯到適合在本分析中使用的國際認可的標準，并已被證明在其聲明的終止日期前是穩(wěn)定的。對于給定的目標分析物，處于不同濃度的參考標準的量可在3至16之間的范圍內(nèi)，且更優(yōu)選地在從5至8之間變化。該參考標準可采取線性稀釋液系列的形式，該線性稀釋液的濃度落入用于讀取微陣列的檢測系統(tǒng)的動態(tài)范圍內(nèi)。在所述方法的第一階段中(圖1，階段1)，將含有未知濃度的目標分析物的測試樣本應用于反應基底之一，該反應基底含有如上述(圖1，(&1)和(131))的微陣列。同樣，將兩個或多個參考標準，其每個含有已知濃度的目標分析物，應用于剩余的反應基底，每個反應基底含有如上所述(圖1，(&2)和62))的一組點(1)和(^)。對于測試樣本和每個參考標準，還提供了報告系統(tǒng)，其提供可以被檢測和測量的信號強度(“測量信號強度”)。測量信號強度以相對于目標分析物或校準標準(其存在于微陣列上任意給定的點中)的量成正比地變化。合適的報告系統(tǒng)的實例是可特定地結(jié)合至目標分析物的熒光標記抗體，其中熒光的強度可以測得并與所結(jié)合的抗體的量成比例。下面將測試樣本和一個或多個參考標準應用于微陣列的離散基底表面，將來自每個基底的校準點組的測量信號強度(y軸)與校準點的各個理論濃度(X軸)進行對比而繪制該測量信號強度?；貧w分析和/或其它熟知的數(shù)學和統(tǒng)計方法可被用于制備標準曲線，該曲線與數(shù)據(jù)點最佳擬合，由此形成了初始校準曲線。因此，存在從暴露于測試樣本的校準點導出的第一初始校準曲線(圖1，(Cl))，和從暴露于參考標準的校準點導出的第二初始校準曲線(圖I, (c2))。其次，通過將每個基底上的捕捉點的測量信號強度繪制為各個初始校準曲線上的y值，求得對應的X值(X軸以濃度為單位)來確定“分析物當量濃度”(“AEC”)，由此確定測試樣本(圖l，(dl))和參考標準(圖l，(d2))中的目標分析物的濃度。這樣做提供了以下值(I)測試樣本中未知濃度的目標分析物的第一分析物當量濃度(“AECI” ；圖I，(el));和(2)已知濃度的目標分析物的一個或多個參考標準中的每一個的第二分析物當量濃度(“AEC2”；圖 1，(e2))。應該注意的是，如在所述方法的該第一階段中獲得的分析物當量濃度值AECl和AEC2，其既沒有考慮分析動力學中的偏離或變化，也沒有考慮微陣列之間微小的批量間變化，比如可能在印刷捕捉和校準點期間以及在應用和移除分析試劑期間產(chǎn)生的變化。在所述方法的第二階段中(圖1，階段2)，通過將用于參考標準的分析物當量濃度AEC2與參考標準的各個已知濃度(“參考濃度”)進行對比來繪制該當量濃度。然后使用回歸分析和/或其它熟知的數(shù)學和統(tǒng)計方法來確定與數(shù)據(jù)點最佳擬合的標準曲線，其被稱作 “參考標準化曲線”(圖l，f)。其次，在參考標準化曲線上繪制用于測試樣本的分析物當量濃度AECl，且AECl的對應的X值被作為修正后的目標分析物濃度(分別為圖1，(g)和(h))。圖2例示了實施例，其中，提供了有益于對結(jié)合至兩個不同探針化合物的多個分析物進行量化的微陣列。例如，所例示的微陣列有益于對結(jié)合至兩個不同抗原的抗體進行量化。如圖2所例示的微陣列包括校準矩陣A。該校準矩陣可以印刷在離散反應基底的表面上，其采取線性的、成比例的稀釋液系列的形式，該稀釋液系列的理論濃度落入用于讀取微陣列的檢測系統(tǒng)的動態(tài)范圍內(nèi)。校準標準的不同濃度水平的量可以在3至20之間的范圍內(nèi)，且更優(yōu)選地在從5至12之間變化。校準矩陣也可以包括用于每個理論濃度的復制點。對于每個濃度水平，該復制點的量可在3至15之間的范圍內(nèi)，且更優(yōu)選地在從5至8個點之間變化。在如圖2所示的本實施例中，可能只需要單個校準矩陣，但是可以理解的是，在微陣列中可以包括多于一個的校準矩陣。在如圖2所示的本實例中，該校準標準可以是不同于目標抗體的抗體，且其通過另外區(qū)別地標記的抗體來識別。例如，該校準標準可以是容易得到的且廉價的抗體，比如人類IgA和人類IgM。該微陣列還含有分析物捕捉矩陣，其為點的子矩陣，該點含有可選擇地結(jié)合至目標分析物的試劑(也被稱作“探針”)。在目標分析物是蛋白質(zhì)的實施例中，該探針可以是特定地結(jié)合至目標分析物的抗體或其碎片。可轉(zhuǎn)換地，在目標分析物是抗體的實施例中，探針可以是被該抗體特定地結(jié)合的抗原。該微陣列可用于檢測和捕捉該可選擇地結(jié)合至兩個不同抗原的抗體。在如圖2所示的本實例中，所例示的微陣列含有分析物捕捉矩陣B和C，由分別含有第一和第二抗原的分析物捕捉點組成。典型地，分析物捕捉矩陣中的復制點的總數(shù)至少等于校準矩陣中參考標準的每個預定濃度的復制點的總數(shù)。例如，如果校準矩陣含有用于參考標準的每個預定濃度的7個復制點，那么樣本捕捉矩陣將含有至少7個用于目標分析物的復制點。該微陣列可進一步含有用于每個目標分析物的正控制矩陣。如此處所使用的，術(shù)語“正控制矩陣”指的是含有配對的目標分析物和試劑的點的子陣列，該試劑可選擇地結(jié)合至該目標分析物。在使用時，每個正控制矩陣的信號強度的讀數(shù)確定了報告系統(tǒng)(例如，可選擇地結(jié)合至目標分析物的熒光標記抗體)和微陣列掃描儀在給定通道內(nèi)恰當?shù)剡\行。另夕卜，在每個正控制矩陣中，信號強度的讀數(shù)容許“點”查找諸如SQiDworks 診斷平臺(SQI診斷系統(tǒng)公司)中的那些算法，以識別微陣列中的所有點的強度值，以用于自動分析。圖2所示的微陣列包含用于有待量化的每個類型的抗體的正控制矩陣。IgA的正控制矩陣H為含有IgA抗體或IgA碎片的點的子陣列，以核實報告系統(tǒng)的IgA特別標記的報告物和掃描儀通道是恰當?shù)剡\行的。IgM的正控制矩陣E為含有IgM抗體或IgM碎片的點的子陣列，以核實報告系統(tǒng)的IgM特別標記的報告物和掃描儀通道正在運行。IgG的正控制矩陣G為含有IgG抗體或IgG碎片的點的子陣列，以核實報告系統(tǒng)的IgG特別標記的報告物和掃描儀通道正在運行。微陣列也可含有負控制矩陣F。如此處所使用的，術(shù)語“負控制矩陣”指的是的不含任何與可檢測水平的任意分析的分析物或任意標記的報告物相互作用的化合物的點的子陣列。在使用時，在該微陣列區(qū)域中的負信號強度讀數(shù)確認在有差別的可檢測標簽和微陣列之間不存在偽相互作用。
微陣列可以進一步含有樣本控制矩陣D。如此處所使用的，術(shù)語“樣本控制矩陣”指的是包含試劑的點的子陣列，該試劑可選擇地結(jié)合至與生物樣本相關(guān)聯(lián)的化合物。該化合物可以是在生物樣本中自然產(chǎn)生的化合物，附帶條件是該化合物與目標分析物是不相同的?？蛇x地，化合物可以是添加到生物樣本中的外來化合物。組成微陣列的每個矩陣可以被印刷到反應基底的表面上，比如珠子或化驗板的孔的表面上。在優(yōu)選的實施例中，矩陣被印刷到化驗板的孔底部上的預定的X-Y坐標上。在所述方法的第一階段中，如上面描述和圖I所例示的，圖2的微陣列用于確定測試樣本和參考標準中的目標分析物的分析物當量濃度。將預定體積的測試樣本和預定體積的每個參考標準應用于離散反應基底。將單獨的反應基底用于每個測試樣本和每個參考標準。測試樣本和參考標準中的目標分析物被容許結(jié)合至分析物捕捉點中的探針。使用可選擇地結(jié)合至目標分析物的標記過的報告物來測量被結(jié)合的分析物的量。雜交條件和標記過的報告物的選擇將取決于目標分析物的性質(zhì)并可以使用傳統(tǒng)方法對其進行確定。在優(yōu)選實施例中，報告系統(tǒng)可包括使用被差別地標記的抗體，該抗體特定地識別多個不同的目標分析物。使用傳統(tǒng)方法來測量信號強度值，其對應于微陣列內(nèi)每個點中的被結(jié)合的標記過的報告物的量。例如，在涉及多個目標分析物的量化的實施例中，可使用區(qū)別標記的報告物，例如熒光標記的抗體，其每一個以不同的特征波長發(fā)出熒光。在該實施例中，可使用電荷耦合裝置(CCD)陣列掃描儀來測量由通過每個點發(fā)出的必不可少的染料波長所產(chǎn)生的特定熒光信號強度。該掃描儀生成每個點的多色強度圖像映射。所產(chǎn)生的信號的強度與包含在被印刷的校準點內(nèi)的報告物的量以及來自被結(jié)合至被印刷的分析物捕捉點的測試樣本或參考標準的分析物的量成正比例。對于每個反應基底，測得了每個分析物捕捉點和每個校準點的信號強度值。對于每一個反應基底，通過如上面圖1，(Cl)和(c2)中描述的、將曲線擬合至與校準標準的理論濃度進行對比的測量信號強度值來生成校準曲線。然后通過在如圖3 (同樣參見圖l，(dl)和(d2)，和上面關(guān)于同樣問題的有關(guān)描述)所示的校準曲線上繪制測試樣本或參考標準的測量信號強度值并使用所述初始校準曲線來確定用于測試樣本(AECl)或用于參考標準(AEC2)的分析物當量濃度。
圖3例示了由采用12個不同濃度水平(在下面的表I (a)中表示為AGM-Ol至AGM-12)的校準標準所進行的分析的結(jié)果制備的初始校準曲線。相對于校準標準的各個理論濃度水平(X軸)，繪制每個校準標準的測量信號強度值(y軸)。然后使用熟知的回歸分析方法將曲線與數(shù)據(jù)點進行擬合，從而獲得初始校準曲線。對于校準標準的每個濃度水平，對于每個理論濃度水平(作為X值)，通過識別校準曲線上對應的y值，對所測量的強度值進行標準化，對應的I值被標識為“擬合信號強度”。表I (a)系列校準點的擬合信號強度
權(quán)利要求
1.一種用于量化測試樣本中的一個或多個分析物的方法，其包括 (a)提供多個離散反應基底，每個反應容器具有印制在其上的微陣列，所述微陣列包括 含有多個校準點的校準矩陣，每個校準點含有預定量的校準化合物，其中每個校準點對應于所述校準化合物的理論濃度；和 分析物捕捉矩陣，其包含多個捕捉點，每個捕捉點含有預定量的試劑，所述試劑可選擇地結(jié)合至所述分析物； (b)將預定體積的測試樣本應用于所述離散反應基底中的一個； (C)提供多個參考標準，每個參考標準具有已知濃度且每個參考標準含有預定量的每個所述分析物； Cd)將預定體積的每個參考標準應用于所述離散反應基底中的一個； (e)在來自步驟(b)和步驟(d)的每個離散反應基底上 (i)應用被標記的報告化合物，其中所述被標記的報告化合物提供可測量的信號強度，所述信號強度與結(jié)合至每個點的分析物或者校準化合物的量成正比； (ii)測量所述微陣列內(nèi)的每個點的信號強度值； (iii)對步驟(b)中的反應基底生成第一校準曲線，并對步驟(d)中的反應基底生成第二校準曲線，在每種情況下，所述校準曲線是通過將曲線與圖表進行擬合而制備的，所述圖表將信號強度值與校準化合物理論濃度進行對比； (iv)使用所述第一校準曲線，確定所述測試樣本的第一分析物當量濃度，并且使用所述第二校準曲線，確定每個所述參考標準的第二分析物當量濃度； (f)通過將曲線與圖表進行擬合來生成參考標準化曲線，所述圖表將所述第二分析物當量濃度與每個參考標準的已知濃度進行對比；和 (g)使用所述參考標準化曲線，對所述測試樣本的第一分析物當量濃度進行標準化，以獲得修正后的分析物濃度。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，在步驟(e(iii))中，所述第一和第二校準曲線通過以下生成 (1)在所述校準矩陣中，如果所述校準矩陣含有兩個或多個校準點，且所述校準點為對應于所述校準化合物的常用理論濃度的復制點，則將每個復制校準點的信號強度值標準化為每個所述校準點的平均信號強度值；和 (2)將曲線與圖表進行擬合，所述圖表將每個所述校準點的平均信號強度值與每個對應校準標準的對應的理論濃度進行對比。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，在步驟(e(iv))中，所述測試樣本或者所述參考標準中的分析物的濃度是由以下確定的 (3)在步驟(b)和步驟(d)中的每個反應基底的所述分析物捕捉矩陣中，如果所述分析物捕捉矩陣含有兩個或多個作為復制的捕捉點，則將每個復制的捕捉點的所述信號強度值標準化為平均信號強度值，并且將每個所述點的信號強度值標準化為每個所述捕捉點的平均信號強度值；和 (4)(i)使用步驟(b)中的反應基底的每個所述捕捉點的平均信號強度值和所述第一校準曲線，計算所述測試樣本中的所述分析物的濃度；和(i i)使用步驟(d)中的所述反應基底的每個所述捕捉點的平均信號強度值和所述第二校準曲線，計算每個所述參考標準中的所述分析物的濃度。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法,其中,通過采用TukeyBiweight算法來實施對校準矩陣和所述樣本捕捉矩陣的每個所述點的測量信號強度值的標準化。
5.如權(quán)利要求I至4中任一項所述的方法，其中，所述分析物捕捉矩陣的點的總數(shù)至少等于所述校準矩陣的點的總數(shù)。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，存在3至20個之間的對應于線性稀釋系列的分析物的不同理論濃度，且其中對于所述校準標準的每個理論濃度存在3至15個之間的點。
7.如權(quán)利要求I至6中任一項所述的方法，其中，所述被標記報告化合物為熒光標記的抗體。
8.如權(quán)利要求I至7中任一項所述的方法，其中，所述多個反應基底采取多孔化驗板的形式。
9.如權(quán)利要求I至7中任一項所述的方法，其中，所述多個反應基底采取多個珠子的形式。
10.如權(quán)利要求I至9中任一項所述的方法，其中，所述測試樣本為生物樣本。
11.一種如權(quán)利要求10所述的方法的應用，其中，所述生物樣本是從患者處獲得的，所述應用包含以下任一種 Ca)監(jiān)測所述患者疾病的進展； (b)測量對所述疾病的治療效果；和 (c)在所述疾病的所述治療期間，測量所述患者的藥物的濃度； 其中所述一個或多個分析物為表示所述疾病的生物標記。
12.—種如權(quán)利要求I所述的方法的應用，以診斷對象的類風濕性關(guān)節(jié)炎，所述應用包含 (1)在從所述對象處獲得的生物樣本中，測量以下的濃度水平 類風濕因子-IgA、類風濕因子-IgG和類風濕因子-IgM中的每一個的濃度水平；和選自由抗環(huán)瓜氨酸肽-IgG、抗環(huán)瓜氨酸肽-IgA和抗環(huán)瓜氨酸肽-IgM構(gòu)成的組中的至少一個抗環(huán)瓜氨酸肽抗體的濃度水平， 其中，提供了用于類風濕因子-IgA、類風濕因子-IgG和類風濕因子-IgM中的每一個和至少一個選定的抗環(huán)瓜氨酸肽抗體的已知濃度的參考標準；和 (2)將類風濕因子-IgA、類風濕因子-IgG和類風濕因子-IgM中的每一個的測量濃度水平與類風濕因子-IgA、類風濕因子-IgG和類風濕因子-IgM的對應指標正常水平進行比較，和 將選定的抗環(huán)瓜氨酸肽抗體的測量濃度水平與選定的抗環(huán)瓜氨酸肽抗體的對應指標正常水平進行比較； 其中，將超過所述對應指標正常水平的任何測量濃度水平診斷為類風濕性關(guān)節(jié)炎。
13.—種如權(quán)利要求I所述的方法的應用，以監(jiān)測患有類風濕性關(guān)節(jié)炎的對象的類風濕性關(guān)節(jié)炎的治療，其包含在治療期間多次測量以下濃度水平 類風濕因子-IgA、類風濕因子-IgG和類風濕因子-IgM的濃度水平；和 選自由抗環(huán)瓜氨酸肽-IgG、抗環(huán)瓜氨酸肽-IgA和抗環(huán)瓜氨酸肽-IgM構(gòu)成的組中的至少一個抗環(huán)瓜氨酸肽抗體的濃度水平。
14.如權(quán)利要求12或13所述的應用，其中，在所述方法中，所述微陣列包含 校準矩陣，其包含多個含有預定量的校準化合物的點，每個點對應于所述校準化合物的理論濃度； 第一分析物捕捉矩陣，其包含多個含有預定量的類風濕因子的點；和 第二分析物捕捉矩陣，其包含多個含有預定量的環(huán)瓜氨酸肽的點。
15.如權(quán)利要求14所述的應用，其中，所述微陣列還包含以下中的一個或多個 正控制矩陣，其包含多個含有預定量的IgA或其碎片、預定量的IgG或其碎片和預定量的IgM或其碎片的點； 負控制矩陣，其包含多個不含以下的點 與被標記的報告化合物相互作用的任意化合物； 任意可選擇地結(jié)合至以下選自由類風濕因子-IgA、類風濕因子-IgG和類風濕因子-IgM構(gòu)成的組中的任何一個的化合物；和任意可選擇地結(jié)合至以下選自由抗環(huán)瓜氨酸肽-IgG、抗環(huán)瓜氨酸肽-IgA和抗環(huán)瓜氨酸肽-IgM構(gòu)成的組中的任何一個的化合物；和樣本控制矩陣，其包含多個含有試劑的點，所述試劑可選擇地結(jié)合有與所述生物樣本相關(guān)的分析物，其中，所述分析物為在所述生物樣本中自然產(chǎn)生的化合物或者為添加到所述生物樣本中的外來化合物；具有以下附加條件所述分析物不是類風濕因子-IgA、類風濕因子-IgG、類風濕因子-IgM、抗環(huán)瓜氨酸肽-IgG、抗環(huán)瓜氨酸肽-IgA或抗環(huán)瓜氨酸肽-IgM0
16.如權(quán)利要求15所述的應用，其中，在所述方法中，所述多個離散反應基底選自由多孔化驗板和多個珠子構(gòu)成的組，且其中所述多個離散反應基底包含一個或多個置信度確認正?；瘶藴屎涂刂啤?br> 17.如權(quán)利要求16所述的應用，所述微陣列包含以下控制中的一個或多個 用于類風濕因子-IgA、類風濕因子-IgG、類風濕因子-IgM中的每一個的至少一個正控制；和用于所述被選擇的抗環(huán)瓜氨酸肽的至少一個正控制； 用于類風濕因子-IgA、類風濕因子-IgG、類風濕因子-IgM中的每一個的至少一個負控制；和用于所述被選擇的抗環(huán)瓜氨酸肽的至少一個負控制； 用于類風濕因子-IgA、類風濕因子-IgG和類風濕因子-IgM的每個參考標準的至少一個正控制；和用于所述被選擇的抗環(huán)瓜氨酸肽的每個參考標準的至少一個正控制； 用于確定矩陣定位、矩陣旋轉(zhuǎn)、矩陣位移和每個陣列的點數(shù)的一個或多個結(jié)構(gòu)控制； 用于確定復制信號強度的一個或多個復制控制； 用于血清確定、背景信號和液體體積轉(zhuǎn)移確定的一個或多個過程控制； 用于確定內(nèi)校準曲線的一個或多個結(jié)構(gòu)控制；和 用于確定標準化曲線的一個或多個結(jié)構(gòu)控制。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于分析物量化的多重微陣列和方法。尤其是，本發(fā)明涉及改進的方法，該方法根據(jù)參考標準曲線對測試樣本中目標分析物濃度進行標準化，該參考標準曲線是從已知濃度目標分析物的經(jīng)驗證、核準和公認的參考標準中導出的。本發(fā)明還涉及用于對確定正常化標準和控制的置信度進行同時測量的方法和檢查。
文檔編號G01N33/564GK102713620SQ201080060201
公開日2012年10月3日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者凱特·史密斯, 彼得·李, 珍妮弗·漢森 申請人:Sqi 診斷系統(tǒng)有限責任公司