專(zhuān)利名稱(chēng)：用于檢測(cè)作為癌癥生物標(biāo)志的網(wǎng)蛋白-1的組合物和方法
用于檢測(cè)作為癌癥生物標(biāo)志的網(wǎng)蛋白-1的組合物和方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)根據(jù)35U. S. C. § 119(e)享有2009年11月5日遞交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)第61/258242號(hào)的優(yōu)先權(quán)。關(guān)于聯(lián)邦資助研究或開(kāi)發(fā)的聲明本發(fā)明以美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院授予的基金號(hào)NIH-P50-CA86355和POl-CAl 17969-01在美國(guó)政府支持下進(jìn)行。美國(guó)政府在本發(fā)明中具有特定權(quán)利。背景在美國(guó)和其他エ業(yè)化國(guó)家中，胰腺癌(PDAC)是癌癥相關(guān)死亡的第四大主要原因[I]。盡管已作出了大量努力，其仍是毀滅性的疾病，其5年存活率小于5%且平均中值存活 期小于I年[I]。這種嚴(yán)酷的預(yù)后主要是由于其初歩診斷經(jīng)常延遲在不可治愈的晩期，通常在轉(zhuǎn)移后。認(rèn)為PDAC通過(guò)稱(chēng)作胰上皮內(nèi)瘤變(PanIN)的前期病變進(jìn)展成侵入性癌癥，與在其他惡性腫瘤中觀察到的腺瘤-癌序列相似。病變從腺瘤(PanIN I)進(jìn)展成伴有發(fā)育異常的腺瘤(PanIN II)、原位癌(PanIN III)并最終進(jìn)展成侵入性癌癥[2，3，4]。盡管通過(guò)前期病變充分表征了該致癌作用，仍未獲得PDAC的有效早期檢測(cè)和篩查。這主要是由于缺乏用于早期癌癥的診斷工具和生物標(biāo)志。理想地，因此PDAC生物標(biāo)志不僅應(yīng)檢測(cè)到侵入性癌癥，而且應(yīng)檢測(cè)到其前期病變、PanIN II和更重要的侵入前惡性PanIN III病變。目前，CA
19.9是唯一臨床使用的PDAC血清生物標(biāo)志。然而，其缺乏特異性和靈敏性，尤其是對(duì)于檢測(cè)小的癌癥和惡性和良性胰疾病的分化的特異性和靈敏性[5]。因此，CA 19. 9不適合PDAC的篩查或早期檢測(cè)。侵入性?xún)?nèi)窺鏡程序(EUS和ERCP)可檢測(cè)某些早期病變，但受限于損傷胰、高假陰性率的可能性，并且高度依賴(lài)操作者[6，7]。其還經(jīng)常不能區(qū)分惡性與良性或惡化前病變[8，9]。橫截面腹部成像也已證實(shí)不能可靠地檢測(cè)早期PDAC，尤其是在高?；颊咧衃10，11]。在多達(dá)30% PDAC患者中，其不能在手術(shù)前檢測(cè)轉(zhuǎn)移[12，13]且不能安全地區(qū)分慢性胰腺炎(CP)和PDAC[14，15]。PDAC和慢性胰腺炎的可靠辨別是重要的，但通常難以做到。這兩種疾病共有許多臨床征兆和癥狀，但各自采用極為不同的治療策略。雖然唯一可用的PDAC祛病治療是根治性手術(shù)切除，治療慢性胰腺炎集中于癥狀改善，最經(jīng)常地可不通過(guò)手術(shù)實(shí)現(xiàn)這種改善[14，15]?？朔壳安捎玫脑\斷工具的缺點(diǎn)的新型生物標(biāo)志和非侵入性成像策略將允許PDAC和慢性胰腺炎的可靠辨別。其還將允許在轉(zhuǎn)移開(kāi)始之前更早地診斷PDAC并因而治療PDAC0因此非常需要它們且最終可有助于提高存活率[16]。最近，基于體外和基因工程小鼠模型中的發(fā)現(xiàn)，表明網(wǎng)蛋白-1 (Plecl)是用于PDAC的潛在新型成像生物標(biāo)志[17]。鑒定到用于檢測(cè)Plecl的肽配體[17]。然而，仍有待評(píng)估Plecl作為用于人PDAC和其前期病變的生物標(biāo)志的合適性。作為非小細(xì)胞肺癌(Harris, 2009, J. Clin. Oncology, 27, No. 15S(5月20日増刊)e22118)和人結(jié)腸直腸腺瘤和腺癌(Lee，2004，J. Med.，35 :(1-6) :141-149)的生物標(biāo)志，Plecl已被確定為用于惡性胰“導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤”(IPMN)的生物標(biāo)志并已被假設(shè)為用于早期檢測(cè)產(chǎn)生于IPMN的癌的標(biāo)志(Bausch等人,2009, J. Gastrointest.Surg. ,13 :1948) o Plecl 的一個(gè)肽配體是肽 KTLLPTP(SEQ ID NO :1) [Kelly 等人(2008)iargeted nanoparticles lor imaging incipient pancreatic ducta丄 adenocarcinoma.PLoS Med 5 :4 :e85 ;國(guó)際專(zhuān)利公布號(hào)為 WO 2009/129220，Kelly 等人，2009 年 10 月 22 日公布]。本領(lǐng)域中存在對(duì)更好的癌癥生物標(biāo)志、對(duì)識(shí)別生物標(biāo)志的新型且更好的試劑的長(zhǎng)久渴望的需要，以幫助對(duì)癌癥進(jìn)行診斷、監(jiān)控和定位。本發(fā)明滿足了這些需要。發(fā)明概述本發(fā)明基于靶向網(wǎng)蛋白-I的本文所述的新型支鏈多聚體肽成像復(fù)合物，且還基于用該復(fù)合物獲得的令人驚奇的結(jié)果。在早期侵入前、原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性人PDAC中網(wǎng)蛋白-I (GenBank登記號(hào)AAR95677)被特異性上調(diào)。在臨床前模型中，網(wǎng)蛋白-I是可用于非侵入性成像的首要PDAC生物標(biāo)志之一。綜合起來(lái)，這些數(shù)據(jù)表明Plecl是靈敏且特異的PDAC生物標(biāo)志，且可用來(lái)改進(jìn)其檢測(cè)和分期。本發(fā)明提供了結(jié)合網(wǎng)蛋白-I或其同源物(homolog)或片段的多聚體肽配體復(fù)合物，所述復(fù)合物包括獨(dú)立結(jié)合網(wǎng)蛋白-I或其同源物或片段的至少兩個(gè)肽。一方面，與網(wǎng)蛋白-I或其同源物或片段結(jié)合的每種肽獨(dú)立并任選地包括至少ー個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸置換或保守氨基酸置換或添加。一方面，獨(dú)立地，任選地通過(guò)添加至少ー個(gè)額外的氨基酸修飾多聚體的每個(gè)肽。一方面，多聚體的每個(gè)肽獨(dú)立且任選地與聚こニ醇偶聯(lián)。一方面，多聚體的每個(gè)肽或任選地與聚こニ醇偶聯(lián)的肽進(jìn)一歩與螯合劑偶聯(lián)。任選地，螯合劑通過(guò)至少一個(gè)接頭與所述肽或任選地與聚こニ醇偶聯(lián)的肽偶聯(lián)。任選地，至少ー種顯像劑與所述螯合劑偶聯(lián)，且任選地至少ー種治療劑與所述螯合劑偶聯(lián)。一方面，多聚體選自由ニ聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體和八聚體組成的組。一方面，多聚體肽配體復(fù)合物為同聚物或異聚物。一方面，同聚物是四聚體。在一個(gè)實(shí)施方式中，多聚體肽配體復(fù)合物包含選自由DTPA、D03A、DOTA, EDTA,TETA, EHPG, HBED, Ν0ΤΑ、DOTMA, TETMA, PDTA, TTHA, LICAM、HYNIC 和 MECAM 組成的組的螯合齊 。一方面，聚こニ醇是聚こニ醇5000。在一個(gè)實(shí)施方式中，多聚體肽配體復(fù)合物包含選自由放射性核素、放射性造影剤、順磁離子、金屬、生物標(biāo)簽、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、超聲造影剤和光敏劑組成的組的顯像剤。一方面，顯像劑是放射性核素。一方面，放射性核素選自由n°In、mIn、mLu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94niTc、94Tc、99mTc、1201、1231、1241、1251、1311、154^158Gd、32P、11C、13N、150、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55CO、72AS、75Br、76Br、82mRb、83Sr 和其他、-、β -或正電子-發(fā)射體組成的組。一方面，放射性核素是mIn。一方面，多聚體肽配體復(fù)合物包含獨(dú)立地具有選自由SEQ ID NO :1_4和9-22組成的組的序列的肽。一方面，所述序列選自由SEQ ID NO :1-4組成的組。SEQ ID NOI (KTLLPTP)是基礎(chǔ)肽配體，且其他序列是其修飾體(見(jiàn)實(shí)施例和圖9)SEQ ID NO :2_β AKTLLPTPSEQ ID NO :3-β AKTLLPTPGGS、
SEQ ID NO :4_KTLLPTPGGSSEQ ID NO :9_ATLLPTPSEQ ID NO : 10-KALLPTPSEQ ID NO :11_KTALPTPSEQ ID NO : 12-KTLAPTPSEQ ID NO : 13-KTLLATPSEQ ID NO : 14-KTLLPAPSEQ ID NO : 15-KTLLPTA SEQ ID NO 16-β AATLLPTPGGSSEQ ID NO 17-βAKALLPTPGGSSEQ ID NO 18-β AKTALPTPGGSSEQ ID NO 19-β AKTLAPTPGGSSEQ ID NO :20-β AKTLLATPGGSSEQ ID NO :21-β AKTLLPAPGGSSEQ ID NO :22-β AKTLLPTAGGS (SEQ ID NO :22)注意到在隨此提供的序列表中，β丙氨酸殘基以Xaa提供。這些序列可被修飾，包括不明顯影響這些肽結(jié)合網(wǎng)蛋白-I或其同源物或片段的氨基酸置換和添加。盡管以上說(shuō)明了丙氨酸置換，本發(fā)明包括使用其他氨基酸的置換。另外，本文公開(kāi)的數(shù)據(jù)表明蘇氨酸以及脯氨酸在序列中的重要性。本發(fā)明的肽作為多聚體是有用的。另外，可通過(guò)添加氨基酸例如β丙氨酸(βΑ)和聚こニ醇來(lái)修飾多聚體以增加穩(wěn)定性、在血流和組織中的半衰期，減少降解等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解在某些情況下可改變序列在復(fù)合物中的取向且多聚體可以是異聚物或同聚物。在一個(gè)實(shí)施方式中，多聚體復(fù)合物為四聚體且具有式(β AKTLLPTPGGS (PEG5000))4ΚΚΚΗ)0ΤΑβΑ-ΝΗ2，圖8中示出了其化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖8還示出了與DOTA偶聯(lián)的顯像劑。一方面，四聚體復(fù)合物具有約8. 3χ 10_7Μ的Ki。在一個(gè)實(shí)施方式中，顯像劑是mIn。一方面，用與計(jì)算機(jī)連接的SPECT/CT掃描儀檢測(cè)顯像劑，并使用程序分析成像數(shù)據(jù)。本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)受治療者體內(nèi)的網(wǎng)蛋白-I或其同源物或片段的方法。該方法包括對(duì)受治療者施用包含顯像劑的多聚體肽配體復(fù)合物，和檢測(cè)包含網(wǎng)蛋白-I的細(xì)胞的位置。一方面，該方法包括使用多聚體肽配體成像復(fù)合物中的肽配體，其中每個(gè)肽配體具有獨(dú)立地選自由SEQ ID NO :1-4和9_22組成的組的序列。一方面，該方法提供了選自由放射性核素、放射性造影剤、順磁離子、金屬、生物標(biāo)簽、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、超聲造影剤和光敏劑組成的組的顯像劑的用途。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解所使用的檢測(cè)方法將取決于所使用的具體顯像劑。在該方法的一方面，網(wǎng)蛋白-I或其同源物或片段是細(xì)胞表面網(wǎng)蛋白-I或其同源物或片段。本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)癌癥、診斷癌癥、監(jiān)控癌癥進(jìn)展或監(jiān)控癌癥治療的方法，其中癌癥細(xì)胞表達(dá)或呈遞網(wǎng)蛋白-I或其同源物或片段。該方法包括向受試受治療者施用包含多聚體肽配體復(fù)合物的藥物組合物，其中該復(fù)合物包含顯像劑，且然后檢測(cè)顯像劑和確定顯像劑在受試受治療者體內(nèi)的水平和位置。將受試受治療者體內(nèi)的水平和位置與來(lái)自未受影響的受治療者的其他方面相同的位置或與受試受治療者的未受影響的區(qū)域的顯像劑的水平和位置進(jìn)行對(duì)比。與來(lái)自未受影響的受治療者或來(lái)自受試受治療者的未受影響的區(qū)域的所述樣品中顯像劑的水平或位置相比，該顯像劑在受試受治療者體內(nèi)的更高水平或不同位置表明該受試受治療者患有表達(dá)或呈遞網(wǎng)蛋白-I或其同源物或片段的癌癥。檢測(cè)到的顯像劑的水平或位置是對(duì)生物標(biāo)志網(wǎng)蛋白-I的位置和量的指示。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥選自由頭頸癌、肝癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、前列腺癌、腎上腺癌、淋巴瘤、唾液腺癌、骨癌、腦癌、小腦癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、ロ鼻咽癌(oronasopharyngeal cancer)、NPC、腎癌、膀胱癌、皮膚癌、黑色素瘤、基底細(xì)胞癌、硬腭癌、舌鱗狀細(xì)胞癌、腦膜瘤、多形性腺瘤、星形細(xì)胞瘤、軟骨肉瘤、皮質(zhì)腺瘤、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和腺癌組成的組。—方面，所述癌癥是胰腺癌。一方面，胰腺癌選自由胰導(dǎo)管腺癌、胰上皮內(nèi)瘤變、腺瘤、伴有發(fā)育異常的腺瘤和原位癌組成的組。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述癌癥是轉(zhuǎn)移性癌癥。本發(fā)明還用于比較待成像的網(wǎng)蛋白-I的水平以基于所檢測(cè)到的顯像劑的水平(網(wǎng)蛋白-I的量的量度)幫助確定癌癥是良性還是惡性的。本發(fā)明還用于確定癌癥的癌變階段并監(jiān)控其從早期到晩期癌癥的進(jìn)展。該方法還用于確定待使用的治療的類(lèi)型和量。在本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方式中，多聚體肽配體復(fù)合物的肽各自具有獨(dú)立地具有選自由SEQ ID NO :1-4和9-22組成的組的序列。在本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方式中，多聚體肽配體復(fù)合物具有式(β AKTLLPTPGGS(PEG5000)) 4KKKKD0TA β A-NH2 且所述顯像劑為 mIn。在該方法的一個(gè)實(shí)施方式中，顯像劑選自由放射性核素、放射性造影剤、順磁離子、金屬、生物標(biāo)簽、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、超聲造影剤和光敏劑組成的組。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，網(wǎng)蛋白-I或其同源物或片段是細(xì)胞表面網(wǎng)蛋白-I或其同源物或片段。本發(fā)明還提供了用于診斷受治療者體內(nèi)的癌癥的組合物和方法，其中癌癥細(xì)胞表達(dá)網(wǎng)蛋白-I或其同源物或片段。該方法包括獲得來(lái)自受治療者的生物樣品，使樣品接觸包含權(quán)利要求I的多聚體肽配體復(fù)合物的組合物，其中復(fù)合物包含顯像劑。該方法還提供了將來(lái)自受試受治療者的樣品中的網(wǎng)蛋白-I的水平或位置與來(lái)自從未受影響的受治療者獲得的其他方面相同的樣品的網(wǎng)蛋白-I的水平或位置或與包含已知量的網(wǎng)蛋白-I的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行比較，其中來(lái)自所述受試受治療者的所述樣品中的更高水平的網(wǎng)蛋白-I表明所述受試受治療者患有癌癥。在該方法的一個(gè)實(shí)施方式中，多聚體肽配體復(fù)合物具有式(β AKTLLPTPGGS (PEG5000)) 4KKKKD0TA β A-NH2。一方面，顯像劑選自由放射性核素、放射性造影剤、順磁離子、金屬、生物標(biāo)簽、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、超聲造影剤和光敏劑組成的組。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含藥學(xué)可接受的載體和結(jié)合網(wǎng)蛋白-I的多聚體肽配體復(fù)合物的藥物組合物。
本發(fā)明還包括試劑盒，其包含含有藥學(xué)可接受的載體和權(quán)利要求I的多聚體肽配體復(fù)合物的藥物組合物、涂抹器和關(guān)于其使用的說(shuō)明材料，和任選地顯像劑和治療劑。為評(píng)價(jià)網(wǎng)蛋白-I靶向的肽(PTP)對(duì)于體內(nèi)成像的效用，本發(fā)明在一個(gè)實(shí)施例中公開(kāi)了在GMP級(jí)設(shè)備中將肽合成為用DOTA作為顯像劑的螯合劑的四聚體結(jié)構(gòu)。一方面，顯像劑是mIn。一方面，用于 本申請(qǐng)中的網(wǎng)蛋白-1的肽配體是肽KTLLPTP (SEQ ID NO I) (Kelly等人，2008，PLoSMedicine, 5 4 :0657-0668 ;國(guó)際專(zhuān)利公布號(hào)為 WO 2009/129220, Kelly 等人，2009年10月22日公布)。一方面，可在制備多聚體肽配體成像復(fù)合物之前如本文所述修飾肽配體。一方面，修飾的肽配體是。一方面，本發(fā)明的新型四聚體肽成像復(fù)合物具有下式( β AKTLLPTPGGS (PEG5000)) 4KKKKD0TA β A-NH2 (本文也表示為[(Ala-Lys-Thr-Leu-Leu-Pro-Thr-Pro-Gly-Gly-Ser-PEG5K) 2_Lys] 2-Lys-Lys (DOTA) -Ala-NH2),也就是說(shuō)，其是包含四個(gè)肽的復(fù)合物，這四個(gè)肽是網(wǎng)蛋白-I的配體。一方面，該復(fù)合物還包含顯像劑以幫助顯示網(wǎng)蛋白-I表達(dá)細(xì)胞的位置。一方面，顯像劑是mIN。任選地，治療劑可被連接或可被包括在包含成像復(fù)合物的藥物組合物中。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，基礎(chǔ)肽配體，即SEQ ID NO :1，可以在復(fù)合物中以反方向取向。一方面，網(wǎng)蛋白-1的其他肽配體包括但不限于SEQ ID NO :1_4和9_22和其有功能的同源物、衍生物和片段。一方面，本發(fā)明的四聚體復(fù)合物具有約8. 3x 10_7M的Ki (抑制離解常數(shù))。一方面，當(dāng)向受治療者施用時(shí)，其具有約4. 29分鐘的血液半衰期。本發(fā)明還提供了其他活性四聚體復(fù)合物。例如，本發(fā)明包括包含用三個(gè)額外的氨基酸(Gly、Gly 和 Ser)修飾的 SEQ ID NO :1，也就是 KTLLPTPGGS (SEQ ID NO 4)的復(fù)合物。四聚體復(fù)合物具有式[Lys-Thr-Leu-Leu-Pro-Thr-Pro_Gly-Gly-Ser]4-LyS4-Ala-DOTA,也表示為[KTLLPTPGGS]4-Κ4-β A-DOTA，具有圖7的結(jié)構(gòu)。賴(lài)氨酸⑷具有結(jié)構(gòu)
ONHtNH2
箱氨酸如本文使用的臨床相關(guān)SPECT示蹤劑能夠?qū)崿F(xiàn)小PDAC和轉(zhuǎn)移的檢測(cè)。一方面，顯像劑或可檢測(cè)的部分包括但不限于放射性核素、放射性造影剤、順磁離子、金屬、生物標(biāo)簽、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、超聲造影剤和光敏劑。令人驚奇地，本發(fā)明的四聚體肽成像復(fù)合物比之前已知的藥物更靈敏。另外，令人驚奇地，本發(fā)明的四聚體肽成像復(fù)合物比已知的藥物更迅速地發(fā)揮作用。本申請(qǐng)還公開(kāi)了網(wǎng)蛋白-1在許多類(lèi)型的癌癥中的表達(dá)(圖2)。因此，本發(fā)明包括使用本發(fā)明的多聚體肽成像復(fù)合物來(lái)檢測(cè)、診斷和定位除了胰腺癌以外的癌癥。本發(fā)明還提供了量化網(wǎng)蛋白-I水平，并因此包括區(qū)分正常、良性和惡性組織的能力。一方面，多聚體肽成像復(fù)合物包括四聚體肽。
本發(fā)明還提供了試劑盒，其包含至少ー種本發(fā)明的多聚體肽配體復(fù)合物、說(shuō)明材料，且任選地包括至少ー種顯像劑和任選地至少ー種治療劑。以下更詳細(xì)地描述了本發(fā)明的各個(gè)方面和實(shí)施方式。附圖
簡(jiǎn)述圖I :網(wǎng)蛋白-I的免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡。A)所評(píng)價(jià)的正常膜、慢性胰腺炎、PanIN、PDAC、異種移植的PDAC和PDAC轉(zhuǎn)移部位(肝臟、淋巴結(jié)和腹膜)的代表性圖像。概覽視圖(上圖)和黒色框的詳細(xì)視圖(下圖)。慢性胰腺炎呈網(wǎng)蛋白-I弱染色，而正常的胰不表達(dá)網(wǎng)蛋白-1。PanIN顯示出弱至中度的膜染色模式。TOAC和PDAC異種移植組織呈中度至強(qiáng)的網(wǎng)蛋白-I胞質(zhì)和膜染色。常見(jiàn)的PDAC轉(zhuǎn)移部位未表現(xiàn)出明顯的網(wǎng)蛋白-I表達(dá)，而腫瘤細(xì)胞呈Plecl強(qiáng)染色。B)樣本中染色強(qiáng)度的分布。所有PDAC個(gè)例呈現(xiàn)出中度或強(qiáng)的染色模式，而正常胰和大部分的慢性胰腺炎不表達(dá)網(wǎng)蛋白-I。相比之下，多于一半的 PanIN II病變?nèi)趸蛑卸缺磉_(dá)Plecl，而大部分的PanIN III病變?yōu)镻lecl陽(yáng)性。C)癌變期間Plecl的細(xì)胞定位也會(huì)變化。雖然在所有PanIN I和大部分PanIN II病變中僅在膜中鑒定到Plecl，但在某些PanIN III病變中其還存在于胞質(zhì)中，且在PDAC中總是在胞質(zhì)中鑒定到Plecl。D)來(lái)自50mg的胰組織(快速冷凍的手術(shù)樣本)的Plecl定量蛋白質(zhì)印跡。在正常的胰和CP中未檢測(cè)到Plecl，而其存在于每個(gè)PDAC中。圖2 :網(wǎng)蛋白-I在正常和惡性人組織中的表達(dá)用于評(píng)價(jià)網(wǎng)蛋白-I表達(dá)的組織微陣列的免疫組織化學(xué)。除了膀胱和男性生殖道，正常組織僅表現(xiàn)出弱至中度的網(wǎng)蛋白-I表達(dá)。只在胰、食道、胃和肺中觀察到區(qū)別正常與惡性疾病的網(wǎng)蛋白-1表達(dá)的明顯差異。常見(jiàn)的PDAC轉(zhuǎn)移部位(淋巴結(jié)、肝臟)不表達(dá)Plecl。圖3 :原位PDAC內(nèi)Plecl的體內(nèi)成像(A)。tPTP的體外驗(yàn)證。將L3. 6細(xì)胞平鋪在96孔板上并與mIn-tPTP —起孵育和遞增對(duì)數(shù)濃度的tPTP或混雜四聚體一起孵育。(B)用mIn-tPTP注射攜帯來(lái)自原位植入的L3. 6細(xì)胞的腫瘤的無(wú)胸腺裸小鼠并在注射后4小時(shí)通過(guò)SPECT/CT成像。注意到tPTP在PDAC中的累積，允許對(duì)胰中和腹膜轉(zhuǎn)移的腫瘤的體內(nèi)成像。T-腫瘤，L-肝臟，rK-右腎，IK-左腎，M-腹膜轉(zhuǎn)移。(C) SPECT/CT成像(圖3)后，處死動(dòng)物(η = 5)，收集器官并評(píng)價(jià)Y計(jì)數(shù)。(D)組織學(xué)。處死具有原位移植的腫瘤的動(dòng)物并取出胰和具有可見(jiàn)腹膜轉(zhuǎn)移的區(qū)域，包埋在OCT中，切片并用Η&Ε染色。Α.胰中腫瘤的IOx圖像。插圖，胰的2χ視圖，示出了兩個(gè)腫瘤。B腹膜轉(zhuǎn)移的IOx圖像。插圖，轉(zhuǎn)移和周?chē)笽吳的2χ圖像。圖4 tPTP靶向PDAC并能夠?qū)崿F(xiàn)非侵入性體內(nèi)成像。用mIn_tPTP注射攜帶來(lái)自原位植入的L3. 6細(xì)胞的腫瘤的無(wú)胸腺裸小鼠并在注射后4小時(shí)通過(guò)SPECT/CT成像。SPECT/CT成像表明tPTP累積在PDAC中，允許對(duì)胰中和腹膜轉(zhuǎn)移的腫瘤的體內(nèi)成像。T-腫瘤；L-肝臟；rK-右腎；IK-左腎；M-腹膜轉(zhuǎn)移。上圖-徑向平面視圖；下圖-冠狀平面視圖。左側(cè)兩幅圖像-CT ;左起第二幅-SPECT ;左起第三幅-SPECT/CT ;右側(cè)兩幅圖像-MIP。(還參見(jiàn)圖3)。圖5 :網(wǎng)蛋白-1靶向肽的圖解說(shuō)明。高度圖示化形式的多聚體肽配體復(fù)合物，包括四拷貝的SEQ ID NO :1以增加多價(jià)性，且描繪了四條5000Da的PEG鏈，可加入這些鏈以增加藥物的循環(huán)時(shí)間、降低免疫原性并保護(hù)肽免于在到達(dá)期望的靶之前被體內(nèi)裂解。未示出其他可能的修飾。
圖6 tPTP-6A的體內(nèi)表征。對(duì)攜帶來(lái)自原位植入的L3. 6細(xì)胞的腫瘤的無(wú)胸腺裸小鼠注射的mIN-tPTP的血液半衰期。在注射后0、15、30、45、60和120分鐘取血液。tPTP的血液半衰期為4. 29分鐘。6B. SPECT/CT成像(見(jiàn)圖4)后，處死動(dòng)物(η = 5)，收集器官并評(píng)價(jià)Y計(jì)數(shù)。胰表現(xiàn)出3%的注射劑量/克，而在腹腔中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出I. 5%的注射劑量/克。mIN-tPTP排泄的主要途徑是通過(guò)尿。圖7 [Lys-Thr-Leu-Leu-Pro-Thr-Pro-Gly-Gly-Ser] 4_Lys4- β Ala-DOTA。具有也表不為[KTLLPTPGGS]4-K4-0A-DOTA 的式[Lys-Thr-Leu-Leu-Pro-Thr-Pro-Gly-Gly-Ser]4_Lys4- β Ala-DOTA 的四聚體復(fù)合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖8 tPTP-4 ( β AKTLLPTPGGS (PEG5000)) KKKKD0TA β A-NH2 的化學(xué)結(jié)構(gòu)。提供了 包括mIn分子的多聚體肽復(fù)合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖9 :KTLLPTP(SEQ ID NO 1)的氨基酸置換丙氨酸突變。本研究中使用的肽由也稱(chēng)為Panc 27肽的噬菌體來(lái)源的序列KTLLPTP (SEQ ID NO : I ;對(duì)照)和突變序列組成。七個(gè)位置中的每ー個(gè)各自被突變成丙氨酸。分另進(jìn)行了丙氨酸突變ATLLPTP、KALLPTP、KTALPTP、KTLAPTP、KTLLATP、KTLLPAP 和 KTLLPTA，即 SEQ ID NO :9_15 并測(cè)試親和力。詳述縮寫(xiě)和簡(jiǎn)稱(chēng)βΑ-β 丙氨酸CP-慢性胰腺炎D0TA-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷 _1，4，7，10-四こ酸ncPTP-陰性對(duì)照 PTPNIR-近紅外NIRF-近紅外熒光團(tuán)Panc 27 肽 _KTLLPTP(SEQ ID NO 1)PanIN-胰上皮內(nèi)瘤變PanIN I-腺瘤PanIN II-伴有發(fā)育異常的腺瘤PanIN III-原位癌PDAC-胰導(dǎo)管腺癌Plecl-網(wǎng)蛋白-1PTP-網(wǎng)蛋白-1靶向肽SPECT-單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像tPTP-四聚體網(wǎng)蛋白-1靶向肽，也稱(chēng)為四聚體合成肽(其靶向網(wǎng)蛋白-1)定義在描述和要求保護(hù)本發(fā)明中，將根據(jù)以下提供的定義使用以下術(shù)語(yǔ)。本文使用冠詞“a (—個(gè))”和“an (—個(gè))”指ー個(gè)或多于ー個(gè)(即，指至少ー個(gè))的該冠詞的語(yǔ)法對(duì)象。舉例來(lái)說(shuō)，“ー個(gè)元件”指一個(gè)元件或多于ー個(gè)的元件。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“約”指近似，在大約或附近的區(qū)域。當(dāng)結(jié)合數(shù)值范圍使用術(shù)語(yǔ)“約”時(shí)，其通過(guò)擴(kuò)大界限高于或低于所提供數(shù)值來(lái)修改那個(gè)范圍。一般來(lái)講，本文使用術(shù)、語(yǔ)“約”來(lái)使數(shù)值與所提供值上下變化10%。一方面，術(shù)語(yǔ)“約”指加上或減去與其一起使用的數(shù)的數(shù)值的20%。因此，約50%指在45%-55%的范圍內(nèi)。本文通過(guò)端點(diǎn)提及的數(shù)值范圍包括包含在那個(gè)范圍內(nèi)的所有整數(shù)和分?jǐn)?shù)(例如，I至5包括I、I. 5、2、2. 75,3,3. 90、4和5)。還應(yīng)當(dāng)理解其所有整數(shù)和分?jǐn)?shù)被認(rèn)為被術(shù)語(yǔ)“約”修改。如本文所用的，與表示由形成腺(包圍空腔的細(xì)胞的集合)的細(xì)胞組成的良性(非癌性)腫瘤的“腺瘤”相反，“腺癌”指癌性腫瘤。如本發(fā)明上下文中使用的，術(shù)語(yǔ)“其他治療活性化合物”或“其他治療劑”指使用或施用化合物用于待治療的具體損傷、疾病或紊亂的其他治療用途。例如，該化合物可包括被用來(lái)治療無(wú)關(guān)疾病或紊亂，或可能不對(duì)被治療的損傷、疾病或紊亂的初次治療反應(yīng)的疾病或紊亂的化合物。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“佐劑”指當(dāng)與特定抗原組合使用時(shí)引發(fā)增強(qiáng)的免疫反應(yīng)的物質(zhì)。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)化合物“的施用”和/或“施用”化合物應(yīng)理解為是指對(duì)需要治療的受治療者提供本發(fā)明的化合物或本發(fā)明的化合物的前藥。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“氣溶膠”指空氣懸浮體。特別地，氣溶膠指本發(fā)明的制劑和其空氣懸浮體的顆?；蛟踊?。如本文所用的，“激動(dòng)劑”是物質(zhì)組合物，當(dāng)對(duì)哺乳動(dòng)物例如人施用時(shí)，其增強(qiáng)或延長(zhǎng)由靶化合物或目標(biāo)分子在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的水平或存在引起的生物活性。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“肽結(jié)構(gòu)的變化”指包括但不限于序列變化和翻譯后修飾的變化?！稗卓刮铩笔俏镔|(zhì)組合物，當(dāng)對(duì)哺乳動(dòng)物例如人施用時(shí)，其抑制由目標(biāo)化合物或分子在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的水平或存在引起的生物活性。如本文所用的，“減輕疾病或紊亂的癥狀”指減小癥狀的嚴(yán)重程度或與患者經(jīng)歷這種癥狀的頻率，或兩者。如本文所用的，氨基酸由其全稱(chēng)，由其相應(yīng)的三字母代碼，或由其相應(yīng)的一字母代碼表示，如下表所示
權(quán)利要求
1.一種用于結(jié)合網(wǎng)蛋白-I或其同源物或片段的多聚體肽配體復(fù)合物，所述復(fù)合物包括獨(dú)立地結(jié)合網(wǎng)蛋白-I或其同源物或片段的至少兩個(gè)肽；其中，結(jié)合網(wǎng)蛋白-I或其同源物或片段的所述肽各自獨(dú)立地任選地包含至少ー個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸置換或保守氨基酸置換；其中，所述肽各自獨(dú)立地任選地通過(guò)添加至少ー個(gè)額外的氨基酸而被修飾；其中，所述肽各自任選地與聚こニ醇偶聯(lián)；其中，所述肽或任選地與聚こニ醇偶聯(lián)的肽各自獨(dú)立地還與螯合劑偶聯(lián)，且任選地所述螯合劑通過(guò)至少ー個(gè)接頭與所述肽或任選地與聚こニ醇偶聯(lián)的肽偶聯(lián)；其中，任選地，至少ー種顯像劑與所述螯合劑偶聯(lián)；且其中，任選地，至少ー種治療劑與所述螯合劑偶聯(lián)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多聚體肽配體復(fù)合物，其中所述多聚體是同聚物或異聚物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多聚體肽配體復(fù)合物，其中所述多聚體是四聚體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多聚體肽配體復(fù)合物，其中所述多聚體肽配體復(fù)合物的肽獨(dú)立地具有選自由SEQ ID NO :1-4和9_22組成的組的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多聚體肽配體復(fù)合物，其中所述序列選自由SEQID NO :1-4組成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多聚體肽配體復(fù)合物，其中所述四聚體復(fù)合物具有約8.3xIO^7M 的 Ki。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的四聚體肽配體復(fù)合物，其中所述復(fù)合物具有式(PAKTLLPTPGGS (PEG5000)) 4KKKKDOTA β A-NH2。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多聚體肽配體復(fù)合物，其中所述螯合劑選自由DTPA、D03A、DOTA, EDTA, TETA, EHPG, HBED, ΝΟΤΑ、DOTMA, TETMA, PDTA, TTHA, LICAM、HYNIC 和 MECAM 組成的組。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多聚體肽配體復(fù)合物，其中所述顯像劑選自由放射性核素、放射性造影剤、順磁離子、金屬、生物標(biāo)簽、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、超聲造影剤和光敏劑組成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多聚體肽配體復(fù)合物，其中所述顯像劑是放射性核素。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的多聚體肽配體復(fù)合物，其中所述放射性核素選自由η°Ιη、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、1231、124I、1251、131I、154-158Gd、32p、nC、13N、150、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55CO、72AS、75Br、76fc、82mRb、83Sr 和其他Y-、β -或正電子-發(fā)射體組成的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的多聚體肽配體復(fù)合物，其中所述放射性核素是mIn。
13.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多聚體肽配體復(fù)合物，其中所述聚こニ醇是聚こニ醇5000。
14.一種檢測(cè)受治療者體內(nèi)的網(wǎng)蛋白-I或其同源物或片段的方法，所述方法包括向受治療者施用包含顯像劑的權(quán)利要求I的多聚體肽配體復(fù)合物，和檢測(cè)包含網(wǎng)蛋白-I的細(xì)胞的位置。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述多聚體肽配體復(fù)合物具有式(PAKTLLPTPGGS (PEG5000)) 4KKKKD0TA β A-NH2 且所述顯像劑為 mIn。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中用與計(jì)算機(jī)連接的SPECT/CT掃描儀檢測(cè)所述顯像劑，并使用程序分析成像數(shù)據(jù)。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中組成所述多聚體肽配體的肽各自具有獨(dú)立地選自由SEQ ID NO :1-4和9-22組成的組的序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述顯像劑選自由放射性核素、放射性造影剤、順磁離子、金屬、生物標(biāo)簽、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、超聲造影剤和光敏劑組成的組。
19.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述網(wǎng)蛋白-1或其同源物或片段是細(xì)胞表面網(wǎng)蛋白-1或其同源物或片段。
20.一種用于檢測(cè)癌癥、診斷癌癥、監(jiān)控癌癥進(jìn)展或監(jiān)控癌癥治療的方法，其中所述癌癥的細(xì)胞表達(dá)網(wǎng)蛋白-I或其同源物或片段，所述方法包括向受試受治療者施用包含權(quán)利要求I的多聚體肽配體復(fù)合物的藥物組合物，其中所述復(fù)合物包含顯像劑，檢測(cè)所述顯像劑和確定所述顯像劑在所述受試受治療者體內(nèi)的水平和位置和將所述水平和位置與來(lái)自未受影響的受治療者的其他方面相同的位置或所述受試受治療者的未受影響的區(qū)域的所述顯像劑的水平和位置進(jìn)行對(duì)比，其中與所述顯像劑在來(lái)自未受影響的受治療者或來(lái)自所述受試受治療者的未受影響的區(qū)域的所述樣品中的水平和位置相比，所述顯像劑在所述受試受治療者體內(nèi)的更高水平或不同位置表明所述受試受治療者患有表達(dá)網(wǎng)蛋白-I或其同源物或片段的癌癥，從而檢測(cè)癌癥、診斷癌癥、監(jiān)控癌癥進(jìn)展或監(jiān)控癌癥治療，其中所述癌細(xì)胞表達(dá)網(wǎng)蛋白-I或其同源物或片段。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述癌癥選自由頭頸癌、肝癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、前列腺癌、腎上腺癌、淋巴瘤、唾液腺癌、骨癌、腦癌、小腦癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、ロ鼻咽癌、NPC、腎癌、膀胱癌、皮膚癌、黑色素瘤、基底細(xì)胞癌、硬腭癌、舌鱗狀細(xì)胞癌、腦膜瘤、多形性腺瘤、星形細(xì)胞瘤、軟骨肉瘤、皮質(zhì)腺瘤、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和腺癌組成的組。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述癌癥是胰腺癌。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述胰腺癌選自由胰導(dǎo)管腺癌、胰上皮內(nèi)瘤變、腺瘤、伴有發(fā)育異常的腺瘤和原位癌組成的組。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述癌癥是轉(zhuǎn)移性癌。
25.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中組成所述多聚體肽配體復(fù)合物的肽各自具有獨(dú)立地選自由SEQ ID NO :1-4和9_22組成的組的序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述多聚體肽配體復(fù)合物具有式(i3AKTLLPTPGGS (PEG5000)) 4KKKKDOTA β A-NH2 且所述顯像劑為 mIn。
27.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述顯像劑選自由放射性核素、放射性造影剤、順磁離子、金屬、生物標(biāo)簽、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、超聲造影剤和光敏劑組成的組。
28.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述網(wǎng)蛋白-1或其同源物或片段是細(xì)胞表面網(wǎng)蛋白-1或其同源物或片段。
29.一種用于診斷受治療者體內(nèi)的癌癥的方法，其中所述癌癥的細(xì)胞表達(dá)網(wǎng)蛋白-I或其同源物或片段，所述方法包括獲得來(lái)自所述受治療者的生物樣品，使所述樣品與包含權(quán)利要求I的多聚體肽配體復(fù)合物的組合物接觸，其中所述復(fù)合物包含顯像劑，將所述網(wǎng)蛋白-I在來(lái)自所述受試受治療者的所述樣品中的水平或位置與從未受影響的受治療者獲得的其他方面相同的樣品的網(wǎng)蛋白-I的水平或位置或與包含已知量的網(wǎng)蛋白-I的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行對(duì)比，其中網(wǎng)蛋白-I在來(lái)自所述受試受治療者的所述樣品中的更高水平表明所述受試受治療者患有癌癥。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述多聚體肽配體復(fù)合物具有式(i3AKTLLPTPGGS (PEG5000)) 4KKKKDOTA β A-NH2。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述顯像劑選自由放射性核素、放射性造影剤、順磁離子、金屬、生物標(biāo)簽、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、超聲造影剤和光敏劑組成的組。
32.—種藥物組合物，包含藥學(xué)可接受的載體和權(quán)利要求I的多聚體肽配體復(fù)合物。
33.ー種試劑盒，包括包含藥學(xué)可接受的載體和權(quán)利要求I的多聚體肽配體復(fù)合物的藥物組合物、涂抹器和關(guān)于其使用的說(shuō)明材料，和任選地顯像劑和治療劑。
34.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多聚體肽配體復(fù)合物，包含顯像劑，其中所述復(fù)合物具有結(jié)構(gòu)
全文摘要
本發(fā)明提供了用于檢測(cè)并定位生物標(biāo)志網(wǎng)蛋白-1的診斷和成像技術(shù)的組合物和方法。本發(fā)明提供了可偶聯(lián)顯像劑和/或治療劑的用于靶向網(wǎng)蛋白-1的多聚體肽配體復(fù)合物，例如具有式(βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2的多聚體肽配體復(fù)合物。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102762984SQ201080060246
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月5日
發(fā)明者金柏莉·A·凱利 申請(qǐng)人:弗吉尼亞大學(xué)專(zhuān)利基金會(huì)