專利名稱：轉(zhuǎn)基因非人動物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，包含轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因非人動物及其產(chǎn)生的方法，以及使用包含轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因非人動物的方法。本發(fā)明的一個實施方案涉及無創(chuàng)地在全動物、組織切片或天然細胞中利用在配體結(jié)合至GPCR受體后對通道調(diào)節(jié)有應(yīng)答的、包含生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因報告系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因模型檢測GPCR配體的方法。
背景技術(shù)：
在藥物研發(fā)過程中，淘汰率很高，五種化合物中只有一種能通過美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的批準(DiMasi, JA, et al, J Health Econ 22，151-185，2003)。此外，盡管投資大大增加了，新藥物的引入在過去30年中保持相對穩(wěn)定，新藥類別中，每年只有兩到三個有進展，最終能夠上市(Lindsay MA, Nature Rev Drug Discovery, 2，831-838，2003)。
應(yīng)用于藥物研發(fā)初始階段的分子和功能性成像可提供生物活性的證據(jù)并證實推定的藥物對其預(yù)期的目標有效。因此，人們對在分子成像技術(shù)投資很有希望能夠促進藥物研發(fā)過程(Rudin M, Progress in Drug Res vol 62)。分子成像技術(shù)相對于更傳統(tǒng)的讀數(shù)方法的優(yōu)勢在于，它們可在完整無損的生物體中進行，并具有足夠的空間和時間分辨率來研究體內(nèi)的生物過程。此外，該技術(shù)還允許在不同的時間點對同一生物模型進行重復(fù)、無創(chuàng)、一致且相對自動化的研究，因此增加了縱向研究的統(tǒng)計效力，并減少所需動物的數(shù)目，因而降低了藥物研究的成本。分子成像分子成像是指通過多學(xué)科(細胞和分子生物學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、物理學(xué)、生物信息學(xué)和工程學(xué))方法的綜合，在活體生物中在細胞和亞細胞水平上利用并整合成像技術(shù)來評估特定的分子過程(Massoud T. F·，Genes Dev. 17:545-580，2003)。遺傳工程的出現(xiàn)已經(jīng)給應(yīng)用科學(xué)(包括例如藥物研發(fā))帶來了重大的變化。同樣地，動物成像技術(shù)的研發(fā)和利用為臨床前研究提供了新的手段(Maggie A. and CianaP.，Nat. Rev. Drug Discov. 4，249-255，2005)。由于對生理事件進行實時定量的困難，因此傳統(tǒng)上動物模型的使用很不方便。這些年來，已經(jīng)研發(fā)出新的成像技術(shù)來克服這一困難，所述技術(shù)例如磁共振成像(MRI)和正電子發(fā)射體層照相術(shù)(PET)。最近，基于螢光素酶(即螢火蟲的發(fā)光酶)的體內(nèi)表達的生物發(fā)光成像已被用于無創(chuàng)檢測。分子成像生物發(fā)光體內(nèi)生物發(fā)光成像(BLI)是一種基于檢測細胞或組織光發(fā)射的靈敏工具。報告基因的使用使得有可能通過體內(nèi)成像方法在活體動物中分析特定細胞和生物過程。生物發(fā)光，即用酶法催化活體生物產(chǎn)生可見光，在很多非哺乳動物物種中是一種天然發(fā)生的現(xiàn)象(Contag, C. H. , et al, Mol. Microbiol. 18:593-603，1995)。螢光素酶是催化底物氧化以釋放光子的酶(Greer L. F.，III，Luminescence 17:43-74, 2002) 對北美螢火蟲的生物發(fā)光研究最為廣泛。螢火蟲螢光素酶基因((Iuc)表達產(chǎn)生螢光素酶，它將底物D-螢光素轉(zhuǎn)化成非反應(yīng)性氧化螢光素，結(jié)果在562nm產(chǎn)生綠色發(fā)光。由于哺乳動物組織并不能天然地產(chǎn)生生物發(fā)光，體內(nèi)BLI具有相當大的吸引力，因為產(chǎn)生的圖像只有很小的背景信號。
BLI要求利用由選擇的基因啟動子(其從組成上啟動發(fā)光報告基因)所控制的生物發(fā)光報告基因所組成的表達盒，對細胞或組織進行基因工程處理(圖3)。為了誘發(fā)發(fā)光，例如螢光素的底物可通過腦室內(nèi)(icv)、靜脈內(nèi)(iv)、腹膜內(nèi)(ip)或皮下(sq)注射給藥。螢光素酶發(fā)射的光可穿透幾毫米到幾厘米的組織深度，但是，每深入組織一厘米，光子強度則降低 10 倍(Contag, C. H. , et al, Mol. Microbiol. 18:593-603，1995)。必須使用靈敏的光檢測儀器來檢測體內(nèi)生物發(fā)光。檢測器測量每單位面積發(fā)射的光子數(shù)目。利用電荷耦合裝置照相機可檢測波長在400和IOOOnm之間的低強度光，該照相機將撞擊硅晶片的光子轉(zhuǎn)換成電子(Spibey CP et al electrophoresis 22:829-836,2001)。軟件可將電子信號轉(zhuǎn)換成二維圖像。軟件還可以對發(fā)射光的強度(撞擊檢測器的發(fā)射光子的數(shù)目)進行定量，并將這些數(shù)值轉(zhuǎn)換成偽色(pseudocolor)圖形或灰度圖像(圖2A和2B)。實際的數(shù)據(jù)是以光子測量的，但是，偽色圖像允許研究人員進行快速視覺解釋。對于更細微的差另O，則可能需要在感興趣的區(qū)域進行定量測量。使用冷卻的電荷耦合裝置(CCD)照相機可降低熱噪音，光密閉機箱可使螢光素酶產(chǎn)生的光實現(xiàn)最佳視覺化和定量(Contag C. H. andBachmann, Μ. H. , Annu. Rev. Biomed. Eng. 4:235-260，2002)。
有用的是，將螢光素酶圖像疊加到另一種類型的圖像上，所述圖像例如發(fā)射信號解剖位置的自動繪像或射線照片(圖2B)。軟件可疊加圖像用于可視化和解釋。通過動物基因工程和分子成像技術(shù)的結(jié)合，有可能對活體動物體內(nèi)的特定分子過程進行動態(tài)研究。這一方法可能潛在地影響臨床前研究方案，因此正在廣泛地改變醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的各個方面(Maggie A. Trends Pharmacolo. Sci 25, 337-342，2004)。G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)-GPCRs作為藥物靶點GPCRs組成了一個很大的細胞表面受體的超家族，可根據(jù)其共有的形態(tài)結(jié)構(gòu)分類為100多個亞家族，GPCR亦稱為七跨膜(7TM)受體。在制藥行業(yè)，GPCR是最經(jīng)常涉及的藥物靶點。所有的上市處方藥物中，大約有30%以GPCR為靶點，使得這一蛋白質(zhì)家族成為藥學(xué)上最成功的一類靶點(Jacoby, E; Chem. Med. Chem.，1:761-782，2006)。GPCR和其細胞外配體之間的相互作用已被證明是治療劑的一個很有吸引力的干擾點。由于這一原因，制藥行業(yè)已經(jīng)研發(fā)了用于發(fā)現(xiàn)生物化學(xué)藥物的分析方法來研究這些配體-GPCR相互作用。活化的GPCR與異源三聚體G蛋白的相互作用催化鳥苷二磷酸(⑶P)與鳥苷三磷酸(GTP)的交換，使之能與幾個下游效應(yīng)子相互作用(Cabrera-VeraT. M.，Endocr. Rev. 24:765-781, 2003)。下游信號取決于所研究GPCR所優(yōu)選的G-α同種型。G- a q/11家族蛋白質(zhì)刺激磷脂酶C(PLC)，而G- a i/0和G- a s家族的代表性蛋白質(zhì)主要調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶(AC)的活性。如果所研究的GPCR通過PLC發(fā)送信號，那么，最廣泛應(yīng)用的基于報告基因的測定GPCR活化的技術(shù)為一種鈣(Ca+2)釋放分析，或是利用Ca+2敏感的熒光團以熒光形式測量(Sullivan E, Methods Mol. Biol. 114:125-133，1999)，或利用水母發(fā)光蛋白和一個化學(xué)發(fā)光底物以發(fā)光的形式測量(Dupriez V. J. , ReceptorsChannels 8:319-330, 2002) 如果所研究的GPCR通過AC發(fā)送信號，那么，則可以利用各種檢測技術(shù)測定胞衆(zhòng)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的含量(Gabriel D. Assay Drug Dev.Technol. 1:291-303, 2003)?；贕PCR報告基因的分析已被廣泛用于當前的藥物發(fā)現(xiàn)計劃中。典型情況下，GPCR報告基因被引入基于細胞的系統(tǒng)來支持大的藥物庫的體外高通量篩選(HTS)以鑒定活化或調(diào)節(jié)特定GPCR的配體或化合物。后續(xù)及跟進的基于細胞的分析證實并細化高通量篩選中鑒定的針對特定GPCR的任何“命中”，但是，同樣的是，這些分析依賴于重組DNA方法以將一個克隆的GPCR引入轉(zhuǎn)換的細胞類型。盡管轉(zhuǎn)換的細胞類型有極佳的增殖能力以支持大的篩選計劃，但它們通常顯示異常的遺傳特性和功能特性，結(jié)果，利用這種模式進行HTS篩選會遇到推定“命中”顯著下降的問題。幾年來，基于生物發(fā)光的報告基因分析已被用來測量GPCR的功能活性(Hill，S.J. Curr. Opin. Pharmacol. 1:526-532, 2001)。由于生物發(fā)光讀數(shù)的低背景信號和GPCR活化和累積性報告基因表達之間的信號擴增步驟，這一分析形式很靈敏。報告基因的啟動子中的cAMP應(yīng)答元件(CRE)使得有可能對依賴G-蛋白的信號傳導(dǎo)進行特異性監(jiān)控。當一個配體結(jié)合至GPCR上時，它在GPCR中引起構(gòu)象變化，這允許它活化相關(guān)的G-蛋白。腺苷酸環(huán)化酶是一種可由G-蛋白調(diào)控的細胞蛋白。當腺苷酸環(huán)化酶結(jié)合至活化的G蛋白的亞單位時，它既可被活化也可被抑制。信號轉(zhuǎn)換取決于G蛋白的類型。腺苷酸環(huán)化酶的作用可在細胞中增加或降低cAMP的生成。產(chǎn)生的cAMP是細胞代謝作用中 的。當cAMP結(jié)合至PKA調(diào)控亞單位時，它們的構(gòu)象被改變，造成調(diào)控亞單位的分解，從而活化蛋白激酶A并允許發(fā)生進一步生物效應(yīng)。然后，PKA發(fā)生磷酰化并活化轉(zhuǎn)錄因子CREB。CREB結(jié)合至某些稱為cAMP應(yīng)答元件(CRE)的DNA序列并因此增加或減少轉(zhuǎn)錄，從而增加或降低某些基因，如螢光素酶報告基因的表達。CreLuc轉(zhuǎn)基因設(shè)計用來直接通過cAMP細胞內(nèi)信號通路或間接通過經(jīng)由PLC的信號傳導(dǎo)來檢測所有三種主要GPCR的活化。由于任何一種細胞類型在其表面上都包含許多不同類型的GPCR，(因此任何細胞在細胞內(nèi)都同時有GPCR通過G-α q/11、G- a i/0和G-a s的信號傳導(dǎo))，因此習(xí)慣思維認為，例如CreLuc的轉(zhuǎn)基因?qū)⒉豢赡芫哂凶銐虻奶禺愋詠韰^(qū)分任何特定的GPCR配體。但是，我們在此證明，CreLuc轉(zhuǎn)基因能夠區(qū)分GPCR配體。我們預(yù)計，螢光素酶報告基因在細胞、組織、切片或整個動物中的生物發(fā)光信號將隨著毛喉素增力口，且將由Gs、Gq或Gi受體的配體調(diào)控。表I顯示CreLuc報告基因系統(tǒng)結(jié)合至GPCR配體時，GPCR活化/抑制對CreLuc報告基因系統(tǒng)的預(yù)期效應(yīng)。此外，我們給出的數(shù)據(jù)證明，我們的新CreLuc報告基因系統(tǒng)可區(qū)分不同類別的GPCR配體，且用于細胞、組織切片和整個動物時，這樣的報告基因系統(tǒng)適用于鑒定新的GPCR配體。表I.當配體結(jié)合至特定的GPCR時，預(yù)期的CreLuc報告基因的生物發(fā)光信號變化
受體類型激動劑拮抗劑，反向激動劑
Gs; Gq增強減弱
~GiMllGPCR生物成像報告基因轉(zhuǎn)基因模型當前藥物發(fā)現(xiàn)的模式中，在從基于細胞的報告基因分析向體內(nèi)模型過渡時，可能的候選藥物淘汰率相當高?，F(xiàn)有無數(shù)的體內(nèi)模型概括了一種特定的人類疾病的全部或部分要點。在這些模型中，展示先導(dǎo)化合物活性是新的化學(xué)GPCR藥物進展的一個重要的里程碑。動物疾病模型通常需要大量的動物和時間以研發(fā)其表型并準確檢測候選化合物對改變疾病結(jié)果的影響。體外試驗后，在一個復(fù)雜的系統(tǒng)中試驗候選藥物，下一步要做的是使用基于機理的疾病狀態(tài)體內(nèi)試驗或體內(nèi)模型。人們對未能改變所誘導(dǎo)的疾病結(jié)果的原因通常了解很少，但是這卻在藥物研發(fā)的工作流程中造成了候選化合物淘汰率高的結(jié)果。包含GPCR配體結(jié)合和活化報告基因分析的轉(zhuǎn)基因模型對當前GPCR藥物發(fā)現(xiàn)的模式將是一個重要的改進。例如，本發(fā)明的一個實施方案描述了一種包含基于螢光素酶報告基因(CreLuc)的cAMP報告基因分析的轉(zhuǎn)基因方法，該方法與整體動物、組織或細胞的分子成像相結(jié)合，將顯著地加速GPCR配體藥物的發(fā)現(xiàn)(Bhaumik, S. and Gambhir, S. S. , Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 99:377-382 2002;Hasan M. T. , et al. , Genesis 29:116-122,2001)。如本文所述，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人動物實施方案提供了以下非限制性的優(yōu)勢I.基于組織或細胞的分析具有和轉(zhuǎn)基因體內(nèi)模型分析同樣的報告基因系統(tǒng)，因此在復(fù)雜的完整生物系統(tǒng)中減少了未知因素的數(shù)目。2.無創(chuàng)成像可在同一動物的時間過程分析中對配體或化合物活性進行定量分析。·3.無創(chuàng)成像減少了每項研究需要的動物數(shù)目，由于每只動物就是其自身的對照，其中所述對照為在時間零點分析的動物，因此達到了更大的統(tǒng)計效力。4.轉(zhuǎn)基因動物將是一個支持體外或離體平行分析的細胞和組織來源。5.轉(zhuǎn)基因動物分析將支持天然細胞類型中配體活性的分析，該分析導(dǎo)致更現(xiàn)實的配體受體相互作用特征。6.轉(zhuǎn)基因動物允許對GPCR配體同時進行藥效學(xué)和藥物動力學(xué)評估。7.轉(zhuǎn)基因動物可在器官和整個動物水平上對組織和細胞類型特異性進行同時鑒定。8.轉(zhuǎn)基因動物允許與其他遺傳改變的模型進行雜交育種以揭示新信號通路及其對特異配體的應(yīng)答。目前在分子過程如藥物代謝(Zhang ff. , et al. Drug Metab.Dispos. 31:1054-1064, 2003)和基因毒性(Gossen J. A. , et al. , Proc. Natl. Acad.Sci. USA 86:7971-7975，1989)以及毒性化合物的效應(yīng)(Sacco M. G. et al. , Nat.Biotechnol. 15:1392-1397, 1997)研究中采用了許多利用不同報告基因進行工程改造的轉(zhuǎn)基因動物。為了達到設(shè)計目標，適合進行分子成像研究的GPCR報告基因動物必須包含幾種要素并經(jīng)過安排，以便既允許高水平的報告基因表達以支持大的生物發(fā)光檢測窗口，也允許在每一種細胞類型中表達以支持所研究的配體或化合物生物分布的廣泛的急性體內(nèi)分析。基因表達所涉及的機理的復(fù)雜性和多樣性使得研究人員永遠無法構(gòu)建在所有情況下都能夠在轉(zhuǎn)基因動物中以完全可以預(yù)測的方式表達的基因(Pinkert，C. A. (ed.) 1994.Transgenic animal technology: A laboratory handbook. Academic Press,Inc.，SanDiedoj Calif. ;Monastersky G. M. and Roblj J. M. (ed.) (1995) Strategies in TransgenicAnimal Science. ASM Press. Washington D. C)。只有通過大量的反復(fù)試驗才能獲得可提供GPCR報告基因生物成像所要求的模型設(shè)計目標的獨特的轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)組合。利用轉(zhuǎn)基因GPCR報告基因與重組細胞分析的比較隨著篩選技術(shù)發(fā)展到可了解單個GPCR行為的程度，很清楚，這些受體相比于開關(guān)作用而言，更多地起著信息微處理器的作用。這就引入了功能選擇性的現(xiàn)象，其中有些配體僅活化特定受體介導(dǎo)的信號機理的一部分，這給藥物發(fā)現(xiàn)開辟了新的視野。發(fā)現(xiàn)新的GPCR配體關(guān)系并對藥物對這些復(fù)雜系統(tǒng)的影響進行定量以指導(dǎo)藥物化學(xué)的需求，給任何藥理報告基因分析都帶來了相當高的要求。這一概念驅(qū)動研究從還原論的基于重組細胞的篩選系統(tǒng)回歸整體系統(tǒng)分析。用一種特異的GPCR或一組GPCR在天然細胞環(huán)境確定配體活性的特征預(yù)期會改善針對一類藥學(xué)上重要的受體識別新藥的成功率(Kenakin TP, Nat. Rev. DrugDiscov. 8，617-625，2009)。包含生物發(fā)光GPCR報告基因的轉(zhuǎn)基因動物模型是一個很有利的分子成像策略，其在完整的生物復(fù)雜系統(tǒng)中定義GPCR配體活性，目標是改進藥物發(fā)現(xiàn)以治療人類疾病。由于CRE/CREB的活化涉及許多各種各樣的生物過程，人們對利用CRE/CREB報告基因表達系統(tǒng)來研究CRE活化具有相當大的興趣。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)是受體活化和其后的蛋白激酶活化后分子內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使，因此也涉及許多生物過程的調(diào)控。被cAMP活化的激酶磷酸化的CREB(cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白)結(jié)合至許多基因啟動 子區(qū)域的cAMP應(yīng)答兀件(CRE)上并啟動轉(zhuǎn)錄(Shaywitz and Greenberg, Annul. Rev.Biochem. ,68:821-861, 1999)。利用帶有六個串聯(lián)CRE并帶有促進β -半乳糖苷酶表達的最小單純皰疹病毒(HSV)啟動子的轉(zhuǎn)基因小鼠來研究大腦切片中CRE介導(dǎo)的基因的表達對慢性抗憂郁治療的應(yīng)答，(Thome J.，et al.，J. Neurosci. 20:4030-4036, 2000)。類似地，帶有四套稠合到胸腺嘧啶去氧核苷激酶啟動子的大鼠生長抑素基因啟動子CRE和螢光素酶基因的轉(zhuǎn)基因小鼠已被用來在大腦組織切片或組織勻漿中研究CRE的活化(Boer et al, PloSOne, May 9;2(5) :e431，2007)。但是，因需要篩選大量的轉(zhuǎn)基因系以便找到適當?shù)膭游锬Ｐ投璧K了迄今為止的研究。此外，鑒定了適當?shù)霓D(zhuǎn)基因系之后，相對低水平的報告基因表達要求處死轉(zhuǎn)基因動物，以便測量報告基因，因此，在一個單個試驗?zāi)Ｊ街行枰褂么罅康膭游?。本發(fā)明一個實施方案為研發(fā)了一種包含絕緣子元件、應(yīng)答元件、啟動子元件、報告基因和功能兀件的轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因因其聞?wù)下屎吐勊降膱蟾婊虮磉_，可快速引入到非人動物中，因此，很容易研發(fā)轉(zhuǎn)基因動物，其作為模型在體內(nèi)(即在活體動物中)、原位(如大腦切片、完整全器官)或體外(如從轉(zhuǎn)基因動物、組織勻漿培養(yǎng)的原代細胞)研究調(diào)控元件的活化。本發(fā)明的一個實施方案為包含CRE Luc報告基因系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因,其用于在非人動物中作為模型通過分子內(nèi)cAMP水平的體內(nèi)調(diào)控來對GPCR配體活性進行定量。作為一個非限制性實例，我們利用一般的cAMP調(diào)控，通過分離的原代細胞和全動物中的生物發(fā)光證明了螢光素酶報告基因的變化。在另一個實施方案中，利用螢光素酶體外分析法分析并確認了組織提取物中報告基因的活化。已經(jīng)在多個小鼠系中記錄了 CRE Luc轉(zhuǎn)基因的應(yīng)答，其顯示單個或多個組織活化特征。此外，作為非限制性實例，我們證明了特異性GPCR配體在全動物、組織切片和原代細胞中活化了 CRE Luc轉(zhuǎn)基因。發(fā)明概述總體上，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體、包含轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因非人動物及其產(chǎn)生的方法，以及使用包含轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因非人動物的方法。本發(fā)明的一個實施方案提供了包含CRE Luc報告基因系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體。本發(fā)明的一個實施方案是將包含CRELuc報告基因系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體引入非人動物。由于cAMP調(diào)控是GPCR的關(guān)鍵活化通路，本發(fā)明可作為一個平臺，對全動物(wholeanimal)、組織切片或細胞中的GPCR被配體或化合物通過報告基因的活化而發(fā)生的活化進行定量，其中報告基因提供可量度的生物發(fā)光信號，如螢光素被螢光素酶代謝的信號。本發(fā)明提供工具來改善新藥發(fā)現(xiàn)實體，例如配體或化合物從基于細胞的分析向全動物的過渡。本發(fā)明的一個實施方案使用與天然細胞中相同的報告基因系統(tǒng)，這將減少新的GPCR配體的淘汰率，同時提供生物利用度數(shù)據(jù)。本發(fā)明的一個實施方案為具有包含轉(zhuǎn)基因基因組的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中的轉(zhuǎn)基因包含第一絕緣子元件、應(yīng)答元件、啟動子、生物發(fā)光報告基因、功能元件和第二絕緣子元件。本發(fā)明的一個實施方案為轉(zhuǎn)基因非人動物，其中第一絕緣子元件選自以下一組元 件核基質(zhì)附著區(qū)(MAR)、DNase I-超敏位點(HS4)和反向末端重復(fù)序列(ITR)。本發(fā)明的另一個實施方案為轉(zhuǎn)基因非人動物，其中第二絕緣子元件選自以下一組元件核基質(zhì)附著元件(MAR)、HS4和ITR。本發(fā)明的另一實施方案為一種轉(zhuǎn)基因非人動物，其中第一絕緣子與第二絕緣子相同。本發(fā)明的一個實施方案包括一種轉(zhuǎn)基因非人動物，其中的應(yīng)答元件選自以下一組元件cAMP應(yīng)答元件(CRE)、激活蛋白I (ASPl)、糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件(GRE)、熱休克應(yīng)答元件(HSE)、血清應(yīng)答元件(SRE)、甲狀腺應(yīng)答元件(TRE)和雌激素應(yīng)答元件(ERE)。本發(fā)明的另一個實施方案為一種轉(zhuǎn)基因非人動物，其中應(yīng)答元件串聯(lián)重復(fù)2到24次。本發(fā)明的另一實施方案為一種轉(zhuǎn)基因非人動物，其中應(yīng)答元件串聯(lián)重復(fù)6次。本發(fā)明的另一實施方案為一種轉(zhuǎn)基因非人動物，其中應(yīng)答元件為CRE，其中CRE應(yīng)答元件可為單個元件或重復(fù)2到24次。本發(fā)明的一個實施方案為一種轉(zhuǎn)基因非人動物，其中的啟動子為最小單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV TK min)。本發(fā)明的一個實施方案為一種轉(zhuǎn)基因非人動物，其中的生物發(fā)光報告基因選自以下一組生物發(fā)光報告基因螢光素酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、半乳糖苷酶、分泌的堿性磷脂酶(SEAP)、人生長激素(HGH)和綠熒光蛋白(GFP)。本發(fā)明的一個實施方案為一種轉(zhuǎn)基因非人動物，其中的功能元件為人生長激素(hGH)基因。本發(fā)明的一個實施方案為一種轉(zhuǎn)基因非人動物，其中的轉(zhuǎn)基因包含SEQ IDNO:18。本發(fā)明的一個實施方案為一種轉(zhuǎn)基因非人動物，其中的轉(zhuǎn)基因包含SEQ IDNO:19。本發(fā)明的一個實施方案為一種從轉(zhuǎn)基因非人動物分離的細胞或從權(quán)利要求I的轉(zhuǎn)基因非人動物分離的組織切片。本發(fā)明的一個實施方案為一種鑒定G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)配體的方法，該方法包括(a)在本文公開的轉(zhuǎn)基因非人動物中測量生物發(fā)光的量；(b)對轉(zhuǎn)基因非人動物給予試驗藥物；(C)在給予試驗藥物后的一個或多個時間點測量該轉(zhuǎn)基因非人動物生物發(fā)光的量；以及(d)比較(a)中測量的生物發(fā)光的量和(C)中測量生物發(fā)光的量，其中(a)中生物發(fā)光的量與(C)中的生物發(fā)光的量的差別將所述試驗藥物鑒定為GPCR配體。本發(fā)明的一個實施方案為一種鑒定G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)配體的方法，該方法包括(a)從本文公開的轉(zhuǎn)基因非人動物制備組織切片；(b)測量該組織切片中生物發(fā)光的量；(C)對組織切片給予試驗藥物；(d)在給予試驗藥物后的一個或多個時間點測量生物發(fā)光的量；以及(e)比較(b)中測量的生物發(fā)光的量和⑷中測量生物發(fā)光的量，其中(b)中生物發(fā)光的量與(d)中的生物發(fā)光的量相比較的差別將所述試驗藥物鑒定為GPCR配體。本發(fā)明的一個實施方案為一種鑒定G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)配體的方法，該方法包括(a)制備從本文公開的轉(zhuǎn)基因非人動物分離的細胞；(b)測量細胞中生物發(fā)光的量；(C)對細胞給予試驗藥物；(d)在給予試驗藥物后的一個或多個時間點測量生物發(fā)光的量；以及(e)比較(b)中測量的生物發(fā)光的量和(d)中測量生物發(fā)光的量，其中(b)中生物發(fā)光的量與(d)中的生物發(fā)光的量相比較的差別將所述試驗藥物鑒定為GPCR配體。本發(fā)明的一個實施方案為一種在轉(zhuǎn)基因非人動物中監(jiān)控GPCR功能的方法，該方法包括(a)用轉(zhuǎn)基因方法修飾非人動物以表達包含第一絕緣子元件、應(yīng)答元件、啟動子、·生物發(fā)光報告基因、功能元件和第二絕緣子元件的轉(zhuǎn)基因；(b)監(jiān)控非人動物的生物發(fā)光；以及(c)將所述生物發(fā)光與GPCR功能相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的一個實施方案為一種在轉(zhuǎn)基因非人動物中監(jiān)控GPCR功能的方法，該方法包括(a)用轉(zhuǎn)基因方法修飾非人動物以表達包含第一絕緣子元件、應(yīng)答元件、啟動子、生物發(fā)光報告基因、功能元件和第二絕緣子元件的轉(zhuǎn)基因；(b)監(jiān)控非人動物的螢光素酶；以及(c)將所述生物發(fā)光與GPCR功能相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的一個實施方案為一種在轉(zhuǎn)基因非人動物中監(jiān)控GPCR功能的方法，該方法包括(a)用轉(zhuǎn)基因方法修飾非人動物以表達包含第一絕緣子元件、應(yīng)答元件、啟動子、生物發(fā)光報告基因、功能元件和第二絕緣子元件的轉(zhuǎn)基因；(b)處理非人動物以模擬疾病狀態(tài)的情況；(C)監(jiān)控非人動物的生物發(fā)光；以及(d)將所述生物發(fā)光與GPCR功能相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的一個實施方案為一種在轉(zhuǎn)基因非人動物中監(jiān)控GPCR功能的方法，該方法包括(a)用轉(zhuǎn)基因方法修飾非人動物以表達包含第一絕緣子元件、應(yīng)答元件、啟動子、生物發(fā)光報告基因、功能元件和第二絕緣子元件的轉(zhuǎn)基因；(b)處理非人動物以模擬疾病狀態(tài)的情況；(C)監(jiān)控非人動物的螢光素酶；以及(d)將所述生物發(fā)光與GPCR功能相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的一個實施方案為一種制備非人轉(zhuǎn)基因動物以用來監(jiān)控GPCR功能的方法，該方法包括(a)用轉(zhuǎn)基因方法修飾非人動物以表達包含第一絕緣子元件、應(yīng)答元件、啟動子、生物發(fā)光報告基因、功能元件和第二絕緣子元件的轉(zhuǎn)基因；(b)測量(a)中的轉(zhuǎn)基因非人動物的生物發(fā)光的量；(c)對轉(zhuǎn)基因非人動物給予GPCR配體；(d)在給予GPCR配體后的一個或多個時間點測量生物發(fā)光的量；以及(e)比較(b)中測量的生物發(fā)光的量和(d)中測量生物發(fā)光的量，其中(b)中生物發(fā)光的量與(d)中的生物發(fā)光的量相比較的差別則將該非人轉(zhuǎn)基因動物鑒定為具有監(jiān)控GPCR功能的用途。本發(fā)明的一個實施方案為一種鑒定調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的化合物的方法，該方法包括(a)從本文公開的轉(zhuǎn)基因非人動物制備細胞；(b)測量該細胞中生物發(fā)光的量；(C)對細胞給予試驗藥物；(d)在給予試驗藥物后的一個或多個時間點測量生物發(fā)光的量；以及(e)比較(b)中測量的生物發(fā)光的量和(d)中測量生物發(fā)光的量，其中(b)中生物發(fā)光的量與(d)中的生物發(fā)光的量的差別將所述試驗藥物鑒定為GPCR配體。
本發(fā)明的一個實施方案為一種鑒定調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的化合物的方法，該方法包括(a)在一個或多個容器中加入從本文公開的轉(zhuǎn)基因非人動物分離的細胞；(b)在一個或多個容器中加入對照；(c)在一個或多個容器中加入試驗藥物；以及(d)測量上述容器中的螢光素酶的量，其中含對照的容器中的螢光素酶的量與含試驗藥物的容器中的螢光素酶的量的差別指示調(diào)控GPCR的化合物。本發(fā)明的一個實施方案為一種鑒定調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的化合物的方法，該方法包括(a)在一個或多個容器中加入從本文公開的轉(zhuǎn)基因非人動物分離的細胞；(b)在一個或多個容器中加入基本cAMP調(diào)節(jié)子；(c)在一個或多個容器中加入試驗藥物；以及(d)測量上述容器中的螢光素酶的量，其中僅含有基本cAMP調(diào)節(jié)子的容器中的螢光素酶的量與含有基本cAMP調(diào)節(jié)子和試驗藥物的容器中的螢光素酶的量相比較的差別指示調(diào)控GPCR的化合物。本發(fā)明的一個實施方案為一種鑒定調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的化合物的方法，該方法包括(a)在一個或多個容器中加入從本文公開的轉(zhuǎn)基因非人動物分離的組織切 片；(b)在一個或多個容器中加入對照；(c)在一個或多個容器中加入試驗藥物；以及(d)測量上述容器中的螢光素酶的量，其中含對照的容器中測得的螢光素酶的量與含試驗藥物的容器中測得的螢光素酶的量的差別指示調(diào)控GPCR的化合物。本發(fā)明的一個實施方案為一種鑒定調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的化合物的方法，該方法包括(a)在一個或多個容器中加入從本文公開的轉(zhuǎn)基因非人動物分離的組織切片；(b)在一個或多個容器中加入基本cAMP調(diào)節(jié)子；(c)在一個或多個容器中加入試驗藥物；以及(d)測量上述容器中的螢光素酶的量，其中僅含有基本cAMP調(diào)節(jié)子的容器中的螢光素酶的量與含有基本cAMP調(diào)節(jié)子和試驗藥物的容器中的螢光素酶的量相比較的差別指示調(diào)控GPCR的化合物。本發(fā)明的一個實施方案為一種鑒定調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的化合物的方法，該方法包括(a)在一個或多個容器中加入從本文公開的轉(zhuǎn)基因非人動物分離的細胞；(b)在一個或多個容器中加入細胞刺激物；(C)在一個或多個容器中加入試驗藥物；以及(e)測量上述容器中的螢光素酶的量，其中含有細胞刺激物的容器中的螢光素酶的量與含有試驗藥物和細胞刺激物的容器中的螢光素酶的量的差別指示調(diào)控GPCR的化合物。本發(fā)明的一個實施方案為一種鑒定調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的化合物的方法，該方法包括(a)在一個或多個容器中加入從本文公開的轉(zhuǎn)基因非人動物分離的細胞；(b)在一個或多個容器中加入細胞刺激物；(c)在一個或多個容器中加入基本cAMP調(diào)節(jié)子；(d)在一個或多個容器中加入試驗藥物；以及(e)測量上述容器中的螢光素酶的量，其中含有細胞刺激物和基本cAMP調(diào)節(jié)子的容器中的螢光素酶的量與含有細胞刺激物、基本cAMP調(diào)節(jié)子和試驗藥物的容器中的螢光素酶的量相比較的差別指示調(diào)控GPCR的化合物。本發(fā)明的一個實施方案為一種鑒定調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的化合物的方法，該方法包括(a)在一個或多個容器中加入從本文公開的轉(zhuǎn)基因非人動物分離的組織切片；(b)在一個或多個容器中加入細胞刺激物；(c)在一個或多個容器中加入試驗藥物；以及(d)測量上述容器中的螢光素酶的量，其中含有細胞刺激物的容器中的螢光素酶的量與含有試驗藥物和細胞刺激物的容器中的螢光素酶的量的差別指示調(diào)控GPCR的化合物。本發(fā)明的一個實施方案為一種鑒定調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的化合物的方法，該方法包括(a)在一個或多個容器中加入從本文公開的轉(zhuǎn)基因非人動物分離的組織切片；(b)在一個或多個容器中加入細胞刺激物；(c)在一個或多個容器中加入基本cAMP調(diào)節(jié)子；(d)在一個或多個容器中加入試驗藥物；以及(e)測量上述容器中的螢光素酶的量，其中含有細胞刺激物和基本cAMP調(diào)節(jié)子的容器中的螢光素酶的量與含有細胞刺激物、基本cAMP調(diào)節(jié)子和試驗藥物的容器中的螢光素酶的量相比較的差別指示調(diào)控GPCR的化合物。


圖I顯示CreLuc生物成像小鼠模型。該圖例示CRE Luc報告轉(zhuǎn)基因被所有三種類型的GPCR (Gi、Gs和Gq)直接通過cAMP通路或間接地通過PLC通路(A圖)分子內(nèi)活化。三種類型的GPCR的螢光素酶報告基因?qū)γ硭卣T導(dǎo)應(yīng)答的生物發(fā)光的變化示于B圖。毛喉素將增加Gs和Gq信號，因此，CreLuc生物發(fā)光將增加，而Gi誘導(dǎo)將降低來自報告基因的信號。G a s通過直接刺激AC而活化依賴于cAMP的通路，G a s抑制cAMP的生成且Gaq刺激PLC，結(jié)果產(chǎn)生了兩個第二信使IP3和DAG?？s寫a，G蛋白的a-亞單元；@，G蛋白的β-亞單元；Y，G蛋白的Y-亞單元；AC，腺苷酸環(huán)化酶；PLC，磷脂酶C ;PKA，蛋白激酶A ；·PKC，蛋白激酶C ;DAG，甘油二酯；IP3，肌醇三磷酸；Ca+2，鈣；CaMK，鈣/鈣調(diào)蛋白激酶；cAMP，環(huán)磷酸腺苷；CRE，cAMP應(yīng)答元件；CREB，cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白。圖2A顯示實時體內(nèi)生物發(fā)光成像并描述了使用這一系統(tǒng)的益處。帶有電腦分析系統(tǒng)的IviSlOO(Xenogen)生物成像儀可利用生物發(fā)光報告基因(如體內(nèi)表達的螢光素酶)發(fā)射的光來進行實時體內(nèi)成像。該軟件支持對無創(chuàng)縱向信號的定量分析。實時體內(nèi)成像相對于傳統(tǒng)的體內(nèi)化合物檢驗有許多優(yōu)勢。傳統(tǒng)的動物研究在處理的不同時間點需要單個小鼠，而利用生物成像模型進行的研究則允許利用相同的動物在多個時間點進行取樣并可在多種處理中重復(fù)使用。如圖中所示，使用當前的方法，O小時、2小時、4小時和8小時的時間過程將需要24只動物(每個時間點n=6)，而利用生物成像技術(shù)僅需要6只動物。這有幾項益處，包括高通量，因為只需要較少的實驗動物，可分析更多化合物的功效；由于可從同一動物收集時間和空間數(shù)據(jù)，可獲得更多的數(shù)據(jù)并提高數(shù)據(jù)品質(zhì)；以及降低統(tǒng)計誤差，這將提高對單個化合物所作的決策的品質(zhì)。圖2B顯示CreLuc轉(zhuǎn)基因小鼠中化合物誘導(dǎo)的典型視覺圖像。與基準水平(左圖)相比，給予異丙腎上腺素(右圖)增加CRE Luc報告基因的脊髓表達。用動物的白光圖像作為灰度偽色圖像以可視方式呈現(xiàn)生物發(fā)光檢測。圖3顯示包含多個DNA元件以增強表達的轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的示意圖。示意圖中的轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)包含以下元件示于圖中作為核基質(zhì)附著區(qū)(MAR)的絕緣子元件以產(chǎn)生獨立于位置的表達；由CRE-cAMP重復(fù)6次CRE)所代表的應(yīng)答元件；圖中所示為最小單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV TK min)的啟動子元件；由針對哺乳動物表達優(yōu)化了的螢光素酶基因代表的報告基因元件(LUC2)，以及由帶有多聚腺苷酸尾(hGH多聚腺苷酸)以增強轉(zhuǎn)基因表達的人生長激素基因表示的功能元件。圖4 :CreLuc轉(zhuǎn)基因載體的體外驗證。利用Lipofectamine 2000 (脂質(zhì)體2000)(Invitrogen, Carlsbad, CA,目錄號 11668-019)將含有 30、100 或 199ngDNA 的雜交或合成(synth)的載體(與水母螢光素酶(renilla Iuciferase)陽性對照載體一起)轉(zhuǎn)染到CHO細胞中。兩天后，細胞用3 μ M毛喉素(Sigma, St Louis, MO，目錄號F6886)刺激4小時，然后用Dual Glo螢光素酶分析系統(tǒng)(Promega，Madison，WI，目錄號E2920)測量螢光素酶的活性。對兩種載體來說，結(jié)果均顯示螢光素酶信號隨劑量增強。雜交載體達到了更高的誘導(dǎo)水平。圖5A顯示PDE抑制劑對正常小鼠的cAMP水平的影響。(摘自ChengJB, JPET, 280，621-626)。如χ-軸所列，對Balb/c小鼠給予載體或藥物，20分鐘后收集血樣并用cAMP放射免疫分析測定cAMP。劑量為10mg/kg時，CP-80，633和咯利普蘭兩者均顯著地提高了血漿中cAMP的水平。圖5B顯示血漿中cAMP的體內(nèi)刺激。對雌性FVB/Tac通過腹膜注射給予載體(1%DMS0)或藥物，30分鐘后收集血液樣本,并用ELISA (Assay Designs, Ann Arbor, MI,目錄號900-163)分析cAMP。使用的藥物如下5mg/kg毛喉素(F) (Sigma F6886)、5mg/kg水溶性毛喉素(H20F) (Calbiochem 344273)、10mg/kg 咯利普蘭(R) (Sigma R6520)或每一種毛喉素與咯利普蘭的組合(F/R)。對水溶性毛喉素與咯利普蘭組合的結(jié)果經(jīng)t-檢驗觀察到統(tǒng)計學(xué)上顯著的14倍增加。毛喉素通過活化腺苷酸環(huán)化酶而提高cAMP的水平，而TOE4抑 制劑(如咯利普蘭)則通過防止cAMP水解而提高了血漿中cAMP的含量?？├仗m和水溶性毛喉素組合提高體內(nèi)cAMP水平14倍。這一組合被用來為建立者(founder)的生物成像篩選提供一個大的誘導(dǎo)窗口，圖6中給出了一個代表性研究。圖6顯示初始建立者誘導(dǎo)的結(jié)果以及CreLuc報告基因小鼠模型基因系的選擇。利用毛喉素和咯利普蘭篩選了誘導(dǎo)體內(nèi)螢光素酶的多個轉(zhuǎn)基因系，然后分離組織，并分析螢光素酶含量。在給藥之前，對轉(zhuǎn)基因小鼠進行了生物成像測定(基準表達水平)，然后，相同的小鼠通過腹膜注射給予10mg/kg咯利普蘭和5mg/kg水溶性毛喉素，給藥后4小時，又進行了生物成像測定(誘導(dǎo)后的表達)。A(亞系#90):給予毛喉素/咯利普蘭提高了CreLuc報告轉(zhuǎn)基因在肺和其他組織中的基準表達；B (亞系#219):基準表達誘導(dǎo)主要在腸中C(亞系#44):在大腦和其他組織中誘導(dǎo)了探測不到的基準表達和報告基因；D(亞系#28):胸腺和肝中增加了的探測不到的基準表達；E(亞系#187):在大腦和脊髓中誘導(dǎo)了探測不到的基準表達。如對一個隨機整合的轉(zhuǎn)基因所預(yù)期的，各系之間在基準表達、組織分布和對誘導(dǎo)的應(yīng)答方面有變化。鑒定出20個亞系在一個或多個組織中有大于5X的誘導(dǎo)。組織特征的變化證明，單一組織(如肺、肝、大腦)可使成像中沒有背景組織應(yīng)答，而多組織則可產(chǎn)生更廣泛的化合物應(yīng)答特性。圖7顯示體內(nèi)或離體外CreLuc篩選分析的一般示意圖。圖8A顯示異丙腎上腺素(ISO)和AMN082 (AMN)對CreLuc小鼠(187系)全腦切片發(fā)光的影響。圖8B顯示毛喉素隨時間對CreLuc小鼠(44系)全腦切片發(fā)光的影響。X-軸上表示時間，單位為分鐘。如底圖中的箭頭所示，在時間=2880時，加入了 50uM毛喉素或載體(DMSO)。圖9顯示CreLuc原代神經(jīng)元細胞的分離和用化合物處理的示意圖。圖10顯示通過β -腎上腺素能受體(AD β R)活化和Dl多巴胺受體(DRDl)活化Gs的調(diào)節(jié)。神經(jīng)元是從187系Ε18胚胎的皮質(zhì)中分離出來的。在培養(yǎng)的第3天，加入測試化合物毛喉素5 μ M(F)、咯利普蘭10 μ M(R)、毛喉素和咯利普蘭組合(F/R)、異丙腎上腺素10 μ Μ、異丙腎上腺素和咯利普蘭組合(I/R)、SKF82958 10 μ M和SKF82958以及咯利普蘭組合(S/R)。所示數(shù)據(jù)為每秒計數(shù)(cps)。圖11顯示前動力蛋白2(PR0K2)肽對原代皮質(zhì)神經(jīng)元中螢光素酶表達的影響。從187系E18上收集了原代皮質(zhì)神經(jīng)元(大腦和脊髓中的可誘導(dǎo)螢光素酶)。分析于培養(yǎng)的第3天進行了 4小時或8小時。以水溶液形式加入PR0K2肽，濃度為InM和ΙΟΟηΜ。所示數(shù)據(jù)為每秒計數(shù)(cps)。圖12顯示前動力蛋白2(PR0K2)肽對不同的CreLuc系原代皮質(zhì)神經(jīng)元中螢光素酶表達的影響。原代皮質(zhì)神經(jīng)元從4個不同的CreLuc系E18中收集。培養(yǎng)的第3天進行了分析(一式三份)，PR0K2肽濃度為InM或ΙΟΟηΜ，分析在兩個時間點上進行，即4小時和24小時。分析采用BrightGlo,讀數(shù)在TopCount上進行。所示數(shù)據(jù)為每秒計數(shù)(cps)。圖13A顯示mGluR7激動劑AMN082對原代皮質(zhì)神經(jīng)元中螢光素酶表達的影響。皮質(zhì)神經(jīng)元從E18胚胎(187系)收集。分析在培養(yǎng)的第3天進行。使用了毛喉素，濃度為 10 μ Mo激動劑ΑΜΝ082 (濃度為InM、IOnM, IOOnM和I μ Μ)與毛喉素組合使用。分析的讀數(shù)用Bright Glo (Promega)在TopCount上進行,分別于4小時和8小時兩個時間點讀數(shù)。所示數(shù)據(jù)為每秒計數(shù)(cps)。圖13B顯示篩選在原代神經(jīng)元中調(diào)節(jié)Gi活性的能力的未知化合物的結(jié)果。皮質(zhì)神經(jīng)元從E18胚胎(187系)收集。分析在培養(yǎng)的第3天進行。使用了毛喉素，濃度為10 μ M。對ΑΜΝ082和未知化合物Α、B或C (在不同濃度)與毛喉素組合的情況下進行了測試，并計算了 EC50值。分析的讀數(shù)用Bright Glo (Promega)在TopCount上進行，讀數(shù)時間點為4小時。所示數(shù)據(jù)為每秒計數(shù)(cps)。圖14顯示mGluR7激動劑AMN082對原代皮質(zhì)神經(jīng)元中螢光素酶表達的影響。原代皮質(zhì)神經(jīng)元從187系的E18胚胎分離。在培養(yǎng)的第7天進行了分析(一式三份)，分析時間為6小時。在與50 μ M毛喉素和10 μ M咯利普蘭組合的情況下測定了 ΑΜΝ082的濃度曲線。分析的讀數(shù)在TopCount光度計上用Bright Glo底物(Promega)進行。所示數(shù)據(jù)為每秒計數(shù)(cps)。圖15A顯示不同CreLuc系的原代皮質(zhì)神經(jīng)元中CBl激動劑CP 55，940對螢光素酶表達的Gi調(diào)節(jié)作用。原代皮質(zhì)神經(jīng)元從4個不同的CreLuc亞系E18中收集。分析在培養(yǎng)的第3天進行。所用的CBl激動劑的量為10 μ Μ、毛喉素為5 μ M且咯利普蘭為10 μ M0分析在兩個時間點進行，4小時和24小時。然后加入Bright Glo螢光素酶分析底物,分析結(jié)果由TopCount光度計讀出。所示數(shù)據(jù)為三次分析的平均值。所示數(shù)據(jù)為每秒計數(shù)(cps)。圖15B顯示CreLuc小鼠的原代皮質(zhì)神經(jīng)元中CBl激動劑CP 55，940對螢光素酶表達的Gi調(diào)節(jié)作用。皮質(zhì)神經(jīng)元從E18胚胎(187系)中分離。分析在培養(yǎng)的第3天進行。所用的毛喉素(F)和咯利普蘭(R)的含量為10 μ M。加入的激動劑的濃度為10 μ Μ、1 μ M和ΙΟΟηΜ。分析的讀數(shù)用BrightGlo (Promega)在TopCount上進行,讀數(shù)時間點為8小時。所示數(shù)據(jù)為每秒計數(shù)(cps)。圖16顯示CreLuc紋狀體神經(jīng)元中由毛喉素、咯利普蘭和Gs激動劑DRDl和AD β R誘導(dǎo)的螢光素酶表達。紋狀體神經(jīng)元從Ε14胚胎(187系)中分離。分析在培養(yǎng)的第4天進行。所用的毛喉素(F)為5μΜ，咯利普蘭(R)為ΙΟμΜ。所用的Gs激動劑異丙腎上腺素(iso)、多巴胺(dopa)和 SKF82958 (chloro)分別為 10μΜ、3μΜ和 I μ Μ。用 TopCount 光度計上用Bright Glo螢光素酶試劑(Promega)進行5小時的分析。所示數(shù)據(jù)為每秒計數(shù)(cps)。圖17顯示基本cAMP誘導(dǎo)劑(如毛喉素(F)和咯利普蘭(R))以及Gs激動劑對螢光素酶在從CreLuc小鼠中分離出來的全脾細胞制備樣中表達的影響。64系脾細胞用抗-⑶3抗體(CD)刺激24小時，另一半未作處理(unstim)。24小時時，在板上加入化合物，再處理4小時。毛喉素和咯利普蘭聯(lián)合處理(F/R)為5uM毛喉素和IOum咯利普蘭。所用的Gs激動劑為EX00000173A (173A)用作EP2激動劑，BW245C用作DPl激動劑，異丙腎上腺素(iso)用作ADPR激動劑。所用的所有Gs激動劑均為10uM。分析一式三份。4小時后，加入IOOul BrightGlo,分析結(jié)果在TopCount光度計上讀出。所示數(shù)據(jù)為每秒計數(shù)(cps)。圖18顯示從5個不同亞系CreLuc小鼠分離的T細胞中咯利普蘭和毛喉素誘導(dǎo)的總cAMP活化的效果。細胞用抗⑶3抗體(lug/ml)刺激。18小時后，在板上加入10 μ M咯利普蘭和5μ M毛喉素，再處理4小時。加入fcightGlo，分析結(jié)果在TopCount上讀出。上 圖所示數(shù)據(jù)為發(fā)光數(shù)據(jù)(每秒計數(shù))，下圖顯示相對于僅含介質(zhì)對照的倍數(shù)增加值。圖19顯示Gs激動劑對從CreLuc小鼠(64系)中分離的抗⑶3刺激的⑶4+T細胞中螢光素酶水平的影響。細胞為每孔1.5xl05，接種于96孔白色不透明板上，然后用抗CD3抗體(lug/ml)刺激。24小時后，加入化合物，再處理4小時。所用的Gs激動劑BW245C、EX00000173A(1734A)和異丙腎上腺素(iso)均為ΙΟμΜ。加入的毛喉素(F)為5 μ Μ，咯利普蘭(R)為ΙΟμΜ。加入BrightGlo,分析結(jié)果在TopCount上讀出。所示數(shù)據(jù)為每秒計數(shù)(cps)。圖20顯示從兩個不同亞系CreLuc小鼠分離的B細胞中咯利普蘭和毛喉素誘導(dǎo)的總cAMP活化的效果。細胞接種于96孔白色不透明板上，每孔2. OxlO5個細胞，并用IOng/ml脂多糖(LPS)刺激。18小時后，在板上加入ΙΟμΜ咯利普蘭和5μ M毛喉素，再處理4小時。加入BrightGlo，分析結(jié)果在TopCount上讀出。所示數(shù)據(jù)為發(fā)光數(shù)據(jù)(每秒計數(shù))，其為相對于僅含介質(zhì)對照的倍數(shù)增加值。圖21顯示Gs激動劑對從CreLuc小鼠中分離的LPS刺激的B220+B細胞中螢光素酶水平的影響。細胞接種于96孔白色不透明板上，每孔2. OxlO5個細胞，然后用IOng/ml脂多糖(LPS)刺激。24小時后，加入化合物，再處理4小時。所用的Gs激動劑BW245C、EX00000173A(1734A)和異丙腎上腺素(iso)均為ΙΟμΜ。加入的毛喉素(F)為5 μ Μ，咯利普蘭(R)為 10 μ Mo 加入 BrightGlo (Promega, Madison, WI,目錄號 E2610),分析結(jié)果在TopCount上讀出。所示數(shù)據(jù)為每秒鐘計數(shù)(cps)。圖22顯示分離的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞(64系)中由基本cAMP激活劑、毛喉素(F)和咯利普蘭(R)以及一種DP受體激動劑BW245C誘導(dǎo)的螢光素酶表達。原代小神經(jīng)膠質(zhì)細胞從P2小鼠的皮質(zhì)中分離，并接種于96孔涂有聚-D-賴氨酸的標準格式化板上。細胞或未加處理或用100ng/ml LPS刺激2小時。然后加入化合物，4小時后進行Bright Glo分析。所用的化合物為5 μ M毛喉素、10 μ M咯利普蘭或兩者組合，或為10 μ M的DPl受體Gs激動劑BW245C。所示數(shù)據(jù)為每秒鐘計數(shù)(cps)。圖23顯示鞘內(nèi)注射的毛喉素(F)和咯利普蘭(R)對CreLuc小鼠(187系)大腦和脊髓中螢光素酶表達誘導(dǎo)的影響。每組N=3-4只三月齡雄性小鼠。A組DMSO對照，B組lug毛喉素/IOug咯利普蘭，C組IOug毛喉素/IOug咯利普蘭，D組40ug毛喉素/IOug咯利普蘭。動物通過腰部鞘內(nèi)注射給藥，每只小鼠體積為5μ I。給藥后4小時對小鼠進行成像測定。圖中給出的為脊髓和大腦的平均峰值發(fā)光度數(shù)據(jù)，單位為光子/Cm2/秒。圖24顯示ΕΡ2激動劑ΕΧ00000173Α對CreLuc小鼠大腦和脊髓中螢光素酶表達的影響。對小鼠(187系)通過腹膜內(nèi)注射載體(5%DMS0, O. 05%tween 80，PBS)或10mg/kgEX00000173A。給藥后4小時對小鼠進行生物成像測定。所示數(shù)據(jù)單位為光子/cm2/秒。圖25顯示EP2激動劑EX00000173A對CreLuc小鼠中螢光素酶表達的影響。對小鼠給予載體對照或各種劑量的EP2激動劑EX0000173A。小鼠通過鞘內(nèi)注射給藥(每只小鼠5μ 1)，4小時之后在IVIS生物成像儀上進行成像測定。所示數(shù)據(jù)為5只小鼠的平均峰值發(fā)光度，單位為光子/cm2/秒。圖26顯示CRE-Luc小鼠不同組織中螢光素酶被腎上腺素受體β 3 (Adrb3)激動劑CL316243(lmg/kg, ip)誘導(dǎo)的情形。螢光素酶分析在組織勻漿中進行。圖27A顯示CRE-Luc小鼠11系(n=2)和115系(n=3)中螢光素酶被Adrb3激動劑CL316243(lmg/kg，腹膜內(nèi)注射)誘導(dǎo)的情形。處理前以及處理后4_5小時進行了 BLI測·定。組織勻漿中螢光素酶的活性示于照片的下面。圖27B顯示CRE-Luc小鼠31系(n=2)和175系(n=3)中螢光素酶被Adrb3激動劑CL316243(lmg/kg，腹膜內(nèi)注射)誘導(dǎo)的情形。處理前以及處理后4_5小時進行了 BLI測定。組織勻漿中螢光素酶的活性示于照片的下面。圖28顯示三個獨立的CRE-Luc小鼠系中螢光素酶報告基因被高血糖素樣肽I受體(GLP-IR)激動劑AVE0010誘導(dǎo)的情形?；€圖像于第I天獲得。第2天，小鼠用AVEOO10 (O. lmg/kg，皮下注射)處理，4小時后進行圖像分析。相對于基線的誘導(dǎo)倍數(shù)標在底部。圖29顯示三個獨立的CRE-Luc小鼠系中螢光素酶報告基因被高血糖素樣肽I受體(GLP-IR)激動劑AVE0010誘導(dǎo)的情形。小鼠用AVE0010 (O. lmg/kg，皮下注射)處理4小時。測量了 8種不同的組織中的螢光素酶活性。圖30顯示β細胞毒素鏈佐星(STZ)對AVE0010誘導(dǎo)CRE-Luc小鼠的影響。對雄性CRE-Iuc小鼠(11系)在通過皮下注射給予O. lmg/kg AVEOO10之前(“未誘導(dǎo)”，上圖)和之后(“AVE0010誘導(dǎo)”，中圖)，進行了成像分析。所有小鼠對AVE0010均有應(yīng)答(中圖)。然后，動物用載體(對照)或STZ(200mpk，腹膜內(nèi)注射)處理。4天之后，再次進行AVEOO10處理后的成像分析(下圖)。圖31顯示AVE0010誘導(dǎo)CRE-Luc可能是β細胞特異性的。動物按照圖30中的說明處理。對未禁食的小鼠通過尾靜脈切口測量了血糖水平。血糖水平在拜耳血糖儀上讀數(shù)。所示血糖水平單位為mg血糖/ml。誘導(dǎo)倍數(shù)為給予AVElO后螢光素酶生物成像水平相對于基線信號的值。STZ (左上圖)增高了血糖水平(BG)。AVE0010(0. lmg/kg，皮下注射)降低了非禁食BG水平。對示于圖30的BLI數(shù)據(jù)進行了定量。圖32顯示將CreLuc骨髓植入非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷Y (NSG)小鼠的情形。骨髓細胞從44系雜合子和64系純合子收集。然后通過尾靜脈細胞注射將細胞植入輻射過的NSG小鼠中，每只小鼠植入I百萬或5百萬個細胞。44系1號和2號小鼠接受了5百萬個細胞,3號和4號小鼠接受了 I百萬個細胞；64系1號小鼠接受了 5百萬個細胞，2、3和4號小鼠接受了 I百萬個細胞。(每個CreLuc系4只NSG小鼠)。第4周時，對動物進行了生物成像測定(數(shù)據(jù)未顯示)，第8周時，又進行了生物成像測定(顯示了數(shù)據(jù))。成像前，64系小鼠用5mg/kg毛喉素和10mg/kg咯利普蘭誘導(dǎo)5小時。圖33顯示小鼠胚胎纖維母細胞中毛喉素、咯利普蘭和異丙腎上腺素對螢光素酶表達的影響。小鼠胚胎纖維母細胞從6個獨立CreLuc系的E12胚胎培養(yǎng)，每孔接種20，000細胞。測試的化合物包括ΙΟμΜ毛喉素(F)，5yM咯利普蘭(R)和ΙΟμΜ異丙腎上腺素(iso)。所示數(shù)據(jù)為每秒鐘計數(shù)(cps)。圖34顯示酵母聚糖處理對CreLuc小鼠(187系)中螢光素酶水平的影響。對處理組動物通過兩只后爪皮下注射酵母聚糖(zymo)以誘導(dǎo)疼痛反應(yīng)。其后4天中(表示為dl、d2、d3和d4)，每天對動物進行生物成像測定。圖35顯示心肌細胞中毛喉素、咯利普蘭和異丙腎上腺素對螢光素酶水平的影響。 心肌細胞從P3幼鼠(229系)中分離。細胞在96孔板上培養(yǎng)。測試的化合物包括10 μ M毛喉素(F)，5 μ M咯利普蘭(R)和10 μ M異丙腎上腺素(iso)。所示數(shù)據(jù)為每秒鐘計數(shù)(cps)。發(fā)明詳述除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語將具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。此處引用的每份出版物、專利申請、專利和其他參考文獻，在與本公開不一致的情況下，均通過引用而以其整體納入本文。謹此說明，本說明書和所附權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式“一”、“一個”、“一種”也具有復(fù)數(shù)的含義，除非上下文另行明確規(guī)定。此外，依照本發(fā)明，在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)，可能會采用常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)以及重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻中均有充分說明。參見，如Sambrook，F(xiàn)ritsch& Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition (1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(下稱“Sambrook et al.，1989”)；DNA Cloning:A Practical Approach Volumes I andII (D. N. Glover ed. 1985) ; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984) ; NucleicAcid Hybridization[B.D. Hames & S.J.Higgins eds. (1985)];Transcription AndTranslation[B. D. Hames & S.J.Higgins, eds. (1984)];Animal Cell Culture[R.
I.Freshney,ed. (1986)];Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press, (1986)];B.Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984) ;F.M.Ausubel etal. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)?！霸囼炈幬铩北粚挿旱亟忉尀榘ㄈ魏尾牧?，如化合物或化學(xué)品，例如有機化合物個體、無機化合物個體、生物化合物或生物材料，如抗體和能識別抗原的片段和結(jié)構(gòu)、核酸，如RNAi等。試驗藥物包括單一藥物或共同施用的多種藥物。本文所用的“轉(zhuǎn)基因動物”是一種非人動物，非限制性實例為哺乳動物，該動物中的一種或多種細胞包括此處定義的遺傳修飾。另外的非限制性實例包括嚙齒類，如大鼠或小鼠。轉(zhuǎn)基因動物的其他實施例包括非人靈長類動物、綿羊、犬、奶牛、山羊、雞、兩棲類動物等。轉(zhuǎn)基因動物的選擇僅受到報告基因產(chǎn)生的光穿過組織到達表面而被檢測的能力的限制。本文所用的“遺傳修飾”是指非人動物基因序列中一個或多個改變。一個非限制性的實施例為在轉(zhuǎn)基因動物的基因組中插入一個轉(zhuǎn)基因。本文所用的“轉(zhuǎn)基因”是指包含啟動子、報告基因、多聚腺苷酸化信號和其他元件以增強表達(絕緣子、內(nèi)含子)的外源DNA。這一外源DNA整合到I-細胞胚胎的基因組中，從其中發(fā)育形成轉(zhuǎn)基因動物且轉(zhuǎn)基因一直保留在成熟動物的基因組中。整合的轉(zhuǎn)基因DNA可出現(xiàn)在受精卵或小鼠基因組中的一個或多個位置，且單個或多個(數(shù)百個)串聯(lián)的轉(zhuǎn)基因拷貝可整合于各個基因組位置。“基本cAMP調(diào)節(jié)子”是指能夠增加或維持cAMP水平的化合物，如有機化合物個體、無機化合物個體、生物化合物或生物材料，例如抗體和能識別抗原的片段和結(jié)構(gòu)、核酸，如RNAi等。非限制性實例包括毛喉素和咯利普蘭?；綾AMP調(diào)節(jié)子包括單個cAMP調(diào)節(jié)子或共同施用的多個cAMP調(diào)節(jié)子。術(shù)語“細胞刺激劑”是指能夠激活細胞或使細胞處于更活化狀態(tài)的化學(xué)物質(zhì)，如有 機化合物個體、無機化合物個體、生物化合物或生物材料，例如抗體和能識別抗原的片段和結(jié)構(gòu)、核酸，如RNAi等。非限制性實例包括脂多糖和抗CD3。本發(fā)明的一個實施方案使用了對照。對照這一術(shù)語是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人士非常理解的。恰當?shù)膶φ湛赡苋Q于所用的分析參數(shù)或所研究的實驗問題。典型情況下，對照為載體對照，其中對照為與溶解試驗藥物或化合物的緩沖液或溶劑相同的物質(zhì)。一個非限制性實例為，如果磷酸鹽緩沖鹽水用來溶解化合物，則載體對照就是磷酸鹽緩沖鹽水。同樣地，如果DMSO被用來溶解試驗藥物，則對照就是DMS0。通常，一次試驗或分析必須使用一種以上對照，因為對所測試化合物要使用一種以上的稀釋劑。本文所用的“螢光素酶”不僅指螢光素酶活性，而且也指螢光素酶蛋白的實際的量。根據(jù)本發(fā)明，可采用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的常規(guī)技術(shù)來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人動物° 例如，Pinkert, C. A. (ed.) 1994. Transgenic animal technology:Alaboratoryhandbook，Academic Press, Inc.，San Diedoj Calif. ;Monastersky G. M. and Roblj J.M. (ed.) (1995)Strategies in transgenic animal science. ASM Press. WashingtonD.C. . and Nagy A,Gertsensteinj Mj Vinterstenj Kj Behringer R 2003. Manipulating theMouse Embryo;A laboratory Manual 3rd edition. Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor, New York。轉(zhuǎn)基因元件本發(fā)明的一個實施方案涉及轉(zhuǎn)基因。該轉(zhuǎn)基因可能包含絕緣子元件、應(yīng)答元件、啟動子元件、報告基因元件和功能元件。應(yīng)答元件是細胞內(nèi)對細胞信號(如激素、酶或其他關(guān)鍵信號蛋白)作出反應(yīng)的回文DNA序列。應(yīng)答元件的非限制性實例包括表2中列出的CRE (cAMP應(yīng)答元件)、雌激素應(yīng)答元件以及其他應(yīng)答元件。應(yīng)答元件作為單個DNA序列或串聯(lián)重復(fù)可并入到轉(zhuǎn)基因中。例如，重復(fù)4次或6次的CRE應(yīng)答元件已被用于轉(zhuǎn)基因構(gòu)建并在體外得到驗證(Deutsch P. J.，etal., J. Biol.Chem. , 263:18466-18472, 1988;Oetjen E JBC 269:27036-27044,1994)。Cre應(yīng)答元件也在體內(nèi)進行了比較，多聚體的增加與對cAMP通路激活劑的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的增加具有相關(guān)關(guān)系(Montoliu, L. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4244, 1995;Boer etal,PloS One, May 9，2 (5) : e431，2007)。本發(fā)明的一個實施方案可能利用任一已知的單個序列或多個串聯(lián)重復(fù)序列的應(yīng)答元件，如串聯(lián)重復(fù)的6個CRE序列CRE)。表2:順式作用應(yīng)答元件
權(quán)利要求
1.一種具有包含轉(zhuǎn)基因基因組的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中的轉(zhuǎn)基因包含第一絕緣子元件、應(yīng)答元件、啟動子、生物發(fā)光報告基因、功能元件和第二絕緣子元件。
2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中所述第一絕緣子元件選自核基質(zhì)附著區(qū)(MAR)、DNase 1-超敏位點(HS4)和反向末端重復(fù)序列(ITR)。
3.權(quán)利要求I的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中所述第二絕緣子元件選自核基質(zhì)附著元件(MAR)、HS4 和 ITR。
4.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中所述第一絕緣子元件與第二絕緣子元件相同。
5.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中所述應(yīng)答元件選自cAMP應(yīng)答元件(CRE)、激活蛋白I (ASPl)、糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件(GRE)、熱休克應(yīng)答元件(HSE)、血清應(yīng)答元件(SRE)、甲狀腺應(yīng)答元件(TRE)和雌激素應(yīng)答元件(ERE)。
6.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中所述應(yīng)答元件串聯(lián)重復(fù)2到24次。
7.權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中所述應(yīng)答元件串聯(lián)重復(fù)6次。
8.權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中所述應(yīng)答元件為CRE。
9.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中所述啟動子為最小單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVTK min)。
10.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中所述生物發(fā)光報告基因選自螢光素酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、分泌的堿性磷脂酶(SEAP)、人生長激素(HGH)和綠熒光蛋白(GFP)。
11.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中所述功能元件為人生長激素(hGH)基因。
12.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中所述轉(zhuǎn)基因包含SEQID NO:18。
13.權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中所述轉(zhuǎn)基因包含SEQID NO:19。
14.一種從權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人動物中分離出來的細胞。
15.一種從權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人動物中分離出來的組織切片。
16.一種識別G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)配體的方法，該方法包括 (a)測量權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人動物中生物發(fā)光的量； (b)對轉(zhuǎn)基因非人動物給予試驗藥物； (c)在給予試驗藥物后的一個或多個時間點，測量轉(zhuǎn)基因非人動物的生物發(fā)光的量；以及 (d)比較(a)中測得的生物發(fā)光的量與(C)中測得的生物發(fā)光的量 其中(a)中的生物發(fā)光的量與(C)中生物發(fā)光的量相比的差別將所述試驗藥物鑒定為GPCR配體。
17.一種識別G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)配體的方法，該方法包括 (a)從權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人動物制備組織切片； (b)測量該組織切片中生物發(fā)光的量； (C)對該組織切片給予試驗藥物； (d)在給予試驗藥物后的一個或多個時間點，測量組織切片的生物發(fā)光的量；以及 (e)比較(b)中測得的生物發(fā)光的量與(d)中測得的生物發(fā)光的量 其中(b)中的生物發(fā)光的量與(d)中生物發(fā)光的量相比的差別將所述試驗藥物鑒定為GPCR配體。
18.一種識別G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)配體的方法，該方法包括 (a)制備從權(quán)利要求I的轉(zhuǎn)基因非人動物分離出來的細胞； (b)測量該細胞中生物發(fā)光的量； (C)對該細胞給予試驗藥物； (d)在給予試驗藥物后的一個或多個時間點，測量細胞的生物發(fā)光的量；以及 (e)比較(b)中測得的生物發(fā)光的量與(d)中測得的生物發(fā)光的量 其中(b)中的生物發(fā)光的量與(d)中生物發(fā)光的量相比的差別將所述試驗藥物鑒定為GPCR配體。
19.一種在非人動物中監(jiān)控GPCR功能的方法，該方法包括 (a)用轉(zhuǎn)基因方法修飾轉(zhuǎn)基因非人動物以表達轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因包含第一絕緣子元件、應(yīng)答元件、啟動子、生物發(fā)光報告基因、功能元件和第二絕緣子元件； (b)監(jiān)控非人動物的生物發(fā)光；以及 (c)建立所述生物發(fā)光與GPCR功能的相關(guān)關(guān)系。
20.一種制備非人轉(zhuǎn)基因動物用于監(jiān)控GPCR功能的方法，該方法包括 (a)用轉(zhuǎn)基因方法修飾轉(zhuǎn)基因非人動物以表達轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因包含第一絕緣子元件、應(yīng)答元件、啟動子、生物發(fā)光報告基因、功能元件和第二絕緣子元件； (b)測量如(a)中所述的轉(zhuǎn)基因非人動物中的生物發(fā)光的量； (c)對轉(zhuǎn)基因非人動物給予GPCR配體； (d)在給予GPCR配體后的一個或多個時間點，測量轉(zhuǎn)基因非人動物中生物發(fā)光的量；以及 (e)比較(b)中測得的生物發(fā)光的量與(d)中測得的生物發(fā)光的量， 其中(b)中的生物發(fā)光的量與(d)中生物發(fā)光的量相比的差別將該非人轉(zhuǎn)基因動物鑒定為具有監(jiān)控GPCR功能的用途。
全文摘要
本發(fā)明總的涉及轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，包含轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因非人動物及其產(chǎn)生的方法，以及使用包含轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因非人動物的方法。本發(fā)明的一個實施方案涉及無創(chuàng)地在全動物、組織切片或天然細胞中利用在配體結(jié)合至GPCR受體后對通道調(diào)節(jié)有應(yīng)答的、包含生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因報告系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因模型中檢測GPCR配體活化的方法。
文檔編號G01N33/50GK102892881SQ201080064384
公開日2013年1月23日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月21日
發(fā)明者H.德雷斯勒, K.D.?？浦Z米德斯, 龐震, H.G.波利特斯 申請人:賽諾菲