專利名稱：Y型探針及其變形型及利用該y型探針的dna微陳列、試劑盒以及基因分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在基因型檢測(cè)及分析時(shí)，可通過(guò)改善靈敏度、特異度及準(zhǔn)確度來(lái)廣泛用于診斷的，在ー個(gè)本體內(nèi)具有兩 個(gè)探針部位的Y型核苷酸探針(probe)及其變形型(d型或者b型探針)，以及利用該Y型核苷酸探針的DNA微陳列、試劑盒以及基因分析方法。
背景技術(shù)：
DNA微陳列或者DNA芯片是在載玻片等固相載體(solid support)上，以點(diǎn)(spot)方式，點(diǎn)樣了數(shù)十個(gè)至數(shù)億個(gè)基因探針的。在DNA微陳列上，放置從組織或者細(xì)胞、體液等檢體中提取之后，用熒光物質(zhì)(fluorescent dye)等來(lái)標(biāo)記的DNA、RNA、cDNA、cRNA、微小RNA、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction; PCR)產(chǎn)物等核酸,并執(zhí)行雜交反應(yīng)或者測(cè)序(sequencing)反應(yīng),可通過(guò)突光掃描機(jī)等設(shè)備來(lái)分析在其反應(yīng)中出現(xiàn)的標(biāo)記物質(zhì)的信號(hào)。據(jù)此，通過(guò)一次實(shí)驗(yàn)可勘察大單位基因的表達(dá)變化或者基因型(genotype)。DNA微陳列是迄今在基因相關(guān)研究或者臨床診療當(dāng)中不可缺少的工具，該DNA微陳列利用于基因的功能和基因組研究等基礎(chǔ)科學(xué)研究，而且掌握基因疾病的機(jī)制，并樹(shù)立診斷指針，查明特定藥物的作用機(jī)制和副作用，并可廣泛利用于設(shè)定疾病的治療決策等臨床診療(PetrikJ.Diagnostic applications of microarrays.Transfusion Medicine.2006;16:233—247;Wheelan SJ，Murillo FM and Boeke JD.The incredible shrinking world of DNAmicroarrays.Mol Biosyst.2008;4(7):726-732;Li X，Quigg RJ，Zhou J，Gu W,Nagesh RaoP, Reed EF.Clinical utility of microarrays:current status, existing challengesand future outlook.Current Genomics.2008;9 (7):466_74)。DNA微陳列根據(jù)置于其上或者點(diǎn)樣(spotting)在其上的探針的種類，劃分為寡核苷酸微陳列和置有cDNA或PCR產(chǎn)物的其他微陳列等兩種DNA微陳列。作為迄今實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的微陳列，大部分主要使用寡核苷酸微陳列。寡核苷酸微陳列根據(jù)其制備方法大體上可劃分為兩種。一個(gè)是在固相載體上直接合成寡核苷酸的，可舉例光版印刷(photolithograpy)方式的昂飛(Affymetrix)公司的芯片、噴墨方式的安捷倫(Agilent)公司的芯片、電子合成方式的科恩比矩陣(Combimatrix)公司的芯片、光化學(xué)合成方式的羅氏(Nimblegen)公司的芯片等。另ー個(gè)是在固相載體上點(diǎn)樣(spotting)或者印上另行預(yù)先制備的寡核苷酸探針的方法。目前處于后者更為廣泛利用的趨勢(shì)，作為代表性的例子可舉例應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystem Inc, ABI)公司的產(chǎn)品、柯德?tīng)柲?Codel ink)公司的產(chǎn)品以及光照派(Illumina)公司的產(chǎn)品等。這些微陳列產(chǎn)品上點(diǎn)樣了長(zhǎng)度為18個(gè)至75個(gè)堿基(bp)的單鏈的直線型(liner, single strand)寡核苷酸探針，點(diǎn)的數(shù)量多樣,最少為12000個(gè),最多為 10億 7200 萬(wàn)個(gè)(Wheelan SJ, Murillo FM and Boeke JD.The incredible shrinkingworld of DNA microarrays.Mol Biosyst.2008 ；4 (7):726_732)。DNA微陳列執(zhí)行以往常 規(guī)的基因檢測(cè)進(jìn)行過(guò)的三種工作，但是，該DNA微陳列與以往的基因檢測(cè)法的不同點(diǎn)在于:能夠以所謂高吞吐量(high-throughput)或大單位一下子檢測(cè)多個(gè)基因，由此大大減少時(shí)間和費(fèi)用，還可應(yīng)用于臨床診斷。利用DNA微陳列的第一檢測(cè)法是尋出特定堿基序列的基因是否存在于檢體內(nèi)的定性分析(qualitative analysis)。例如是將成為疾病的病原菌的固有基因的堿基序列用作探針來(lái)制備微陳列，在其上放置檢體的核酸進(jìn)行雜交反應(yīng)，由此尋出靶基因來(lái)診斷病原菌的方法。利用這種所謂基因型分析(genotyping)，可準(zhǔn)確掌握作為宮頸癌病原菌的人乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV)或作為流感病原菌的流行性感冒病毒(influenza virus)、性感染病原菌的種類以及菌株或亞種(strain)。而且，由于掌握是否存在各個(gè)癌癥固有的基因，還可診斷特定癌癥。還可預(yù)測(cè)要檢測(cè)的細(xì)菌或癌癥的惡性度或預(yù)后是否產(chǎn)生藥物反應(yīng)及副作用。這還可以用低密度(low density)微陳列來(lái)實(shí)現(xiàn),具有制備容易，費(fèi)用低廉，有用于臨床診斷的優(yōu)點(diǎn)，是在商業(yè)化最容易實(shí)現(xiàn)的形態(tài)的DNA芯片(I^SM, Choi TH, Lee SY,Yoo NC.Applications of DNA microarray in disease diagnostics.T Microbiol Biotechnol.2009:19 (7):635-46)。利用DNA微陳列的第二檢測(cè)法是，用于確認(rèn)特定堿基序列的基因在檢體內(nèi)存在多少的定量分析(quantitative analysis)。這將是首次登場(chǎng)的cDNA微陳列表現(xiàn)的檢測(cè)法(Shena M, Shalon D, Davis Rff,Broiwn P0.Quantitative monitoring of gene expressionpattern with a amplementary DNA microarray.Science.1995; 270:467-470)。在微陳列內(nèi)點(diǎn)樣要勘察的基因的多個(gè)探針，并用分別不同的熒光染料(fluorescent dye)標(biāo)記靶物質(zhì)或靶疾病的對(duì)照物質(zhì)或者對(duì)照組的RNA或cDNA、cRNA之后，置于微陳列上進(jìn)行雜交反應(yīng)，由此掌握基因表達(dá)時(shí)，兩組之間究竟出現(xiàn)何種差異的方法。利用DNA微陳列的第三檢測(cè)法是，用于確認(rèn)基因的堿基序列的變化，具體是檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)、點(diǎn)突變(point mutation)或者缺失(deletion)的方法,進(jìn)而,還可以確認(rèn)特定基因的復(fù)制數(shù)(copy number)。通常,針對(duì)要分析的堿基分別采用單堿基的寡核苷酸探針?lè)譃橐吧?wild type)和突變型(mutantor variant type) 2種,或者分為A、C、G、T等4個(gè)種類,然后在微陳列上點(diǎn)樣，由此制備DNA芯片。隨后，利用ー種方法:在其上放置檢體DNA或cDNA，或者放置PCR產(chǎn)物，并在非常嚴(yán)格的條件(highly stringent condition)下執(zhí)行雜交反應(yīng),來(lái)尋 出完全一致的探針。即，在微陳列上利用等位基因特異性寡核苷酸雜交法(allele specific oligonucleotidehybridization, ASH)或雜交測(cè)序(sequencing by hybridization, SBH)方法。好幾家企業(yè)正在銷(xiāo)售以等位基因特異性寡核苷酸雜交方式檢測(cè)人體的整體SNP或者重要SNP的微陳列。例如，就昂飛(Affymetrix)公司的SNP芯片而言，將對(duì)于ー個(gè)SNP采用20個(gè)至28個(gè)多種完全一致型(perfect match type)及不一致型(mismatch type)的寡核苷酸探針利用于微陳列(Rabbee N and Speed TP.Agenotype calling algorithm for AffymetrixSNP arrays.Bioinformatics2006;22:7-12;Liu WM, X.Yang XD G, Matsuzaki H,HuangJ, Mei R, Ryder TB, Webster TA, Dong S`, Liu G, K.ff.Jones Kff, G.C.Kennedy GC and Kulp
D.Algorithms for large-scale genotyping microarrays, Bioinformatics.2003;19:2397-2403)。但是，利用DNA微陳列要對(duì)多個(gè)靶的單堿基的差異進(jìn)行準(zhǔn)確的識(shí)別，實(shí)際上存在很多困難。對(duì)此，最近針對(duì)DNA微陳列，強(qiáng)大的競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品也上市了。例如，作為連讀嵌入式數(shù)據(jù)庫(kù)引擎(giga base)的堿基的所謂高吞吐量(high-throughput)堿基序列分析設(shè)備的宜曼達(dá)(Illumania)公司的Solexa和Helicos、羅氏(Roche)公司的454設(shè)備、應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems)公司的SOLiD。實(shí)際上這些產(chǎn)品與DNA微陳列相比時(shí)，在堿基序列分析的量上超過(guò)了 DNA微陳列，而且，在十幾天內(nèi)可解讀人體基因組的整體堿基序列(Wheelan SJj Murillo FM and B oeke JD.The incredible shrinking world ofDNAmicroarrays.Mol Biosyst.2008;4 (7):726_732)。微陳列于1995年 由希娜(Sherma)首次發(fā)表之后，雖然其歷史長(zhǎng)久，但臨床上實(shí)際利用的產(chǎn)品只在少數(shù)。對(duì)于美國(guó)來(lái)說(shuō)，作為藥物基因組學(xué)(pharmacogenetics)檢測(cè)產(chǎn)品的AmpliChip CYP450、作為乳房癌診斷芯片的MammaPrint、用于檢測(cè)p53突變的AmpliChipP53檢測(cè)、用于勘察癌癥的根源的PathwOTk Tissue of Origin檢測(cè)、用于勘察染色體異常的BAC airay檢測(cè)法備受美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)的認(rèn)可而被使用(Li X，QuiggRJj Zhou J, Gu W，Nagesh Rao P，Reed EF.Clinical utility of microarrays: currentstatus,existing challenges and future outlook.Curr Genomics.2008;9(7):466-74;Heller T，Kirchheiner J，Armstrong VW,Luthe H, Tzvetkov M, BrockmollerJ，Oellerich M.AmpliChip CYP450 GeneChip:a new gene chip that allows rapidand accurate CYP2D6 genotyping.Ther.Drug Monit.2006;28:673-677;Mook S，Van’tVeer LJ，Rutgers EJj Piccart-Gebhart MJj Cardoso F.1ndividualization of therapyusing Mammaprint: from development to the MINDACT Trial.Cancer Genomics Proteomics.2007;4:147-155;Lawrence HJ，Truong S，Patten N，N akao A, Wu L.detection ofp53mutations in cancer by the amplichip p53test)。并且，在韓國(guó)和歐洲等國(guó)家，用于診斷人乳頭瘤病毒(HPV)的基因型的芯片備受食品與藥物管理局的認(rèn)可而被售賣(mài)。為了將DNA微陳列廣泛利用于臨床診斷，需要解決的問(wèn)題不少。即使是任何一種形態(tài)的DNA微陳列，在分析信號(hào)時(shí)出現(xiàn)的非特異性信號(hào)，所謂本底噪聲(backgroundnoise)均成為共同問(wèn)題。這將給分析或產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化帶來(lái)困難。因此，實(shí)際上目前提出了對(duì)于DNA微陳列的準(zhǔn)確度或價(jià)值的嚴(yán)重非難(Allison DB，Cui XQj Page GP and SabripouM.Microarray data analysis:From disarray to consolidation and consensus,Genetics.2006;7:55-65;Draghici SP，Eklund SPK and Eklund and Szallasi Z.Reliabilityand reproducibility issues in DNA microarray measurements.Trends in Genetics 2006;22:pp.101_109;Kothapalli R，Yoder SJ，Mane S and Loughran TPj Microarrayresults:How accurate are they .BMC Bioinformatics.2002;3:22)。DNA微陳列在許多點(diǎn)上一下子進(jìn)行多次檢測(cè)，需要對(duì)其資料進(jìn)行處理，出現(xiàn)實(shí)際上不能容易進(jìn)行準(zhǔn)確的資料分析和統(tǒng)計(jì)處理的問(wèn)題。通常釆用對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，將p值(value)調(diào)到0.05，并接受小于0.05、小于5%的錯(cuò)誤的方法。但是，如果在微陳列上，分析數(shù)千萬(wàn)到10億多個(gè)的點(diǎn)時(shí)，其中，約5%的數(shù)百至數(shù)千萬(wàn)的點(diǎn)的資料呈假陽(yáng)性或假陰性，這將成為嚴(yán)重的大規(guī)模錯(cuò)誤。為了避免這種錯(cuò)誤，試圖過(guò)分析多個(gè)微陳列的方法，但是當(dāng)考慮到個(gè)別微陳列的價(jià)格昂貴的問(wèn)題時(shí)，在費(fèi)用方面上存在很多困難。在實(shí)際操作利用微陳列的實(shí)驗(yàn)時(shí)，毎次做實(shí)驗(yàn)結(jié)果都不同，而且各個(gè)微陳列的結(jié)果上出現(xiàn)大差異的情況較多，甚至，即使在相同的一個(gè)微陳列內(nèi)，也按不同點(diǎn)出現(xiàn)差異。這種問(wèn)題當(dāng)中最大的因素之一是實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組(control)未被確實(shí)定立。換言之，在DNA微陳列上進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)時(shí)，按各個(gè)點(diǎn)尚未明確設(shè)定內(nèi)部參照物質(zhì)(internal reference)。
在DNA微陳列實(shí)驗(yàn)時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)的錯(cuò)誤分為兩種，一個(gè)是基于各實(shí)驗(yàn)的檢體或目的的特有的錯(cuò)誤，另ー個(gè)是微陳列自身或檢測(cè)過(guò)程中引起的錯(cuò)誤。前者與檢體的不均勻性(heterogeneity)和多態(tài)性、隨著生理狀態(tài)而發(fā)生的變化、基因與環(huán)境的相互作用等相關(guān)。后者是DNA微陳列自身引起的錯(cuò)誤(slide effect)，例如，制備DNA微陳列時(shí)出現(xiàn)的錯(cuò)誤:固相載體即載玻片的種類和表面化學(xué)、點(diǎn)樣探針時(shí)使用的微針、在各點(diǎn)上點(diǎn)樣的探針的量、探針與載玻片的相互作用，探針是否堅(jiān)固地固定于載玻片等。而且，雜交反應(yīng)進(jìn)行的多么順利也是關(guān)鍵，這取決于溫度、時(shí)間以及緩沖液的條件。標(biāo)記物質(zhì)是否好好標(biāo)記(labeling)在檢體核酸也是關(guān)鍵(Bakay M, Chen YW, Borup R, Zhao P，Nagaraju K and
E.P.Hofiman EP.sources of variability and efiect 01 experiments丄 approach onexpression profiling data interpretation.BMC Bioinformatics.2002;3:4;Han ES, WuY,McCarter R，Nelson JF，Richardson A and Hilsenbeck S S.Reproducibility, sourcesof variability, pooling, and sample size:1mportant considerations for the designof high-density oligonucleotide array experiments.Journal of Gastroenterology.2004;59:306-315; Huber W, Heydebreck A, Sultmann H，Poustka A and VingronM,Variance stabilization applied to microarray data calibration and to thequantification of differential expression,Bioinformatics.2002;18:96-104;Mol1y MPj Brzezinski EE，Hang JQj McDowell MT and VanBogelen RA.0vercoming technicalvariation and biological variation in quantitative proteomics.Proteomics.2003
;3:1912-1919;Oleksiak MFj G.A.Churchill GA and D.L.Crawford, Variation in geneexpres sion within and among natural populations,Nature Genetivs.2002;32:261—266;Sprui丄丄 SE，Hardy JLS and Weir B.Assessing sources of variability inmicroarray gene expression data.BioTechniques.2002:916-923;Whitney AR，DiehnM，Popper SJj Alizadeh AAj J.C.Boldrick JC，Reiman DA and Brown P0.1ndividualityand variation in gene expression patterns in human blood,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.2003;100:1896-1901;Zakharkin SO, Kim K，Mehta T，Chen L,Barnes S, ScheirerKE，Parrish RS，Allison DB and Page G P.Sources of variation in Affymetrixmicroarray experiments.BMC Bioinformatics.2005;6:214)。在進(jìn)行DNA微陳列實(shí)驗(yàn)時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)的另一個(gè)問(wèn)題與探針相關(guān)。如上所述，迄今，大部分DNA微陳列使用直線型的單螺旋寡核苷酸探針。但是，這些探針在固相載體上進(jìn)行雜交反應(yīng)時(shí)，與液體狀態(tài)下進(jìn)行的雜交不同地難以調(diào)整成`適當(dāng)條件。設(shè)計(jì)而制備適當(dāng)?shù)墓押塑账崽结樖枪押塑账嵛㈥惲械摹鞍⒒锼闺臁?，也是成功的重要條件。因此，為了改善現(xiàn)有直線型寡核苷酸探針的問(wèn)題，試圖過(guò)多種變形探針的設(shè)計(jì)方法。例如，將天然的核酸在其堿基或糖環(huán)(sugar ring)或者磷酸雙酯骨架(phosphodiesterbackbone)改變結(jié)構(gòu)的所謂核酸衍生物(nucleic acid analog)或仿制品(mimic)。作為代表性的例子包含肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)、鎖核酸(locked nucleicacid, LNA)及嗎B非基(morpholino)等。PNA或LNA與常規(guī)的寡核苷酸相比時(shí),其熔融溫度(Tm)上出現(xiàn)明顯的差異，具有尤其對(duì)單堿基的SNP或突變分析優(yōu)秀的優(yōu)點(diǎn)(Karkareb, Bhatnagar D.Promising nucleic acidanalogs and mimics:cnaracteristic featuresand applications of PNA，LNA，and morpholin0.Appl Microbiol Biotechnol.2006;71(5):575-86;TolstrupN, Nielsen PS,Kolberg TG,Frankel AM,Vissing H,KauppinenS.01igoDesign:0ptimal design of LNA (locked nucleic acid) oligonucleotidecapture probes for gene expression profiling.NucleicAcids Res.2003;31(13):3758-62;Nhakeel S, Karim S and Ali A.Peptide nucleic acid (PNA)-a review.J ournal of ChemicalTechnology and biotechnology.2006; 81:892-899)。但是，不能廣泛利用于分析多個(gè)基因的表達(dá)，當(dāng)前尚未開(kāi)發(fā)出如同本發(fā)明的Y型探針，在內(nèi)部一起結(jié)合追加的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基因的探針的形態(tài)。作為多種變形探針的其他例子，可舉例寡重生(0LIG0SPAWN)。這是由表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tag,EST)的大規(guī)模單基因簇(unigene)數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)計(jì)橫穿寡核苷酸探針(Overgo probe)的方法(Zheng.T, Svensson TT, Madishetty K, Close TI, TiangT,Lonardi S.0ligoSpawn: a software tool for the design of overgo probes from largeunigene datasets.BMC Bioinformatics.2006 Tan9: 7: 7)。這雖然有利于快速設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，但尚未開(kāi)發(fā)出如同本發(fā)明的Y型探針，在內(nèi)部一起結(jié)合追加的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基因的探針的形態(tài)。作為多種變形探針的另一個(gè)例子，還涌躍起進(jìn)行基因組DNA瓦片陳列(GenomicDNA tiling array) (Bertone P, Trifonov V, Rozowsky TS, Schubert F, Emanuelsson0,Karro T.Kao MY, Snyder M, Gerstein M.Design optimization methods for genomicDNA tiling arrays.Genome Res.2006;16 (2): 271-81;Wheelan SJ, Murillo FM andBoeke JD.The incredible shrinking world of DNA microarrays.Mol Biosyst.2008;4(7):26-732)。這是在一個(gè)探針?lè)湃攵鄠€(gè)亞探針，接著在微陳列的一個(gè)點(diǎn)內(nèi)嵌入多個(gè)探針來(lái)一下子檢測(cè)多個(gè)基因的瓦片方式寡核苷酸微陳列`(mult1-tiling oligonucleotidemicroarray)。這是在一個(gè)探針內(nèi)一下子連接位于類似位置的多個(gè)寡核苷酸而層壓的形態(tài)的探針，對(duì)確認(rèn)巨大基因組整體的基因表達(dá)有效。但是，這只是單純地將多個(gè)寡核苷酸連接為縱長(zhǎng)的直線，而無(wú)法分開(kāi)識(shí)別進(jìn)入到一個(gè)瓦片(tiling)探針內(nèi)的各個(gè)寡核苷酸和亞探針。這雖然對(duì)檢測(cè)基因數(shù)的延長(zhǎng)有效率，但并不像本發(fā)明的Y型探針包含內(nèi)部對(duì)照參照物質(zhì)，因此檢測(cè)的靈敏度或特異度及再現(xiàn)性難以被視為顯著提高。如上所述，為了 DNA微陳列廣泛利用于臨床診斷，DNA微陳列所使用的寡核苷酸探針需要進(jìn)一步改善，而且可使檢測(cè)法和結(jié)果解讀均為標(biāo)準(zhǔn)化是關(guān)鍵。首先，為了實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，需要按各個(gè)點(diǎn)添加內(nèi)部參照物質(zhì)或?qū)φ瘴镔|(zhì)(internal reference or control)的探針。這是為了解決各個(gè)點(diǎn)與微陳列、各個(gè)點(diǎn)與載玻片、各個(gè)點(diǎn)與雜交反應(yīng)的差異及錯(cuò)誤而必須要采用的。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的在于，提供在各點(diǎn)上將要檢測(cè)的靶基因和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基因一起用作探針而嵌入的新穎Y型探針及其變形型，由此改善以往寡核苷酸探針，并解決現(xiàn)有寡核苷酸微陳列的問(wèn)題，實(shí)際應(yīng)用于臨床診斷。問(wèn)題的解決手段本發(fā)明者為了解決上述的現(xiàn)有寡核苷酸微陳列的問(wèn)題，講究了一個(gè)探針和在一個(gè)點(diǎn)內(nèi)將要檢測(cè)的靶基因和對(duì)照基因一起用作探針而嵌入的方法。一起結(jié)合靶基因的探針和對(duì)照基因的探針來(lái)制成一個(gè)探針，以可充分統(tǒng)計(jì)的數(shù)字(例如，20個(gè)以上)，在微陳列上對(duì)該探針進(jìn)行點(diǎn)樣之后，在其上側(cè)放置檢體核酸，即DNA或RNA、cDNA、cRNA、微小RNA等進(jìn)行雜交反應(yīng)時(shí)，如果分別將靶基因和對(duì)照基因標(biāo)記為Cy_3及Cy-5，則在各點(diǎn)上除外本底信號(hào)之后的信號(hào)中測(cè)定了對(duì)照基因與靶基因的信號(hào)之比(Cy3/Cy5)，如果在各個(gè)點(diǎn)上檢索該比之后計(jì)算其平均及標(biāo)準(zhǔn)偏差，則可實(shí)現(xiàn)更加正確的的統(tǒng)計(jì)分析。這相當(dāng)于在各個(gè)點(diǎn)內(nèi)嵌入對(duì)照組來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，由此使假陽(yáng)性和假陰性最小化，避免點(diǎn)之間差異引起的錯(cuò)誤，從而可實(shí)現(xiàn)順暢的正態(tài)化(normalization)。由此,使上述的滑動(dòng)效果，即DNA微陳列導(dǎo)致的錯(cuò)誤最小化，僅通過(guò)少數(shù)的微陳列的實(shí)驗(yàn)，即可獲得可統(tǒng)計(jì)的資料，因此還可以顯著減少各實(shí)驗(yàn)中所需的費(fèi)用和時(shí)間。據(jù)此，本發(fā)明者發(fā)明了在一個(gè)本體內(nèi)以Y字形態(tài)放置兩個(gè)寡核苷酸探針部位的本發(fā)明的Y型探針以及在固相載體上點(diǎn)樣該Y型探針的方法。同時(shí)，還研制出了使Y型探針中的一側(cè)不對(duì)稱地變短的變形，即d字形或者b字形的探針。由于本發(fā)明的探針一次包含兩個(gè)寡核苷酸探針或者肽核酸(PNA)探針并形成為Y字形態(tài)，因而，所包含的各探針與各自的互補(bǔ)性堿基序列的核酸進(jìn)行反應(yīng)，由此同時(shí)發(fā)生兩個(gè)雜交反應(yīng)，在進(jìn)行該反應(yīng)時(shí)，嵌入兩個(gè)不同的檢索用染料(dye)，從而可分析其反應(yīng)。本發(fā)明者開(kāi)發(fā)及制備出如此的Y字形雙重寡核苷酸探針(Y-shaped duplex oligonucleotideprobe,以下被稱為‘Y字形探針’或者‘Υ字探針’或者‘Υ型探針’)，還開(kāi)發(fā)了通過(guò)利用該Y字形雙重寡核苷酸探針來(lái)檢測(cè)基因，并將該Y字形雙重寡核苷酸探針應(yīng)用于臨床診斷的方法。`本發(fā)明的探針由左側(cè)探針部分(left side probe)、左側(cè)莖區(qū)部分(left sidestem)、右側(cè)莖區(qū)部分、右側(cè)探針部分、連接肽(linker)(或者間隔(spacer))部分等五種部位形成。本探針的左側(cè)及右側(cè)探針部分由最多達(dá)到150個(gè)的寡核苷酸或者PNA形成，按照目的可應(yīng)用多種堿基序列。只不過(guò)，就兩側(cè)的寡核苷酸探針而言，其堿基序列的一側(cè)為正向(5’ 一3’)，另一側(cè)為反向(3’ 一5’)。莖區(qū)部分由最多達(dá)到40個(gè)的互補(bǔ)性寡核苷酸形成，并起到支撐向上方相連接的兩側(cè)探針的作用?？刹捎盟械那o區(qū)部分的堿基序列，若使用端粒堿基順序則方便。連接肽起到將兩側(cè)的探針和莖區(qū)固定在載玻片等固相載體上的作用。作為DNA微陳列的載體，廣泛利用經(jīng)過(guò)醛處理的載玻片，在該情況下，作為連接肽適合采用內(nèi)部氨基發(fā)生變形的多個(gè)碳基組(internal Amino Modifier Cn dT;iAmMCnT)。除此之外，將在末端帶有生物素(biotin)的多個(gè)碳基組用作連接肽，上述探針和莖區(qū)還可以通過(guò)利用該連接肽，固定在包被鏈毒親和素(streptoavidin)的載體上。如果利用陣列儀(arrayer)將本發(fā)明的Y字形探針點(diǎn)樣在載玻片等載體，則完成DNA微陳列。其中，用突光染料(fluorescent dye)等來(lái)標(biāo)記要檢測(cè)的祀核酸，即DNA或RNA、cDNA、cRNA、微小RNA等之后,放置該祀核酸進(jìn)行雜交反應(yīng)之后,可用熒光掃描機(jī)來(lái)分析此時(shí)產(chǎn)生的突光信號(hào)。此時(shí)的掃描機(jī)根據(jù)檢測(cè)目的和方法可選擇單色、雙色或者四色的掃描機(jī)。本發(fā)明的Y字形寡核苷酸探針，相比單一直線型探針具有更優(yōu)秀的優(yōu)點(diǎn)。第一，由于在一個(gè)整體的探針內(nèi)包含兩個(gè)探針部位，因而進(jìn)行雙重檢索，由此可進(jìn)行更準(zhǔn)確的分析。第二，通過(guò)一起檢索對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或內(nèi)部參照物質(zhì)，來(lái)使假陰性結(jié)果(false negativeresult)和假陽(yáng)性結(jié)果(false positive result)最小化,因此可改善檢測(cè)的靈敏度和特異度。第三，通過(guò)避免點(diǎn)間錯(cuò)誤，可實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)分析。第四，可實(shí)現(xiàn)對(duì)于對(duì)照物質(zhì)的靶物質(zhì)的相對(duì)性計(jì)量。第五，由于存在莖區(qū)部位，對(duì)于熔融溫度(Tm)或時(shí)效處理溫度來(lái)說(shuō)，在熱力學(xué)上可更加進(jìn)行區(qū)別化，這將在以等位基因特異雜交方式對(duì)單一堿基的突變進(jìn)行分析時(shí)，會(huì)更清楚地掌握變化。第六，莖區(qū)部位位于其上側(cè)的探針部位和連接肽及載玻片載體之間，來(lái)減少空間妨礙或電磁場(chǎng)妨礙，并且使雜交反應(yīng)順利進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，第一，可提 供可分析要診斷的疾病及各基因的DNA或者RNA的特定序列有無(wú)的Y型探針及其設(shè)計(jì)和制備方法，第二，可提供點(diǎn)樣了Y型探針的生物芯片及其制備方法，第三，可提供能夠有效地與上述生物芯片進(jìn)行反應(yīng)的PCR方法和熒光標(biāo)記方法，第四，可提供利用上述生物芯片來(lái)檢測(cè)靶基因，并分析基因型、基因表達(dá)程度及基因堿基序列的突變的方法，第五，可提供能夠?qū)⑸鲜錾镄酒糜谂R床的方法。發(fā)明的主旨本發(fā)明提供一種在一個(gè)本體具有兩個(gè)探針部位的Y字形的核苷酸探針。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針向5’ 一3’的方向以及從左側(cè)上方朝向右側(cè)上方的方向，依次由(I)左側(cè)探針部位、(2)左側(cè)莖區(qū)部位、(3)連接肽部位、(4)右側(cè)莖區(qū)部位以及(5)右側(cè)探針部位形成。本發(fā)明提供d字形的核苷酸探針，上述Y字形探針的(I)左側(cè)探針部位被去除，由
(2)左側(cè)莖區(qū)部位、(3)連接肽部位、(4)右側(cè)莖區(qū)部位及(5)右側(cè)探針部位形成。本發(fā)明提供b字形的核苷酸探針，上述Y字形探針的(5)右側(cè)探針部位被去除，由(I)左側(cè)探針部位、(2)左側(cè)莖區(qū)部位、(3)連接肽部位及(4)右側(cè)莖區(qū)部位形成。優(yōu)選地，就本發(fā)明的上述Y字形、d字形及b字形的探針而言，上述左側(cè)莖區(qū)部位和右側(cè)莖區(qū)部位呈現(xiàn)由具有互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸來(lái)相結(jié)合的結(jié)構(gòu)，上述左側(cè)莖區(qū)部位或者右側(cè)莖區(qū)部位，在分別相對(duì)于左側(cè)莖區(qū)部位或者右側(cè)莖區(qū)部位的整體堿基序列中，包含一半以上的G堿基。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述左側(cè)莖區(qū)部位和右側(cè)莖區(qū)部位呈現(xiàn)由具有互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸來(lái)相結(jié)合的結(jié)構(gòu)，莖區(qū)部位的堿基序列包含端粒的堿基序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述左側(cè)莖區(qū)部位或者右側(cè)莖區(qū)部位，由堿基單體反復(fù)一次以上而形成，上述堿基單體選自包含以下的堿基單體的組中。TTGGG ；TAGGG ；TTGGGG ；TTTGGG ；TTAGGG ；TTTGGGG ；TTTAGGG ；TTTTGGGG ；TTTAGGGG。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述左側(cè)探 針部位或者右側(cè)探針部位具有與靶基因互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸。
優(yōu)選地,本發(fā)明的上述左側(cè)探針部位或者右側(cè)探針部位是具有15個(gè)至150個(gè)的堿
基序列的寡核苷酸。優(yōu)選地，就本發(fā)明的上述左側(cè)探針部位而言，從上方到下方的堿基序列以5’ 一 3’的順序排列；就上述右側(cè)探針部位而言，從下方到上方的堿基序列以5’ 一3’的順序排列。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述連接肽部位為了與包被醛固相載體相結(jié)合，由作為氨基改性雙脫氧胸苷的C6dT、C3dT、C12dT或者C18dT形成。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針由肽核酸(PNA)形成。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針通過(guò)合成方法來(lái)制備而得，該合成方法包括以下步驟:I)脫除三苯甲基步驟；2)偶聯(lián)步驟；3)加帽步驟；以及4)氧化步驟。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位分別由寡核苷酸形成，該寡核苷酸具有分別與一個(gè)靶基因內(nèi)的兩個(gè)相互不同的部位互補(bǔ)的堿基序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位分別由寡核苷酸形成，該寡核苷酸具有與一個(gè)祀基因內(nèi)的相同的部位互補(bǔ)的堿基序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位分別由寡核苷酸形成，該寡核苷酸具有分別與相互不同的靶基因互補(bǔ)的堿基序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位中的一側(cè)探針部位由具有與靶基因互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸形成；剩余的一側(cè)`探針部位由具有與對(duì)照基因互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸形成。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述對(duì)照基因與靶基因沒(méi)有互補(bǔ)性，并且在檢體中不存在或者表達(dá)。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述對(duì)照基因是大腸桿菌的motD基因。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針是具有序列號(hào)5至序列號(hào)50中的一個(gè)以上堿基序列的
寡核苷酸。本發(fā)明提供一種DNA微陳列，該DNA微陳列是上述探針在固相載體進(jìn)行點(diǎn)樣而形成的。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述固相載體選自包含載玻片、玻珠、微型孔板、硅晶片及尼龍膜的組中。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述DNA微陳列還點(diǎn)樣了人β —珠蛋白基因。優(yōu)選地，本發(fā)明的作為上述探針的點(diǎn)樣部位的加樣孔(well)劃分為8個(gè)。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針由具有序列號(hào)5至序列號(hào)50中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于HPV的檢測(cè)及基因型分析。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針與具有5’末端由Cy5來(lái)標(biāo)記的序列號(hào)4的堿基序列的寡核苷酸引物和5’末端由Cy3來(lái)標(biāo)記的序列號(hào)I的堿基序列的寡核苷酸引物互補(bǔ)地相結(jié)
八
口 ο優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針由具有序列號(hào)51至序列號(hào)55中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于作為性傳播疾病(STD)的病原菌的檢測(cè)以及基因型分析，上述病原菌分別為淋球菌(NG)、沙眼衣原體(CT)、單純性皰疹病毒(HSV)、梅毒螺旋體(TP)及杜克雷嗜血桿菌(HD)。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針由具有序列號(hào)56至序列號(hào)199中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于A型流感病毒的檢測(cè)以及基因型分析。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針由具有序列號(hào)212至序列號(hào)213的堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因和β -肌動(dòng)蛋白的表達(dá)分析。優(yōu)選地，就本發(fā)明的上述探針而言，左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位中的某一側(cè)由與靶核酸的有義鏈的單核苷酸多態(tài)性(SNP)部位互補(bǔ)的寡核苷酸形成，剩余的一側(cè)由與不具有靶核酸的反義鏈的SNP部位的部位互補(bǔ)的寡核苷酸形成，上述探針用于SNP分析。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針由序列號(hào)220至序列號(hào)239中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于 ACE、ADRB2、Apo E、CETP, CFH、ESRl、ILIA、MTHFR 或者 N0S3 基因的SNP分析。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針由序列號(hào)258至序列號(hào)272中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于K-ras基因的突變分析。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述d字形探針的右側(cè)探針部位由具有與A、C、G或者T的點(diǎn)突變互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸形成；此時(shí)，將與點(diǎn)突變互補(bǔ)的堿基位于右側(cè)探針部位的中心部位；右側(cè)探針部位的長(zhǎng)度為15bp至30bp，上述d字形探針用于點(diǎn)突變分析。本發(fā)明提供一種檢體的基因分析用試劑盒，該檢體的基因分析用試劑盒包含:上述DNA微陳列；針對(duì)檢體的靶基因的PCR反應(yīng)用引物對(duì)；緩沖液；以及雜交反應(yīng)用緩沖液。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述PCR反應(yīng)用引物對(duì)用于A型流感病毒的基因擴(kuò)增，上述PCR反應(yīng)用引物對(duì)是具有選自序列號(hào)208至`序列號(hào)211中的堿基序列的寡核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述PCR反應(yīng)用引物對(duì)用于β -肌動(dòng)蛋白和EGFR基因的定量型實(shí)時(shí)PCR，上述PCR反應(yīng)用引物對(duì)分別是具有序列號(hào)214至序列號(hào)219的堿基序列的寡核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述PCR反應(yīng)用弓丨物對(duì)用于SNP檢測(cè)，上述PCR反應(yīng)用弓丨物對(duì)是具有選自序列號(hào)240至序列號(hào)257中的兩個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述試劑盒用于疾病的診斷、預(yù)防、預(yù)測(cè)或者對(duì)癥治療。本發(fā)明提供一種基因分析方法，該基因分析方法包括在上述DNA微陳列上放置用標(biāo)記物質(zhì)來(lái)標(biāo)記的檢體的靶核酸，并對(duì)上述探針和靶核酸進(jìn)行雜交的步驟。優(yōu)選地,本發(fā)明的上述標(biāo)記物質(zhì)是選自包含Cy3、Cy5、Cy5.5、氟硼突(Bodipy)、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 568>Alexa594>Alexa 660、羅丹明(Rhodamine)、TAMRA> FAM> FITC、Fluor X、ROX、德克薩斯紅(Texas Red)、澄青(Orange green) 488X、澄青 514X、HEX、TET、JOE、牡蠣(Oyster) 556、牡蠣 645、氟硼熒 630/650、氟硼熒 650/665、Calfluor Orange 546、Calfluor red 610>Quasar 670 及生物素的組中的一個(gè)以上的標(biāo)記物質(zhì)。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述祀核酸通過(guò)PCR、RT-PCR或者試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄(in vitrotranscription)方法,用標(biāo)記物質(zhì)來(lái)標(biāo)記。優(yōu)選地，本發(fā)明的基因分析方法，還包括如下步驟:經(jīng)過(guò)上述雜交反應(yīng)之后，利用熒光掃描機(jī)來(lái)分析標(biāo)記物質(zhì)的信號(hào)，來(lái)勘察靶核酸的表達(dá)程度。優(yōu)選地,本發(fā)明的上述信號(hào)分析是通過(guò)正態(tài)化過(guò)程(normalization)來(lái)進(jìn)行的。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述正態(tài)化過(guò)程是在各點(diǎn)上除外本底的噪聲信號(hào)，來(lái)勘察Cy5和Cy3的信號(hào)，重新與作為持家基因的β -肌動(dòng)蛋白基因的Cy3信號(hào)進(jìn)行比較的三重正態(tài)化過(guò)程。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述靶核酸選自包含DNA、RNA、cDNA及cRNA的組中。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述cDNA通過(guò)RT-PCT，并用Cy3來(lái)標(biāo)記；上述cRNA通過(guò)試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄，并用Cy3來(lái)標(biāo)記。優(yōu)選地，在用本發(fā)明的上述Cy3來(lái)標(biāo)記的cDNA或者cRNA上雜交了混合物，該混合物由用Cy5來(lái)標(biāo)記的作為外部對(duì)照物質(zhì)(external control)的大腸桿菌的motD基因混合。并且，本發(fā)明涉及一種利用Y型探針的臨床診斷方法，該臨床診斷方法包括如下步驟:第一步驟:設(shè)計(jì)Y型探針的步驟；第二步驟:合成Y型探針的步驟；第三步驟:利用Y型 探針來(lái)制備DNA微陳列的步驟；第四步驟:準(zhǔn)備要置于微陳列上的核酸檢體，通過(guò)PCR或者試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄等方法，將標(biāo)記物質(zhì)(labeling dye)粘在上述核酸檢體的步驟；第五步驟:將檢體置于DNA微陳列，并進(jìn)行雜交反應(yīng)的步驟；第六步驟:在DNA微陳列上進(jìn)行雜交反應(yīng)之后，對(duì)其信號(hào)進(jìn)行解讀及分析的步驟；第七步驟:利用Y型探針來(lái)掌握靶基因及對(duì)照基因的存在與否及存在量的步驟；第八步驟:利用Y型探針來(lái)進(jìn)行多種基因型分析，并將該Y型探針應(yīng)用于臨床診療的步驟，具體而言，是診斷HPV或流行性感冒及性傳播的病原菌，并且表明其類型，由此決定疾病診斷和治療方針的步驟；第九步驟:利用Y型探針來(lái)分析多個(gè)基因的表達(dá)程度的步驟；第十步驟:利用Y型探針來(lái)分析特定堿基序列的突變，即SNP或點(diǎn)突變等的步驟；第十一步驟:將Y型探針應(yīng)用于臨床診斷的步驟，具體而言，是通過(guò)SNP分析預(yù)測(cè)發(fā)病的危險(xiǎn)，來(lái)預(yù)先預(yù)防發(fā)病，或者通過(guò)SNP分析預(yù)測(cè)藥物效果及副作用來(lái)對(duì)癥選藥，或者通過(guò)突變分析及基因表達(dá)分析，篩選(screening)或者診斷疾病，或者預(yù)測(cè)藥物效果，對(duì)癥選藥的步驟。發(fā)明的效果根據(jù)利用本發(fā)明的Y型探針及其變形型的基因分析用DNA微陳列(芯片)及試劑盒，都能準(zhǔn)確地分析特定基因的存在及其類型，以及表達(dá)程度和堿基序列的變化，進(jìn)而不僅能夠快速而準(zhǔn)確地診斷感染和癌癥等各種疾病，還能分類病癥，預(yù)測(cè)嚴(yán)重度和預(yù)后，決定治療方針，對(duì)癥下藥等，由此十分有用于臨床診療。


圖1是表示本發(fā)明的Y型探針的一例的示意圖。圖2是用于將本發(fā)明的Y型探針與芯片表面相結(jié)合的反應(yīng)物質(zhì)iAmMC6T( internalAmino Modifier C6 dT)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖3是通過(guò)PCR使作為宮頸癌誘因病毒(HPV)的人β珠蛋白(human betaglobin;HBB)基因擴(kuò)增來(lái)對(duì)其進(jìn)行電泳的照片(實(shí)施例5)。圖3是用Cy5來(lái)標(biāo)記HPV-16L1基因，用Cy3來(lái)標(biāo)記HBB基因，在人工晶癌細(xì)胞(0&^)的細(xì)胞株(即￥_16型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))中通過(guò)公知的方法提取DNA，利用表I的LI基因和HBB基因各自的引物來(lái)執(zhí)行PCR，在0.8%瓊脂糖凝膠執(zhí)行電泳的結(jié)果。道(Lane)M:100bp尺寸標(biāo)記，道1:陰性對(duì)照組，道2:HPV_16L1基因的PCR產(chǎn)物(185bp)，道3:HBB基因的PCR產(chǎn)物(102bp)。圖4是可診斷宮頸 癌誘因病毒(HPV)的DNA生物芯片的各加樣孔(well)內(nèi)所出現(xiàn)的方格(grid)(實(shí)施例4)。紅色部分是在HPV中間點(diǎn)樣高危型的部分，綠色部分是在HPV中間點(diǎn)樣低危型的部分，黃色部分是點(diǎn)樣HBB基因的部分，藍(lán)色部分是在本發(fā)明的Y型探針中間點(diǎn)樣一個(gè)YP16S和YP16AS的部分。圖5是在利用圖4的方格來(lái)制備的22種的HPV芯片上同時(shí)點(diǎn)樣本發(fā)明的Y型探針，并利用HPV-16 (Cy5標(biāo)記)和HBB (Cy3標(biāo)記)來(lái)雜交之后的掃描圖片(實(shí)施例5)?？装?Well) l&2:HPV16-Cy5&HBB-Cy5 標(biāo)記的檢體、孔板(Well) 3&4:HBB_Cy5 標(biāo)記的檢體、孔板(Well) 5&6:HPV16-Cy5&HBB的正向引物上用Cy3來(lái)標(biāo)記的檢體、孔板(Well)7&8:HPV16-Cy5&HBB的反向引物上用Cy3來(lái)標(biāo)記的檢體。圖6是在利用HBB正向_Cy3PCR產(chǎn)物來(lái)雜交的芯片中，在532nm下僅對(duì)一個(gè)加樣孔進(jìn)行掃描的圖片(實(shí)施例6)。圖7是在3%瓊脂糖凝，對(duì)利用STD芯片用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來(lái)執(zhí)行PCR的產(chǎn)物進(jìn)行電泳的圖片。M:100bp DNA尺寸標(biāo)記，道(Lanel)至6經(jīng)過(guò)單一PCR，并分別表示為杜克雷嗜血桿菌的PCR產(chǎn)物(440bp )、皰疹病毒I型的PCR產(chǎn)物(384bp )、皰疹病毒2型的PCR產(chǎn)物(400bp )、沙眼衣原體的PCR產(chǎn)物(32Ibp)、淋球菌的PCR產(chǎn)物(284bp)以及梅毒的PCR產(chǎn)物(260bp)，道7是使用上述5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并通過(guò)實(shí)施例9的方法執(zhí)行多重PCR的產(chǎn)物，可確認(rèn)5個(gè)基因均實(shí)現(xiàn)PCR。圖8是在利用Y型探針的STD芯片上，對(duì)用陽(yáng)性物質(zhì)來(lái)使淋球菌雜交的結(jié)果進(jìn)行掃描的圖片(實(shí)施例9)。圖9是在利用Y型探針的STD芯片上，對(duì)用陽(yáng)性物質(zhì)來(lái)使沙眼衣原體雜交的結(jié)果進(jìn)行掃描的圖片(實(shí)施例9)。圖10是在利用Y型探針的STD芯片上，對(duì)用陽(yáng)性物質(zhì)使梅毒螺旋體雜交的結(jié)果進(jìn)行掃描的圖片(實(shí)施例9)。圖11是在利用Y型探針的STD芯片上，對(duì)用陽(yáng)性物質(zhì)使杜克雷嗜血桿菌雜交的結(jié)果進(jìn)行掃描的圖片(實(shí)施例9)。圖12是在利用Y型探針的STD芯片上，對(duì)用陽(yáng)性物質(zhì)使單純性皰疹病毒雜交的結(jié)果進(jìn)行掃描的圖片(實(shí)施例9)。圖13表示利用Y型探針的A型流感病毒芯片的方格(實(shí)施例10)。圖14是對(duì)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使A型流感病毒芯片雜交的結(jié)果進(jìn)行掃描的圖片(實(shí)施例10)。H基因由Cy5來(lái)標(biāo)記，N基因由Cy3來(lái)標(biāo)記，RPP、SWH1、SW infA及infA均由Cy5來(lái)標(biāo)記。第一圖片是利用本發(fā)明的Y型探針，在532nm和635nm下掃描的圖片,豬(swine)流行性感冒(HlNl)的病毒僅在本發(fā)明芯片的HlNl、HlONl、infA、RPP、swHl及swinfA的點(diǎn)上表示信號(hào)，在第二波長(zhǎng)635nm下僅表示NI基因的信號(hào)，在第三波長(zhǎng)532nm下，僅在HlNl、infA、RPP、swHl及swinfA的點(diǎn)上表示信號(hào)。因此，證明了本發(fā)明的芯片中所使用的Y型探針?lè)謩e與豬流行性感冒病毒基因進(jìn)行雜交。圖15a是利用拖慢(TaqMan)探針，均對(duì)各個(gè)RnaseP、SffHU Sff infA及infA基因進(jìn)行一步法實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(One step Real time RT-PCR)之后,使用轉(zhuǎn)子基因(rotor gene) 6.0軟件來(lái)分析的結(jié)果。使用從陰性對(duì)照組(nc, negative control)、陽(yáng)性對(duì)照組(pc, positive control ;新型流行性感冒陽(yáng)性病毒的RNA)及患者的檢體提取的RNA，來(lái)執(zhí)行實(shí)時(shí)RT-PCR，由此確認(rèn)，患者的三個(gè)檢體僅在RnaseP中被檢測(cè)而呈陰性，陽(yáng)性對(duì)照組中的SWHl、Sff infA、infA和RNaseP基因均得到擴(kuò)增。圖15b是利用拖慢(TaqMan)探針，并通過(guò)7個(gè)臨床檢體僅分析各個(gè)RNaseP和SWHl基因的結(jié)果。7個(gè)檢體當(dāng)中，只有兩個(gè)檢體從SWHl和RNaseP中被檢測(cè)且呈陽(yáng)性，剩余的4個(gè)檢體的基因當(dāng)中，只有RNaseP基因均得到擴(kuò)增，因此呈陰性，一個(gè)檢體連RNaseP基因也得不到擴(kuò)增，因此進(jìn)行復(fù)檢。圖16是在2%瓊脂糖凝膠,對(duì)通過(guò)執(zhí)行實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real timeRT-PCR)而獲得的結(jié)果中的RNase P基因和SWHl基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳的圖片。由本圖片所確認(rèn)，對(duì)于實(shí)際檢體來(lái)說(shuō)，由于僅靠PCR產(chǎn)物的大小，在電泳難以區(qū)分陽(yáng)性和陰性，因而HlNl需要執(zhí)行通過(guò)使用本發(fā)明的DNA芯片或?qū)崟r(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RealtimeRT-PCR)方法來(lái)確認(rèn)的檢測(cè)。M:100bp DNA尺寸標(biāo)記、N:陰性對(duì)照組(Negative control)、道(Lane) I至6:利用患者的檢體來(lái)獲得的PCR產(chǎn)物、cDNA:新型流行性感冒陽(yáng)性物質(zhì)的cDNA。圖17是表示本發(fā)明的基因表達(dá)檢測(cè)用Y型探針的基本結(jié)構(gòu)和在點(diǎn)樣該基本結(jié)構(gòu)的微陳列上，對(duì)檢體和對(duì)照物質(zhì)的cRNA進(jìn)行雜交的示意圖。圖18是表示利用Y型探針來(lái)分析基因表達(dá)時(shí)的外部對(duì)照物質(zhì)的示意圖。具體地表示，實(shí)施例11所使用的T7啟動(dòng)子和包含多聚A尾巴、大腸桿菌motD基因的合成寡核苷酸(A)及質(zhì)粒(B)序列。將這些用作模板(templ`ate),加入Cy_5,進(jìn)行試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄,制作用熒光標(biāo)記的靶之后，與從檢體中獲得的cRNA混合而用于在DNA微陳列上執(zhí)行的雜交反應(yīng)。圖19是從正常人和患者的檢體中提取RNA之后合成cDNA，通過(guò)Y型探針微陳列來(lái)分析EGFR基因和β-肌動(dòng)蛋白基因的表達(dá)的圖片(實(shí)施例11)。圖20是從正常人和患者的檢體中提取RNA之后合成cDNA，通過(guò)qRT_PCR來(lái)分析EGFR基因和β-肌動(dòng)蛋白基因的表達(dá)的結(jié)果(實(shí)施例11)。由此可知，肌動(dòng)蛋白基因的Ct值在兩個(gè)檢體之間未出現(xiàn)差異，EGFR基因在患者身上可以表達(dá)，但在正常人身上無(wú)法表達(dá)。圖21表示利用包含Y型探針的SNP基因型芯片來(lái)檢測(cè)基因的結(jié)果，圖21是利用雙色(dual color)熒光掃描機(jī)的圖片。在各點(diǎn)上去除本底信號(hào)之后，勘察Cy_5對(duì)比Cy_3的經(jīng)過(guò)正態(tài)化處理的信號(hào)(normalized signal),據(jù)此尋出完全一致的點(diǎn)的探針,其結(jié)果，呈現(xiàn)對(duì)CFH、CETP及MTHFR基因不利的(unfavorable, high risk) SNP。即，與用各基因的Cy3來(lái)標(biāo)記的PCR反應(yīng)物質(zhì)進(jìn)行雜交而產(chǎn)生的報(bào)道基因有SNP的情況下，掃描時(shí)用綠色來(lái)表示，與用Cy5來(lái)標(biāo)記的PCR反應(yīng)物質(zhì)雜交而產(chǎn)生的參比基因是沒(méi)有SNP的部分，因此掃描時(shí)經(jīng)常用紅色來(lái)表示。因此，對(duì)于在一個(gè)基因中的Y型探針來(lái)說(shuō)，當(dāng)各基因沒(méi)有SNP部分時(shí)，均用Cy5來(lái)表示，當(dāng)具有SNP部分時(shí)，用互補(bǔ)色來(lái)表示。因此，本檢體中，在補(bǔ)體因子(CFH, Complement factor H)基因的第 402 密碼子出現(xiàn)了 SNP (Y402H, rsl061170)，在膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CETP,Cholesterol ester transporter protein)基因的第 1553 喊基出現(xiàn)了 SNP (G1533A)。并且,在亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR, Methylene tetrahydrofolatereductase)的第 677 次堿基分別表示 SNP (C677T, Ala222Val)。圖22是表示對(duì)于K-ras基因的第12密碼子的GTT (Gly)和AGT (Ser)的d型探針的結(jié)構(gòu)的示意圖。圖23是K-ras DNA微陳列的掃描圖片。分析肺癌患者的血液檢體的結(jié)果表明，K-ras基因的第12密碼子由GTT突變?yōu)锳GT (Glyl2Ser)。
具體實(shí)施例方式以下，通過(guò)實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。然而，以下實(shí)施例只是用于證明本發(fā)明的結(jié)構(gòu)及效果的一例，而不表示本發(fā) 明局限于以下實(shí)施例。實(shí)施例1:Y型探針的設(shè)計(jì)對(duì)DNA芯片開(kāi)發(fā)起到最重要作用的過(guò)程是研制本發(fā)明的Y字形態(tài)的雙重寡核苷酸探針的結(jié)構(gòu)。其中，包括如下工序:粘貼用于將該探針置于固相載體(solidsupport, features)的連接肽的工序；粘貼間隔(spacer),為了察看信號(hào)，粘貼標(biāo)記物質(zhì)(labeling dye)的工序。本發(fā)明的Y型探針是連續(xù)的一個(gè)寡核苷酸，并呈以Y字形樹(shù)枝形態(tài)，將兩個(gè)不同的寡核苷酸探針置于莖區(qū)上的類似于樹(shù)的結(jié)構(gòu)。如同將該樹(shù)種在地上的根部，即為將上述探針置于載玻片等固定載體的部分叫做連接肽或者間隔。檢體像雪一樣掉落在該樹(shù)上，對(duì)于該檢體來(lái)說(shuō)，如果具有與樹(shù)的兩支的探針互補(bǔ)的序列的DNA或者RNA選擇性地相結(jié)合，則發(fā)生雜交反應(yīng)，剩余的雪(檢體)將被洗去。在該雜交反應(yīng)粘貼標(biāo)記物質(zhì)(labeling dye)來(lái)解讀其信號(hào)。本發(fā)明的Y型探針與文獻(xiàn)中揭示的所謂分子信標(biāo)(molecular beacon)或者發(fā)卡探針(hairpin probe)不同，即在結(jié)構(gòu)上沒(méi)有所謂環(huán)(loop)部分，而且也不使用粹滅探針(quencher probe)。(Wang K, Tang Z, Yang CJ, Kim Y, Fang X, Li ff, Wu Y, MedleyCD，Cao Z and Li J.Molecular engineering of DNA:Molecular beacon.Angew ChemInt Ed Engl.2009;48 (45):856-870;Li Y，Zhou X and Ye D.Molecular beacons:anoptimal multifunctional biological role.Biochemical and Biophysical ResearchCommunincation.2008;373:457—461;Yao GY and Tan W.Molecular-beacon-basedarray for sensitive DNA analysis.Anakytical Biichemistry.2004;331:216-223;Broude NE.Stem-1oop oligonucleotides:a robust tool for molecular biology andbiotechnology.Trends in Biotechnology.2002; 20 (6): 249-256)。因此，是個(gè)與信標(biāo)完全不同的探針。而且，在結(jié)構(gòu)或者作用方法上，與其他文獻(xiàn)中揭示的信標(biāo)變形的探針完全不同(Tsourkas A，Behlke MA and Bao G.Structure-function relationship ofshared stem and conventional molecular beacons.Nucleic Acids Research.2002;30( 19): 4208-4215;Misra A，Kumar P and Gupta KC.Design and Synthesis ofhairpin probe for specific mis—match discrimination.Nucleic Acids SymposiumSeries.2007;51:311-312;Riccelli RVjMerante F，Leung KTjBortolin S，ZastawnyRLj Janeczko R and Benight AS.Nucleic Acid Research.2001;29 (4):996-1004)。如圖1所示，本發(fā)明的Y型探針從5’ 一3’方向來(lái)看，并且從左側(cè)上方開(kāi)始向右側(cè)上方時(shí)，由(I)左側(cè)探針部位(left side probe, A部位)、(2)左側(cè)莖區(qū)部位(left sidestem, B部位)、(3)連接肽至間隔部位(C部位)、(4)右側(cè)莖區(qū)部位(right side stem, D部位)以及(5)右側(cè)探針部位(right side probe, E部位)構(gòu)成。以下，更詳細(xì)的說(shuō)明各部位的結(jié)構(gòu)如下。(I)莖區(qū)部位(stem part)為了適當(dāng)定位本發(fā)明的Y型探針，優(yōu)先適當(dāng)?shù)刂苽溆糜谥卧揧型探針的莖部分。莖成為由具有互補(bǔ)性的序列的寡核苷酸結(jié)合的結(jié)構(gòu)，優(yōu)選地，為了堅(jiān)固地結(jié)合，C-G堿基需占一半以上，在C-G堿基之間插入T或者A堿基。例如，GnTGmTGo的形態(tài)。雖然可以采用多種堿基序列的結(jié)構(gòu)，但優(yōu)選的是生體內(nèi)自然存在。在有核生物的染色體的末端存在由反復(fù)的堿基序列構(gòu)成的端粒(telomere)，就人等哺乳類而言，其序列呈現(xiàn)反復(fù)了 TTAGGG或TTTAGGG或T1-3 (T/A) G3-的結(jié)構(gòu)，就其他生物而言，其序列呈現(xiàn)反復(fù)了TTGGGG或TTTTGGGG的結(jié)構(gòu)。在免疫球蛋白的開(kāi)關(guān)部位(switch portion)上也出現(xiàn)類似的結(jié)構(gòu)(Balagurumoothy P, Brahmachari SK, Mohnaty D, Bansal M and SasisekharanV.Hairpin and parallel quartet structures for telomeric sequences.Nucleic AcidsResearch.1992;20 (15):4061-4067;Balagurumoothy P and Brahmachari SK.Structureand stability of human telomeric sequence.Journal of Biochemistry.1994;269
(34):21858-21869)0優(yōu)選地，發(fā)明的莖部位成為在其一側(cè)的鏈上反復(fù)以下的堿基一次或兩次以上的結(jié)構(gòu)。例)1.TTGGG`2.TAGGG3.TTGGGG4.TTTGGG5.TTAGGG6.TTTGGGG7.TTTAGGG8.TTTTGGGG9.TTTAGGGGS卩，最短為5個(gè)至9個(gè)的寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合，并可以延長(zhǎng)其長(zhǎng)短。當(dāng)考慮到經(jīng)濟(jì)費(fèi)用和效率時(shí)，如果利用由TTAGGG-AATCCC的堿基序列形成的人體的端粒的最小單位就很簡(jiǎn)便。但是，其長(zhǎng)度可以不受限制地變形。通常，只要是C6、C12或者C18就無(wú)妨。(2)左側(cè)及右側(cè)探針部分其中，寡核苷酸探針設(shè)計(jì)成與要檢測(cè)的靶基因互補(bǔ)，并且可以采用任何堿基序列。但是，必須適當(dāng)設(shè)計(jì)左側(cè)及右側(cè)探針的寡核苷酸的堿基序列和長(zhǎng)度。需要注意的是，選擇探針的優(yōu)選的基本原則在于，左側(cè)和右側(cè)的寡核苷酸相互具有互補(bǔ)性，而防止左側(cè)和右側(cè)的寡核苷酸相結(jié)合，并且，防止各自構(gòu)成二次結(jié)構(gòu)。在Y型探針的設(shè)計(jì)中，另一個(gè)重要的是方向。左側(cè)探針(A部位)包含反向的3’ 一5’順序的序列，右側(cè)探針(E部位)需要構(gòu)成正向的5’ 一3’順序的序列。左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位的長(zhǎng)度，通常是優(yōu)選為15bp至75bp左右，根據(jù)用途，可以是延長(zhǎng)到150bp左右，或者相反地還可縮短為小于15bp。各探針的準(zhǔn)確的長(zhǎng)度隨著如何決定實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、靶基因的結(jié)構(gòu)及堿基序列上的特征、檢測(cè)的靈敏度和特異度、再現(xiàn)性、噪聲、偏壓(bias)而不同。當(dāng)要提高特異度時(shí),通常使用最短為15bp至25bp的寡核苷酸。當(dāng)著重于靈敏度時(shí)，通常 使用最長(zhǎng)為40bp至70bp的寡核苷酸。當(dāng)為了 SNP或突變而要進(jìn)行等位基因特意雜交分析時(shí)，探針長(zhǎng)度為15個(gè)至22個(gè)左右，研制能夠識(shí)別其中心部的I個(gè)堿基或者兩三個(gè)堿基之差。當(dāng)檢體為相對(duì)于特定基因的PCR產(chǎn)物，在其產(chǎn)物尋出特定堿基序列的存在而要分析基因型時(shí)，例如，當(dāng)要分析病毒或細(xì)菌感染的準(zhǔn)確的種和亞種的基因型時(shí)，將探針長(zhǎng)度為20個(gè)左右，尤其選擇3堿基以上在中心部出現(xiàn)差異。根據(jù)序列存在不能使用的喊基。左側(cè)和右側(cè)的探針長(zhǎng)度無(wú)需相互對(duì)稱，根據(jù)目的和用途，左側(cè)探針的長(zhǎng)度極端的變短，如圖22所示，也可成為d字形。并且，右側(cè)的探針極端的變短，還可成為b字形。寡核苷酸探針的堿基序列及長(zhǎng)度的決定參照公知的方法即可。即，在要檢測(cè)的靶基因的部位中，需要選擇與非祀向(non-targeting)基因互補(bǔ)性最小的特異部位。接著，探針應(yīng)設(shè)計(jì)成，通過(guò)調(diào)整雜交溫度，使探針的熔解溫度(Tm)的范圍在適當(dāng)范圍內(nèi)。此時(shí)，當(dāng)然要加入C+G的百分比和探針長(zhǎng)度來(lái)計(jì)算。防止構(gòu)成二次結(jié)構(gòu)，優(yōu)選地分析自我折疊能源(self folding energy)。通常使用的方法是，以滑動(dòng)窗口(sliding window)方式提取候補(bǔ)探針集合之后，基于該候補(bǔ)組，除了與對(duì)象基因進(jìn)行互補(bǔ)結(jié)合以外，考慮多個(gè)條件等來(lái)最終選擇最順利發(fā)生雜交的可能性高的探針。還可以通過(guò)虛擬雜交模塊(virtualhybridization module)可選定最佳的探針。探針集合設(shè)計(jì)可被視為，尋出發(fā)生雜交的可能性高的序列的最優(yōu)化問(wèn)題，在這種觀點(diǎn)上，還使用進(jìn)化計(jì)算方法。并且，還使用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等的學(xué)習(xí)方法(David P.Kreil, Roslin R.Russell and Steven Russell.Microarray Oligonucleotide Probes.Methods in Enzymology2006;410:73-98;Lemoline S, Combes F and Le Crom S.An evaluation of custom microarray application:theoligonucleotide design challenge.Nucleic Acids Research.2009;37(6):1726-1739)。簡(jiǎn)便的方法使用被商業(yè)化而在市場(chǎng)售賣(mài)的寡核苷酸探針設(shè)計(jì)程序。例如，ArrayOligoSeIector、CommOligo、HPD、Mprime、01iD、01igoArray、OLigodb、OLigoFaktory、OLigoPicker、POligoWiz、Oliz、Ospery、PICKY、PROBEmer> Probesel> ProbeSelect、R0S0、SEPON及YODA等。這些大部分提供交叉雜交(cross hybridization)分析、適當(dāng)探針的數(shù)分析、避免所謂的低復(fù)雜度區(qū)(low complexity zone)、方向設(shè)定等必要的基本信息。(Bozdech Z, Zhu J, Joachimiak MP, Cohen FE, Pulliam B, DeRisi JL.Expression profiling of the schizont and trophozoite stages of Plasmodiumfalciparum with a 1ng-oligonucleotide microarray.Genome Biol.2003;4:R9;LiX, He Z,Zhou J.Selection of optimal oligonucleotide probes for microarraysusing multiple criteria, global alignment and parameter estimation.NucleicAcids Res.2005;33:6114-6123;Rimour S, Hill D, Militon C, Peyret P.GoArrays:highlydynamic and efficient microarray probe design.Bioinformatics.2005;21:1094-1103;Chung WH, Rhee SK, Wan XF, Bae JW, Quan ZX, Park YH.Design of long oligonucleotideprobes for functional gene detection in a microbial community.Bioinformatics.2005;21:4092-4100;Rouchka EC, Khalyfa A, Cooper NG.MPrime: efficient
權(quán)利要求
1.一種Y字形的核苷酸探針，其特征在于，在一個(gè)本體具有兩個(gè)探針部位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其特征在于，上述探針向5’一3’的方向以及從左側(cè)上方朝向右側(cè)上方的方向，依次由(I)左側(cè)探針部位、(2)左側(cè)莖區(qū)部位、(3)連接肽部位、(4)右側(cè)莖區(qū)部位以及(5)右側(cè)探針部位形成。
3.一種d字形的核苷酸探針，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針的(I)左側(cè)探針部位被去除，由(2)左側(cè)莖區(qū)部位、(3)連接肽部位、(4)右側(cè)莖區(qū)部位及(5)右側(cè)探針部位形成。
4.一種b字形的核苷酸探針，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針的(5)右側(cè)探針部位被去除，由(I)左側(cè)探針部位、(2)左側(cè)莖區(qū)部位、(3)連接肽部位及(4)右側(cè)莖區(qū)部位形成。
5.根據(jù)權(quán)利要求2至4中的任一項(xiàng)所述的探針，其特征在于， 上述左側(cè)莖區(qū)部位和右側(cè)莖區(qū)部位呈現(xiàn)由具有互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸來(lái)相結(jié)合的結(jié)構(gòu)； 上述左側(cè)莖區(qū)部位或者右側(cè)莖區(qū)部位，在分別相對(duì)于左側(cè)莖區(qū)部位或者右側(cè)莖區(qū)部位的整體喊基序列中，包含一半以上的G喊基。
6.根據(jù)權(quán)利要求2至4中的任一項(xiàng)所述的探針，其特征在于， 上述左側(cè)莖區(qū)部位和右側(cè)莖區(qū)部位呈現(xiàn)由具有互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸來(lái)相結(jié)合的結(jié)構(gòu)； 莖區(qū)部位的喊基序列包含端 粒的喊基序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的探針，其特征在于，上述左側(cè)莖區(qū)部位或者右側(cè)莖區(qū)部位，由堿基單體反復(fù)一次以上而形成，上述堿基單體選自包含以下的堿基單體的組中:TTGGG、TAGGG、TTGGGG、TTTGGG、TTAGGG、TTTGGGG、TTTAGGG、TTTTGGGG、TTTAGGGG。
8.根據(jù)權(quán)利要求2至4中的任一項(xiàng)所述的探針，其特征在于，上述左側(cè)探針部位或者右側(cè)探針部位是具有與靶基因互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求2至4中的任一項(xiàng)所述的探針，其特征在于，上述左側(cè)探針部位或者右側(cè)探針部位是具有15個(gè)至150個(gè)的堿基序列的寡核苷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求2至4中的任一項(xiàng)所述的探針，其特征在于， 就上述左側(cè)探針部位而言，從上方到下方的堿基序列以5’ 一3’的順序排列； 就上述右側(cè)探針部位而言，從下方到上方的堿基序列以5’ 一3’的順序排列。
11.根據(jù)權(quán)利要求2至4中的任一項(xiàng)所述的探針，其特征在于，上述連接肽部位為了與包被醛固相載體相結(jié)合，由作為氨基改性雙脫氧胸苷的C6dT、C3dT、C12dT或者C18dT形成。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至4中的任一項(xiàng)所述的探針，其特征在于，上述探針由肽核酸(PNA)形成。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至4中的任一項(xiàng)所述的探針，其特征在于， 上述探針通過(guò)合成方法來(lái)制備而得，該合成方法包括以下步驟: 1)脫除三苯甲基步驟； 2)偶聯(lián)步驟； 3)加帽步驟；以及 4)氧化步驟。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的探針，其特征在于，上述左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位分別由寡核苷酸形成，該寡核苷酸具有分別與一個(gè)靶基因內(nèi)的兩個(gè)相互不同的部位互補(bǔ)的堿基序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的探針，其特征在于，上述左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位分別由寡核苷酸形成，該寡核苷酸具有與一個(gè)靶基因內(nèi)的相同的部位互補(bǔ)的堿基序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的探針，其特征在于，上述左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位分別由寡核苷酸形成，該寡核苷酸具有分別與相互不同的靶基因互補(bǔ)的堿基序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的探針，其特征在于， 上述左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位中的一側(cè)探針部位由具有與祀基因互補(bǔ)的喊基序列的寡核苷酸形成； 剩余的一側(cè)探針部位由具有與對(duì)照基因互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸形成。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的探針，其特征在于，上述對(duì)照基因不與靶基因具有互補(bǔ)性，并且在檢體中不存在或者表達(dá)。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的探針，其特征在于，上述對(duì)照基因是大腸桿菌的motD基因。
20.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的探針，其特征在于，上述探針是具有序列號(hào)5至序列號(hào)50中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸。
21.一種DNA微陳列，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求1至4中的任一項(xiàng)所述的探針在固相載體進(jìn)行點(diǎn)樣而形成。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列，其特征在于，上述固相載體選自包含載玻片、玻珠、微型孔板、硅晶片及尼龍膜的組中。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列，其特征在于，上述DNA微陳列還點(diǎn)樣了人β—珠蛋白基因。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列，其特征在于，作為上述探針的點(diǎn)樣部位的加樣孔劃分為8個(gè)。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列，其特征在于，上述探針由具有序列號(hào)5至序列號(hào)50中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于HPV的檢測(cè)及基因型分析。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的DNA微陳列，其特征在于，上述探針與具有5’末端由Cy5來(lái)標(biāo)記的序列號(hào)4的堿基序列的寡核苷酸引物和5’末端由Cy3來(lái)標(biāo)記的序列號(hào)I的堿基序列的寡核苷酸引物互補(bǔ)地相結(jié)合。
27.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列，其特征在于，上述探針由具有序列號(hào)51至序列號(hào)55中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于作為性傳播疾病(STD)的病原菌的檢測(cè)以及基因型分析，上述病原菌分別為淋球菌(NG)、沙眼衣原體(CT)、單純性皰疹病毒(HSV)、梅毒螺旋體(TP )及杜克雷嗜血桿菌(HD )。
28.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列，其特征在于，上述探針由具有序列號(hào)56至序列號(hào)199中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于A型流感病毒的檢測(cè)以及基因型分析。
29.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列，其特征在于，上述探針由具有序列號(hào)212至序列號(hào)213的堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于β_肌動(dòng)蛋白和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因的表達(dá)分析。
30.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列，其特征在于，就上述探針而言，左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位中的某一側(cè)由與靶核酸的有義鏈的單核苷酸多態(tài)性(SNP)部位互補(bǔ)的寡核苷酸形成，剩余的一側(cè)由與不具有靶核酸的反義鏈的SNP部位的部位互補(bǔ)的寡核苷酸形成，上述探針用于SNP分析。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的DNA微陳列，其特征在于，上述探針由序列號(hào)220至序列號(hào)239中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于ACE、ADRB2、Apo E、CETP、CFH、ESR1、ILIA、MTHFR或者NOS3基因的SNP分析。
32.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列，其特征在于，上述探針由序列號(hào)258至序列號(hào)272中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于K-ras基因的突變分析。
33.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列，其特征在于， 上述d字形探針的右側(cè)探針部位由具有與A、C、G或者T的點(diǎn)突變互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸形成； 此時(shí)，將與點(diǎn)突變互補(bǔ)的堿基位于右側(cè)探針部位的中心部位； 右側(cè)探針部位的長(zhǎng)度為15bp至30bp，上述d字形探針用于點(diǎn)突變分析。
34.一種檢體的基因分析用試劑盒，其特征在于， 包含: 根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列； 針對(duì)檢體的靶基因的PCR反應(yīng)用引物對(duì)； 緩沖液；以及 雜交反應(yīng)用緩沖液。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的試劑 盒，其特征在于，上述PCR反應(yīng)用引物對(duì)用于A型流感病毒的基因擴(kuò)增，上述PCR反應(yīng)用引物對(duì)是具有選自序列號(hào)208至序列號(hào)211中的堿基序列的寡核苷酸。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的試劑盒，其特征在于，上述PCR反應(yīng)用引物對(duì)用于β-肌動(dòng)蛋白和EGFR基因的定量型實(shí)時(shí)PCR，上述PCR反應(yīng)用引物對(duì)分別是具有序列號(hào)214及序列號(hào)215、序列號(hào)217及序列號(hào)218的堿基序列的寡核苷酸。
37.根據(jù)權(quán)利要求34所述的試劑盒，其特征在于，上述PCR反應(yīng)用引物對(duì)用于SNP檢測(cè)，上述PCR反應(yīng)用引物對(duì)是具有選自序列號(hào)240至序列號(hào)257中的兩個(gè)以上喊基序列的寡核苷酸。
38.根據(jù)權(quán)利要求34所述的試劑盒，其特征在于，上述試劑盒用于疾病的診斷、預(yù)防、預(yù)測(cè)或者對(duì)癥治療。
39.一種基因分析方法，其特征在于，包括在權(quán)利要求21的DNA微陳列上放置用標(biāo)記物質(zhì)來(lái)標(biāo)記的檢體的靶核酸，并對(duì)上述探針和靶核酸進(jìn)行雜交的步驟。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的基因分析方法，其特征在于，上述標(biāo)記物質(zhì)是選自包含Cy3、Cy5、Cy5.5、氣砸突、Alexa 488> Alexa 532> Alexa 546> Alexa 568> Alexa 594> Alexa660、羅丹明、TAMRA, FAM、FITC、Fluor X、R0X、德克薩斯紅、橙青 488X、橙青 514X、HEX、TET、JOE、牡蠣 556、牡蠣 645、氟硼熒 630/650、氟硼熒 650/665、Calf Iuor Orange 546、Calfluorred 610, Quasar 670及生物素的組中的一個(gè)以上的標(biāo)記物質(zhì)。
41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的基因分析方法，其特征在于，上述靶核酸通過(guò)PCR、RT-PCR或者試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄方法，用標(biāo)記物質(zhì)來(lái)標(biāo)記。
42.根據(jù)權(quán)利要求39所述的基因分析方法，其特征在于，還包括如下步驟: 經(jīng)過(guò)上述雜交反應(yīng)之后，利用熒光掃描機(jī)來(lái)分析標(biāo)記物質(zhì)的信號(hào)，來(lái)勘察靶核酸的表達(dá)程度。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的基因分析方法，其特征在于，上述信號(hào)分析是通過(guò)正態(tài)化過(guò)程來(lái)進(jìn)行的。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的基因分析方法，其特征在于，上述正態(tài)化過(guò)程是在各點(diǎn)上除外本底的噪聲信號(hào)，來(lái)勘察Cy5和Cy3的信號(hào)，重新與作為持家基因的β_肌動(dòng)蛋白基因的Cy3信號(hào)進(jìn)行比較的三重正態(tài)化過(guò)程。
45.根據(jù)權(quán)利要求39所述的基因分析方法，其特征在于，上述靶核酸選自包含DNA、RNA、cDNA 及 cRNA 的組中。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的基因分析方法，其特征在于， 上述cDNA通過(guò)RT-PCT，并用Cy3來(lái)標(biāo)記； 上述cRNA通過(guò)試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄,并用Cy3來(lái)標(biāo)記。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的基因分析方法，其特征在于，在用上述Cy3來(lái)標(biāo)記的cDNA或者cRNA上雜交了混合物，該混合物由用Cy5來(lái)標(biāo)記的作為外部對(duì)照物質(zhì)的大腸桿菌的motD基因混合而成。
全文摘要
本發(fā)明涉及在基因型檢測(cè)及分析時(shí)，可通過(guò)改善靈敏度、特異度及準(zhǔn)確度來(lái)廣泛用于診斷的，在一個(gè)本體內(nèi)具有兩個(gè)探針部位的Y型核苷酸探針(probe)及利用該Y型核苷酸探針(probe)的DNA微陳列、試劑盒以及基因分析方法。本Y型探針的結(jié)構(gòu)由左側(cè)探針部分、左側(cè)莖區(qū)部分、連接肽(linker)、右側(cè)莖區(qū)部分以及右側(cè)探針部分等五種部位形成。本發(fā)明的DNA微陳列同時(shí)重復(fù)檢索相同的基因，或者同時(shí)檢索不同的兩個(gè)靶基因，由此能夠提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度。尤其是，在一個(gè)點(diǎn)(spot)同時(shí)檢索靶基因和對(duì)照基因，由此在分析時(shí)減少錯(cuò)誤，并可實(shí)現(xiàn)定量分析，還能容易實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。本發(fā)明的Y型探針均可利用于基因型分析、基因表達(dá)分析、突變或者SNP分析，并且可廣泛利用于疾病診斷和預(yù)測(cè)、治療決策等基因診斷。
文檔編號(hào)G01N33/52GK103097533SQ201080066318
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者文宇哲, 吳明烈 申請(qǐng)人:固德基因公司