專利名稱：近紅外光譜法檢測蜂膠中黃酮類化合物含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蜂膠中黃酮類化合物的含量檢測方法，具體地說是利用近紅外光譜快 速測定蜂膠原料中主要黃酮成分含量的方法。
背景技術(shù)：
蜂膠是蜜蜂從植物芽孢和樹干處采集樹脂混入蜜蜂上顎腺分泌物以及蜂蠟等形 成的一種具有芳香味的黏性膠狀固形物，其中含有超過200種的活性成分，包括多酚(黃 酮苷，酚酸及其酯類)，木脂素類，倍半萜烯類，苯醌類，類固醇類及氨基酸。由于蜂膠具有 抗菌、抗濾過性病原體、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、自由基清除、肝保護(hù)、抗炎及抗癌等生物活性，近 年來在保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，現(xiàn)已有多種產(chǎn)品被開發(fā)，如蜂膠軟膠囊、蜂膠 粉、蜂膠噴霧劑、蜂膠口服液和蜂膠片等。其優(yōu)良的自由基清除能力與其黃酮類化合物的含 量較高有著密不可分的關(guān)系，而蜂膠的抗癌活性則主要來源于咖啡酸苯乙酯(CAPE)和3， 5-二異戊二烯基-4-羥基肉桂酸(DHCA)的作用，因此蜂膠中活性成分的含量是鑒定蜂膠質(zhì) 量的重要因素，只有達(dá)到《無公害食品-蜂膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2003年版》中所規(guī)定的指標(biāo)成分的 含量要求的蜂膠產(chǎn)品，消費(fèi)者才可以放心食用。近年來，對蜂膠中黃酮類化合物含量分析的方法主要為高效液相色譜法(HPLC)。 在現(xiàn)有的文獻(xiàn)中，對蜂膠的HPLC含量檢測方法并不充分，本發(fā)明中在進(jìn)行近紅外研究之 前，還改進(jìn)了 HPLC方法，使得各組分峰得到較好的分離，得到盡可能多的峰容量，因?yàn)橹挥?建立更可靠的標(biāo)準(zhǔn)參照方法，才能使得蜂膠中各成分被準(zhǔn)確的定量。由于蜂膠中成分復(fù)雜， 在達(dá)到較好的分離度的同時(shí)，檢測時(shí)間也就相對加長，每個(gè)樣品的檢測時(shí)間要達(dá)到60分鐘 以上，效率低，不利于對蜂膠質(zhì)量控制的現(xiàn)場檢測，且作為流動(dòng)相使用的溶劑耗費(fèi)量大，不 經(jīng)濟(jì)。因此，開發(fā)一種準(zhǔn)確、快速的檢測方法，對于凈化蜂膠市場，加強(qiáng)對食品安全的監(jiān)督和 監(jiān)控，尤為緊要。近紅外光譜分析技術(shù)因具有分析時(shí)間短、無需樣品預(yù)處理、非破壞性、無污染以及 成本低等特點(diǎn)，已成為一種快速的現(xiàn)代分析技術(shù)，廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品/食品領(lǐng)域的品質(zhì)檢 測。國內(nèi)外許多學(xué)者對其進(jìn)行了深入的研究，并且從實(shí)驗(yàn)室的靜態(tài)研究向在線檢測研究方 向發(fā)展。該法在中藥材等天然藥物含量測定方面已經(jīng)取得了一定的成果，但是國內(nèi)外均未 見有關(guān)應(yīng)用該技術(shù)對蜂膠進(jìn)行定量分析的研究報(bào)道。天然產(chǎn)物蜂膠，作為健康食品已被廣泛的開發(fā)和應(yīng)用，它是一個(gè)多組分的復(fù)雜體 系，保證其產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定均一對實(shí)現(xiàn)其現(xiàn)代化具有重要意義。因此，發(fā)展一種科學(xué)、有效、 快速的復(fù)雜天然產(chǎn)物的質(zhì)量檢測方法就成為急需解決的難題之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種利用近紅外區(qū)光譜快速檢測蜂膠樣品中主要黃酮類化合物 含量的方法。本發(fā)明所建立的該方法包括如下步驟①收集蜂膠樣品，選擇足量有代表性的校正集樣本，用HPLC法檢測樣品中黃酮類化合物含量；②測定校正集樣品的近紅外光譜譜圖，取光譜圖的7500 4500CHT1波段進(jìn)行光譜 預(yù)處理后，與HPLC法側(cè)得的該樣品的黃酮類化合物含量相關(guān)聯(lián)，采用偏最小二乘法建立校 正模型；③測定待測蜂膠樣品的近紅外光譜譜圖，采用與步驟②中相同的預(yù)處理方法處理 所得譜圖中7500 4500CHT1波段，將預(yù)處理后得到的光譜調(diào)入步驟②的校正模型，得到待 測蜂膠樣品中黃酮類化合物含量。步驟①中所述的蜂膠采集自國內(nèi)三個(gè)主要產(chǎn)地是遼寧、浙江、河南；為保證建立 模型的準(zhǔn)確性和抗干擾能力，建立校正模型的樣品中目標(biāo)組分的含量范圍應(yīng)能涵蓋以后要 分析樣品中該組分的含量范圍，本發(fā)明收集了國內(nèi)三產(chǎn)地、不同季節(jié)的蜂膠原料，能充分的 代表預(yù)測樣品的全部背景信息。本發(fā)明的檢測中，所針對的目標(biāo)產(chǎn)物是蜂膠中的主要黃酮類化合物，槲皮素、喬松 素、球松素、白楊素、莰菲醇和高良姜素。步驟①為了檢測這些化合物在蜂膠中的含量而建 立的HPLC檢測方法包括如下條件色譜柱DAIS0PAKSP-120-5 ODS-AP (250mmX 4. Omml. D)，流動(dòng)相①體積比20%的甲酸-水溶液，②乙腈，梯度洗脫乙腈比例從30%經(jīng)30min均速升至45%，再經(jīng)30分鐘均速升至75%， 再經(jīng)10分鐘均速升至95%，保持10分鐘，檢測波長280nm;進(jìn)樣量10μ 1。該HPLC檢測的檢測值即作為檢測真值。上述本發(fā)明的方法中，近紅外光譜數(shù)據(jù)以漫透射的方式采集，將蜂膠樣品甲醇溶 液倒入石英液體池，液體池專用通道測量，進(jìn)行樣品的光譜采集，每個(gè)樣品的光譜圖都是由 經(jīng)32次掃描取平均而得。掃描的波譜范圍為UJOOcnr1 ^OOcnT1。所述用于近紅外掃 描的蜂膠樣品甲醇溶液濃度為59mg/ml-61mg/ml。若濃度再高，會(huì)有不溶現(xiàn)象，若濃度過小 模型建立的效果不好。步驟②在譜圖與數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)前，需要對光譜采用合適的光譜預(yù)處理方法，以減輕 或消除各種因素的干擾，所述的預(yù)處理方法選自下列方法中的一種或幾種多元散射校 正(MSC)，減去一條直線(SLS)，最小最大標(biāo)準(zhǔn)化(MMN)，不進(jìn)行預(yù)處理(NSAP)，常量補(bǔ)償 消除(COE)，向量標(biāo)準(zhǔn)化(VN)，一階導(dǎo)數(shù)(FD)，二階導(dǎo)數(shù)(SD)，一階導(dǎo)數(shù)加減去一條直線 (FD+SLS)，一階導(dǎo)數(shù)加向量標(biāo)準(zhǔn)化(FD+VN)和一階導(dǎo)數(shù)加多元散射校正(FD+MSC)。步驟③ 對待測蜂膠樣品的近紅外光譜譜圖的預(yù)處理方法與步驟②中相同。上述方法中的步驟②在進(jìn)行光譜預(yù)處理之后，以交叉驗(yàn)證均方根差(RMSECV)和 相關(guān)系數(shù)(R2)為指標(biāo)，確定最佳PLS主成分?jǐn)?shù)，選擇最佳波段，最佳主成分?jǐn)?shù)，平滑點(diǎn)數(shù)，運(yùn) 用化學(xué)計(jì)量學(xué)中的偏最小二乘法(PLQ建立近紅外光譜多元校正模型；本發(fā)明中步驟③所述測定的光譜和校正模型的適用性判據(jù)是對預(yù)示集樣品所建 立的定量模型，進(jìn)行內(nèi)部交叉驗(yàn)證，以交叉驗(yàn)證誤差均方根(RMSECV)為指標(biāo)，確定最佳PLS 主成分?jǐn)?shù)，再以最佳主成分?jǐn)?shù)及先前選取的最佳波段為參數(shù)建立最終模型；對驗(yàn)證集樣品 進(jìn)行含量測定，由預(yù)測均方根誤差(RMSEP)和相關(guān)系數(shù)平方(R2)來評價(jià)最終模型的優(yōu)劣。針對同一組樣品、同一組分，R2 (應(yīng)大于閾值70)越大，RMSECV越小，RMSECV決定預(yù)測樣品的 誤差大小最為重要。運(yùn)用Bruker 0PUS/QUANT2定量分析軟件中PLS法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，其中 50份樣品作為預(yù)測樣品機(jī)，用校正樣品集進(jìn)行內(nèi)部交叉驗(yàn)證，槲皮素、喬松素、球松素、白楊 素、莰菲醇和高良姜素的 RMSECV 為 0. 0121,0. 0417,0. 913,0. 236，1. 12,0. 214, R2 為 79. 88， 93. 81，88. 36，97. 81，88. 44，80. 8 ；當(dāng)由驗(yàn)證集樣品評價(jià)PLS模型的檢測能力時(shí)，RMSEP為 0. 0115,0. 0378,0. 819,0. 217，1. 01,0. 914, R2 為 75. 67,95. 63,91. 95,98. 41,85. 69,86. 39。本研究選取作為蜂膠質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的最有代表性的幾種黃酮類化合物槲皮素、喬 松素、球松素、白楊素、莰菲醇和高良姜素為目標(biāo)，分別建立定量模型，RMSECV較小，R2均大 于閾值70，相關(guān)性良好。并對未知驗(yàn)證集樣品進(jìn)行預(yù)測，所得結(jié)果令人滿意。說明應(yīng)用近紅 外光譜技術(shù)結(jié)合適當(dāng)?shù)亩嘣Ｕ?偏最小二乘法)可以同時(shí)對蜂膠中黃酮類化合物槲皮 素、喬松素、球松素、白楊素、莰菲醇和高良姜素進(jìn)行定量分析，方法準(zhǔn)確，比標(biāo)準(zhǔn)含量檢測 方法節(jié)省大量時(shí)間，可顯著提高質(zhì)量控制效率，縮短檢測周期，為發(fā)展中藥等天然藥物實(shí)時(shí) 分析技術(shù)開辟了一個(gè)新途徑。


本發(fā)明附圖4幅圖1是近紅外光譜模型建立及應(yīng)用過程；圖2是三產(chǎn)地蜂膠原料及標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖，圖2 (A)是浙江蜂膠原料高效液相色譜圖，圖2 (B)是荊條蜂膠原料高效液相色譜圖，圖2 (C)是河南蜂膠原料高效液相色譜圖，圖2(D)是幾種主要黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖，圖中槲皮素、莰菲 醇、喬松素、白楊素、高良姜素和球松素的出峰時(shí)間分別為:7. 43min、ll. 27min、14. Mmin、 27. 48min、28. 75min、55. 04min ；圖3是蜂膠原料的原始近紅外光譜圖；圖4是訓(xùn)練集樣品的預(yù)測值與真值相關(guān)圖。
具體實(shí)施例方式下面以實(shí)施例的方式對本發(fā)明所述的近紅外光譜模型建立及應(yīng)用過程作進(jìn)一步 說明，該實(shí)施例不應(yīng)解釋為對本發(fā)明的限制。本發(fā)明所述的近紅外光譜模型建立及應(yīng)用過程如附圖1，具體如下1、儀器條件和蜂膠樣品的處理儀器近紅外光譜由德國Bruker公司MPA型近紅外光譜儀采集，該儀器配有 OPUS數(shù)據(jù)處理軟件，樣品轉(zhuǎn)輪，透過單元，石英液體吸收池和光纖探頭測樣器-銦鎵砷 (InGaAs)檢測器。每個(gè)樣品的光譜圖都是由經(jīng)32次掃描取平均而得。掃描的波譜范圍為 12，500CHT1 4000cm-1 ο樣品實(shí)驗(yàn)中所用的樣品為直接于產(chǎn)地收集的蜂膠原料，考慮到蜂膠樣品不同部 位的成分差異性，在配制成溶液以前，來自同一區(qū)域的蜂膠樣品被充分的粉碎，用甲醇溶 解，0.45μπι的濾膜(Walkman，USA)過濾，制成濃度為60mg/ml的蜂膠甲醇溶液用于進(jìn)紅外光譜的掃描；將進(jìn)行了用于掃描的蜂膠樣品溶液甲醇稀釋100倍進(jìn)行HPLC分析。2、HPLC檢測方法包括如下條件色譜柱DAIS0PAKSP-120-5 ODS-AP (250mmX 4. Omml. D)，流動(dòng)相①體積比20%的甲酸-水溶液，②乙腈，梯度洗脫乙腈比例從30%經(jīng)30min均速升至45%，再經(jīng)30分鐘均速升至75%， 再經(jīng)10分鐘均速升至95%，保持10分鐘，檢測波長280nm;進(jìn)樣量10μ 1。該HPLC檢測的檢測值即作為檢測真值。對三產(chǎn)地蜂膠原料及標(biāo)準(zhǔn)品按照如上HPLC條件檢測得到高效液相色譜圖如圖2， 其中圖2 (A)是浙江蜂膠原料高效液相色譜圖，圖2 (B)是荊條蜂膠原料高效液相色譜圖，圖2 (C)是河南蜂膠原料高效液相色譜圖，圖2(D)是幾種主要黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖，圖中槲皮素、莰菲 醇、喬松素、白楊素、高良姜素和球松素的出峰時(shí)間分別為:7. 43min、11. 27min、14. Mmin、 27. 48min、28. 75min、55. 04min。3、測量本實(shí)驗(yàn)使用的是石英液體吸收池，采用漫透射方式，將60士0. lmg/ml蜂 膠樣品甲醇溶液倒入液體池，進(jìn)行樣品的光譜采集，同一樣品被掃描32次，據(jù)平均后得到 最終的光譜圖，如圖3。4、預(yù)測圖3所示為光譜的原始數(shù)據(jù)，從中可以看出，強(qiáng)度較大的吸收峰集中 在4000(^^-7500(3!^1光譜范圍內(nèi)，但是實(shí)際上光譜中的吸收峰均為甲醇的貢獻(xiàn)，因此在 選擇波數(shù)范圍時(shí)要首先摒棄大于9000cm-1無吸收的波段，去掉近端溶劑的強(qiáng)吸收波段 ^OOcn^lSOOcnr1，然后再進(jìn)一步通過各種光譜預(yù)處理方法對譜圖進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳吸收 波段范圍。偏最小二乘法(PLS)分別求出樣品集光譜矩陣和樣品組分矩陣的主成分矩陣， 將這兩個(gè)矩陣相關(guān)聯(lián)，求其線形關(guān)系，用所建立的線形函數(shù)來預(yù)測未知樣品，其中的最佳 主成分?jǐn)?shù)采用內(nèi)部交叉檢驗(yàn)來得出。在使用PLS法時(shí)，主成分?jǐn)?shù)是預(yù)示集的評價(jià)參數(shù)，當(dāng) RMSECV最小時(shí)，主成分?jǐn)?shù)最佳。本研究中，所建立的槲皮素、喬松素、球松素、白楊素、莰菲醇 和高良姜素定量模型的最佳主成分?jǐn)?shù)見表1。 表1 6個(gè)PLS定量模型各最佳建模參
權(quán)利要求
1.近紅外光譜法檢測蜂膠中黃酮類化合物含量的方法，包括如下步驟①收集蜂膠樣品，選擇足量有代表性的校正集樣本，用HPLC法檢測樣品中黃酮類化合 物含量；②測定校正集樣品的近紅外光譜譜圖，取光譜圖的7500 4500CHT1波段進(jìn)行光譜預(yù)處 理后，與HPLC法側(cè)得的該樣品的黃酮類化合物含量相關(guān)聯(lián)，采用偏最小二乘法建立校正模 型；③測定待測蜂膠樣品的近紅外光譜譜圖，采用與步驟②中相同的預(yù)處理方法處理所得 譜圖中7500 4500CHT1波段，將預(yù)處理后得到的光譜調(diào)入步驟②的校正模型，得到待測蜂 膠樣品中黃酮類化合物含量。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于測定樣品近紅外光譜的掃描范圍是12500 4000cm-1 ο
3.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述用于近紅外掃描的蜂膠樣品溶液濃度為 59 61mg/ml，溶劑是甲醇。
4.權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的近紅外光譜譜圖的測定方法是使用 Bruker公司MPA型傅立葉變換近紅外光譜儀，采用漫反射方式，液體池專用通道測量，每個(gè) 樣品經(jīng)32次掃描取平均而得。
5.權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述的黃酮類化合物是槲皮素、喬松素、 球松素、白楊素、莰菲醇和高良姜素。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的步驟①的HPLC檢測條件為色譜柱DAIS0PAK SP-120-5 ODS-AP (250mmX 4. Omml. D),流動(dòng)相①體積比20%的甲酸-水溶液，②乙腈，梯度洗脫乙腈比例從30%經(jīng)30min均速升至45%，再經(jīng)30分鐘均速升至75%，再經(jīng) 10分鐘均速升至95%，保持10分鐘，檢測波長280nm ；進(jìn)樣量10μ1。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的近紅外光譜譜圖的預(yù)處理方法選自下列 方法中的一種或幾種多元散射校正，減去一條直線，最小最大標(biāo)準(zhǔn)化，不進(jìn)行預(yù)處理，常量 補(bǔ)償消除，向量標(biāo)準(zhǔn)化，一階導(dǎo)數(shù)，二階導(dǎo)數(shù)，一階導(dǎo)數(shù)加減去一條直線，一階導(dǎo)數(shù)加向量標(biāo) 準(zhǔn)化和一階導(dǎo)數(shù)加多元散射校正。
全文摘要
近紅外光譜法檢測蜂膠中黃酮類化合物含量的方法，包括如下步驟①收集蜂膠樣品，選擇足量有代表性的校正集樣本，用HPLC法檢測樣品中黃酮類化合物含量；②測定校正集樣品的近紅外光譜譜圖，取光譜圖的7500～4500cm-1波段進(jìn)行光譜預(yù)處理后，與HPLC法側(cè)得的該樣品的黃酮類化合物含量相關(guān)聯(lián)，采用偏最小二乘法建立校正模型；③測定待測蜂膠樣品的近紅外光譜譜圖，采用與步驟②中相同的預(yù)處理方法處理所得譜圖中7500～4500cm-1波段，將預(yù)處理后得到的吸光度值代入步驟②的校正模型，得到待測蜂膠樣品中黃酮類化合物含量。該方法適用于蜂膠中主要黃酮類化合物的定量分析，方法準(zhǔn)確，省時(shí)高效。
文檔編號G01N30/02GK102081076SQ20111000061
公開日2011年6月1日 申請日期2011年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月4日
發(fā)明者姜博海, 宋其玲, 李悅青, 王世盛, 蔡蕊, 趙偉杰, 高志剛 申請人:大連理工大學(xué)