專利名稱：一種電化學(xué)生物傳感器敏感膜及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于電化學(xué)生物傳感器及其制備技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)計一種共價鍵合生物活性物質(zhì)并摻雜電子傳遞體和電子媒介體的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠電化學(xué)生物傳感器敏感膜及其制備方法。
背景技術(shù)：
電化學(xué)生物傳感器以其高靈敏性、高選擇性、低費用和操作簡單等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、食品和藥物分析以及環(huán)境控制等領(lǐng)域。電化學(xué)生物傳感器應(yīng)用于實際分析和檢測的同時還帶來了可觀的經(jīng)濟(jì)效益。電化學(xué)生物傳感器敏感膜的制備是構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器的關(guān)鍵步驟。殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠以其優(yōu)良的生物相容性、溫度穩(wěn)定性、化學(xué)惰性和成膜性等諸多優(yōu)勢被廣泛用作電化學(xué)生物傳感器敏感膜。生物活性物質(zhì)可被固定在溶膠-凝膠膜的三維網(wǎng)孔中并保持其原有的生物構(gòu)象和生物活性。但由于這種固定方法屬于物理包埋法，長期使用會導(dǎo)致生物活性物質(zhì)的流失，從而影響傳感器的穩(wěn)定性。另一方面，二氧化硅溶膠-凝膠膜的電子傳導(dǎo)性相對較差，而且其所制備的電化學(xué)生物傳感器尤其是基于檢測H2A的傳感器通常需要高于+0. 6V的工作電位，實際樣品中共存的一些電活性物質(zhì)如尿酸和抗壞血酸等會產(chǎn)生干擾，這些問題會影響傳感器的靈敏度和選擇性。硅烷偶聯(lián)劑如3-異氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷和2-(3，4-環(huán)氧環(huán)己烷)乙基三甲氧基硅烷已被廣泛應(yīng)用于復(fù)合有機(jī)-無機(jī)材料的制備。如在文獻(xiàn)(I)Journal of Materials Chemistry，2005，15 :3952-3961 中，Simone S. Silva 等人將 3-異氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷同時作為殼聚糖的偶聯(lián)劑和溶膠-凝膠前驅(qū)體，通過其異氰酸酯基和殼聚糖的氨基間的共價偶聯(lián)及其同步溶膠-凝膠過程合成了具有良好生物活性的殼聚糖-二氧化硅復(fù)合物。同時異氰酸酯基和環(huán)氧基也是常見的生物活性物質(zhì)的偶聯(lián)基團(tuán)?？梢妼⑦@些硅烷偶聯(lián)劑同時作為生物活性物質(zhì)和殼聚糖的共價偶聯(lián)劑以及溶膠-凝膠前驅(qū)體，通過共價偶聯(lián)反應(yīng)和同步溶膠-凝膠過程，可將生物活性物質(zhì)牢固地共價鍵合在所形成的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠三維網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)中，進(jìn)而可提高傳感器的穩(wěn)定性，但通過這種方法制備電化學(xué)生物傳感器敏感膜還未見報道。電子傳遞體如碳納米管和電子媒介體如普魯士藍(lán)等其優(yōu)越的電化學(xué)性能引起了廣泛的關(guān)注。如在文獻(xiàn)O)ElectrOanalySiS，2009，21 2207-2212中，Junfeng ^iai等人將多壁碳納米管于鐵氰化鉀、氯化鐵和氯化鉀的酸性溶液中攪拌12小時后制備了普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管復(fù)合物，多壁碳納米管可顯著提高普魯士藍(lán)的電化學(xué)行為，同時該復(fù)合物可有效地催化H2A的還原，在低達(dá)-0. IV下可對H2A 產(chǎn)生明顯的計時電流響應(yīng)，響應(yīng)的靈敏度為153. 7 μ Amr1CnT2,檢測限為5. 67Χ10_ΤΜ。但將這些電子傳遞體和電子媒介體摻雜到二氧化硅溶膠-凝膠中以提高電化學(xué)生物傳感器的靈敏度和選擇性還未見報道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種電化學(xué)生物傳感器敏感膜及其制備方法，采用硅烷偶聯(lián)劑將生物活性物質(zhì)牢固地共價鍵合于其同步形成的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠生物相容的三維網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)中，同時將電子傳遞體和電子媒介體摻雜到其中。將硅烷偶聯(lián)劑如3-異氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷和2-(3，4-環(huán)氧環(huán)己烷)乙基三甲氧基硅烷同時作為生物活性物質(zhì)和殼聚糖的共價偶聯(lián)劑以及溶膠-凝膠前驅(qū)體，通過功能基團(tuán)和氨基的共價偶聯(lián)及同步溶膠-凝膠過程，可將生物活性物質(zhì)牢固地共價鍵合在同步形成的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠生物相容的三維網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)中，從而有效地防止生物活性物質(zhì)的流失，進(jìn)而提高電化學(xué)生物傳感器的穩(wěn)定性。電子傳遞體和電子媒介體具有優(yōu)良的電化學(xué)性能，同時將其摻雜到二氧化硅溶膠-凝膠中，可提高溶膠-凝膠膜的電子傳導(dǎo)性，同時還可賦予其在低電位進(jìn)行檢測的性能，進(jìn)而提高電化學(xué)生物傳感器的靈敏度和選擇性。因此本發(fā)明提供的共價鍵合生物活性物質(zhì)并摻雜電子傳遞體和電子媒介體的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠電化學(xué)生物傳感器敏感膜可顯著提高電化學(xué)生物傳感器的穩(wěn)定性、靈敏度和選擇性。本發(fā)明提供的共價鍵合生物活性物質(zhì)并摻雜電子傳遞體和電子媒介體的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠電化學(xué)生物傳感器敏感膜是由電子傳遞體、電子媒介體和共價鍵合生物活性物質(zhì)的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠組成，其中電子傳遞體的含量為0. 05 2. Omg/cm2,電子媒介體的含量為0. Ol 2. Omg/cm2,生物活性物質(zhì)的含量為0. Ol 2. Omg/ cm2，殼聚糖的含量為0. 02 5. Omg/cm2，其余為二氧化硅溶膠-凝膠。所述的電子傳遞體為單壁碳納米管、多壁碳納米管、富勒烯、金納米粒子、銀納米粒子、鉬納米粒子、四氧化三鐵納米粒子中的一種；所述的電子媒介體為普魯士藍(lán)、鐵氰化鉀、二茂鐵、乙?；F、丙?；F、丁酰基二茂鐵、戊酰基二茂鐵、己?；F、辛酰基二茂鐵、1，1'-雙乙?；F、1，1'-雙己酰基二茂鐵、乙基二茂鐵、丙基二茂鐵、丁基二茂鐵、戊基二茂鐵、己基二茂鐵、1，1'-雙丁基二茂鐵、1，1'-雙己基二茂鐵、環(huán)戊烯基二茂鐵、環(huán)己烯基二茂鐵、 3- 二茂鐵?；?、4- 二茂鐵?；∷帷?- 二茂鐵基丁酸、5- 二茂鐵基戊酸、二茂鐵基甲醇、二茂鐵基乙醇、二甲氨基甲基二茂鐵、二茂鐵甲酸、二茂鐵乙酸、二茂鐵丙酸、二茂鐵酰胺、二茂鐵酰氯、二茂鐵硫代甲酰胺、氨基二茂鐵、萘酚綠B、天青、四氰基對苯二醌二甲烷、 四硫富瓦烯、四硫富瓦烯-四氰基二亞甲基苯醌、亞甲基藍(lán)、新亞甲基藍(lán)中的一種；所述的電子傳遞體和電子媒介體可被二者相互結(jié)合后的復(fù)合體所替代；所述的生物活性物質(zhì)為葡糖糖氧化酶、膽固醇氧化酶、乙醇氧化酶、尿酸氧化酶、黃嘌呤氧化酶、辣根過氧化物酶、酪氨酸酶、肌紅蛋白、細(xì)胞色素氧化酶、乙酰膽堿酯酶、乳酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶中的一種。本發(fā)明提供的共價鍵合生物活性物質(zhì)并摻雜電子傳遞體和電子媒介體的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠電化學(xué)生物傳感器敏感膜的制備方法是A.摻雜電子傳遞體和電子媒介體的殼聚糖-二氧化硅溶膠的制備按電子傳遞體和電子媒介體的終濃度分別為為0. 5 10mg/mL和0. 1 10mg/mL 將其超聲5 60min分散于0.1 1.0%的殼聚糖溶液中，然后按體積比為10 1 2 1 的比例將電子傳遞體和電子媒介體的殼聚糖溶液與硅烷偶聯(lián)劑混合，并在室溫條件下劇烈攪拌丨 得到摻雜電子傳遞體和電子媒介體的殼聚糖-二氧化硅溶膠；B.生物活性物質(zhì)的共價鍵合按生物活性物質(zhì)的終濃度為0. 1 lOmg/mL將其加入到A得到的溶膠中，并于O 10°C條件下緩慢攪拌1 4h，得到共價鍵合生物活性物質(zhì)并摻雜電子傳遞體和電子媒介體的殼聚糖-二氧化硅溶膠；C.敏感膜在電極表面的制備按8 400 μ L/cm2將步驟B得到的溶膠滴到電極表面，并將電極于2 10°C條件下干燥5 Mh，即可在電極表面形成一層共價鍵合生物活性物質(zhì)并摻雜電子傳遞體和電子媒介體的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠電化學(xué)生物傳感器敏感膜。所述的電子傳遞體為單壁碳納米管、多壁碳納米管、富勒烯、金納米粒子、銀納米粒子、鉬納米粒子、四氧化三鐵納米粒子中的一種；所述的電子媒介體為普魯士藍(lán)、鐵氰化鉀、二茂鐵、乙?；F、丙?；F、丁酰基二茂鐵、戊酰基二茂鐵、己?；F、辛酰基二茂鐵、1，1'-雙乙酰基二茂鐵、1，1'-雙己?；F、乙基二茂鐵、丙基二茂鐵、 丁基二茂鐵、戊基二茂鐵、己基二茂鐵、1，1'-雙丁基二茂鐵、1，1'-雙己基二茂鐵、環(huán)戊烯基二茂鐵、環(huán)己烯基二茂鐵、3- 二茂鐵?；?、4- 二茂鐵?；∷帷?- 二茂鐵基丁酸、 5-二茂鐵基戊酸、二茂鐵基甲醇、二茂鐵基乙醇、二甲氨基甲基二茂鐵、二茂鐵甲酸、二茂鐵乙酸、二茂鐵丙酸、二茂鐵酰胺、二茂鐵酰氯、二茂鐵硫代甲酰胺、氨基二茂鐵、萘酚綠B、天青、四氰基對苯二醌二甲烷、四硫富瓦烯、四硫富瓦烯-四氰基二亞甲基苯醌、亞甲基藍(lán)、新亞甲基藍(lán)中的一種。所述的電子傳遞體和電子媒介體可被二者相互結(jié)合后的復(fù)合體所替代。所述的殼聚糖溶液為殼聚糖通過超聲或攪拌溶解于0. 5 2. 0%的醋酸中的溶液。所述的硅烷偶聯(lián)劑為3-異氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷、3-異氰酸酯基丙基三甲氧基硅烷、3-(2，3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、3-(2，3-環(huán)氧丙氧)丙基三乙氧基硅烷、 2-(3，4-環(huán)氧環(huán)己烷)乙基三甲氧基硅烷、3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷中的一種。所述的生物活性物質(zhì)為葡糖糖氧化酶、膽固醇氧化酶、乙醇氧化酶、尿酸氧化酶、 黃嘌呤氧化酶、辣根過氧化物酶、酪氨酸酶、肌紅蛋白、細(xì)胞色素氧化酶、乙酰膽堿酯酶、乳酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶中的一種。所述的電極為玻碳電極、金電極、鉬電極、熱解石墨電極、石墨碳糊電極中的一種。本發(fā)明的效果可以從本發(fā)明提供的敏感膜修飾的電極性能看出。采用上述方法在玻碳電極上采用3-異氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷制備共價鍵合葡萄糖氧化酶并摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠敏感膜并以其作為工作電極，以飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極，Pt電極作為對電極組成葡萄糖電化學(xué)生物傳感器。將該傳感器的三電極體系置于PH值為5. 0 9. 0的磷酸鹽緩沖溶液中，采用美國 PARSTAT 2273電化學(xué)工作站進(jìn)行電化學(xué)測試。采用計時電流法(i_t)在-0. IV(vs. SCE)測試電極對葡萄糖的響應(yīng)電流，結(jié)果如圖3所示，修飾電極對葡萄糖具有良好的響應(yīng)，響應(yīng)時間小于10s，葡萄糖的線性響應(yīng)濃度范圍為2. 5X10—5 1. 3X10_3M，檢測限為7. 5 X 10 靈敏度為 15. ZyAmT1CnT2,該靈敏度明顯高于文獻(xiàn)(3)Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2005，381 =500-507中所報道的電沉積普魯士藍(lán)層和物理包埋葡萄糖氧化酶的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠膜修飾電極的數(shù)值。采用i_t法測試修飾電極于-0. IV下的抗干擾能力，結(jié)果如圖4所示，濃度均為0. ImM的尿酸和抗壞血酸均未對電極產(chǎn)生干擾。采用i_t法測試電極在儲存于劇烈攪拌的磷酸鹽緩沖液中對葡萄糖的響應(yīng)穩(wěn)定性，結(jié)果如圖 5所示，以四乙氧基硅烷(TE0Q作為溶膠-凝膠前驅(qū)體所形成的摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管和葡萄糖氧化酶的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠膜修飾的對照電極在儲存24h前響應(yīng)不斷增大，24h后又開始下降，而本發(fā)明提供的敏感膜修飾的電極在整個儲存過程中響
應(yīng)非常穩(wěn)定。同現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明提供的共價鍵合生物活性物質(zhì)并摻雜電子傳遞體和電子媒介體的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠電化學(xué)生物傳感器敏感膜應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器的突出優(yōu)點是(1)通過共價鍵將生物活性物質(zhì)牢固地鍵合于同步形成的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠生物相容的三維網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)中，在保證生物活性物質(zhì)生物活性的前提下有效地防止其流失，顯著提高傳感器的穩(wěn)定性。(2)在敏感膜中摻雜電子傳遞體可顯著提高其電子傳導(dǎo)性，從而提高傳感器的響應(yīng)靈敏度。(3)在敏感膜中摻雜電子媒介體還可同時賦予其在低電位下進(jìn)行高效檢測的性能，進(jìn)而降低實際樣品中共存的電活性物質(zhì)所產(chǎn)生的干擾，提高傳感器的選擇性。(4)基于該敏感膜的電化學(xué)生物傳感器的制備工藝簡單，且不涉及到有機(jī)溶劑，從而在保證傳感器性能的前提下降低其制備成本并提高其制備的安全性，適合商用型電化學(xué)生物傳感器的大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1.基于本發(fā)明制備的共價鍵合葡萄糖氧化酶并摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠敏感膜的葡萄糖電化學(xué)生物傳感器的EIS圖譜橫坐標(biāo)-阻抗實部Z'(單位歐姆，0)縱坐標(biāo)-阻抗虛部Z “(單位歐姆，0)a.玻碳電極 b.殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠膜修飾玻碳電極c.共價鍵合葡萄糖氧化酶的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠膜修飾玻碳電極d.共價鍵合葡萄糖氧化酶并摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠膜修飾玻碳電極圖2.基于本發(fā)明制備的共價鍵合葡萄糖氧化酶并摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠敏感膜的葡萄糖電化學(xué)生物傳感器對H2A響應(yīng)的i-t 曲線橫坐標(biāo)-時間t (單位秒，S)縱坐標(biāo)-電流i (單位微安，μ A)內(nèi)插圖傳感器響應(yīng)電流與H2A濃度的關(guān)系曲線橫坐標(biāo)- 濃度C (單位毫摩爾，mM)縱坐標(biāo)-電流i (單位微安，μ A)圖3.基于本發(fā)明制備的共價鍵合葡萄糖氧化酶并摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠敏感膜的葡萄糖電化學(xué)生物傳感器對葡萄糖響應(yīng)的i"t曲線 橫坐標(biāo)-時間t (單位秒，S)縱坐標(biāo)-電流i (單位微安，μ A)內(nèi)插圖傳感器響應(yīng)電流與葡萄糖濃度的關(guān)系曲線橫坐標(biāo)-葡萄糖濃度C (單位毫摩爾，mM)縱坐標(biāo)-電流i (單位微安，μ A)圖4.基于本發(fā)明制備的共價鍵合葡萄糖氧化酶并摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠敏感膜的葡萄糖電化學(xué)生物傳感器的抗干擾i_t曲線a.加入0. ImM葡萄糖b.加入 0. ImM 尿酸c.加入0. ImM抗壞血酸d.加入0. ImM葡萄糖 橫坐標(biāo)-時間t (單位秒，s)縱坐標(biāo)-電流i (單位微安，μ A)圖5.基于本發(fā)明制備的共價鍵合葡萄糖氧化酶并摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠敏感膜的葡萄糖電化學(xué)生物傳感器在儲存于劇烈攪拌的磷酸鹽緩沖液中對0. ImM葡萄糖的響應(yīng)穩(wěn)定性曲線a.基于本發(fā)明制備的敏感膜的葡萄糖電化學(xué)生物傳感器b.基于以TEOS作為溶膠-凝膠前驅(qū)體所制備的敏感膜的對照電化學(xué)生物傳感器橫坐標(biāo)-儲存時間t (單位小時，h)縱坐標(biāo)-電流i (單位微安，μ A)
具體實施例方式實施例1A.摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠的制備A-1.按多壁碳納米管的終濃度為0.5mg/mL將其加入到積比為3 1的濃硫酸和濃硝酸混酸中于室溫條件下超聲6h，14000轉(zhuǎn)離心收集碳納米管并用去離子水將其洗滌至中性，然后置真空干燥箱中于50°C條件下干燥12h ；A-2.將酸處理后的多壁碳納米管超聲0. 分散于pH為1.5的去離子水中，使碳納米管的終濃度為0. 5mg/mL，然后加入氯化鐵、鐵氰化鉀和氯化鉀，使其終濃度分別為 1. 2,2. 6、11. Omg/mL，然后于室溫條件下攪拌Mh，收集多壁納米管復(fù)合物并充分洗滌至中性，置真空干燥箱中于50°C條件下干燥1 后即可得到普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管；A-3.稱取2. 3mg普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管、80 μ L 3_異氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷加入到500 μ L 0. 25%的殼聚糖溶液中，在室溫條件下劇烈攪拌4h得到摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠。B.葡萄糖氧化酶的共價鍵合將2. 9mg葡萄糖氧化酶加入到A得到的溶膠中，并于4°C條件下緩慢攪拌1. 5h,得到共價鍵合葡萄糖氧化酶并摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠。C.敏感膜在玻碳電極表面的制備
取6 μ L步驟B得到的溶膠滴到電極表面，并將電極于4°C條件下干燥12h，即可在電極表面形成一層共價鍵合葡萄糖氧化酶并摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠敏感膜。以修飾玻碳電極為工作電極，鉬絲為對電極，SCE電極作為參比電極，實驗溫度為室溫，測試體系為0. 05M, pH 6. 9的磷酸緩沖溶液，用i_t法在-0. IV (vs. SCE)檢測電極對葡萄糖的響應(yīng)。該傳感器的響應(yīng)時間小于10秒；線性范圍為2. 5X 10_5 1.3X IO-3M;線性相關(guān)系數(shù)為0. 9998 ；根據(jù)信噪比大于3的原則，測得電極的最低檢測限為7. 5X IO-6M ； 靈敏度為 15. ZyAmT1CnT2,該靈敏度明顯高于文獻(xiàn)(3)Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2005，381 =500-507中所報道的電沉積普魯士藍(lán)層和物理包埋葡萄糖氧化酶的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠膜修飾電極的數(shù)值；濃度均為0. ImM的尿酸和抗壞血酸均未對電極產(chǎn)生干擾；和基于TEOS為溶膠-凝膠前驅(qū)體所制備的敏感膜的對照傳感器相比較， 該傳感器在儲存于劇烈攪拌的磷酸鹽緩沖液中的響應(yīng)非常穩(wěn)定。實施例2A.摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠的制備A-1.按多壁碳納米管的終濃度為0.5mg/mL將其加入到積比為3 1的濃硫酸和濃硝酸混酸中于室溫條件下超聲6h，14000轉(zhuǎn)離心收集碳納米管并用去離子水將其洗滌至中性，然后置真空干燥箱中于50°C條件下干燥12h ；A-2.將酸處理后的多壁碳納米管超聲0. 分散于pH為1.5的去離子水中，使碳納米管的終濃度為0. 5mg/mL，然后加入氯化鐵、鐵氰化鉀和氯化鉀，使其終濃度分別為 1. 2,2. 6、11. Omg/mL，然后于室溫條件下攪拌Mh，收集多壁納米管復(fù)合物并充分洗滌至中性，置真空干燥箱中于50°C條件下干燥1 后即可得到普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管；A-3.稱取2. 3mg普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管、80 μ L 3_異氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷加入到500 μ LO. 25%的殼聚糖溶液中，在室溫條件下劇烈攪拌4h得到摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠。B.膽堿氧化酶的共價鍵合將2. 2mg膽堿氧化酶加入到A得到的溶膠中，并于4°C條件下緩慢攪拌1.證，得到共價鍵合膽堿氧化酶并摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠。C.敏感膜在玻碳電極表面的制備取6 μ L步驟B得到的溶膠滴到電極表面，并將電極于4°C條件下干燥12h，即可在電極表面形成一層共價鍵合膽堿氧化酶并摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠敏感膜。以修飾玻碳電極為工作電極，鉬絲為對電極，SCE電極作為參比電極，實驗溫度為室溫，測試體系為0. 05M, pH 6. 9的磷酸緩沖溶液，用i_t法在-0. IV (vs. SCE)檢測電極對硫代膽堿的響應(yīng)。該傳感器對硫代膽堿具有良好的電化學(xué)響應(yīng)，且靈敏度較高；濃度均為 0. ImM的尿酸和抗壞血酸均未對電極產(chǎn)生干擾；電極的穩(wěn)定性較高，可保持在一個半月以上。實施例3A.摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠的制備A-1.按多壁碳納米管的終濃度為0.5mg/mL將其加入到積比為3 1的濃硫酸和濃硝酸混酸中于室溫條件下超聲6h，14000轉(zhuǎn)離心收集碳納米管并用去離子水將其洗滌至中性，然后置真空干燥箱中于50°C條件下干燥12h ；A-2.將酸處理后的多壁碳納米管超聲0. 分散于pH為1.5的去離子水中，使碳納米管的終濃度為0. 5mg/mL，然后加入氯化鐵、鐵氰化鉀和氯化鉀，使其終濃度分別為 1. 2,2. 6、11. Omg/mL，然后于室溫條件下攪拌Mh，收集多壁納米管復(fù)合物并充分洗滌至中性，置真空干燥箱中于50°C條件下干燥1 后即可得到普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管；A-3.稱取2. 3mg普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管、80 μ L 3_異氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷加入到500 μ L 0. 25%的殼聚糖溶液中，在室溫條件下劇烈攪拌4h得到摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠。B.膽固醇氧化酶的共價鍵合將5. 6mg膽固醇氧化酶加入到A得到的溶膠中，并于4°C條件下緩慢攪拌1. 5h,得到共價鍵合膽固醇氧化酶并摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠。C.取6 μ L步驟B得到的溶膠滴到電極表面，并將電極于4°C條件下干燥12h，即可在電極表面形成一層共價鍵合膽固醇氧化酶并摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠敏感膜。以修飾玻碳電極為工作電極，鉬絲為對電極，SCE電極作為參比電極，實驗溫度為室溫，測試體系為0. 05M, pH 6. 9的磷酸緩沖溶液，用i_t法在-0. IV (vs. SCE)檢測電極對膽固醇的響應(yīng)。該傳感器對膽固醇具有良好的電化學(xué)響應(yīng)，且靈敏度較高；濃度均為0. ImM 的尿酸和抗壞血酸均未對電極產(chǎn)生干擾；電極的穩(wěn)定性較高，可保持在一個半月以上。實施例4A.摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠的制備A-1.按多壁碳納米管的終濃度為0.5mg/mL將其加入到積比為3 1的濃硫酸和濃硝酸混酸中于室溫條件下超聲6h，14000轉(zhuǎn)離心收集碳納米管并用去離子水將其洗滌至中性，然后置真空干燥箱中于50°C條件下干燥12h ；A-2.將酸處理后的多壁碳納米管超聲0. 分散于pH為1.5的去離子水中，使碳納米管的終濃度為0. 5mg/mL，然后加入氯化鐵、鐵氰化鉀和氯化鉀，使其終濃度分別為 1. 2,2. 6、11. Omg/mL，然后于室溫條件下攪拌Mh，收集多壁納米管復(fù)合物并充分洗滌至中性，置真空干燥箱中于50°C條件下干燥1 后即可得到普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管；A-3.稱取2. 3mg普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管、80 μ L 3_異氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷加入到500 μ LO. 25%的殼聚糖溶液中，在室溫條件下劇烈攪拌4h得到摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠。B.乙醇氧化酶的共價鍵合將5. 6mg乙醇氧化酶加入到A得到的溶膠中，并于4°C條件下緩慢攪拌1. 5h，得到共價鍵合乙醇氧化酶并摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠。C.取6 μ L步驟B得到的溶膠滴到電極表面，并將電極于4°C條件下干燥12h，即可在電極表面形成一層共價鍵合乙醇氧化酶并摻雜普魯士藍(lán)修飾的多壁碳納米管的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠敏感膜。以修飾玻碳電極為工作電極，鉬絲為對電極，SCE電極作為參比電極，實驗溫度為室溫，測試體系為0. 05M, pH 6. 9的磷酸緩沖溶液，用i_t法在-0. IV (vs. SCE)檢測電極對乙醇的響應(yīng)。該傳感器對乙醇具有良好的電化學(xué)響應(yīng)，且靈敏度較高；濃度均為0. ImM的尿酸和抗壞血酸均未對電極產(chǎn)生干擾；電極的穩(wěn)定性較高，可保持在一個半月以上。
權(quán)利要求
1.一種電化學(xué)生物傳感器敏感膜，其特征在于敏感膜是由電子傳遞體、電子媒介體和共價鍵合生物活性物質(zhì)的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠組成，其中電子傳遞體的含量為 0. 05 2. Omg/cm2,電子媒介體的含量為0. Ol 2. Omg/cm2,生物活性物質(zhì)的含量為0. Ol 2. Omg/cm2，殼聚糖的含量為0. 02 5. Omg/cm2，其余為二氧化硅溶膠-凝膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種電化學(xué)生物傳感器敏感膜，其特征在于所述的電子傳遞體為單壁碳納米管、多壁碳納米管、富勒烯、金納米粒子、銀納米粒子、鉬納米粒子、四氧化三鐵納米粒子中的一種；所述的電子媒介體為普魯士藍(lán)、鐵氰化鉀、二茂鐵、乙?；F、丙?；F、丁?；F、戊?；F、己?；F、辛?；F、1，1'-雙乙?；F、1，1'-雙己?；F、乙基二茂鐵、丙基二茂鐵、丁基二茂鐵、戊基二茂鐵、己基二茂鐵、1，1'-雙丁基二茂鐵、1，1'-雙己基二茂鐵、環(huán)戊烯基二茂鐵、環(huán)己烯基二茂鐵、3- 二茂鐵?；?、4- 二茂鐵?；∷?、4- 二茂鐵基丁酸、5- 二茂鐵基戊酸、二茂鐵基甲醇、二茂鐵基乙醇、二甲氨基甲基二茂鐵、二茂鐵甲酸、二茂鐵乙酸、二茂鐵丙酸、二茂鐵酰胺、二茂鐵酰氯、二茂鐵硫代甲酰胺、氨基二茂鐵、萘酚綠B、天青、四氰基對苯二醌二甲烷、四硫富瓦烯、四硫富瓦烯-四氰基二亞甲基苯醌、亞甲基藍(lán)、新亞甲基藍(lán)中的一種；所述的生物活性物質(zhì)為葡糖糖氧化酶、膽固醇氧化酶、乙醇氧化酶、尿酸氧化酶、黃嘌呤氧化酶、辣根過氧化物酶、酪氨酸酶、肌紅蛋白、細(xì)胞色素氧化酶、乙酰膽堿酯酶、乳酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種電化學(xué)生物傳感器敏感膜，其特征在于所述的電子傳遞體和電子媒介體可被二者相互結(jié)合后的復(fù)合體所替代。
4.一種如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)生物傳感器敏感膜的制備方法，具體制備步驟如下A.摻雜電子傳遞體和電子媒介體的殼聚糖-二氧化硅溶膠的制備按電子傳遞體和電子媒介體的終濃度分別為為0. 5 lOmg/mL和0. 1 10mg/mL將其超聲5 60min分散于0. 1 1.0%的殼聚糖溶液中，然后按體積比為10 1 2 1的比例將電子傳遞體和電子媒介體的殼聚糖溶液與硅烷偶聯(lián)劑混合，并在室溫條件下劇烈攪拌i ^！得到摻雜電子傳遞體和電子媒介體的殼聚糖-二氧化硅溶膠；B.生物活性物質(zhì)的共價鍵合按生物活性物質(zhì)的終濃度為0. 1 lOmg/mL將其加入到A得到的溶膠中，并于O 10°C 條件下緩慢攪拌1 4h，得到共價鍵合生物活性物質(zhì)并摻雜電子傳遞體和電子媒介體的殼聚糖-二氧化硅溶膠；C.敏感膜在電極表面的制備按8 400 μ L/cm2將步驟B得到的溶膠滴到電極表面，并將電極于2 10°C條件下干燥5 Mh，即可在電極表面形成一層共價鍵合生物活性物質(zhì)并摻雜電子傳遞體和電子媒介體的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠電化學(xué)生物傳感器敏感膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)生物傳感器敏感膜的制備方法，其特征是步驟A中所述的電子傳遞體為單壁碳納米管、多壁碳納米管、富勒烯、金納米粒子、銀納米粒子、鉬納米粒子、四氧化三鐵納米粒子中的一種；所述的電子傳遞體為普魯士藍(lán)、鐵氰化鉀、二茂鐵、 乙?；F、丙?；F、丁?；F、戊?；F、己?；F、辛?；F、1，1'-雙乙?；F、1，Γ -雙己?；F、乙基二茂鐵、丙基二茂鐵、丁基二茂鐵、戊基二茂鐵、己基二茂鐵、1，1'-雙丁基二茂鐵、1，1'-雙己基二茂鐵、環(huán)戊烯基二茂鐵、環(huán)己烯基二茂鐵、3- 二茂鐵?；W酸、4- 二茂鐵?；∷?、4- 二茂鐵基丁酸、5- 二茂鐵基戊酸、二茂鐵基甲醇、二茂鐵基乙醇、二甲氨基甲基二茂鐵、二茂鐵甲酸、二茂鐵乙酸、二茂鐵丙酸、二茂鐵酰胺、二茂鐵酰氯、二茂鐵硫代甲酰胺、氨基二茂鐵、萘酚綠B、天青、四氰基對苯二醌二甲烷、四硫富瓦烯、四硫富瓦烯-四氰基二亞甲基苯醌、亞甲基藍(lán)、新亞甲基藍(lán)中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)生物傳感器敏感膜的制備方法，其特征是步驟A中所述的電子傳遞體和電子媒介體可被二者相互結(jié)合后的復(fù)合體所替代。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)生物傳感器敏感膜的制備方法，其特征是步驟A中所述的殼聚糖溶液為殼聚糖通過超聲或攪拌溶解于0. 5 2. 0%的醋酸中的溶液；所述的硅烷偶聯(lián)劑為3-異氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷、3-異氰酸酯基丙基三甲氧基硅烷、3-(2， 3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、3-(2，3-環(huán)氧丙氧)丙基三乙氧基硅烷、2-(3，4-環(huán)氧環(huán)己烷)乙基三甲氧基硅烷、3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)生物傳感器敏感膜的制備方法，其特征是步驟B中所述的生物活性物質(zhì)為葡糖糖氧化酶、膽固醇氧化酶、乙醇氧化酶、尿酸氧化酶、黃嘌呤氧化酶、辣根過氧化物酶、酪氨酸酶、肌紅蛋白、細(xì)胞色素氧化酶、乙酰膽堿酯酶、乳酸脫氫酶、 琥珀酸脫氫酶中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)生物傳感器敏感膜的制備方法，其特征是步驟C中所述的電極為玻碳電極、金電極、鉬電極、熱解石墨電極、石墨碳糊電極中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種共價鍵合生物活性物質(zhì)并摻雜電子傳遞體和電子媒介體的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠電化學(xué)生物傳感器敏感膜及其制備方法。通過硅烷偶聯(lián)劑的溶膠-凝膠過程及其與生物活性物質(zhì)以及殼聚糖的共價偶聯(lián)，將生物活性物質(zhì)共價鍵合于同步形成的殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠三維網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)中。同時將電子傳遞體和電子媒介體摻雜到其中。同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的電化學(xué)生物傳感器敏感膜對傳感器的穩(wěn)定性、選擇性和靈敏度都有顯著提高。
文檔編號G01N27/327GK102590305SQ20111000493
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月12日
發(fā)明者付光磊, 岳秀麗, 戴志飛 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)