專利名稱：一種硫酸銅快速定量分析發(fā)酵液提取物中長鏈二元酸含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二元酸發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域的檢測方法，具體地，涉及一種利用硫酸銅比色法快速定量分析發(fā)酵液提取物中長鏈二元酸的方法。
背景技術(shù)：
長鏈二元酸(long chain dicarboxylic acids, DCAs)是指碳鏈中含有10個以上碳原子的脂肪族二元羧酸。長鏈二元酸是重要的有機酸產(chǎn)品，用于合成高性能工程塑料尼龍1212、高檔服裝用尼龍熱熔膠和高級涂料等，市場需求量相當(dāng)大。用化學(xué)法生產(chǎn)長鏈二元酸存在技術(shù)、設(shè)備要求，高能耗大等缺點，而且一些長鏈二元酸也難以用化學(xué)方法制備，目前長鏈二元酸的生產(chǎn)逐步采用微生物發(fā)酵法進行。在長鏈二元酸發(fā)酵過程中，必須經(jīng)常性的對發(fā)酵液中長鏈二元酸含量進行分析，以合理的控制發(fā)酵進程。對發(fā)酵過程產(chǎn)酸量分析可以采用氣相色譜法、薄層色譜法、以及NaOH滴定法，其中氣相色譜法需使用價格昂貴的氣相色譜儀、還需對長鏈二元酸進行衍生處理，不但成本高、檢測時間長，而且對系統(tǒng)的各項要求也很高(中國科學(xué)院微生物研究所烴代謝組.微生物的正烷烴代謝I假絲醉母的正烷經(jīng)代謝產(chǎn)物的研究.微生物學(xué)報，1981，21(1) 88-95)；薄層色譜法同樣也存在檢測時間長、儀器設(shè)備要求高的問題(王麗華等.薄層色譜法分析十三碳二元酸及其單、雙甲酯.石油化工高等學(xué)校學(xué)報，2003，16 O) :29-32)。NaOH滴定法由于操作簡單，常用于發(fā)酵過程粗提產(chǎn)品中長鏈二元酸的快速分析，但滴定法存在較大誤差一直難以克服。李占朝等研究表明為了獲得較準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，需要經(jīng)過多次重復(fù)實驗，取其平均值(李占朝.十二碳二元酸的重結(jié)晶精制工藝研究.北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文，2009，17-26.)。此外，發(fā)酵生產(chǎn)長鏈二元酸粗提工藝大多采用酸沉淀法，直接利用NaOH滴定計算二元酸產(chǎn)量，提取物中無機酸殘留也會造成較大誤差。因此，研究建立一種簡便、準(zhǔn)確、高效的長鏈二元酸檢測方法， 可供實驗研究及實際生產(chǎn)的分析檢測所需。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用硫酸銅比色法快速定量分析發(fā)酵液提取物中長鏈二元酸的方法。通過長鏈二元酸與硫酸銅-甲醇溶液的Cu2+反應(yīng)形成沉淀，離心去除沉淀后，在600-850nm檢測上清液吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算長鏈二元酸的含量。本發(fā)明包括發(fā)酵長鏈二元酸樣品的制備，比色法快速分析長鏈二元酸含量兩部分。操作步驟如下(1)發(fā)酵長鏈二元酸樣品的制備取體積為V1的發(fā)酵液加lmol/1氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至9. 5、60°C下振蕩30min使長鏈二元酸充分溶于水相中。離心使發(fā)酵液中固相、水相及發(fā)酵剩余烷烴分離，取出體積為V2 的水相部分，用6mol/L HCl調(diào)pH值至2. 0，加入2倍V2體積的乙醚進行抽提，分相后乙醚萃取液倒入燒杯中，再以2倍V2體積的乙醚重新萃取一次，合并萃取液，在通風(fēng)櫥中吹去乙醚，得到白色固體即為長鏈二元酸粗提物。(2)比色法快速分析長鏈二元酸含量①配制硫酸銅-甲醇溶液稱取Ig硫酸銅加入干燥的錐形瓶中，量取20_200mL甲醇與硫酸銅混合，搖勻，至硫酸銅完全溶解。②檢測波長的選擇取硫酸銅-甲醇溶液進行光譜掃描，以最強吸收峰波長為檢測分析波長。對空白測定20次，方法的檢出限(3s/k)為0.011mg/mL。③標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立精確稱量標(biāo)準(zhǔn)十二烷二酸25、50、75、100、125、150、175、 200mg，加入5mL硫酸銅-甲醇反應(yīng)溶液，使標(biāo)準(zhǔn)十二烷二酸濃度分別為5、10、15、20、25、 30、35、40mg/mL(每個標(biāo)準(zhǔn)樣設(shè)3個平行)，常溫120rpm振蕩反應(yīng)10_60min，5000rpm離心 IOmin,取上清液于820nm波長處測定吸光值。以O(shè)D82tl為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)十二烷二酸含量為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，線性回歸方程為C1 = -91. 185X0D82Q+101.66，決定系數(shù)R2 = 0. 9920。④樣品中長鏈二元酸含量分析將一定量的待測物加入到5mL硫酸銅-甲醇反應(yīng)監(jiān)測溶液中，常溫120rpm振蕩反應(yīng)10_60min，5000rpm離心lOmin，取上清液于820nm波長處測定吸光值。將吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程中，即可計算出檢測反應(yīng)液中長鏈
二元酸的含量。根據(jù)以下公式即可算出發(fā)酵液中長鏈二元酸含量(以十二烷二酸為標(biāo)準(zhǔn))
…r、 C C1 c 101.66-91.185XOD820C(g/L) = 5x-^ = 5x---^
廠2*2本發(fā)明的優(yōu)點在于長鏈二元酸易溶于甲醇，在均相條件下和顯色劑硫酸銅反應(yīng)迅速、完全；利用比色法檢測反應(yīng)上清液吸光值，操作簡單，提高檢測結(jié)果的精確度；整個分析檢測不需要昂貴儀器設(shè)備或貴重試劑，成本低。
具體實施例方式為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明做進一步的描述。實例1 (1)發(fā)酵長鏈二元酸樣品的制備取IOOmL發(fā)酵液加lmol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至9. 5、60°C下振蕩30min使長鏈二元酸充分溶于水相中。SOOOrpm離心IOmin使發(fā)酵液中固體、水相以及發(fā)酵剩余烷烴分離，取出IOmL水相部分，用6mol/LHCl調(diào)pH值至2. 0，加入20mL乙醚進行抽提，分相后乙醚萃取液倒入燒杯中，再以20mL的乙醚重新萃取一次，合并萃取液，在通風(fēng)櫥中吹去乙醚，得到白色固體即為長鏈二元酸提取物。(2)比色法快速分析長鏈二元酸含量將長鏈二元酸提取物加入到5mL硫酸銅-甲醇反應(yīng)監(jiān)測溶液中，常溫120rpm振蕩反應(yīng)10-60min，5000rpm離心lOmin，取上清液于820nm波長處測定吸光值。根據(jù)公式
C(8/L) = 5χ·| = 5χ !Ο1.66-9 5·82。算出發(fā)酵液中長鏈二元酸含量。檢測結(jié)果發(fā)酵液中長鏈二元酸的濃度為6. 17g/L實例2:(1)發(fā)酵長鏈二元酸樣品的制備取IOOmL發(fā)酵液加lmol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至9. 5、60°C下振蕩30min使長鏈二元酸充分溶于水相中。SOOOrpm離心IOmin使發(fā)酵液中固體、水相、發(fā)酵剩余烷烴分離，取出 30mL水相部分，用6mol/LHCl調(diào)pH值至2.0，加入60mL乙醚進行抽提，分相后乙醚萃取液倒入燒杯中，再以60mL的乙醚重新萃取一次，合并萃取液，在通風(fēng)櫥中吹去乙醚，得到長鏈二元酸提取物。(2)比色法快速分析長鏈二元酸含量將長鏈二元酸提取物加入到5mL硫酸銅-甲醇反應(yīng)監(jiān)測溶液中，常溫120rpm振蕩反應(yīng)10-60min，5000rpm離心lOmin，取上清液于820nm波長處測定吸光值。根據(jù)公式
權(quán)利要求
1.一種硫酸銅快速定量分析發(fā)酵液提取物中長鏈二元酸含量的方法，包括發(fā)酵產(chǎn)長鏈二元酸樣品的制備，比色法快速分析長鏈二元酸含量；其特征在于利用長鏈二元酸與硫酸銅-甲醇溶液反應(yīng)，沉淀溶液中銅離子，固液分離后使用比色法檢測上清液吸光值，長鏈二元酸含量與吸光值成反比關(guān)系，根據(jù)由標(biāo)準(zhǔn)長鏈二元酸繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算發(fā)酵液提取物中長鏈二元酸含量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于使用十二烷二酸作為長鏈二元酸標(biāo)準(zhǔn)，十二烷二酸在硫酸銅-甲醇反應(yīng)溶液的濃度范圍為0-40mg/mL。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于硫酸銅-甲醇反應(yīng)溶液濃度為5-50g/L。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于分析測量波長為600-850nm。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種硫酸銅快速定量分析發(fā)酵液提取物中長鏈二元酸含量的方法。發(fā)酵液中長鏈二元酸經(jīng)提取后，加入硫酸銅-甲醇溶液并充分反應(yīng)，固液分離后利用比色法檢測上清液吸光值，根據(jù)長鏈二元酸含量與吸光值成反比關(guān)系計算出發(fā)酵液提取物中長鏈二元酸含量。本發(fā)明操作簡單，精確度高，成本低，是一種很好的長鏈二元酸檢測分析方法。
文檔編號G01N21/78GK102183514SQ201110028098
公開日2011年9月14日 申請日期2011年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月26日
發(fā)明者余運玲, 林日輝 申請人:廣西民族大學(xué)