專利名稱：骨組織免疫組化抗原修復(fù)的方法以及相關(guān)的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種骨組織免疫組化抗原修復(fù)的方法以及相關(guān)的試劑盒。
背景技術(shù)：
免疫組織化學(xué)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的技術(shù)，它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)中的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。免疫組化技術(shù)是一種綜合定性、定位和定量；形態(tài)、機(jī)能和代謝密切結(jié)合為一體的研究和檢測(cè)技術(shù)。在原位檢測(cè)出病原的同時(shí)，還能觀察到組織病變與該病原的關(guān)系，確認(rèn)受染細(xì)胞類型，從而有助于了解疾病的發(fā)病機(jī)理和病理過程。組織在制作過程中，由于化學(xué)試劑的作用封閉了抗原，又由于熱的作用致使部分抗原的肽鏈發(fā)生扭曲，致使在免疫組化的染色過程中不能將其顯示出來，因此在免疫組化染色后的鏡下觀察過程中，有可能出現(xiàn)下面一些問題陽(yáng)性物反應(yīng)不強(qiáng)，時(shí)隱時(shí)現(xiàn)，表達(dá)不均勻，有時(shí)可出現(xiàn)假陰性等。之所以會(huì)出現(xiàn)這些不利于觀察的現(xiàn)象，原因主要有如下幾個(gè)方面首先，組織在用甲醛固定的過程中所形成的醛鍵可封閉抗原的決定簇；其次，甲醛在保存進(jìn)程中會(huì)形成羥甲基，也可封閉抗原決定族；在組織固定過程中，甲醛與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，形成醛交聯(lián)蛋白，這種化合物封閉了抗原，使之無法表達(dá)出來。由于上面這些原因存在，因此極大地影響了免疫組化技術(shù)中對(duì)組織切片的觀察，為了解決上述存在的問題，更好地暴露出抗原，將其很好地顯示出來，目前世界上公認(rèn)的方法就是必須進(jìn)行抗原修復(fù)(Antigen retrieval) 0 Shi SR等在1991年發(fā)表的文章(參見Shi SR, Key ME, KalraKL. Antigen retrieval in formal in-fixed, paraffin-embeddedtissues an enhancement method forimmunohistochemical staining based onmicrowave oven heating of tissue sections.J Histochem Cytochem,1991,39(6)741-748)中首次提出抗原修復(fù)(Antigen retrieval)的概念。所謂抗原修復(fù)即利用化學(xué)試劑和熱的作用將這些抗原重新暴露出來或修正過來的過程。至今為止，抗原修復(fù)有許多種方法，主要分為物理化學(xué)試劑抗原修復(fù)法及化學(xué)試劑抗原修復(fù)法這兩種主要的修復(fù)方法。上述方法中，需要根據(jù)抗體種類不同，或者根據(jù)抗原的表達(dá)程度，或者根據(jù)組織不同來進(jìn)行選擇，不同的修復(fù)方法對(duì)于不同的組織也會(huì)產(chǎn)生不同的修復(fù)效果。骨組織不同于一般的軟組織，其是一種堅(jiān)硬的結(jié)締組織，骨組織由粘多糖和一些膠原纖維樣骨膠纖維構(gòu)成的骨樣組織和沉著于其中的無機(jī)鹽(骨鹽)形成的。無機(jī)鹽以羥基磷灰石結(jié)晶的形式存在，其中絕大部分為水合磷酸鈣，此外還包括微量碳酸鹽和檸檬酸鹽等。因此骨組織和其他一些已經(jīng)鈣化的組織在脫水、透明等制片過程前用單純酸類、混合酸類、螯合劑、離子交換樹脂和電解脫鈣等方法，將組織中的鈣鹽用脫鈣劑出去，才能夠制成切片。骨組織的免疫組化是病理技術(shù)中的一大難題。由于骨組織中60%以上為鈣鹽組成的羥基磷灰石結(jié)晶，因而骨組織固定、脫鈣都是制備標(biāo)本的重要環(huán)節(jié)。一些強(qiáng)酸如鹽酸、硝酸等雖能快速有效除去骨組織中的鈣鹽，但對(duì)其中的抗原蛋白也產(chǎn)生了致命性破壞?？乖钠茐臅?huì)嚴(yán)重影響免疫組化的效果，因此除了需要在組織制片過程中將抗原最大程度地保護(hù)好以外，在骨組織免疫組化過程中，還必須進(jìn)行有效的抗原修復(fù)。即在免疫組織化學(xué)前用物理或化學(xué)方法，使被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢復(fù)。
然而，現(xiàn)有技術(shù)中，常規(guī)使用的骨組織抗原修復(fù)方法，如熱抗原修復(fù)等物理法，容易造成骨組織掉片，掉片率甚至高于80%以上，并產(chǎn)生大量褶皺，影響抗原的觀察；即使使用酶修復(fù)的方法，掉片率也高達(dá)70%以上，且產(chǎn)生大量褶皺，而且抗原暴露較差，顯色很弱。即使在將載玻片換為硅化載玻片或氨基基片或后仍然存在上述現(xiàn)象。因此，本領(lǐng)域急需一種不容易造成脫片，且能夠使得抗原暴露更充分的針對(duì)骨組織免疫組化的抗原修復(fù)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的骨組織免疫組化中存在容易掉片以及骨組織抗原無法充分暴露等問題，提供一種用于骨組織免疫組化抗原修復(fù)的方法以及相關(guān)的試劑盒。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題一種用于骨組織免疫組化抗原修復(fù)的方法，包括如下步驟取預(yù)熱至18 37°C的透明質(zhì)酸酶溶液加到骨組織切片樣本上，覆蓋整個(gè)骨組織切片樣本，在18 37°C的溫度條件下消化處理10 60分鐘后清洗；然后取預(yù)熱至18 37°C的胃蛋白酶溶液加到骨組織切片樣本上，覆蓋整個(gè)組織樣本，在18 37°C的溫度條件下消化處理20 60分鐘后清洗，即可完成抗原修復(fù)。優(yōu)選的,所述透明質(zhì)酸酶溶液中,透明質(zhì)酸酶的使用濃度為I. 5 2. 5mg/ml,工作pH值為4. 5 6. O。優(yōu)選的，所述胃蛋白酶溶液中，胃蛋白酶的質(zhì)量體積比濃度為O. 3 O. 5%，工作pH值為I. O 2. 5。這里所述的“質(zhì)量體積比濃度”為溶質(zhì)的質(zhì)量與溶液體積的比例，表示每IOOml溶液中含有溶質(zhì)的質(zhì)量(單位以g計(jì))，即1%= lg/100ml。優(yōu)選的，所述透明質(zhì)酸酶溶液消化處理的溫度為23 28°C，所述胃蛋白酶溶液消化處理的溫度為23 28°C。進(jìn)一步優(yōu)選的，針對(duì)每一片骨組織切片樣本，每次使用的透明質(zhì)酸酶溶液的體積為50 IOOul，每次使用的胃蛋白酶溶液的體積為50 IOOul。所述胃蛋白酶溶液和透明質(zhì)酸酶溶液的溶劑可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的溶劑，如去離子水、生理鹽水等。優(yōu)選的，所述透明質(zhì)酸酶的溶劑為滅菌后的去離子水，并使用HCl水溶液來調(diào)節(jié)至所需要的pH值，進(jìn)一步優(yōu)選使用O. lmol/L的HCl水溶液來調(diào)節(jié)PH值；所述胃蛋白酶溶液的溶劑為HCl水溶液，進(jìn)一步優(yōu)選為O. 08 O. 12mol/L的HCl水溶液，最優(yōu)選為O. lmol/L的HCl水溶液。所述的胃蛋白酶及透明質(zhì)酸酶均可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過市售途徑獲得。
本發(fā)明的第二方面，是提供了一種試劑盒，該試劑盒中包括透明質(zhì)酸酶溶液和胃蛋白酶溶液，且所述透明質(zhì)酸酶溶液的濃度為I. 5 2. 5mg/ml，所述胃蛋白酶溶液的質(zhì)量體積比濃度為O. 3 0.5%。優(yōu)選的,所述透明質(zhì)酸酶溶液的pH值為4. 5 6. O,所述胃蛋白酶的pH值為I. O
2. 5o優(yōu)選的，所述透明質(zhì)酸酶的溶劑為滅菌后的去離子水，使用O. 08 O. 12mol/L的HCl溶液來調(diào)節(jié)至所需要的pH值；所述胃蛋白酶溶液的溶劑為HCl溶液，進(jìn)一步優(yōu)選為O. 08 O. 12mol/L的HCl溶液，最優(yōu)選為O. lmol/L的HCl溶液。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述試劑盒中，還含有磷酸鹽緩沖溶液(PBS)作為洗滌液，最優(yōu)選的，所述洗滌液為含O. 05 %吐溫-20的pH7. 4的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明的第三方面，提供了上述試劑盒的使用方法，包括如下步驟取預(yù)熱至18 37°C的透明質(zhì)酸酶溶液加到骨組織切片樣本上，覆蓋整個(gè)骨組織切片樣本，在18 370C的溫度條件下消化處理10 60分鐘后清洗；然后取預(yù)熱至18 37°C的胃蛋白酶溶液加到骨組織切片樣本上，覆蓋整個(gè)組織樣本，在18 37°C的溫度條件下消化處理20 60分鐘后清洗，即可完成抗原修復(fù)。較佳的，所述透明質(zhì)酸酶溶液消化處理后需用PBS洗滌液洗滌骨組織切片，且在胃蛋白酶溶液消化處理后需用PBS洗滌液洗滌骨組織切片。優(yōu)選的，所述PBS洗滌的步驟為洗滌3次，每次洗滌2分鐘。使用本發(fā)明的抗原修復(fù)試劑盒來針對(duì)骨組織切片進(jìn)行抗原修復(fù)處理，能夠克服傳統(tǒng)抗原修復(fù)方法(物理法及單一化學(xué)法)具有的掉片率高、抗原暴露不充分的問題。傳統(tǒng)的抗原修復(fù)方法處理后的骨組織切片一般掉片率高達(dá)90%，而采用本發(fā)明的抗原修復(fù)方法處理后的骨組織切片掉片率可以被極大程度地降低，解決了本領(lǐng)域技術(shù)人員長(zhǎng)期以來難以解決的技術(shù)問題。同時(shí)，經(jīng)本發(fā)明中所述的抗原修復(fù)方法處理后的骨組織切片與傳統(tǒng)的抗原修復(fù)方法相比較，組織破損面積不超過該樣品總面積的5%，且具有抗原暴露更加充分、顯色效果好等特性。本發(fā)明中的試劑盒具有成本低、效果好等特點(diǎn)。


圖1為實(shí)施例I中經(jīng)過抗原修復(fù)處理后的骨組織切片染色結(jié)果示意圖。圖2為實(shí)施例2中經(jīng)過抗原修復(fù)處理后的骨組織切片染色結(jié)果示意圖。圖3為實(shí)施例3中經(jīng)過抗原修復(fù)處理后的骨組織切片染色結(jié)果示意圖。圖4為實(shí)施例4中經(jīng)過抗原修復(fù)處理后的骨組織切片染色結(jié)果示意圖。
圖5為實(shí)施例I中的陰性對(duì)照組的染色結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明的技術(shù)方案。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。 本發(fā)明實(shí)施例中使用的試劑名稱及其購(gòu)買途徑如下表中所示。
權(quán)利要求
1.一種用于骨組織免疫組化抗原修復(fù)的方法，包括如下步驟 取預(yù)熱至18 37°C的透明質(zhì)酸酶溶液加到骨組織切片樣本上，覆蓋整個(gè)骨組織切片樣本，在18 37°C的溫度條件下消化處理10 60分鐘后清洗；然后取預(yù)熱至18 37°C的胃蛋白酶溶液加到骨組織切片樣本上，覆蓋整個(gè)組織樣本，在18 37°C的溫度條件下消化處理20 60分鐘后清洗，即可完成抗原修復(fù)。
2.如權(quán)利要求I中所述的用于骨組織免疫組化抗原修復(fù)的方法，其特征在于，所述透明質(zhì)酸酶溶液中，透明質(zhì)酸酶的濃度為I. 5 2. 5mg/ml,pH值為4. 5 6. 0 ;所述胃蛋白酶溶液中，胃蛋白酶的質(zhì)量體積比濃度為0. 3 0. 5%，pH值為I. 0 2. 5。
3.如權(quán)利要求I中所述的用于骨組織免疫組化抗原修復(fù)的方法，其特征在于，所述透明質(zhì)酸酶消化處理的溫度為23 28°C，所述胃蛋白酶消化處理的溫度為23 28°C。
4.如權(quán)利要求I中所述的用于骨組織免疫組化抗原修復(fù)的方法，其特征在于，所述透明質(zhì)酸酶溶液的溶劑為去離子水；所述胃蛋白酶溶液的溶劑為HCl水溶液。
5.如權(quán)利要求I 4中任一所述的用于骨組織免疫組化抗原修復(fù)的方法，其特征在于，針對(duì)每一片骨組織切片樣本，每次使用的透明質(zhì)酸酶溶液的體積為50 lOOul，每次使用的胃蛋白酶溶液的體積為50 lOOul。
6.一種用于骨組織免疫組化抗原修復(fù)的試劑盒，該試劑盒中包括透明質(zhì)酸酶溶液和胃蛋白酶溶液，且所述透明質(zhì)酸酶溶液中，透明質(zhì)酸酶的濃度為I. 5 2. 5mg/ml, pH值為4.5 6. 0 ;所述胃蛋白酶溶液中，胃蛋白酶的質(zhì)量體積比濃度為0. 3 0. 5 %，pH值為I.0 2. 5。
7.如權(quán)利要求6中所述的用于骨組織免疫組化抗原修復(fù)的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還含有PBS洗滌液。
8.如權(quán)利要求6中所述的用于骨組織免疫組化抗原修復(fù)的試劑盒，其特征在于，所述透明質(zhì)酸酶溶液的溶劑為去離子水；所述胃蛋白酶溶液的溶劑為HCl水溶液。
9.權(quán)利要求6-8中任一所述的用于骨組織免疫組化抗原修復(fù)的試劑盒的使用方法，包括如下步驟取預(yù)熱至18 37°C的透明質(zhì)酸酶溶液加到骨組織切片樣本上，覆蓋整個(gè)骨組織切片樣本，在18 37°C的溫度條件下消化處理10 60分鐘后清洗；然后取預(yù)熱至18 37°C的胃蛋白酶溶液加到骨組織切片樣本上，覆蓋整個(gè)組織樣本，在18 37°C的溫度條件下消化處理20 60分鐘后清洗，即可完成抗原修復(fù)。
10.如權(quán)利要求9中所述的用于骨組織免疫組化抗原修復(fù)的試劑盒的使用方法，其特征在于，所述透明質(zhì)酸酶溶液消化處理后需用PBS洗滌液洗滌骨組織切片樣本，且在胃蛋白酶溶液消化處理后需用PBS洗滌液洗滌骨組織切片樣本。
11.權(quán)利要求6-8中任一所述的用于骨組織免疫組化抗原修復(fù)的試劑盒在骨組織免疫組化領(lǐng)域的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種骨組織免疫組化抗原修復(fù)的方法以及相關(guān)的試劑盒。所述方法包括如下步驟取透明質(zhì)酸酶溶液加到骨組織切片樣本上，消化處理后清洗；然后取胃蛋白酶溶液加到骨組織切片樣本上，消化處理20～60分鐘后清洗。本發(fā)明還公開了一種骨組織免疫組化抗原修復(fù)試劑盒及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明的抗原修復(fù)方法能夠?qū)⒐墙M織免疫組化樣本在抗原修復(fù)后的掉片率降低至5%以下，組織破損面積不超過該樣品總面積的5%，樣品抗原暴露效果更好。本發(fā)明的抗原修復(fù)方法及相關(guān)試劑盒解決了骨組織免疫組化的嚴(yán)重掉片和抗原暴露不充分的問題，可以廣泛適應(yīng)各種骨組織的免疫組化實(shí)驗(yàn)。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102620979SQ20111003425
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2011年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月31日
發(fā)明者田鳴, 陳海清 申請(qǐng)人:上海舜百生物科技有限公司