專利名稱：檢測(cè)Galectin-3的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種時(shí)間分辨免疫熒光(Time Resolved Fluoroimmunoassay, TRF)檢測(cè)方法，具體為應(yīng)用時(shí)間分辨免疫熒光方法檢測(cè)樣品中的 Galectin-3蛋白的濃度。人外周血中(ialectin-3蛋白濃度的增加與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)，運(yùn)用本試劑盒能夠?qū)σ认侔┑陌l(fā)生發(fā)展起到診斷作用。
背景技術(shù)：
(ialectin-3是β -半乳糖苷結(jié)合蛋白，屬lectin家族成員，它具有CRD結(jié)構(gòu)域， 與含β-半乳糖苷的糖蛋白和糖脂具有很高的親和力，在細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間起到特異性粘附作用，與腫瘤的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)、生長(zhǎng)和粘附密切相關(guān)。我們運(yùn)用MALDI-T0F-MS質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)(ialectin-3在人胰腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)[1]，并且它的表達(dá)水平與胰腺癌的分期及預(yù)后相關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，正常人、胰腺癌和其它消化系統(tǒng)腫瘤外周血清中均未檢測(cè)出feilectin-3蛋白，而胰腺癌患者外周血清中的feilectin-3陽性率高達(dá)為30% β]。因此，Galectin-3對(duì)胰腺癌具有明確的診斷價(jià)值。時(shí)間分辨免疫熒光(Time Resolved Fluoroimmunoassay, TRF)檢測(cè)方法是一種成熟的免疫分析方法，具有高特異、高靈敏的優(yōu)點(diǎn)，是在臨床醫(yī)學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等諸多方面得到十分廣泛的應(yīng)用，是目前取代放射性免疫分析的一種定量檢測(cè)方法。它的基本原理是利用三價(jià)稀土離子(如Eu3+)作為示蹤物，延遲檢測(cè)壽命較長(zhǎng)的特異性激發(fā)熒光以排除非特異性及背景熒光的干擾，即測(cè)定復(fù)合物中的稀土離子被激發(fā)的延遲熒光強(qiáng)度，從而確定待測(cè)蛋白的濃度。使用熒光增強(qiáng)液的TRF能夠檢測(cè)到皮克(pg，10 — 12g/ml)水平的蛋白，因此， 本試劑盒采用TRF的方法來檢測(cè)(ialectin-3的濃度，是考慮了多方面的優(yōu)點(diǎn)。目前，國(guó)際上還沒有報(bào)道專門用于檢測(cè)(ialectin-3的時(shí)間分辨免疫熒光方法，也沒有相應(yīng)的試劑盒提供，因此，該試劑盒的開發(fā)和應(yīng)用，是填補(bǔ)了這方面的空白。參考文獻(xiàn)
1.Jian-Hua Chen, Run-Zhou Ni ☆ , Ming-Bing Xiao, et al. Comparative proteomic analysis of differentially expressed proteins in human pancreatic cancer tissue. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2009 Apr;8(2):193-200. (☆ :Corresponding author)
2.葛飛，倪潤(rùn)洲☆，肖明兵，江楓，陸翠華，李立人，朱凈，李小彥，劉肇修。血清 (ialectin-3對(duì)胰腺癌診斷價(jià)值的初探。《南通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)》，2010,30 (1):32 — 3
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靈敏、特異的檢測(cè)樣本中(ialectin-3蛋白濃度的試劑盒及其制備方法。本發(fā)明的目的是通過以下方法實(shí)現(xiàn)的在酶標(biāo)板中用包被抗體(單克隆小鼠抗人Galectin-3抗體)包被，封閉后加入待測(cè)樣品孵育，洗板，加入檢測(cè)抗體(生物素化的羊抗人 (ialectin-3多抗)孵育，再次洗板后加入Eu3 +標(biāo)記的鏈親和霉素孵育，然后洗板加入熒光增強(qiáng)液，振蕩5分鐘后用337nm波長(zhǎng)光激發(fā)，延時(shí)200微秒在615nm波長(zhǎng)處檢測(cè)發(fā)射熒光值； 通過標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和相應(yīng)的熒光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，待檢樣品中的(ialectin-3濃度就可以通過它的熒光值并對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到。本發(fā)明檢測(cè)(ialectin-3的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，其包括以下組成
(1)包被緩沖液為磷酸鹽緩沖液(PBS)，其成分為140mMNaCl, 2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4,1. 8mM KH2PO4, pH 值為 7· 4 ；
(2)封閉液為含1%BSA的PBS，其成分為PBS，1%BSA；
(3)洗滌液為含0. 05%Tween-20 的 iTris-HCl 緩沖液(TBS)，其成分為 SOmMmiTris-HCl 緩沖液(pH 7. 8),0. 05%Tween-20 ；
(4)加樣緩沖液的成分為含1%BSA的PBS，其成分為PBS，1%BSA；
(5)熒光增強(qiáng)液(EnhancementSolution)；
(6)檢測(cè)緩沖液(AssayBuffer)為50mM的Tris-HCl緩沖液(pH 7.8)，其中含有 1%BSA,l%bovine globulin,0. 05%Tween 40，DTPA ；
(7)包被抗體為單克隆小鼠抗人feilectin-3抗體(MonoclonalAnti-Human Galectin-3 Antibody)，儲(chǔ)存濃度為 1 μ g/ μ 1 ；
(8)檢測(cè)抗體為生物素化的羊抗人feilectin-3多抗(BiotinylatedAnti-Human Galectin-3 Antibody)，儲(chǔ)存濃度為 50ng/ μ 1 ；
(9)Eu3+標(biāo)記的鏈親和霉素(Eu3+-labeled str印tavidin)，儲(chǔ)存濃度為0. 1 μ g/ μ 1 ；
(10)標(biāo)準(zhǔn)品，重組人Galectin-3 蛋白(Recombinant Human Galectin-3)，濃度為 100 μ g/μ 1。
本發(fā)明檢測(cè)felectin-3的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒的使用步驟如下
(1)用PBS稀釋包被抗體一單克隆小鼠抗人feilectin-3抗體(MonoclonalAnti-Human Galectin-3 Antibody)至濃度為4μ g/ml，以100 μ 1/孔加入96孔酶標(biāo)板，4°C過夜；
(2)棄去包被抗體，300μ1/孔洗滌液洗滌三次，加入封閉液200μ 1/孔，37°C孵育Ih ；
(3)棄去封閉液，300μ 1/孔洗滌液洗滌三次，加入待測(cè)培養(yǎng)上清樣品和倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品100μ 1/孔，37°C孵育Ih ；
(4)棄去樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，300μ 1/孔洗滌液洗滌三次；
(5)用加樣緩沖液稀釋檢測(cè)抗體一生物素化的羊抗人(ialectin-3多抗(Biotinylated Anti-Human Galectin-3 Antibody)至濃度為75ng/ml，以100 μ 1/孔加入稀釋好的檢測(cè)抗體，37°C孵育lh；
(6)棄去檢測(cè)抗體，300μ 1/孔洗滌液洗滌三次；
(7)用檢測(cè)緩沖液(AssayBuffer)稀釋Eu3 +標(biāo)記的鏈親和霉素(Eu3 +-labeled str印tavidin)，終濃度為500ng/ml，以100 μ 1/孔加入酶標(biāo)板，37°C避光孵育Ih ；
(8)棄去Eu3+標(biāo)記的鏈親和霉素(Eu3+-labeled str印tavidin)，300 μ 1/孔洗滌液洗滌四次
(9)加入熒光增強(qiáng)液(EnhancementSolution) 200 μ 1/孔，室溫避光緩慢水平搖動(dòng)5min ；
(10)讀板設(shè)定激發(fā)光波長(zhǎng)(Excitationwavelength)為337nm，發(fā)射光波長(zhǎng) (Emission wavelength)為615nm，延時(shí)200微秒測(cè)定615nm處的熒光值；
(11)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)繪圖軟件根據(jù)測(cè)定的值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(12)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和未知濃度樣品的熒光值計(jì)算待測(cè)樣品中的(ialectin-3的濃度。
本試劑盒采用時(shí)間分辨免疫熒光方法來檢測(cè)樣品中的felectin-3蛋白濃度，其中應(yīng)用了雙抗體夾心法，利用包被抗體一單克隆小鼠抗人feilectin-3抗體(Monoclonal Anti-Human Galectin-3 Antibody)來捕獲樣品中微量的feilectin-3蛋白，然后用生物素 it^i^-iKA Galectin-3 (Biotinylated Anti-Human Galectin-3 Antibody) 捕獲的(ialectin-3蛋白結(jié)合，由于生物素與鏈親和霉素能夠高親和力結(jié)合，我們用Eu3+標(biāo)記的鏈親和霉素(Eu3 + -labeled streptavidin)來與生物素化的羊抗人feilectin-3多抗結(jié)合，形成三明治樣復(fù)合結(jié)構(gòu)，樣品中的(ialectin-3就被Eu3+標(biāo)記上并固定在酶標(biāo)板中， 最后應(yīng)用337nm波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)，在發(fā)射光波長(zhǎng)(Emission wavelength)為615nm處，測(cè)定熒光值；然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算(Galectin-3的濃度。應(yīng)用時(shí)間分辨免疫熒光法來高靈敏、高特異地檢測(cè)外周血中的felectin-3濃度是該試劑盒的一個(gè)最顯著特色和創(chuàng)新。
本發(fā)明還具有良好的穩(wěn)定性，操作時(shí)間短，成本低。


圖1為檢測(cè)(ialectin-3蛋白濃度的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中的一些術(shù)語與縮寫TRF:時(shí)間分辨免疫熒光；BSA:牛血清白蛋白； Tween-20 吐溫20 ；Tween-40 吐溫40 ；PBS 磷酸鹽緩沖液；TBS =Tris-HCl 緩沖液；bovine globulin 牛球蛋白；DTPA 二乙烯三胺五乙酸。試劑配方
1.緩沖液
包被緩沖液為磷酸鹽緩沖液(PBS)，其成分為140mM NaCl,2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 1. 8mM KH2PO4, pH 值為 7· 4 ；
洗滌液為含0. 05%Tween-20的iTris-HCl緩沖液(TBS)，其成分為50mM的iTris-HCl 緩沖液(pH 7. 8),0. 05%Tween-20 ；
封閉液為含1%BSA的PBS，其成分為PBS，1%BSA ； 加樣緩沖液為含1%BSA的PBS，其成分為PBS，1%BSA ；
檢測(cè)緩沖液為50mM的Tris-HCl緩沖液(pH 7. 8)，其中含有1%BSA, l%bovine globulin,0. 05%Tween 40，DTPA ；
2.標(biāo)準(zhǔn)品蛋白
商品化的重組人feilectin-3蛋白(R&D公司產(chǎn)品)4.酶標(biāo)板
Nunc八聯(lián)孔酶標(biāo)條
本發(fā)明運(yùn)用時(shí)間分辨免疫熒光方法來檢測(cè)樣品中的felectin-3蛋白濃度，其試劑盒的使用步驟如下
(1)用PBS稀釋包被抗體一單克隆小鼠抗人feilectin-3抗體(MonoclonalAnti-Human Galectin-3 Antibody)至濃度為4μ g/ml，以100 μ 1/孔加入96孔酶標(biāo)板，4°C過夜；
(2)棄去包被抗體，300μ 1/孔洗滌液洗滌三次，加入封閉液200 μ 1/孔，37°C孵育Ih ；
(3)棄去封閉液，300μ1/孔洗滌液洗滌三次，加入待測(cè)培養(yǎng)上清樣品和倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品100μ 1/孔，37°C孵育Ih ；
(4)棄去樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，300μ 1/孔洗滌液洗滌三次；
(5)用加樣緩沖液稀釋檢測(cè)抗體一生物素化的羊抗人(ialectin-3多抗(Biotinylated Anti-Human Galectin-3 Antibody)至濃度為75ng/ml，以100 μ 1/孔加入稀釋好的檢測(cè)抗體，37°C孵育lh；
(6)棄去檢測(cè)抗體，300μ 1/孔洗滌液洗滌三次；
(7)用檢測(cè)緩沖液(AssayBuffer)稀釋Eu3 +標(biāo)記的鏈親和霉素(Eu3 +-labeled str印tavidin)，終濃度為500ng/ml，以100 μ 1/孔加入酶標(biāo)板，37°C避光孵育Ih ；
(8)棄去Eu3+標(biāo)記的鏈親和霉素(Eu3+-labeled str印tavidin)，300 μ 1/孔洗滌液洗滌四次
(9)加入熒光增強(qiáng)液(EnhancementSolution) 200 μ 1/孔，室溫避光緩慢水平搖動(dòng) 5min ；
(10)讀板設(shè)定激發(fā)光波長(zhǎng)(Excitationwavelength)為337nm，發(fā)射光波長(zhǎng) (Emission wavelength)為615nm，延時(shí)200微秒測(cè)定615nm處的熒光值；
(11)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)繪圖軟件根據(jù)測(cè)定的值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(12)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和未知濃度樣品的熒光值計(jì)算待測(cè)樣品中的(ialectin-3的濃度。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)feilectin-3的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，其特征在于包括以下組成(1)包被緩沖液為磷酸鹽緩沖液(PBS)，其成分為140mMNaCl, 2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4,1. 8mM KH2PO4, pH 值為 7· 4 ；(2)封閉液為含1%BSA的PBS，其成分為PBS，1%BSA；(3)洗滌液為含0. 05%Tween-20 的 iTris-HCl 緩沖液(TBS)，其成分為 50mM 的 iTris-HCl 緩沖液(pH 7. 8),0. 05%Tween-20 ；(4)加樣緩沖液的成分為含1%BSA的PBS，其成分為PBS，1%BSA；(5)熒光增強(qiáng)液(EnhancementSolution)；(6)檢測(cè)緩沖液(AssayBuffer)為50mM的Tris-HCl緩沖液(pH 7.8)，其中含有 1%BSA,l%bovine globulin,0. 05%Tween 40，DTPA ；(7)包被抗體為單克隆小鼠抗人feilectin-3抗體(MonoclonalAnti-Human Galectin-3 Antibody)，儲(chǔ)存濃度為 1 μ g/ μ 1 ；(8)檢測(cè)抗體為生物素化的羊抗人feilectin-3多抗(BiotinylatedAnti-Human Galectin-3 Antibody)，儲(chǔ)存濃度為 50ng/ μ 1 ；(9)Eu3+標(biāo)記的鏈親和霉素(Eu3+-labeled str印tavidin)，儲(chǔ)存濃度為0. 1 μ g/ μ 1 ；(10)標(biāo)準(zhǔn)品，重組人Galectin-3 蛋白(Recombinant Human Galectin-3)，濃度為 100 μ g/μ 1。
2.如權(quán)利要求1所述檢測(cè)felectin-3的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒的使用方法，其特征在于以下步驟(1)用PBS稀釋包被抗體一單克隆小鼠抗人feilectin-3抗體(MonoclonalAnti-Human Galectin-3 Antibody)至濃度為4μ g/ml，以100 μ 1/孔加入96孔酶標(biāo)板，4°C過夜；(2)棄去包被抗體，300μ1/孔洗滌液洗滌三次，加入封閉液200μ 1/孔，37°C孵育Ih ；(3)棄去封閉液，300μ 1/孔洗滌液洗滌三次，加入待測(cè)培養(yǎng)上清樣品和倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品100μ 1/孔，37°C孵育Ih ；(4)棄去樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，300μ 1/孔洗滌液洗滌三次；(5)用加樣緩沖液稀釋檢測(cè)抗體一生物素化的羊抗人(ialectin-3多抗(Biotinylated Anti-Human Galectin-3 Antibody)至濃度為75ng/ml，以100 μ 1/孔加入稀釋好的檢測(cè)抗體，37°C孵育lh；(6)棄去檢測(cè)抗體，300μ 1/孔洗滌液洗滌三次；(7)用檢測(cè)緩沖液(AssayBuffer)稀釋Eu3 +標(biāo)記的鏈親和霉素(Eu3 +-labeled str印tavidin)，終濃度為500ng/ml，以100 μ 1/孔加入酶標(biāo)板，37°C避光孵育Ih ；(8)棄去Eu3+標(biāo)記的鏈親和霉素(Eu3+-labeled str印tavidin)，300 μ 1/孔洗滌液洗滌四次(9)加入熒光增強(qiáng)液(EnhancementSolution) 200 μ 1/孔，室溫避光緩慢水平搖動(dòng) 5min ；(10)讀板設(shè)定激發(fā)光波長(zhǎng)(Excitationwavelength)為337nm，發(fā)射光波長(zhǎng) (Emission wavelength)為615nm，延時(shí)200微秒測(cè)定615nm處的熒光值；(11)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)繪圖軟件根據(jù)測(cè)定的值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(12)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和未知濃度樣品的熒光值計(jì)算待測(cè)樣品中的(ialectin-3的濃度。
全文摘要
檢測(cè)Galectin-3的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒。試劑盒包括包被緩沖液；封閉液；洗滌液；加樣緩沖液；熒光增強(qiáng)液；檢測(cè)緩沖液；包被抗體(單克隆小鼠抗人Galectin-3抗體)；檢測(cè)抗體(生物素化的羊抗人Galectin-3多抗)；Eu3＋標(biāo)記的鏈親和霉素；標(biāo)準(zhǔn)品(重組人Galectin-3蛋白)。其使用包括該試劑盒采用雙抗體夾心法和時(shí)間分辨免疫熒光原理來檢測(cè)樣品中的Galectin-3蛋白的濃度。在酶標(biāo)板中包被抗體包被，封閉后加入待測(cè)樣品孵育，洗板，加入檢測(cè)抗體孵育，再次洗板后加入Eu3＋標(biāo)記的鏈親和霉素孵育，然后洗板加入熒光增強(qiáng)液，振蕩5分鐘后用337nm波長(zhǎng)光激發(fā)，延時(shí)200微秒在615nm波長(zhǎng)處檢測(cè)發(fā)射熒光值；通過標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和相應(yīng)的熒光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，待檢樣品中的Galectin-3濃度就可以通過它的熒光值并對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102226809SQ201110036899
公開日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月13日
發(fā)明者倪潤(rùn)洲, 倪溫慨, 肖明兵 申請(qǐng)人:倪潤(rùn)洲, 倪溫慨, 肖明兵