專利名稱：檢測鼠疫耶爾森氏菌的試劑及熒光定量pcr檢測鼠疫耶爾森氏菌的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及檢測鼠疫耶爾森氏菌的試劑及鼠疫病原菌的檢測方法，尤其涉及復合 探針鼠疫病原菌標識基因進行擴增，進而利用熒光PCR技術檢測鼠疫病原菌的方法。
背景技術：
鼠疫(Plague)由鼠疫桿菌引起的，嚴重危害人類的一種烈性傳染病。鼠疫具有傳 染性強、傳播迅速、病情嚴重、病死率高等特點，為國際檢疫傳染病之一。我國頒布的《傳染 病防治法》也將鼠疫定為甲類傳染病。傳染病預防控制的最關鍵技術環(huán)節(jié)就是建立病原體偵查檢測的實驗室診斷方法， 能準確、快速地檢出與監(jiān)測病原體。鼠疫耶爾森氏菌的檢測目前仍然主要是依靠細菌培養(yǎng)， 生化反應，血清凝集等方法來鑒定。這些方法已經(jīng)使用了幾十年，并在細菌鑒定中發(fā)揮了重 大作用，但普遍存在檢測時間滯后，方法的敏感性差等不足，不能滿足快速準確的需求。傳 統(tǒng)PCR技術和核酸雜交技術的發(fā)現(xiàn)大大的促進了細菌檢測技術的發(fā)展，但存在容易交叉污 染、無法定量分析等不足。實時熒光定量PCR技術解決了傳統(tǒng)PCR技術的不足，已經(jīng)成為細 菌等微生物快速定量檢測的首選技術。定量PCR技術可在同一管內實現(xiàn)DNA的擴增和同步 檢測，而無需在PCR后進行凝膠電泳分析，具有高效、快速、特異的優(yōu)點，非常適用于單一病 原體的檢測。Taqman探針、分子信標、雜交探針(Lightcycler)等用于炭疽、鼠疫、霍亂等生 物戰(zhàn)劑的檢測中，相關儀器可對采集到的樣品進行實時檢測分析。發(fā)展快速、敏感、特異、系 統(tǒng)的病原微生物的篩查技術、方法和試劑，發(fā)展先進、系統(tǒng)的病原微生物分離和檢測方法， 可以有效地對傳染病的暴發(fā)和流行進行早期預警、快速確認，控制新發(fā)傳染病的口岸傳入， 并可有助于提高對突發(fā)公共衛(wèi)生事件、暴發(fā)疫情和不明原因疾病的快速應急反應和處理能 力。

發(fā)明內容
本發(fā)明的第一個目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種檢測鼠疫耶爾森氏菌的 試劑，可以用于快速準確地檢測鼠疫耶爾森氏菌。為此，本發(fā)明采用以下技術方案它包括 以下上游引物、下游引物、熒光探針和淬滅探針；上游引物的基因序列Pl 為5，-ATTCTGTTGTTTTGCCTTGA-3，，即序列表 SEQ NO 1 所示序列；下游引物的基因序列P2為5，-CTTGGATGTTGAGCTTCCTA-3，即序列表SEQ NO 2所 示序列；熒光探針的基因序列T7 為5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3，，即序列表 SEQ NO 3 所示序列；淬滅探針的基因序列SP6 為5，-TAAAATCCACTGTGATATCTT-3，，即序列表 SEQ NO 4所示序列。
本發(fā)明另一個目的是提供一種熒光定量PCR檢測鼠疫耶爾森氏菌的方法，可以快 速準確地檢測鼠疫耶爾森氏菌。為此，本發(fā)明采用以下技術方案它采用直接水煮法提取鼠疫耶爾森氏菌基因組DNA 取50 μ 11 X 109CFU/mL的細 菌樣品，置于沸水浴中煮沸10分鐘，IOOOOXg離心2分鐘，取2μ 1上清作為擴增模板；所述方法的PCR 反應體系為 25 μ 1 :l(kimol/L 的 Tris-HCl，pH 為 8. 0 ；5(kimol/ L 的 KCl ；體積百分比 3% 甲酰胺；5mmol/L MgCL2 ； 100 μ mol/L 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP ； 0. 5ymol/L的上述上游引物，0. 5ymol/L的上述下游引物，1. 5U Taq酶，100nmol/L的上述 熒光探針，200nmol/L的上述淬滅探針；PCR反應程序為預變性95°C 3min、94°C 5s、擴增的 退火溫度為54°C 20s共40個循環(huán)；所述方法還包括以下檢測步驟提取樣本DNA為擴增模板，按上述熒光定量PCR的 反應體系及反應程序在實施熒光定量PCR儀上進行擴增，并同時進行陰性對照和陽性對照 的擴增，其中陰性對照采用非鼠疫致病菌，陽性對照采用鼠疫耶爾森氏菌陽性參考品；反應 結束后，將樣本循環(huán)閾值C(t)與熒光定量PCR標準曲線對照，就得到樣本DNA中的靶基因 片段拷貝濃度；按照靶基因片段拷貝濃度判斷樣本中鼠疫耶爾森氏菌的濃度。本發(fā)明具有顯著的優(yōu)點，通常傳統(tǒng)的鼠疫耶爾森氏菌檢測技術操作繁瑣，耗時較 長，影響因素多，不能達到快速診斷的目的。根據(jù)鼠疫耶爾森氏菌6MD質粒上特有的致病基 因-血漿凝固酶及胞漿素原活化因子Pla基因，設計引物和探針，與整個genbank數(shù)據(jù)庫進 行BLAST檢索，發(fā)現(xiàn)其只對鼠疫菌上的pla基因序列特異，和其它物種的核酸序列無同源， 保證了檢測方法的特異性。該方法可在同一管內實現(xiàn)DNA的擴增和同步檢測，而無需在PCR 后進行凝膠電泳分析，對樣本的定量檢測只需2小時左右即可完成，具有操作簡便，高效、 快速、特異的優(yōu)點。


圖Ia為實施例1中組合1的檢測同一模板的實時擴增曲線圖，其中，1為 1 X 105cfu/ml的實時擴增曲線、2為lX104cfu/ml的實時擴增曲線、3為1 X 103cfu/ml的實 時擴增曲線。圖Ib為實施例1中組合2的檢測同一模板的實時擴增曲線圖，其中，1為 1 X 105cfu/ml的實時擴增曲線、2為lX104cfu/ml的實時擴增曲線、3為1 X 103cfu/ml的實 時擴增曲線。圖2a為實施例1中FP探針的純度分析圖譜。圖2b為實施例1中QP探針的純度分析圖譜。圖3a為實施例1中上游引物的的HPLC分析圖譜。圖3b為實施例1中下游引物的的HPLC分析圖譜。圖4為淬滅探針的淬滅效果圖，其中，1表示單有熒光探針組，2表示復合探針組。圖5為熒光探針的延伸性能圖，其中，1為加上游引物組，2.為不加上游引物組。圖6為本發(fā)明實施例2繪制的熒光定量PCR標準曲線
具體實施例方式實施例1引物與探針的制備
1.靶基因選擇鼠疫耶爾森氏菌6MD質粒上有產生鼠疫耶爾森氏菌素的pst基因和血漿凝固酶及 胞漿素原活化因子Pla基因，后者被認為與人類致病有關，可作為鼠疫菌的診斷標志。根據(jù) 檢索genbank數(shù)據(jù)庫，獲得pla基因序列。2.熒光探針、淬滅探針與PCR引物的設計和篩選遵循復合探針設計原則，根據(jù)pla基因的序列，設計了兩組引物和探針。熒光探針 5'端標記熒光分子FAM作為報告基團，3'端標記磷酸，以阻斷其延伸。淬滅探針的3'端 連接一淬滅基團Dabcyl。為了從兩組復合探針及引物組合中篩選出擴增效率高的一個組合，將這些組合 進行實時PCR分析，采用檢測鼠疫耶爾森氏菌標準株ATCC23053-B1的3個不同濃度樣本 (1 X 105cfu/ml、1 X 104cfu/mlU X 103cfu/ml)，觀察它們同時擴增同一樣品的能力來確定 最佳組合。如表1和圖la、lb所示，采用組合1進行檢測時，其檢測樣品時的Ct值較小，而 且熒光響應強度值ARFU較高，說明該組合擴增效率較高，因此，在后述的所有實驗中，均 采用這個組合。表1引物及探針組合對擴增效率的影響
權利要求
1.檢測鼠疫耶爾森氏菌的試劑，其特征在于它包括以下上游引物、下游引物、熒光探針 和淬滅探針；上游引物的基因序列Pl為5，-ATTCTGTTGTTTTGCCTTGA-3’ ；下游引物的基因序列P2為5，-CTTGGATGTTGAGCTTCCTA-3 ；熒光探針的基因序列T7為5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3，；淬滅探針的基因序列 SP6 為5，-TAAAATCCACTGTGATATCTT-3，。
2.一種熒光定量PCR檢測鼠疫耶爾森氏菌的方法，其特征在于它采用直接水煮法提 取鼠疫耶爾森氏菌基因組DNA 取50 μ 11 X 109CFU/mL的細菌樣品，置于沸水浴中煮沸10分 鐘，IOOOOXg離心2分鐘，取2 μ 1上清作為擴增模板；所述方法的 PCR 反應體系為 25 μ 1 :10mmol/L 的 Tris-HCl，pH 為 8. 0 ;50mmol/L 的 KCl ； 體積百分比 3% 甲酰胺；5mmoVLMgCL2 ； 100 μ mol/L 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP ；0. 5 μ mol/ L的權利要求1所述的上游引物，0. 5 μ mol/L的權利要求1所述的下游引物，1. 5U Taq酶， 100nmol/L的權利要求1所述的熒光探針，200nmol/L的權利要求1所述的淬滅探針；PCR反 應程序為預變性95°C 3min、94°C 5s、擴增的退火溫度為20s共40個循環(huán)；所述方法還包括以下檢測步驟提取樣本DNA為擴增模板，按上述熒光定量PCR的反應 體系及反應程序在實施熒光定量PCR儀上進行擴增，并同時進行陰性對照和陽性對照的擴 增，其中陰性對照采用非鼠疫致病菌，陽性對照采用鼠疫耶爾森氏菌陽性參考品；反應結束 后，將樣本循環(huán)閾值C(t)與熒光定量PCR標準曲線對照，就得到樣本DNA中的靶基因片段 拷貝濃度；按照靶基因片段拷貝濃度判斷樣本中鼠疫耶爾森氏菌的濃度。
3.如權利要求2所述的一種熒光定量PCR檢測鼠疫耶爾森氏菌的方法，其特征在于 熒光定量PCR標準曲線采用以下步驟制得取不同DNA載量的質粒參考品各2 μ 1，按上述熒光定量PCR的反應體系及反應程序在 實施熒光定量PCR儀上進行擴增；反應結束后根據(jù)得到的各個濃度的循環(huán)閾值C (t)，采用 計算機自動繪制熒光定量PCR標準曲線。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測鼠疫耶爾森氏菌的試劑，它包括上游引物、下游引物、熒光探針和淬滅探針。本發(fā)明還提供了利用上述試劑熒光定量PCR檢測鼠疫耶爾森氏菌的方法。本發(fā)明根據(jù)鼠疫耶爾森氏菌6MD質粒上特有的致病基因-血漿凝固酶及胞漿素原活化因子pla基因，設計引物和探針，與整個genebank數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索，發(fā)現(xiàn)其只對鼠疫菌上的pla基因序列特異，和其它物種的核酸序列無同源，保證了檢測方法的特異性。該方法可在同一管內實現(xiàn)DNA的擴增和同步檢測，而無需在PCR后進行凝膠電泳分析，對樣本的定量檢測只需2小時左右即可完成，具有操作簡便，高效、快速、特異的優(yōu)點。
文檔編號G01N21/64GK102146467SQ20111003845
公開日2011年8月10日 申請日期2011年2月15日 優(yōu)先權日2011年2月15日
發(fā)明者呂沁風, 吳忠華, 李 禾, 鄭偉 申請人:浙江國際旅行衛(wèi)生保健中心