專(zhuān)利名稱(chēng)：草魚(yú)呼腸孤病毒快速檢測(cè)試紙及其制備、使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及養(yǎng)殖病害病原檢測(cè)技術(shù)的改進(jìn)，具體講是一種草魚(yú)呼腸孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)快速檢測(cè)試紙及其制備、使用方法，屬于免疫學(xué)和病毒學(xué)交叉技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
草魚(yú)呼腸孤病毒病是草魚(yú)養(yǎng)殖中危害嚴(yán)重的疾病之一，導(dǎo)致很高的草魚(yú)死亡率， 可達(dá)70-80 %的死亡率，給草魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。該病毒引起的疾病又稱(chēng)為草魚(yú)出 血病，其出血癥狀常與細(xì)菌引起的出血很難鑒別，又鑒于草魚(yú)出血病尚無(wú)有效的治療方法， 因而簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)方法尤顯重要，以期達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防的目的?？焖贉?zhǔn)確的病毒分 離檢測(cè)技術(shù)已成為學(xué)者研究的焦點(diǎn)之一。目前，病毒性草魚(yú)出血病的診斷主要是依靠實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒檢測(cè)來(lái)確 診，現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法有葡萄球菌A蛋白協(xié)同凝集試驗(yàn)(楊廣智1991)；酶聯(lián)免疫吸附檢 測(cè)法(江育林1993)；熒光抗體技術(shù)檢測(cè)法(江育林1993)；斑點(diǎn)免疫印跡檢測(cè)法(邵健忠 1996)；免疫吸附電鏡觀察法(袁愛(ài)華1990)；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(王鐵輝1997)等。 這些方法，操作程式較為復(fù)雜，需要一定的實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備，且耗時(shí)較長(zhǎng)，整個(gè)過(guò)程需要幾 個(gè)乃至十幾個(gè)小時(shí)，達(dá)不到快速檢測(cè)的目的。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法靈敏度高，可用于無(wú) 癥狀病魚(yú)的檢測(cè)，但其高靈敏度易導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法及斑點(diǎn)免疫印跡 檢測(cè)法，是目前常用的檢測(cè)方法，但被檢組織的內(nèi)源酶可以對(duì)其檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致假 陽(yáng)性的出現(xiàn)。因此一種適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害病原的快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速、無(wú)假陽(yáng)性的檢測(cè) 方法的研制勢(shì)在必行，以期達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒病嚴(yán)重危害草魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的現(xiàn)狀，針對(duì)水生生物生理特 點(diǎn)，設(shè)計(jì)發(fā)明提供一種能夠達(dá)到快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確檢測(cè)目的的草魚(yú)呼腸孤病毒快速檢測(cè)試紙 及其制備、使用方法。本發(fā)明的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)如下草魚(yú)呼腸孤病毒快速檢測(cè)試紙，其包括保藏號(hào)為CCTCC_C201103雜交瘤細(xì)胞 所分泌的抗草魚(yú)呼腸孤病毒、膠體金標(biāo)記的單克隆抗體C(簡(jiǎn)稱(chēng)金標(biāo)單抗C)；保藏號(hào)為 CCTCC-C201104雜交瘤細(xì)胞所分泌的抗草魚(yú)呼腸孤病毒的單克隆抗體D (簡(jiǎn)稱(chēng)單抗D)和 羊抗小鼠IgG ；適當(dāng)尺寸的不干膠載體板；其特殊之處在于在該載體板的中間部設(shè)有由粘 貼包被有單抗D (又稱(chēng)檢測(cè)線)和羊抗小鼠IgG (又稱(chēng)質(zhì)控線)的硝酸纖維膜制成的檢測(cè) 層；與該層相延續(xù)的兩端設(shè)置吸水紙分別構(gòu)成加樣端吸水層和手持端吸水層；在檢測(cè)層的 檢測(cè)線的遠(yuǎn)端與加樣端吸水層交界處，設(shè)有載有金標(biāo)單抗C的玻璃纖維膜，該膜一端部分 設(shè)置在加樣端吸水層之下，其另一端部分設(shè)置在檢測(cè)層之上。所述的金標(biāo)單抗C制備
是以公知的膠體金的制備工藝制備膠體金溶液，膠體金的顆粒大小為10-20nm，將 單克隆抗體C加入到上述的膠體金溶液中，慢攪混勻，加入牛血清白蛋白，離心后的沉淀用 含有1-10%牛血清白蛋白和0. 3-3%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液懸起，加入疊氮鈉，制成金標(biāo) 單抗C。所述的載有金標(biāo)單抗C的玻璃纖維膜的制備將金標(biāo)單抗C液體，按每平方厘米700-1000 μ 1噴在玻璃纖維膜上，冷凍干燥，40C
保存?zhèn)溆?。草魚(yú)呼腸孤病毒快速檢測(cè)試紙的使用方法將該試紙的加樣端吸水層插入或在其 上滴加被檢測(cè)樣品，5-10分鐘內(nèi)在位于檢測(cè)層上的檢測(cè)線和質(zhì)控線處顯示紅色，即雙紅線， 表示草魚(yú)呼腸孤病毒陽(yáng)性和檢測(cè)試紙有效。所述的檢測(cè)樣品制備的過(guò)程是取被檢草魚(yú)腎臟加入至離心管中，按質(zhì)量/體積 1 (5-10) (g/ml)加入0. 01mol/L pH為6_8的磷酸鹽緩沖液，用搗碎棒將草魚(yú)腎臟搗碎， 使病毒釋放于該離心管液體中，即制成檢測(cè)樣品。本發(fā)明草魚(yú)呼腸孤病毒快速檢測(cè)試紙的檢測(cè)原理將草魚(yú)呼腸孤病毒快速檢測(cè)試紙的加樣端吸水層插入或在其上滴加由磷酸鹽緩 沖液從搗碎的草魚(yú)腎臟提取含有病毒粒子的檢測(cè)樣品，根據(jù)夾心免疫層析原理，即由金標(biāo) 單抗C同檢測(cè)樣品液中的抗原反應(yīng)，形成由金標(biāo)單抗C-草魚(yú)呼腸孤病毒復(fù)合物，當(dāng)該復(fù)合 物層析至硝酸纖維素膜上預(yù)先包被在檢測(cè)線上的單抗D處時(shí)，此處的抗體會(huì)識(shí)別該復(fù)合物 中抗原，反應(yīng)的結(jié)果便形成了金標(biāo)單抗C+草魚(yú)呼腸孤病毒抗原+單抗D的夾心結(jié)構(gòu)，最終 是單抗C上標(biāo)記的膠體金顆粒在此固定并累積出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紅色線，未反應(yīng)的金標(biāo)單抗 C則仍繼續(xù)層析前行，當(dāng)?shù)竭_(dá)點(diǎn)預(yù)先包被在質(zhì)控線羊抗鼠IgG處時(shí)，抗體類(lèi)型為IgG的金標(biāo) 單抗C被其結(jié)合住，從而在此處也出現(xiàn)由膠體金顆粒固定并累積而顯現(xiàn)出肉眼可見(jiàn)的紅色 線，結(jié)果是檢測(cè)線顯示紅色表示草魚(yú)呼腸孤病毒陽(yáng)性；檢測(cè)線不顯示紅色，表示草魚(yú)呼腸 孤病毒陰性，即檢測(cè)樣品中不含草魚(yú)呼腸孤病毒或是草魚(yú)呼腸孤病毒含量極低。質(zhì)控線顯 示紅色，表示試紙有效；質(zhì)控線處不顯示紅色，說(shuō)明試紙失效，即或是金標(biāo)抗體C、或是羊抗 鼠IgG失活，檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明的草魚(yú)呼腸孤病毒快速檢測(cè)試紙，從實(shí)際的養(yǎng)殖需要出發(fā)，使用時(shí)無(wú)需 專(zhuān)門(mén)設(shè)施和操作技術(shù)，適合普通養(yǎng)殖戶(hù)池邊檢測(cè)，應(yīng)用簡(jiǎn)單，具有檢測(cè)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈 敏等特點(diǎn)，并具有較高的穩(wěn)定性；2、本發(fā)明的草魚(yú)呼腸孤病毒快速檢測(cè)試紙使用方法中，無(wú)需加入特殊的裂解液； 只需將草魚(yú)腎臟搗碎即可，與傳統(tǒng)病毒提取研磨、離心等方法相比，此方法方便簡(jiǎn)單，可快 速提取病毒檢測(cè)。


圖1草魚(yú)呼腸孤病毒快速檢測(cè)試紙示意圖；圖2草魚(yú)呼腸孤病毒快速檢測(cè)試紙的檢測(cè)結(jié)果示意圖。雜交瘤細(xì)胞株GCRV-C，其保藏編號(hào)為CCTCC_C201103 ；保藏單位全稱(chēng)及簡(jiǎn)稱(chēng)中 國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)；保藏單位地址湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心；保藏日期2011年1月17日。雜交瘤細(xì)胞株GCRV-D，其保藏編號(hào)為CCTCC-C201104 ；保藏單位全稱(chēng)及簡(jiǎn)稱(chēng)中 國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)；保藏單位地址湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏 中心；保藏日期2011年1月17日。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施例結(jié)合附圖進(jìn)一步描述如下參見(jiàn)圖1，2本發(fā)明草魚(yú)呼腸孤病毒快速檢測(cè)試紙，其包括保藏號(hào)為 CCTCC-C201103雜交瘤細(xì)胞所分泌的抗草魚(yú)呼腸孤病毒、膠體金標(biāo)記的單克隆抗體C(簡(jiǎn) 稱(chēng)金標(biāo)單抗C)；保藏號(hào)為CCTCC-C201104雜交瘤細(xì)胞所分泌的抗草魚(yú)呼腸孤病毒的單克 隆抗體D (簡(jiǎn)稱(chēng)單抗D)和羊抗小鼠IgG ；包被有單抗D和羊抗小鼠IgG的硝酸纖維膜；載 有金標(biāo)單抗C的玻璃纖維膜2 ；帶有不干膠的載體板7 (加樣端為A，手持端為B)。在帶有 不干膠的載體板7的中間部，粘貼包被有單抗D(又稱(chēng)檢測(cè)線3)和羊抗小鼠IgG(又稱(chēng)質(zhì) 控線4)的硝酸纖維膜為檢測(cè)層5 ；與該層相延續(xù)的兩端設(shè)置吸水紙分別構(gòu)成加樣端吸水層 1和手持端吸水層6 ；在檢測(cè)層5的檢測(cè)線3的遠(yuǎn)端與加樣端吸水層1交界處，設(shè)有載有金 標(biāo)單抗C的玻璃纖維膜2，該膜一端部分設(shè)置在加樣端吸水層1之下，其另一端部分設(shè)置在 檢測(cè)層5之上。實(shí)施例1.所述的單抗C膠體金標(biāo)記方法為(1)膠體金的制備10-20nm膠體金顆粒制備，將0.01%氯金酸溶液IOOOml與 0. 1 %檸檬酸鈉25-44ml混合，加熱至100攝氏度，制成膠體金溶液，該溶液的pH值用 0.2%碳酸鉀調(diào)至8. 0-8. 4，備用；(2)金標(biāo)單抗C的制備單抗C濃度為3_5g/L時(shí)，IOOml膠體金標(biāo)記的最適單抗量為120-150 μ 1，按此 比例將單抗C加入到膠體金溶液中，慢攪50-60分鐘，加入牛血清白蛋白，4°C過(guò)夜；然 后將其在4°C下，17000g離心110-120分鐘；取離心沉淀，用含有牛血清白蛋白和 0. 3-3% 吐溫-20 的 0. 01mol/L磷酸鹽緩沖液(KCLO. 2g，NaCL8. 0g，KH2PO4O. 2g, Na2HPO412H20 2. 9g，蒸餾水1000ml,pH 7. 4)懸起，再加疊氮鈉將濃度調(diào)至0. 01-0. 03%，即制成金標(biāo)單抗 C0實(shí)施例2.載有金標(biāo)單抗C的玻璃纖維層塊的制備將制成的金標(biāo)單抗C，按每平方厘米 700-1000 μ 1噴在玻璃纖維膜上，冷凍干燥，4°C保存?zhèn)溆谩?shí)施例3.本發(fā)明的草魚(yú)呼腸孤病毒快速檢測(cè)試紙檢測(cè)層制備方法為辛酸_硫酸銨法提純 的抗草魚(yú)呼腸孤病毒單抗D冷凍干燥后，制備成3-5mg/ml抗草魚(yú)呼腸孤病毒單抗D液，用 劃線機(jī)將其劃于硝酸纖維素膜上，形成檢測(cè)線3 ；同樣，將羊抗小鼠IgG，制備成l-2mg/ml， 用劃線機(jī)將其劃于硝酸纖維素膜上，形成質(zhì)控線4。兩線相距4-6mm，質(zhì)控線4近手持端吸 水層6，檢測(cè)線3近加樣端吸水層1，36-37°C烘干。實(shí)施例4.
本發(fā)明的分別分泌單抗C和D的兩株雜交瘤細(xì)胞，其制備與選擇的方法如下(1)利用草魚(yú)腎細(xì)胞系體外擴(kuò)增草魚(yú)呼腸孤病毒，利用超速離心法純化病毒。(2)用提純的草魚(yú)呼腸孤病毒液為抗原，免疫Balb/c小白鼠；(3)將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合，培養(yǎng)得450株雜交瘤細(xì)胞；(4)采用間接免疫熒光法篩選出抗草魚(yú)呼腸孤病毒的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株；(5)采用有限稀釋法對(duì)其中20株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行了克?。?6)通過(guò)不同模式金標(biāo)免疫層析方法選出2株不同的抗草魚(yú)呼腸孤病毒的單抗C 和D，分別作為金標(biāo)單抗與包被檢測(cè)線單抗。其具體實(shí)驗(yàn)方法為通過(guò)間接免疫熒光法選出 抗病毒強(qiáng)陽(yáng)性的5種單抗，單抗C、單抗E、單抗A、單抗B以及單抗D，金標(biāo)單抗C與分別以 同濃度、同體積的這5種單抗為包被抗體，同時(shí)檢測(cè)同一草魚(yú)呼腸孤病毒樣本，結(jié)果單抗D 為包被抗體時(shí)，效果最佳(見(jiàn)表1)。因而，選擇單抗C作為金標(biāo)單抗，而單抗D為包被檢測(cè) 線的單抗。表1不同模式檢測(cè)草魚(yú)呼腸孤病毒的金標(biāo)免疫層析結(jié)果
權(quán)利要求
1.草魚(yú)呼腸孤病毒快速檢測(cè)試紙，其包括保藏號(hào)為CCTCC-C201103雜交瘤細(xì)胞所 分泌的抗草魚(yú)呼腸孤病毒、膠體金標(biāo)記的單克隆抗體C(簡(jiǎn)稱(chēng)金標(biāo)單抗C)；保藏號(hào)為 CCTCC-C201104雜交瘤細(xì)胞所分泌的抗草魚(yú)呼腸孤病毒的單克隆抗體D (簡(jiǎn)稱(chēng)單抗D)和 羊抗小鼠IgG ；適當(dāng)尺寸的不干膠載體板；其特征在于在該載體板的中間部設(shè)有由粘貼包被有單抗D(又稱(chēng)檢測(cè)線)和羊抗小鼠 IgG (又稱(chēng)質(zhì)控線)的硝酸纖維膜制成的檢測(cè)層；與該層相延續(xù)的兩端設(shè)置吸水紙，分別構(gòu) 成加樣端吸水層和手持端吸水層；在檢測(cè)層的檢測(cè)線的遠(yuǎn)端與加樣端吸水層交界處，設(shè)有 載有金標(biāo)單抗C的玻璃纖維膜，該膜一端部分設(shè)置在加樣端吸水層之下，其另一端部分設(shè) 置在檢測(cè)層之上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述草魚(yú)呼腸孤病毒快速檢測(cè)試紙，其特征在于所述的膠體金標(biāo) 記的單克隆抗體C，其制備方法如下(1)膠體金的制備以公知的方法，按一定的配比將氯金酸與檸檬酸三鈉混合并加熱 制備成膠體金溶液，制得的膠體金的顆粒大小為10-20nm ；(2)膠體金標(biāo)記的單克隆抗體C的制備將單克隆抗體C加入到上述(1)步的膠體金溶 液中，慢攪混勻，加入牛血清白蛋白，離心后的沉淀用含有1-10%牛血清白蛋白和0. 3-3% 吐溫-20的磷酸鹽緩沖液懸起，加入疊氮鈉，制成膠體金標(biāo)記的單克隆抗體C;(3)載有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體C的玻璃纖維膜的制備將上述(2)步制成的膠體 金標(biāo)記的單克隆抗體C，按每平方厘米700-1000 μ 1噴在玻璃纖維膜上，冷凍干燥，4°C保存
3.權(quán)利要求1所述草魚(yú)呼腸孤病毒快速檢測(cè)試紙的使用方法，其特征在于將該試紙 的加樣端吸水層插入或在其上滴加被檢測(cè)樣品，5-10分鐘內(nèi)在位于檢測(cè)層上的檢測(cè)線和質(zhì) 控線處顯示紅色，即雙紅線，表示草魚(yú)呼腸孤病毒陽(yáng)性和檢測(cè)試紙有效。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述草魚(yú)呼腸孤病毒快速檢測(cè)試紙的使用方法，其特征在于所述 的檢測(cè)樣品制備的過(guò)程是取被檢草魚(yú)腎臟加入至離心管中，按質(zhì)量/體積比1 (5-10) (g/ml)加入0. Olmol/LpH為6-8的磷酸鹽緩沖液，用搗碎棒將草魚(yú)腎臟搗碎，使病毒釋放于 該離心管液體中，即制成檢測(cè)樣品。
全文摘要
一種草魚(yú)呼腸孤病毒快速檢測(cè)試紙，包括保藏號(hào)為CCTCC-C201103雜交瘤細(xì)胞所分泌的抗草魚(yú)呼腸孤病毒、膠體金標(biāo)記的金標(biāo)單抗C；保藏號(hào)為CCTCC-C201104雜交瘤細(xì)胞所分泌的抗草魚(yú)呼腸孤病毒的單抗D和羊抗小鼠IgG，不干膠載體板；在該載體板的中間部設(shè)有由粘貼包被有單抗D構(gòu)成檢測(cè)線和羊抗小鼠IgG構(gòu)成質(zhì)控線的硝酸纖維膜制成的檢測(cè)層；與該層相延續(xù)的兩端設(shè)置吸水紙，分別構(gòu)成加樣端吸水層和手持端吸水層；在檢測(cè)層的檢測(cè)線的遠(yuǎn)端與加樣端吸水層交界處，設(shè)有載有金標(biāo)單抗C的玻璃纖維膜，該膜一端部分設(shè)置在加樣端吸水層之下，其另一端部分設(shè)置在檢測(cè)層之上。該試紙穩(wěn)定性好，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/558GK102109526SQ20111003935
公開(kāi)日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2011年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月12日
發(fā)明者張莉, 杜蓉, 王曉潔 申請(qǐng)人:魯東大學(xué)