專利名稱：hIL-17RD-ECD單克隆抗體的制備及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體的制備和應用，尤其涉及一種hIL-17RD-E⑶單克隆抗體的制備及應用。
背景技術：
Thl7細胞分泌的IL-17包括IL-17A和IL-17F這兩個炎癥分子，他們都是通過 IL-17受體家族傳遞信號，從而影響下游基因表達的。白介素17受體家族(IL-17reC印tor) 是一種廣泛存在于免疫活性細胞上的免疫性受體，能介導IL-17信號通路，具有很多重要的生理功能。目前已經發(fā)現(xiàn)了小鼠和人IL-17RD可以傳遞IL-17信號傳導，并和IL-17RA 形成雜合二聚體。目前，對IL-17RA在基因克隆，蛋白表達等方面都進行了大量的研究，并取得了很大進展，而對IL-17RD的研究相對較少。IL-17RD在一次大規(guī)模的原位雜交中被發(fā)現(xiàn)，而此次原位雜交旨在篩選出在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中空間限制基因。這些在類似的空間和時間表達的基因形成一個相互調控在共同通路中相互作用的家族。IL-17RD表達模式與成纖維細胞生長因子基因家族相似，而其表達也是受到FGFs調控的。自從IL-17RD首次從斑馬魚中被發(fā)現(xiàn)以來，在雞，鼠，人類中其直系統(tǒng)同源都被鑒定出來。IL-17RD基因只存在于脊椎動物中，定位于單一的基因座。然而，通過可變聯(lián)結機制形成了 IL-17RD異構體具有不同的生物化學和生物學特性。因此，進一步對IL-17RD的活性和作用機制的研究稱為熱點。

發(fā)明內容
本發(fā)明一個目的是提供一種保藏號為CGMCC No. 4576的小鼠雜交瘤細胞 (musmusculus hybridoma)1F8。本發(fā)明提供了一種保藏號為CGMCC No. 4576的小鼠雜交瘤細胞(mus musculushybridoma)1F8。本發(fā)明另一個目的是提供由保藏號為CGMCC No. 4576的小鼠雜交瘤細胞 (musmusculus hybridoma) 1F8 產生的單克隆抗體。本發(fā)明提供了由保藏號為CGMCC No. 4576的小鼠雜交瘤細胞(mus musculushybridoma) 1F8產生的單克隆抗體。所述的單克隆抗體在制備白介素17受體D檢測試劑盒中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。所述的單克隆抗體在制備檢測白介素17受體D的膠體金快速檢測試紙條中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。含有所述的單克隆抗體的檢測白介素17受體D的試劑盒也是本發(fā)明保護的范圍。含有所述的單克隆抗體的檢測白介素17受體D的膠體金快速檢測試紙條也是本發(fā)明保護的范圍。
經篩選得到能穩(wěn)定分泌抗人白介素17受體D(hIL_17RD)的單克隆抗體的雜交瘤細胞株1F8，該雜交瘤細胞株1F8的分類命名為小鼠雜交瘤細胞mus musculushybridoma, 已于2011年2月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱 CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)， 保藏號為 CGMCC No. 4576。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明篩選得到1株能穩(wěn)定分泌抗人白介素17受體 D(hIL-17RD)的單克隆抗體的雜交瘤細胞，并對其進行生物學特性鑒定，以期進一步探討 hIL-17RD基因與自身免疫疾病如類風濕性關節(jié)炎之間可能存在的相互關系及其功能的深入研究提供依據和奠定基礎，制備抑制類風濕關節(jié)炎等自身免疫疾病的潛在藥物蛋白。


圖 1 為 hIL-17RD-ECD 蛋白的 SDS-PAGE 分析圖2為陽性雜交瘤細胞特異性篩選圖3為抗hIL_17RD的單克隆抗體的類型鑒定圖4為腹水抗體效價的測定圖5為單抗純度及分子質量鑒定圖6為Western blot檢測內源hIL_17RD的結果圖 7 為 Western blot 檢測外源的 hIL_17RD 和 hIL_17RD_ECD
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、單克隆抗體的制備1、動物免疫人工合成hIL_17RD的胞外區(qū)蛋白(hIL_17RD_ECD，其核苷酸序列為序列表中的序列1所示，其氨基酸序列為序列表中的序列2所示，與GenbankNM_017563. 3的第1-739位核苷酸一致)的核苷酸序列作為模板，以IL-17RD-F_BamHI :atgcggatcccgccgacacctgtggc和 IL-17RD-R-PstI :aactgcagtcagtgatggtgatg 為引物，進行 PCR 擴增，得到的 PCR 產物經過 BamHI和I3StI酶切，與經過同樣酶切的PFASTBAC-DUAL EXP VECTOR載體(購自hvitrogen 產品目錄10712024)大片段連接，得到連接產物，轉化大腸桿菌DH5a，得到轉化子，轉染步驟如下a、挑白斑提取轉化子的質粒；b、轉染在直徑8cm的dish里均勻的鋪(2. 5-3) X IO6個sf9細胞(購自武漢病毒所，sf9 cell)，細胞融合度為70%-80%。準備兩個2ml的EP管，各加入IOOul的sf900 無血清培養(yǎng)基(Invitrogen，產品目錄#10902096)，向其中一管中加入15ulCellfectin (轉染試劑，購自hvitrogen，貨號G4B2996936FB53)，另一管中加入2mg質粒，輕輕混勻，室溫 (250C )靜置5min然后將兩管混在一起，室溫(25°C )靜置30min。加1. 8ml sf900培養(yǎng)基輕柔混勻，滴加在鋪好的細胞表面，培養(yǎng)箱中靜置證。在證后細胞基本貼壁，吸出培養(yǎng)基， 加入8ml新的無血清sf900。27°C靜置培養(yǎng)10天，離心留上清，即為PO病毒。
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C、病毒擴增取50ul PO加入到50ml密度為(1. 5-2. 5) XlO6的sf9細胞中， 270C IOOrpm培養(yǎng)6天，離心收上清，即為Pl病毒，此時病毒滴度已可以感染細胞并大量表達蛋白。d、感染并表達蛋白用大的細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)800ml sf9細胞，當細胞密度為 (1. 5-2. 5) X IO6且狀態(tài)良好時，以1 100加入Pl病毒，27°C IOOrpm培養(yǎng)48-72h，收細胞。e、蛋白純化將細胞培養(yǎng)物4000rpm離心lOmin，上清抽濾后濃縮，在此過程中換用 lysis buffer (IOmM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.5)濃縮到 200ml，離心 15000rpm35min, 收集上清加入1.5ml Ni-NTA，4°C搖動孵育池，使目標蛋白與Ni-NTA充分結合。孵育后， 使清液流過，加入含20mM咪唑的lysis buffer洗800ml，用15ml含500mM咪唑的lysis buffer洗脫目的蛋白，濃縮至800ul，使用AKTA和Superdex200分子篩層析柱(GE公司產品目錄G4A90FD2ACFF64)進行進一步精細純化，純化后SDS-PAGE檢測結果如圖1所示，可以看出該蛋白大小為35KDa左右，即得到目的蛋白hIL-17RA-ECD(hIL-17RD胞外區(qū)蛋白；外源 hIL-17RD-ECD)。選6只8-12周齡Balb/C小鼠進行腹腔內免疫，初次免疫用80ug hIL_17RD胞外區(qū)蛋白加弗氏完全佐劑，兩周后，用40ug hIL-17RD-E⑶加弗氏不完全佐劑強化免疫2次， 每次間隔2周，最后一次用hIL-17RD-ECD采用靜脈注射強化免疫(不含佐劑)，3天后尾部采血，ELISA檢測血清抗體效價。2、間接 ELISA 法用2ug/ml的抗原(hIL-17RD_ECD蛋白)IOOul/孔包被96孔板，4°C過夜后，用洗液洗滌3次，加150ul/孔封閉液在37°C封閉池，洗滌3次，拍干。加入待測樣品(血清)， 第一孔1 1000稀釋，往下1 3的梯度倍比稀釋，37°C孵育30min，洗板4次，拍干。取辣根酶標記的羊抗鼠IgG(bse-(^96G上海碩盟生物科技公司)按照1 5000倍稀釋， IOOul/孔加入板子，37°C孵育30min，洗滌4次，拍干。最后加入IXTMB IOOul/孔，37°C顯色15-30min。然后加入終止液(2M H2SO4) 50ul/孔。以450nm單波長測定各孔OD值，并用陰性對照孔PBS (GIBCO 21600-044,稱量干粉4. 875g溶入500ml超純水滅菌備用)OD值的比值(P/N)大于2. 1為限，作為判斷陽性或者確定效價的臨界點。結果為血清效價為1 720000的陽性小鼠，可以用于細胞融合。3、雜交瘤細胞融合篩選1)、融合前4天將陽性小鼠強化免疫，小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0比例為 10 1，PEG(分子量4000)融合，選擇培養(yǎng)基為含HAT的RPMI640培養(yǎng)基。10天后，ELISA 篩選雜交瘤細胞上清，用有限稀釋法對抗體分泌陽性雜交瘤細胞進行克隆，經過兩次篩選最終確定13株細胞為陽性細胞。2)、特異性測定間接ELISA法檢測所有陽性13株細胞是否能夠特異識別hIL_17RD，以 hIL-17RD-E⑶(核苷酸序列為序列表中的序列1)和hIL-17RA-E⑶(其核苷酸序列為Gene ID :NM_017563的第1-897位核苷酸，制備方法與1中的hIL_17RD_E⑶基本相同。)為抗原，結果如圖2所述，可以看出，只有一株命名為1F8的陽性細胞可以與hIL-17RD-E⑶特異結合，說明1F8可以特異識別hIL-17RD經篩選得到能穩(wěn)定分泌抗人白介素17受體D(hIL_17RD)的單克隆抗體的雜交瘤細胞株1F8，該雜交瘤細胞株1F8的分類命名為小鼠雜交瘤細胞mus musculushybridoma, 已于2011年2月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱 CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)， 保藏號為 CGMCC No. 4576。4、單克隆抗體的生產及純化1)同系小鼠單克隆抗體腹水的制備采用動物體內生產單抗的方法。每只Balb/C小鼠腹腔注射滅菌液體石蠟0. 5ml, 7天后，每只小鼠腹腔注射IX IO6個小鼠雜交瘤細胞(mus musculus hybridoma) 1F8CGMCC No. 4576。7天后觀察小鼠腹水生產情況，如腹部明顯膨大，即可抽取腹水。腹水采集后 13000RPM離心IOmin除去油脂和沉淀，收集上清液，即為腹水單克隆抗體。2)純化將腹水單克隆抗體用Binding Buffer (LS6510-10供應廠商Biovision)平衡 protein G(LS6510-10供應廠商=Biovision)至基線平穩(wěn)，收集流穿液，然后將流穿液再次上柱，平衡至基線平穩(wěn)。加入Eluting Buffer(LS6510-10供應廠商Biovision)洗脫，收集洗脫峰，即為純化的腹水單克隆抗體。二、單克隆抗體特性鑒定1、抗體類及亞類的鑒定用采用Southern Biotech 試劑盒(5300-01 southernbiotecti)鑒定單克隆抗體的亞類，結果如圖3所示，雜交瘤細胞株1F8CGMCC No. 4576分泌的單克隆抗體的重鏈為 IgGl，輕鏈為Kappa型。2、ELISA效價的測定采用間接ELISA測定純化的腹水單克隆抗體，2ug/ml的抗原(hIL-17RD_ECD蛋白)100ul/孔包被96孔板做ELISA，結果如圖4所示，可以看出，純化后效價為1 81000。3.抗體的分子質量鑒定采用SDS-PAGE進行測定單克隆抗體，結果如圖5所示，單克隆抗體的重鏈約為 46KD，輕鏈約為25KD。4.單抗?jié)舛葴y定紫外分光法測定單克隆抗體在^Onm和^Onm處的吸光度值A280和A260。蛋白含量按照下列公式計算蛋白質含量(g/L) = 1. 45XA280-0. 74XA260。結果為蛋白質含量為1.62mg/ml。實施例2、單克隆抗體的應用分別取昆明白小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司請?zhí)峁┏鍪酃炯爱a品目錄號)的腦、腎、肺，分別提取腦、腎、肺的蛋白；人工合成hIL-17RD(GenbankNM_017563. 3 的第 1-739 位核苷酸)， 以 IL-17RD-F-BamHI :atgcggatcccgccgacacctgtggc 禾口 IL-17RD-R-Ps11 aactgcagtcagtgatggtgatg為引物，得到的PCR產物經過BamHI和I3StI酶切，與經過同樣酶切的PFASTBAC-DUAL EXP VECTOR載體大片段的連接，得到連接產物，轉化大腸桿菌DH5a，得到轉化子，轉染步驟如下a、挑白斑提取轉化子的質粒；
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b、轉染在直徑8cm的dish里均勻的鋪(2. 5_3) X IO6個sf9細胞，細胞融合度為 70%-80%。準備兩個2ml的EP管，各加入IOOul的sf900無血清培養(yǎng)基，向其中一管中加 15ul Cellfectin，另一管中加入2mg質粒，輕輕混勻，室溫(25°C )靜置5min然后將兩管混在一起，室溫)靜置30min。加1. 8ml sf900培養(yǎng)基輕柔混勻，滴加在鋪好的細胞表面，培養(yǎng)箱中靜置證。在證后細胞基本貼壁，吸出培養(yǎng)基，加入8ml新的無血清sf900。 27°C靜置培養(yǎng)10天，離心留上清，即為PO病毒。C、病毒擴增取50ul PO加入到50ml密度為(1. 5-2. 5) XlO6的sf9細胞中， 270C IOOrpm培養(yǎng)6天，離心收上清，即為Pl病毒，此時病毒滴度已可以感染細胞并大量表達蛋白。d、感染并表達蛋白用大的細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)800ml sf9細胞，當細胞密度為 (1. 5-2. 5) X IO6且狀態(tài)良好時，以1 100加入Pl病毒，27°C IOOrpm培養(yǎng)48-72h，收細胞。e、蛋白純化將細胞培養(yǎng)物4000rpm離心lOmin，上清抽濾后濃縮，在此過程中換用 lysis buffer (IOmM HEPES, 150mM NaCl，pH 7. 5)濃縮到 200ml，離心 15000rpm35min，收集上清加入1.5ml Ni-NTA，4°C搖動孵育池，使目標蛋白與Ni-NTA充分結合。孵育后，使清液流過，加入含20mM咪唑的lysis buffer洗800ml，用15ml含500mM咪唑的lysis buffer 洗脫目的蛋白，濃縮至800ul，使用AKTA和SuperdeX200分子篩層析柱進行進一步精細純化，SDS-PAGE檢測結果，即得到較純的目的蛋白純化得到外源hIL-17RD。腦、腎、肺的蛋白、外源hIL-17RD、外源hIL_17RD_ECD(實施例1得到的hIL_17RD 胞外區(qū)蛋白)進行Wfestern blot分析，將蛋白經SDS-PAGE電泳，轉移至NC膜上，將實施例1得到純化的腹水單克隆抗體(1 10000)稀釋作為一抗，HRP標記的羊抗鼠 IgG(bse-(^96G，上海碩盟生物科技公司)作為二抗。結果如圖6和7所示，其中6為腦、腎、肺的蛋白的結果，從圖中可以看出1腦，2 腎，3 肺中存在 hIL-17RD ；大小均為 130KD，這與 hIL_17RD (Gene ID :NM_017563 的第 1-897 位核苷酸)的大小一致。7為外源IL-17RD和外源的hIL_17RD_E⑶的檢測結果，其中1為外源的 hIL-17RD，2為外源的hIL-17RD-ECD，從圖中看出，可以檢測出外源hIL-17RD (100KD)和 hIL-17RD-ECD(130KD)。檢測得到的大小與已知蛋白的大小一致，證明本發(fā)明的單克隆抗體正確。
權利要求
1.保藏號為CGMCC No. 4576 的小鼠雜交瘤細胞(mus musculus hybridoma) 1F8。
2.由保藏號為CGMCCNo. 4576的小鼠雜交瘤細胞(mus musculus hybridoma) 1F8產生的單克隆抗體。
3.權利要求2所述的單克隆抗體在制備白介素17受體D檢測試劑盒中的應用。
4.權利要求2所述的單克隆抗體在制備檢測白介素17受體D的膠體金快速檢測試紙條中的應用。
5.含有權利要求2所述的單克隆抗體的檢測白介素17受體D的試劑盒。
6.含有權利要求2所述的單克隆抗體的檢測白介素17受體D的膠體金快速檢測試紙
全文摘要
本發(fā)明公開了一種hIL-17RD-ECD單克隆抗體的制備及應用。本發(fā)明提供的一種保藏號為CGMCC No.4576的小鼠雜交瘤細胞(mus musculus hybridoma)1F8。還提供了小鼠雜交瘤細胞(mus musculus hybridoma)1F8產生的單克隆抗體。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明篩選得到1株小鼠雜交瘤細胞(mus musculushybridoma)1F8，并對其進行生物學特性鑒定，以期進一步探討hIL-17RD基因與自身免疫疾病如類風濕性關節(jié)炎之間可能存在的相互關系及其功能的深入研究提供依據和奠定基礎，制備抑制類風濕關節(jié)炎等自身免疫疾病的潛在藥物蛋白。
文檔編號G01N33/577GK102174475SQ201110039700
公開日2011年9月7日 申請日期2011年2月17日 優(yōu)先權日2011年2月17日
發(fā)明者任芳麗, 夏永靜, 孫小軍, 常智杰, 楊世高, 王銀銀 申請人:清華大學