專利名稱：一種以漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物傳感器領(lǐng)域，尤其是涉及一種以漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極的制備方法。
背景技術(shù)：
酚類物質(zhì)在環(huán)境中廣泛的存在，作為一種有毒物質(zhì)，對人類的健康造成了極大的危害，因此酚類物質(zhì)的檢測就成為了亟待解決的問題，同時(shí)也對環(huán)境監(jiān)測有著重要的意義。對苯二酚被廣泛的應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域，是一種毒性很強(qiáng)且難于的降解的酚類污染物之一，現(xiàn)有的對苯二酚檢測方法主要采用色譜法，存在分析儀器昂貴、操作復(fù)雜，不能及時(shí)在線監(jiān)測的缺陷。生物傳感器是指用固定化的生物體成分(如酶、抗原、抗體、激素等)或生物體本身(如細(xì)胞、細(xì)胞器、組織等)作為分子識別元件，對待測分析物具有高度選擇性的分析儀器。生物傳感器是一門由生物、化學(xué)、物理、醫(yī)學(xué)、電子、材料技術(shù)等多種學(xué)科相互滲透成長起來的新學(xué)科。酶電極是第一代生物傳感器，它是以酶作為分子識別器件的電化學(xué)生物傳感器，由一個(gè)固定化酶敏感膜和與之密切結(jié)合的電極組成的換能系統(tǒng)，它把固定化酶和電極結(jié)合在一起，因而具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)(I)它既有不溶性酶體系的優(yōu)點(diǎn)，又具有電化學(xué)系統(tǒng)的高靈敏性；(2)由于酶的專一反應(yīng)性，使其具有很高的選擇性；(3)酶電極安全可靠、靈敏度高、分析速度快、操作簡易、儀器設(shè)備簡單及便于攜帶等特點(diǎn)。固定化酶的方法主要吸附法、共價(jià)結(jié)合法及交聯(lián)結(jié)合法，其中吸附法具有技術(shù)簡單，工藝條件溫和，可供選擇的載體多樣及載體可活化循環(huán)再利用的特點(diǎn)。目前，酶電極已成功地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、國防、環(huán)境、食品工業(yè)及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，成為一種強(qiáng)有力的分析工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種工藝簡單、成本低廉、檢測方便、便于攜帶的以漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極的制備方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種以漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(I)采用水熱法與煅燒法結(jié)合制備多孔納米二氧化鈦微球載體；(2)將步驟(I)制備得到的多孔納米二氧化鈦微球載體與稀漆酶溶液混合后于振蕩水槽吸附固定化，得到漆酶/多孔納米二氧化鈦固定化酶；(3)將步驟(2)制備得到的漆酶/多孔納米二氧化鈦固定化酶，均勻分散到四氟乙烯與全氟_2-(磺酸乙氧基)丙基乙烯基醚的共聚物(Nafion)稀溶液后，將得到的混合溶液均勻滴在玻碳電極上，然后在常溫下自然干燥即可。步驟(I)中所述的水熱法包括以下步驟向二氯二茂鈦的水溶液中滴加乙二胺，控制反應(yīng)溫度為100-150°C，反應(yīng)時(shí)間為5-8h，得到的初樣品依次用去離子水、無水乙醇各離心洗滌三次。
所述的二氯二茂鈦的水溶液的濃度為l-3mg/mL，滴加的乙二胺與二氯二茂鈦的水溶液的體積比為(0.01-0.015) I。步驟(I)中所述的煅燒法包括以下步驟采用控制升溫，將經(jīng)水熱法合成得到的產(chǎn)品置于管式爐中，控制升溫速率為3-4°C /s，煅燒溫度為400°C，煅燒時(shí)間為2h，然后控制將溫速率為3-4°C /s將溫度降至室溫，即得到多孔納米二氧化鈦微球載體。步驟(2)中所述的稀漆酶溶液的濃度為O. 01g/ml，在每毫升的稀漆酶溶液中含多孔納米二氧化鈦微球載體4mg。步驟(2)中所述的吸附固定化的溫度為4°C，吸附時(shí)間為12h，固定化后用去離子水離心洗凈，并在常溫下干燥。步驟(3)中所述的四氟乙烯與全氟_2-(磺酸乙氧基)丙基乙烯基醚的共聚物(Nafion)稀溶液的濃度為O. 05wt%，控制每毫升Nafion稀溶液中漆酶/多孔納米二氧化 鈦固定化酶的含量為Img,控制混合溫度為6°C,超聲混合6min。步驟(3)中所述的玻碳電極在拋光布上分別用粒徑為O. 3 μ m及O. 05 μ m的Al2O3粉末拋光，再依次在濃硝酸、蒸餾水和無水乙醇中各超聲清洗5min后于紅外燈下干燥。利用制備得到的漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極建立三電極工作系統(tǒng)，采用磷酸氫二鈉-檸檬酸為空白底液分別檢測水體中對苯二酚電化學(xué)響應(yīng)情況。所述的三電極系統(tǒng)包括工作電極漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極，對電極Pt電極，參比電極Ag/NaCl電極，采用的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液pH為5. 6，濃度為O. Imol/L，對苯二酚的濃度為O. 05mol/L。檢測對苯二酚電化學(xué)響應(yīng)情況通過循環(huán)伏安法的響應(yīng)測定，掃描電壓的范圍為-I. 4V I. 4V，掃描速度為O. 05mv/s。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(I)本申請是基于漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極的一種制備方法，成本低廉、制備簡單，借助于多孔納米材料較高的比表面積能夠?yàn)槠崦柑峁└嗟母街稽c(diǎn)，載酶量高，且由于僅采用吸附法固定，酶在固定化過程中活性損失小，漆酶電極活性強(qiáng)；(2)本申請的漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極有較強(qiáng)的電子傳導(dǎo)能力，對于水體污染物對苯二酚有明顯的電化學(xué)響應(yīng)，在鄰苯二酚污染物檢測上有極大的應(yīng)用潛力。


圖I為多孔納米二氧化鈦微球載體的SEM照片；圖2為多孔納米二氧化鈦微球載體XRD圖；圖3為純漆酶、多孔納米二氧化鈦微球載體及漆酶/多孔納米二氧化鈦固定化酶的傅立葉紅外圖；圖4為裸玻碳電極對水體酚類污染物對苯二酚的循環(huán)伏安曲線；圖5為多孔納米二氧化鈦微球修飾電極對水體酚類污染物對苯二酚的循環(huán)伏安曲線；圖6為漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極對水體酚類污染物對苯二酚的循環(huán)伏安曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例I一種漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極的制備方法，該方法包括以下步驟多孔納米二氧化鈦微球載體的制備(I)水熱合成法制備，20mg Ti(CP)2Cl2分散于IOml去離子水于反應(yīng)釜中，并滴加2 3滴乙二胺。120°C條件下水熱反應(yīng)6h，冷卻室溫，以水、無水乙醇各離心洗滌三次；
(2)將步驟(I)所得樣品經(jīng)管式爐于400°C條件下煅燒2h后得到，控制升溫、降溫速率為3 4°C /s，即得多孔納米二氧化鈦微球載體。所制備的多孔納米二氧化鈦微球載體SEM圖及XRD圖分別如圖I、圖2所示。實(shí)施例2一種漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極的制備方法，該方法包括以下步驟漆酶/多孔納米二氧化鈦固定化酶的制備(I)稱取20mg載體與5ml的稀漆酶溶液混合,室溫下(約6°C )超聲IOmin,后放入振蕩水槽常溫(4°C左右)下吸附固定化12個(gè)小時(shí)。(2)用去離子水多次清洗步驟⑴中所制備的固定化酶6次，常溫下至干燥，并與變色硅膠一起密封保存于4°C溫度條件下。純漆酶、多孔納米二氧化鈦微球載體及漆酶/多孔納米二氧化鈦固定化酶傅立葉紅外圖對比圖如圖3所示，其中a為多孔納米二氧化鈦微球載體，b為漆酶/多孔納米二氧化鈦固定化酶，c為純漆酶。實(shí)施例3一種漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極的制備方法，該方法包括以下步驟漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極的制備(I)稱取Img的漆酶/多孔納米二氧化鈦固定化酶溶于5ml O. 05wt%的四氟乙烯與全氟-2-(磺酸乙氧基)丙基乙烯基醚的共聚物(Nafion)溶液，室溫下(約6V )超聲3min使其混合均勻；(2)將玻碳電極在拋光布上分別用粒徑為O. 3 μ m及O. 05 μ m Al2O3粉末拋光，并依次用濃硝酸、蒸餾水和無水乙醇中分別超聲清洗5min后于紅外燈下干燥，取10 μ I均勻分散的漆酶/多孔納米Ti02/Nafion混合液滴在潔凈的玻碳電極上，常溫下自然干燥，即得漆酶/多孔納米TiO2修飾電極。實(shí)施例4漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極對水體酚類污染物對苯二酚的電化學(xué)響應(yīng)，包括以下步驟(I)修飾電極對水體酚類污染物對苯二酚的循環(huán)伏安法電化學(xué)響應(yīng)的測定，采用三電極體系(修飾電極，Pt電極，Ag/NaCl電極)進(jìn)行檢測，先將修飾電極在O. lmol/1磷酸氫二鈉-檸檬酸(PH = 5. 6)空白底液中循環(huán)掃描至基線穩(wěn)定狀態(tài)；(2)往空白底液中加入一定濃度的對苯二酚溶液，使對苯二酚的終溶度為
IX 10_5，設(shè)置掃描速度為O. 05mv/s,掃描電壓范圍為-I. 4V I. 4V，采用循環(huán)伏安法記錄下實(shí)驗(yàn)曲線，并扣除背景。裸玻碳電極、多孔納米二氧化鈦微球修飾電極及漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極對水體酚類污染物對苯二酚的循環(huán)伏安曲線如圖4 6所示。
實(shí)施例5一種以漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極的制備方法，包括以下步驟(I)采用水熱法與煅燒法結(jié)合制備多孔納米二氧化鈦微球載體，水熱法包括以下步驟向濃度為lmg/mL的二氯二茂鈦的水溶液中滴加乙二胺，滴加的乙二胺與二氯二茂鈦的水溶液的體積比為0.01 1，控制反應(yīng)溫度為100°C，反應(yīng)時(shí)間為8h，得到的初樣品依次用去離子水、無水乙醇各離心洗滌三次；煅燒法包括以下步驟采用控制升溫，將經(jīng)水熱法合成得到的產(chǎn)品置于管式爐中，控制升溫速率為3°C /s，煅燒溫度為400°C，煅燒時(shí)間為2h，然后控制將溫速率為3°C /s將溫度降至室溫，即得到多孔納米二氧化鈦微球載體；
(2)將步驟⑴制備得到的多孔納米二氧化鈦微球載體與濃度為O. 01g/mL的稀漆酶溶液混合后于振蕩水槽吸附固定化，在每毫升的稀漆酶溶液中含多孔納米二氧化鈦微球載體4mg，控制溫度為4°C，吸附時(shí)間為12h，固定化后用去離子水離心洗凈，并在常溫下干燥得到漆酶/多孔納米二氧化鈦固定化酶；(3)將步驟⑵制備得到的漆酶/多孔納米二氧化鈦固定化酶，均勻分散到濃度為
O.05被％的Nafion稀溶液，控制每毫升Nafion稀溶液中漆酶/多孔納米二氧化鈦固定化酶的含量為Img,控制混合溫度為6°C,超聲混合6min,將得到的混合溶液均勻滴在玻碳電極上，該玻碳電極在拋光布上分別用粒徑為O. 3 μ m及O. 05 μ m的Al2O3粉末拋光，再依次在濃硝酸、蒸餾水和無水乙醇中各超聲清洗5min后于紅外燈下干燥，然后在常溫下自然干燥即可。利用制備得到的漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極建立三電極工作系統(tǒng)，包括工作電極漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極，對電極Pt電極，參比電極Ag/NaCl電極，采用磷酸氫二鈉-檸檬酸為空白底液分別檢測水體中對苯二酚電化學(xué)響應(yīng)情況，采用的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液PH為5. 6，濃度為O. lmol/L，對苯二酚的濃度為O. 05mol/L，檢測對苯二酚電化學(xué)響應(yīng)情況通過循環(huán)伏安法的響應(yīng)測定，掃描電壓的范圍為-I. 4V I. 4V，掃描速度為O. 05mv/s。實(shí)施例6一種以漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極的制備方法，包括以下步驟(I)采用水熱法與煅燒法結(jié)合制備多孔納米二氧化鈦微球載體，水熱法包括以下步驟向濃度為3mg/mL的二氯二茂鈦的水溶液中滴加乙二胺，滴加的乙二胺與二氯二茂鈦的水溶液的體積比為O. 015 1，控制反應(yīng)溫度為150°C，反應(yīng)時(shí)間為5h，得到的初樣品依次用去離子水、無水乙醇各離心洗滌三次；煅燒法包括以下步驟采用控制升溫，將經(jīng)水熱法合成得到的產(chǎn)品置于管式爐中，控制升溫速率為4°C /s，煅燒溫度為400°C，煅燒時(shí)間為2h，然后控制將溫速率為4°C /s將溫度降至室溫，即得到多孔納米二氧化鈦微球載體；(2)將步驟⑴制備得到的多孔納米二氧化鈦微球載體與濃度為O. 01g/mL的稀漆酶溶液混合后于振蕩水槽吸附固定化，在每毫升的稀漆酶溶液中含多孔納米二氧化鈦微球載體4mg，控制溫度為4°C，吸附時(shí)間為12h，固定化后用去離子水離心洗凈，并在常溫下干燥得到漆酶/多孔納米二氧化鈦固定化酶；(3)將步驟⑵制備得到的漆酶/多孔納米二氧化鈦固定化酶，均勻分散到濃度為
O.05被％的Nafion稀溶液，控制每毫升Nafion稀溶液中漆酶/多孔納米二氧化鈦固定化酶的含量為Img,控制混合溫度為6°C,超聲混合6min,將得到的混合溶液均勻滴在玻碳電極上，該玻碳電極在拋光布上分別用粒徑為O. 3 μ m及O. 05 μ m的Al2O3粉末拋光，再依次在濃硝酸、蒸餾水和無水乙醇中各超聲清洗5min后于紅外燈下干燥，然后在常溫下自然干燥即可。利用制備得到的漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極建立三電極工作系統(tǒng)，包括工作電極漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極，對電極Pt電極，參比電極Ag/NaCl電極，采用磷酸氫二鈉-檸檬酸為空白底液分別檢測水體中對苯二酚電化學(xué)響應(yīng)情況，采用的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液PH為5. 6，濃度為O. lmol/L,對苯二酚的濃度為O. 05mol/L,檢測對苯二酚電化學(xué)響應(yīng)情況通過循環(huán)伏安法的響應(yīng)測定，掃描電壓的范圍為-1.4V 1.4V，掃描速度為O. 05mv/s。權(quán)利要求
1.一種以漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)采用水熱法與煅燒法結(jié)合制備多孔納米二氧化鈦微球載體； (2)將步驟(I)制備得到的多孔納米二氧化鈦微球載體與稀漆酶溶液混合后于振蕩水槽吸附固定化，得到漆酶/多孔納米二氧化鈦固定化酶； (3)將步驟(2)制備得到的漆酶/多孔納米二氧化鈦固定化酶，均勻分散到四氟乙烯與全氟-2_(磺酸乙氧基)丙基乙烯基醚的共聚物(Nafion)的稀溶液后，將得到的混合溶液均勻滴在玻碳電極上，然后在常溫下自然干燥即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種以漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極的制備方法，其特征在于，步驟(I)中所述的水熱法包括以下步驟向二氯二茂鈦的水溶液中滴加乙二胺，控制反應(yīng)溫度為100-150°C，反應(yīng)時(shí)間為5-8h，得到的初樣品依次用去離子水、無水乙醇各離心洗滌三次。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種以漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極的制備方法，其特征在于，所述的二氯二茂鈦的水溶液的濃度為l_3mg/mL，滴加的乙二胺與二氯二茂鈦的水溶液的體積比為(0.01-0.015) I。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種以漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極的制備方法，其特征在于，步驟(I)中所述的煅燒法包括以下步驟采用控制升溫，將經(jīng)水熱法合成得到的產(chǎn)品置于管式爐中，控制升溫速率為3-4°C /s，煅燒溫度為400°C，煅燒時(shí)間為2h，然后控制將溫速率為3-4°C /s將溫度降至室溫，即得到多孔納米二氧化鈦微球載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種以漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的稀漆酶溶液的濃度為O. 01g/mL，在每毫升的稀漆酶溶液中含多孔納米二氧化鈦微球載體4mg。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種以漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的吸附固定化的溫度為4°C，吸附時(shí)間為12h，固定化后用去離子水離心洗凈，并在常溫下干燥。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種以漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述的四氟乙烯與全氟_2-(磺酸乙氧基)丙基乙烯基醚的共聚物(Nafion)稀溶液的濃度為O. 05wt%，控制每毫升Nafion稀溶液中漆酶/多孔納米二氧化鈦固定化酶的含量為Img,控制混合溫度為6°C,超聲混合6min。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種以漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述的玻碳電極在拋光布上分別用粒徑為O. 3μπι及O. 05μπι的Al2O3粉末拋光，再依次在濃硝酸、蒸餾水和無水乙醇中各超聲清洗5min后于紅外燈下干燥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以漆酶/多孔納米二氧化鈦修飾電極的制備方法，該酶電極的制備包括材料的準(zhǔn)備、多孔納米二氧化鈦載體的水熱法與煅燒法結(jié)合使用制備、漆酶在載體上的吸附固定、電極修飾步驟，用固定化漆酶均勻分散在Nafion稀溶液中修飾玻碳電極作為工作電極，建立三電極系統(tǒng)，將三電極系統(tǒng)與電化學(xué)工作站連接，通過循環(huán)伏安法檢測其對水體污染物對苯二酚的電化學(xué)響應(yīng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有成本低廉、制備簡單、固定化漆酶酶活高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N27/327GK102645469SQ20111004186
公開日2012年8月22日 申請日期2011年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月21日
發(fā)明者吳慶生, 朱鐵建, 毛琦謙 申請人:同濟(jì)大學(xué)