專利名稱：中藥注射劑鞣質(zhì)檢查方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥注射劑雜質(zhì)檢查領(lǐng)域，用于中藥注射劑鞣質(zhì)類雜質(zhì)，以控制中藥注射劑的質(zhì)量。
背景技術(shù)：
中藥注射劑最早產(chǎn)生在上世紀(jì)四十年代，由錢信忠等學(xué)者開創(chuàng)。在中國，中藥注射劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床并得到了業(yè)界的認(rèn)可。2010年版《中華人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)一部就收錄有燈盞細(xì)辛、清開靈、止喘靈等單方和復(fù)方注射劑。中藥注射劑在推進(jìn)中藥劑型發(fā)展，拓展中藥的應(yīng)用范圍，服務(wù)廣大人民健康等方面的確功不可沒。安全、有效、質(zhì)量可控依然是中藥注射劑的基本質(zhì)量要求。從技術(shù)上來講，業(yè)界大體上已經(jīng)解決了中藥注射劑的有效性問題(盡管作用機(jī)制尚不完全清除)，而安全性問題依然是業(yè)界難題。然而，隨著中藥注射劑的廣泛應(yīng)用于臨床，其不良反應(yīng)日益暴露，特別是致死性不良反應(yīng)也屢有報(bào)道。根據(jù)目前公開的不良反應(yīng)資料，中藥注射劑的不良反應(yīng)可以累及各個(gè)系統(tǒng)和臟器，甚至導(dǎo)致死亡。中藥注射劑的不良反應(yīng)與特定的雜質(zhì)是分不開的。中藥注射劑大多為植物提取物。作為生物提取物，在原料提取過程中會(huì)帶來多種植物大分子雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸等。鞣質(zhì)能與蛋白質(zhì)結(jié)合，是常見的中藥注射劑致痛物質(zhì)。 鞣質(zhì)的種類較多，鞣質(zhì)的單體如鞣酸、沒食子酸等小分子，也有不同縮合程度的鞣質(zhì)大分子聚合物。鞣質(zhì)不穩(wěn)定，容易氧化、聚合、變色，甚至產(chǎn)生沉淀，是影響中藥注射劑質(zhì)量的主要物質(zhì)之一。一般認(rèn)為縮合鞣質(zhì)不大可能參與中藥注射劑的藥理作用。因?yàn)榭s合鞣質(zhì)的分子量較大，口服不吸收，如果中藥注射劑從口服制劑開發(fā)而來，那么縮合鞣質(zhì)是不可能參與療效的，相反還會(huì)導(dǎo)致不良反應(yīng)。因此2010年版《中華人民共和國國藥典(一部)》(以下稱 《藥典》)也有專門控制鞣質(zhì)的中藥注射劑雜質(zhì)檢查。存在中藥注射劑中的鞣質(zhì)屬于混合物，鞣質(zhì)的分子量是個(gè)不確定值，因此分子量和理化性質(zhì)可能有較大的差別，很難用HPLC和/或質(zhì)譜等儀器分析方法進(jìn)行檢查。由于鞣質(zhì)，特別是存在中藥注射劑中的縮合鞣質(zhì)是影響中藥注射劑的重要雜質(zhì)， 因此有必要從嚴(yán)控制。本發(fā)明是針對(duì)中藥注射劑的特點(diǎn)而建立的，對(duì)鞣質(zhì)類雜質(zhì)檢查具有靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用蛋白質(zhì)能高強(qiáng)度吸附沉淀鞣質(zhì)的特點(diǎn)建立本方法，以提高中藥注射劑鞣質(zhì)檢查的靈敏性和特異性。本方法包括以下步驟1、將蛋白質(zhì)吸附膜用蛋白質(zhì)包被；2、將中藥注射劑溶液與蛋白質(zhì)包被的膜進(jìn)行接觸；3、用含有有機(jī)溶劑的溶液洗滌蛋白質(zhì)包被膜；4、觀察點(diǎn)樣斑點(diǎn)的顏色深淺，判斷中藥注射劑中的鞣質(zhì)。在以上步驟1中，用蛋白質(zhì)包被的膜包括但不限于硝酸纖維素膜、尼龍膜、PVDF膜(Polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯膜)，所用的蛋白質(zhì)包括但不限于蛋清、牛血清白蛋白。在以上步驟2中，中藥注射劑溶液與蛋白質(zhì)包被膜接觸的方式包括但不限于點(diǎn)樣方式和過濾方式，與蛋白質(zhì)包被膜接觸之前可以先用甲醇等有機(jī)溶劑進(jìn)行濕潤處理。在以上步驟3中，洗滌蛋白質(zhì)包被膜的有機(jī)溶液濃度為0-100%，有機(jī)溶劑包括但不限于甲醇和DMSO(二甲基亞砜)。采用有機(jī)溶液洗滌的量和洗滌的次數(shù)不限。步驟4進(jìn)行結(jié)果判斷時(shí)，可以和標(biāo)準(zhǔn)鞣質(zhì)樣品進(jìn)行對(duì)照，以此判斷中藥注射劑中的鞣質(zhì)含量。本方法實(shí)施的效果是，檢查中藥注射劑鞣質(zhì)的靈敏性和特異性高，抗干擾能力強(qiáng)。本發(fā)明方法的推薦條件是蛋白質(zhì)包被的膜采用PVDF膜，注射液與蛋白質(zhì)包被膜的接觸方式為過濾方式，洗滌蛋白質(zhì)包被膜的有機(jī)溶液為DMS0，點(diǎn)樣后洗滌3次，每次10分鐘。


圖1為采用蛋白質(zhì)包被的PVDF膜以點(diǎn)樣方式建立鞣質(zhì)檢查方法，確定本發(fā)明檢查限的結(jié)果圖A為在普通PVDF膜上點(diǎn)不同濃度鞣質(zhì)溶液被甲醇洗滌后的結(jié)果；B為采用經(jīng)10%蛋清溶液包被PVDF膜點(diǎn)樣洗滌后的圖片；點(diǎn)1到8的焦性沒食子酸含量分別為 20. 00,6. 67,2. 22,0. 74,0. 25,0. 08,0. 03、0mg/ml。點(diǎn)樣量 1 μ 1。圖2為采用蛋白質(zhì)包被的硝酸纖維素膜(NC膜)以點(diǎn)樣方式建立鞣質(zhì)檢查方法， 確定本發(fā)明檢查限的結(jié)果圖Α為在普通NC膜上點(diǎn)不同濃度鞣質(zhì)溶液被甲醇洗滌后的結(jié)果；B為采用經(jīng)10%蛋清溶液包被NC膜點(diǎn)樣洗滌后的圖片；點(diǎn)1到8的焦性沒食子酸含量分別為20. 00,6. 67,2. 22,0. 74,0. 25,0. 08,0. 03、0mg/ml。點(diǎn)樣量 1 μ 1。圖3為蛋白包被PVDF膜用過濾方式檢查溶液中的鞣質(zhì)限量Α為蛋白包被PVDF 膜，B為普通PVDF膜。點(diǎn)1-5的鞣質(zhì)濃度為2. 00,0. 67,0. 22,0. 07、0mg/ml (按焦性沒食子酸計(jì))，濾過體積為0. 5ml。圖4為蛋白質(zhì)包被PVDF膜點(diǎn)樣后被甲醇DMSO混合溶液洗滌的結(jié)果圖點(diǎn)樣的鞣質(zhì)濃度為20. 00mg/ml (按焦性沒食子酸計(jì))；點(diǎn)樣量1 μ 1。圖5為本發(fā)明以點(diǎn)樣方式檢查酚性中藥成分野黃芩苷的結(jié)果圖Α為將飽和濃度的野黃芩苷水溶液點(diǎn)在普通PVDF膜上，經(jīng)甲醇洗滌前后的斑點(diǎn)圖；B為將飽和濃度的野黃芩苷水溶液點(diǎn)在蛋白質(zhì)包被PVDF膜上，經(jīng)甲醇洗滌前后的斑點(diǎn)圖；點(diǎn)樣量Iy 1。圖6為梯度濃度的鞣質(zhì)按照《中國藥典》方法沉淀鞣質(zhì)后，再取上清液以點(diǎn)樣方式用本法檢查的結(jié)果圖點(diǎn)1-7的鞣質(zhì)理論濃度> 1000、333、111、37· 0,12. 3,4. 11、0μ g/ml。 點(diǎn)樣量 μ 。圖7為本發(fā)明以點(diǎn)樣方式檢查標(biāo)準(zhǔn)鞣質(zhì)溶液和蛋清溶液混離心上清液的結(jié)果圖從左至右各點(diǎn)鞣質(zhì)的含量分別為20，000、6，667、2，222、741、246、82、27、9、3、1. 5、 0 μ g/ml (按焦性沒食子酸計(jì))，點(diǎn)樣量1 μ 1。圖8為采用吸收曲線法檢查標(biāo)準(zhǔn)鞣質(zhì)溶液吸收光譜圖R1-10的鞣質(zhì)濃度分別為 20，000,6, 667,2, 222、741、246、82、27、9、3、1. 5 μ g/ml (按焦性沒食子酸計(jì))，R0 不含鞣質(zhì)。圖9為采用吸收曲線法檢查標(biāo)準(zhǔn)鞣質(zhì)溶和1 %蛋清溶液混離心上清液混合離心上清液的吸收光譜圖=Rl-IO的鞣質(zhì)濃度分別為20，000、6，667、2，222、741、246、82、27、9、3、 1. 5 μ g/ml (按焦性沒食子酸計(jì))，RO不含鞣質(zhì)。圖10為本發(fā)明以點(diǎn)樣方式檢查四種中藥注射劑鞣質(zhì)的結(jié)果圖1、2、3、4分別為清開靈注射液，雙黃連注射液，丹參注射液和為燈盞細(xì)辛注射液的斑點(diǎn)。圖11為本發(fā)明以過濾方式檢查四種中藥注射劑鞣質(zhì)的結(jié)果圖1、2、3、4分別為清開靈注射液，雙黃連注射液，丹參注射液和為燈盞細(xì)辛注射液的斑點(diǎn)。濾過量0. 5ml。
具體實(shí)施例方式實(shí)施示例1采用點(diǎn)樣方式用蛋白質(zhì)包被的PVDF膜建立中藥注射劑鞣質(zhì)檢查方法，確定檢查限取一張PVDF膜，用甲醇濕潤后浸泡在10%的蛋清溶液中，室溫振搖3小時(shí)后，取出風(fēng)干備用。用蒸餾水配制出濃度為20mg/ml的焦性沒食子酸溶液5ml，室溫自然放置，等溶液的吸光度GlOnm，d = lcm)達(dá)到3以上作為鞣質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。取8支1. 5ml試管編號(hào) 1-8。1號(hào)管加入標(biāo)準(zhǔn)鞣質(zhì)儲(chǔ)備溶液1.5ml。隨后于2-8號(hào)管各加入蒸餾水lml，從1號(hào)管中溶液0. 5ml加入到2號(hào)管，混勻后再取0. 5ml加入到3號(hào)管，依次配制到7號(hào)管。即得到濃度梯度為3倍的一組鞣質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，鞣質(zhì)的濃度從1號(hào)管到8號(hào)管依次為20. 00,6. 67、 2.22、0·74、0·25、0· 08、0. 03、0mg/ml。將被蛋白質(zhì)包被的PVDF膜用甲醇潤濕后，分別點(diǎn)梯度鞣質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液1 μ 1。然后把此膜浸泡在甲醇溶液中洗滌3次，每次10分鐘。隨后將此膜風(fēng)干拍照，結(jié)果如圖1所示。從圖1可見，樣品點(diǎn)在未被蛋白質(zhì)包被的PVDF膜上，經(jīng)甲醇洗滌后此膜基本上無色(圖1Α)，而把鞣質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液點(diǎn)在蛋白質(zhì)包被的PVDF膜上經(jīng)甲醇洗滌后仍能顯示出鞣質(zhì)的顏色(圖1Β)。采用蛋白質(zhì)包被的PVDF膜，本法檢查鞣質(zhì)的限量為0. 75-0. 25mg/ml。實(shí)施示例2采用點(diǎn)樣方式用蛋白質(zhì)包被的NC膜建立中藥注射劑鞣質(zhì)檢查方法，確定檢查限取一張NC膜浸泡在10%的蛋清溶液中，室溫振搖3小時(shí)后，取出風(fēng)干備用。用蒸餾水配制出濃度為20mg/ml的焦性沒食子酸溶液5ml，室溫自然放置，等溶液的吸光度GlOnm，d = lcm)達(dá)到3以上作為鞣質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。取8支1. 5ml試管編號(hào) 1-8。1號(hào)管加入標(biāo)準(zhǔn)鞣質(zhì)儲(chǔ)備溶液1.5ml。隨后于2-8號(hào)管各加入蒸餾水lml，從1號(hào)管中溶液0. 5ml加入到2號(hào)管，混勻后再取0. 5ml加入到3號(hào)管，依次配制到7號(hào)管。即得到濃度梯度為3倍的一組鞣質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，鞣質(zhì)的濃度從1號(hào)管到8號(hào)管依次為20. 00,6. 67、 2.22、0·74、0·25、0· 08、0. 03、0mg/ml。在被蛋白質(zhì)包被的NC膜上分別點(diǎn)梯度鞣質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液1 μ 1。然后把此膜浸泡在 50%甲醇溶液中洗滌3次，每次10分鐘。隨后將此膜風(fēng)干拍照，結(jié)果如圖1所示。從圖2可見，樣品點(diǎn)在未被蛋白質(zhì)包被的NC膜上，經(jīng)50%甲醇洗滌后此膜基本上無色(圖2Α)，而把鞣質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液點(diǎn)在蛋白質(zhì)包被的NC膜上經(jīng)50%甲醇洗滌后點(diǎn)1仍能顯示出鞣質(zhì)的顏色(圖2Β)。采用蛋白質(zhì)包被的NC膜，本法檢查鞣質(zhì)的限量為20mg/ml，對(duì)比采用蛋白質(zhì)包被的PVDF膜，蛋白質(zhì)包被的NC膜檢查效果較劣。
實(shí)施示例3采用濾過方式建立蛋白質(zhì)包被PVDF膜鞣質(zhì)檢查方法，確定檢查限量將6mg/ml的焦性沒食子酸溶液(pH4_5)，于80°C恒溫3天，當(dāng)410nm吸收值達(dá)到3以上后作為鞣質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物，并按照3倍梯度配制鞣質(zhì)稀釋液；取一張用10%蛋清包被 PVDF膜，安裝在小孔濾器上，一頭連接真空泵；先用0. Iml甲醇濕潤濾膜，隨后加入不同濃度的鞣質(zhì)水溶液0. 5ml，負(fù)壓通過濾膜；將濾膜取出，加入甲醇(DMSO)溶液置于搖床上振搖 30min ；如此用未被蛋白質(zhì)包被的PVDF膜進(jìn)行操作作為對(duì)照；洗滌至對(duì)照膜基本無色終止洗滌，與凝膠成像儀上拍照，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，過濾方式檢查鞣質(zhì)的限量至少在0.07mg/ml以下。因此濾過方式比點(diǎn)樣方式檢查限低，如果增加檢測(cè)體積，檢測(cè)的限量將進(jìn)一步下降。實(shí)施示例4蛋白質(zhì)包被PVDF膜鞣質(zhì)斑點(diǎn)的穩(wěn)定性考察取一張PVDF膜，用甲醇濕潤后浸泡在10%的蛋清溶液中，室溫振搖3小時(shí)后，取出風(fēng)干備用。用蒸餾水配制出濃度為20mg/ml的焦性沒食子酸溶液5ml，室溫自然放置，等溶液的吸光度GlOnm，d = lcm)達(dá)到3以上作為鞣質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。將蛋白質(zhì)包被的PVDF膜用甲醇潤濕后，多處點(diǎn)20mg/ml的鞣質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液1 μ 1。然后把此膜浸泡在甲醇溶液中洗滌3次，每次10分鐘。隨后將此膜剪開再浸泡在含不同甲醇和DMSO的混合溶液中洗滌3次，每次10分鐘，隨后取出拍照。另用未被蛋白質(zhì)包被的PVDF 膜平行進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果如圖4所示。從圖4可見，鞣質(zhì)點(diǎn)在蛋白質(zhì)包被的PVDF膜上，經(jīng)甲醇洗滌后再次用甲醇DMSO混合溶液洗滌，陽性斑點(diǎn)依然存在(圖3Α)，而把鞣質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液點(diǎn)在未被蛋白質(zhì)包被的PVDF膜上經(jīng)相同方法處理后陽性斑點(diǎn)消失(圖3Β)。實(shí)施示例5用本法點(diǎn)樣方式檢查中藥酚性成分野黃芩苷取一張PVDF膜，用甲醇濕潤后浸泡在10%的蛋清溶液中，室溫振搖3小時(shí)后，取出風(fēng)干備用。取一支含野黃芩苷的注射用粉末，用蒸餾水配制野黃芩苷的飽和水溶液備用，溶液為金黃色。將蛋白質(zhì)包被的PVDF膜用甲醇潤濕后，點(diǎn)野黃芩苷飽和水溶液1 μ 1。然后把此膜浸泡在甲醇溶液中洗滌3次，每次10分鐘。此膜洗滌前拍照，洗滌風(fēng)干后也拍照。結(jié)果如圖5所示。從圖5可見，野黃芩苷鞣質(zhì)點(diǎn)在普通PVDF膜上和蛋白質(zhì)包被的PVDF膜上，未被甲醇洗滌前均可見一斑點(diǎn)，但經(jīng)甲醇洗滌后斑點(diǎn)均消失。表明中藥中的小分子有色酚性物質(zhì)對(duì)此法的干擾較小。實(shí)施示例6本法點(diǎn)樣方式檢查鞣質(zhì)與藥典方法的比較取一張PVDF膜，用甲醇濕潤后浸泡在10%的蛋清溶液中，室溫振搖3小時(shí)后，取出風(fēng)干備用。另制備蛋清生理鹽水溶液。
用蒸餾水配制出濃度為6mg/ml的焦性沒食子酸溶液5ml，室溫自然放置，等溶液的吸光度GlOnm，d = lcm)達(dá)到3以上作為鞣質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。取8支1. 5ml試管編號(hào) 1-7。1號(hào)管加入標(biāo)準(zhǔn)鞣質(zhì)儲(chǔ)備溶液1. 5ml。隨后于2-8號(hào)管各加入蒸餾水1ml，從1號(hào)管中溶液0. 5ml加入到2號(hào)管，混勻后再取0. 5ml加入到3號(hào)管，依次配制到6號(hào)管。即得到濃度梯度為3倍的一組鞣質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，鞣質(zhì)的濃度從1號(hào)管到8號(hào)管依次為6. 00,2. 00,0. 67、 0.22、0·07、0. 02、0mg/ml。取各標(biāo)準(zhǔn)鞣質(zhì)液Iml加入到比色管中，再加入5ml 1 %蛋清生理鹽水溶液，放置10 分鐘，觀察結(jié)果。隨后從比色管取液體Iml加入到1. 5ml離心管中，經(jīng)15，OOOg離心5分鐘， 觀察有無沉淀。結(jié)果如表1所示。表1結(jié)果表明《中國藥典》檢查鞣質(zhì)的限量>6mg/ml，而離心法的限量約為6mg/ml。表1各標(biāo)準(zhǔn)鞣質(zhì)管的蛋白質(zhì)沉淀變化
權(quán)利要求
1.一種檢查中藥注射劑鞣質(zhì)的方法，其特征在與按以下步驟進(jìn)行1)將蛋白質(zhì)吸附膜用蛋白質(zhì)包被；2)將中藥注射劑溶液與蛋白質(zhì)包被膜接觸；3)用含有有機(jī)溶劑的溶液洗滌蛋白質(zhì)包被膜；4)觀察點(diǎn)樣斑點(diǎn)的顏色深淺，判斷中藥注射劑中的鞣質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的中藥注射劑鞣質(zhì)檢查方法，其特征在于蛋白質(zhì)吸附膜包括但不限于PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)、硝酸纖維素膜(NC膜)，包被膜的蛋白質(zhì)包括但不限于蛋清、牛血清白蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的中藥注射劑鞣質(zhì)檢查方法，其特征在于中藥注射劑溶液與蛋白質(zhì)包被膜接觸的方式包括但不限于點(diǎn)樣方式和過濾方式。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的中藥注射劑鞣質(zhì)檢查方法，其特征在于洗滌蛋白質(zhì)包被膜所用的有機(jī)溶液濃度為0-100%，有機(jī)溶劑包括但不限于甲醇和DMSO(二甲基亞砜)，以及它們兩種或兩種以上任意比例的混合；采用有機(jī)溶液洗滌的量和洗滌的次數(shù)不限。
全文摘要
一種能夠檢查中藥注射劑鞣質(zhì)的檢查方法，用于檢查中藥注射劑的鞣質(zhì)類雜質(zhì)，以控制中藥注射劑的質(zhì)量。其特征在于按以下步驟進(jìn)行1)將蛋白質(zhì)吸附膜用蛋白質(zhì)包被，2)將中藥注射劑溶液與蛋白質(zhì)包被膜進(jìn)行接觸，3)用含有有機(jī)溶劑的溶液洗滌蛋白質(zhì)包被膜，4)觀察點(diǎn)樣斑點(diǎn)的顏色深淺，判斷中藥注射劑中的鞣質(zhì)。本法點(diǎn)樣方式檢查中藥注射劑所含鞣質(zhì)的濃度可達(dá)0.75-0.25mg/ml，采用濾過方式可達(dá)0.07mg/ml，檢查限量低于2010年版《中華人民共和國藥典(一部)》，同時(shí)較強(qiáng)的抗干擾能力強(qiáng)，適用于中藥注射劑鞣質(zhì)的檢查。
文檔編號(hào)G01N33/15GK102221599SQ20111004649
公開日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月28日
發(fā)明者李奇峰, 林青, 柯瑾, 段為鋼, 殷華 申請(qǐng)人:云南中醫(yī)學(xué)院