專利名稱：電化學(xué)檢測(cè)可卡因的方法及其中使用的三段式適配體探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及可卡因檢測(cè)的領(lǐng)域，更具體地涉及利用適配體探針進(jìn)行可卡因電化學(xué)檢測(cè)的領(lǐng)域
背景技術(shù)：
目前對(duì)于毒品的檢測(cè)技術(shù)雖有很多，如高效液相-紫外光譜技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)、高效液相-電化學(xué)技術(shù)、電子鼻、電子俘獲、顯微拉曼技術(shù)(MRS,micro raman spectroscopy)、X射線探測(cè)技術(shù)、熱中子斷層掃描等。這些技術(shù)的檢測(cè)靈敏度高，但檢測(cè)步驟繁瑣、設(shè)備昂貴，測(cè)試程序復(fù)雜，成本較高，需要專業(yè)技術(shù)人才，不適合現(xiàn)場(chǎng)快速篩查使用。針對(duì)緝毒工作的實(shí)際需求，需要開發(fā)靈敏度高、選擇性好、便攜式、能耗低、易操作的智能化毒品快速檢測(cè)產(chǎn)品，以達(dá)到現(xiàn)場(chǎng)、靈敏、快速的檢測(cè)目的。目前國(guó)內(nèi)外正對(duì)吸毒人員快速現(xiàn)場(chǎng)篩查和液體中毒品檢測(cè)的主要技術(shù)是各種基于免疫反應(yīng)的產(chǎn)品，主要有酶免疫分析和免疫膠體金技木。前者涉及酶反應(yīng)，檢測(cè)步驟繁瑣，試劑穩(wěn)定性差，通常不能很穩(wěn)保存。后者簡(jiǎn)便，快速，但誤判率高，只能進(jìn)行定性測(cè)試，靈敏度較低，難以進(jìn)行質(zhì)量控制，即使是同一批生產(chǎn)的試劑，也很難保證每個(gè)試劑的同一性，因此一般只能用于定性試驗(yàn)，不能進(jìn)行定量分析。相對(duì)于抗體，適配體具有多方面的顯著優(yōu)點(diǎn)。適配體(aptamer)是新一代的非常有應(yīng)用前景的功能性生物分子。適配體是從 1014的隨機(jī)序列的DNA或RNA庫(kù)中通過(guò)指數(shù)富集的系統(tǒng)分子進(jìn)化方法(SystematicEvolution of Ligands by Exponentialenrichment,簡(jiǎn)稱SELEX)篩選出來(lái)的，能夠特異性地與祀標(biāo)分子結(jié)合，從而特異性地識(shí)別靶標(biāo)分子(Ellington AD, Szostak Jff (1990) Nature 346 :818-822. Tuerk C，Gold L (1990)Science249 :505-510.)。適配體可以用于包括蛋白質(zhì)、小分子、重金屬離子、細(xì)胞和病毒等的各種各樣的生物分子的檢測(cè)，具有極大的應(yīng)用前景。與傳統(tǒng)的抗體相比，適配體在多個(gè)方面具有顯著的優(yōu)越性(表I)。適配體穩(wěn)定性高、價(jià)格低廉、不同批次產(chǎn)品質(zhì)量完全相同，而且具有與抗體相當(dāng)甚至更好的專ー性和親和性。表I :適配體與抗體的比較
權(quán)利要求
1.用于電化學(xué)檢測(cè)可卡因的三段式適配體探針，所述三段式適配體探針在特異性識(shí)別可卡因，包括具有巰基修飾的探針I(yè)、具有氧化還原基團(tuán)，優(yōu)選氧化還原基團(tuán)亞甲基藍(lán)修飾的探針2和未修飾的探針3，所述探針1、2和3在存在可卡因時(shí)，與可卡因形成絡(luò)合物。
2.權(quán)利要求I所述的三段式適配體探針，其中所述探針1、2和3的序列分別為5’ -HS-C6-TTTGTTCTTCAAT，5’ -GGGAGTCAAGAAC-MB 和 5’ -AGTGGGACGACA，其中 MB 是氧化還原基團(tuán)亞甲基藍(lán)，HS是巰基。
3.ー種電化學(xué)檢測(cè)可卡因的方法，其特征在于使用根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的三段式適配體探針，包括以下步驟 (1)將所述探針I(yè)包被到金電極上，形成檢測(cè)電極； (2)將所述探針2和所述探針3與空白對(duì)照或待測(cè)樣品混合，形成空白對(duì)照混合物或待測(cè)樣品混合物；和 (3)將所述檢測(cè)電扱、對(duì)電極和參考電極插入到所述空白對(duì)照混合物或待測(cè)樣品混合物中，進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，當(dāng)待測(cè)樣品產(chǎn)生的電流信號(hào)大于空白對(duì)照產(chǎn)生的電流信號(hào)時(shí)表示所述待測(cè)樣品中含有可卡因。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于 在所述步驟(I)中，將所述金電極浸泡在含有所述探針I(yè)和還原試劑的反應(yīng)緩沖溶液中；然后用去離子水沖洗電極，并浸泡在含有l(wèi)mM6_mercaptohexanol的反應(yīng)緩沖溶液中；電極然后用去離子水沖洗，浸泡在反應(yīng)緩沖溶液中備用，其中所述探針I(yè)的量?jī)?yōu)選為5-50 u L，100 U M，所述還原試劑優(yōu)選為最終濃度為5-50 y M的TCEP (tris- (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride),反應(yīng)緩沖溶液優(yōu)選為 IOmM, IMNaCl磷酸鹽緩沖溶液。
5.權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于 在所述步驟⑶中，電化學(xué)檢測(cè)采用方波伏安法，其中使用鉬絲作為對(duì)電扱，Ag/AgCl電極作為參考電極；方波伏安法測(cè)量的掃描電勢(shì)、電勢(shì)掃描梯度、振幅和頻率可以根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，其中優(yōu)選地，掃描電勢(shì)相對(duì)于Ag/AgCl電極為從0到-0. 4V，電勢(shì)掃描梯度為0. 001V，振幅0. 05V，頻率60Hz ;所述反應(yīng)緩沖溶液為10mM，IM NaCl磷酸鹽緩沖溶液，pH7.0 ;所述探針3的濃度優(yōu)選為0. 1-10 u M，所述探針2的濃度優(yōu)選為0. 1-10 u M。
6.ー種電化學(xué)定量檢測(cè)可卡因的方法，其特征在于使用根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的三段式適配體探針，包括以下步驟 (1)將所述探針I(yè)包被到金電極上，形成檢測(cè)電極； (2)將所述探針2和所述探針3與一系列不同濃度的可卡因標(biāo)準(zhǔn)品或未知濃度的待測(cè)樣品分別混合，形成一系列不同濃度的可卡因標(biāo)準(zhǔn)品混合物和待測(cè)樣品混合物； (3)將所述檢測(cè)電扱、對(duì)電極和參考電極插入到步驟(2)中配制的一系列不同濃度的可卡因標(biāo)準(zhǔn)品混合物中，進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，根據(jù)不同濃度的可卡因標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生電流信號(hào)的變化繪制可卡因電化學(xué)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；和 (4)將所述檢測(cè)電扱、對(duì)電極和參考電極插入步驟(2)中配制的待測(cè)樣品混合物中，進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，根據(jù)所述待測(cè)樣品產(chǎn)生的電流信號(hào)的變化和步驟(3)中繪制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線確定所述待測(cè)樣品中的可卡因濃度。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述可卡因電化學(xué)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線滿足如下關(guān)系I = 11.8661og10C+12. 303 (r2 = 0. 9984)，其中C為可卡因的摩爾濃度，單位為u M,I為電流信號(hào)的百分比變化。
8.權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于 在所述步驟(I)中，將所述金電極浸泡在含有所述探針I(yè)和還原試劑的反應(yīng)緩沖溶液中；然后用去離子水沖洗電極，并浸泡在含有l(wèi)mM6-mercaptohexanol的反應(yīng)緩沖溶液中；電極然后用去離子水沖洗，浸泡在反應(yīng)緩沖溶液中備用，其中所述探針I(yè)的量?jī)?yōu)選為5-50 u L，100 U M，所述還原試劑優(yōu)選為最終濃度為5-50 y M的TCEP (tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride),反應(yīng)緩沖溶液優(yōu)選為 IOmM, IMNaCl磷酸鹽緩沖溶液。
9.權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于 在所述步驟(3)和(4)中，電化學(xué)檢測(cè)采用方波伏安法，其中使用鉬絲作為對(duì)電扱，Ag/AgCl電極作為參考電極；方波伏安法測(cè)量的掃描電勢(shì)、電勢(shì)掃描梯度、振幅和頻率可以根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，其中優(yōu)選地，掃描電勢(shì)相對(duì)于Ag/AgCl電極為從0到-0. 4V，電勢(shì)掃描梯度為0. 001V,振幅0. 05V,頻率60Hz ;所述反應(yīng)緩沖溶液為10mM，IM NaCl磷酸鹽緩沖溶液，pH 7. 0 ;所述探針3的濃度優(yōu)選為0. 1-10 u M，所述探針2的濃度優(yōu)選為0. 1-10 u M ;所述不同濃度的可卡因標(biāo)準(zhǔn)品的濃度優(yōu)選分別為O、I ii M、10 ii M、100 ii M、1000 u M。
全文摘要
本發(fā)明提供用于電化學(xué)檢測(cè)可卡因的三段式適配體探針，以及使用所述三段式適配體探針進(jìn)行可卡因電化學(xué)檢測(cè)的方法。所述三段式適配體探針特異性識(shí)別可卡因，包括具有巰基修飾的探針1、具有氧化還原基團(tuán)亞甲基藍(lán)修飾的探針2和未修飾的探針3。
文檔編號(hào)G01N27/30GK102650612SQ20111004686
公開日2012年8月29日 申請(qǐng)日期2011年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月25日
發(fā)明者婁新徽 申請(qǐng)人:首都師范大學(xué)