專利名稱：一種基于重組ul55蛋白的鴨瘟病毒抗體檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及應(yīng)用重組UL55原核表達(dá)蛋白作為包被抗原而建立檢測(cè)的鴨瘟病毒抗體方法。
背景技術(shù)：
鴨瘟(duck plague, DP)是由皰疹病毒科中的DPV引起的常見于鴨、鵝、天鵝等水禽的一種高度致死性傳染病。本病死亡率高，傳播迅速，自1923年在荷蘭首次發(fā)生后，已蔓延至世界許多國(guó)家和地區(qū)，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。因此迫切需要建立有效可靠的監(jiān)測(cè)手段，以便能及時(shí)正確地了解鴨群的健康狀態(tài)和免疫抗體水平。本病的經(jīng)典診斷方法為中和試驗(yàn)，但因繁瑣耗時(shí)(約1 2周)，敏感性較差且實(shí)驗(yàn)要求嚴(yán)格，不適于大批量血清樣品的檢測(cè)和在基層推廣。用ELISA方法檢測(cè)病毒特異抗體已被公認(rèn)為是一種敏感的方法，它比中和試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)敏感，而且對(duì)不易培養(yǎng)的病毒，或培養(yǎng)周期長(zhǎng)、不易引起細(xì)胞病變、無(wú)法用中和試驗(yàn)檢測(cè)的病毒，ELISA檢測(cè)更具有意義，不僅能檢測(cè)某種病毒的總抗體，而且還可檢測(cè)針對(duì)病毒某一抗原成分的抗體。但是由于DPV全病毒純化方法的復(fù)雜性以及純度不夠理想，阻礙了包被全病毒的ELISA方法(DPV-ELISA)的大規(guī)模應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種基于重組UL55蛋白為抗原的鴨瘟病毒抗體檢測(cè)方法，所述重組UL55蛋白的獲得是通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET3h-UL55、轉(zhuǎn)化表達(dá)菌并發(fā)酵培養(yǎng)，收集到大量的含有重組UL55蛋白的菌體沉淀，再通過(guò)超聲波破碎菌體、重組UL55蛋白包涵體冼滌、純化及梯度透析而獲得的；同時(shí)，用Wfestern blotting分析證實(shí)該蛋白可與抗DPV陽(yáng)性血清發(fā)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)；進(jìn)一步確定了重組UL55蛋白的包被濃度及一抗、二抗的稀釋度，制備了鴨瘟病毒抗體檢測(cè)方法，該方法避免了繁瑣的病毒純化步驟，且操作簡(jiǎn)單，特異性、靈敏性較高。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為基于重組UL55蛋白的鴨瘟病毒抗體檢測(cè)方法，具體步驟為a固相抗原的制備將包被濃度為0. 2mg/ml濃度重組UL55蛋白液固相載體連接， 用封閉液封閉，洗滌去除未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)，得固相抗原；b —抗結(jié)合將待檢血清作160倍的稀釋，得稀釋血清，即一抗，通過(guò)保溫反應(yīng)使所述稀釋血清與所述固相抗原結(jié)合形成固相抗原抗體復(fù)合物，洗滌去除固相載體上雜質(zhì)；c 二抗結(jié)合將酶標(biāo)二抗作2000倍的稀釋，得酶標(biāo)二抗稀釋液，將所述酶標(biāo)二抗稀釋液與所述固相抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，得抗原-抗體-二抗復(fù)合物；d顯色在步驟c所得抗原-抗體-二抗復(fù)合物加入色原底物避光顯色后，加入終止液終止反應(yīng)得顯色樣品液；e檢測(cè)并判定將步驟d所述顯色樣品液用酶標(biāo)儀測(cè)OD45tlnm值，所述OD45tlnm值> 0. 330為陽(yáng)性，所述OD450nm ( 0. 330則為陰性。
進(jìn)一步，所述的鴨瘟病毒抗體檢測(cè)方法的具體步驟為a固相抗原的制備將包被濃度等于0. 2mg/ml的重組UL55蛋白液與固相載體連接，用封閉液封閉，洗滌去除未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)，得固相抗原；b —抗結(jié)合將待檢血清作等于160倍的稀釋，得稀釋血清，即一抗，通過(guò)保溫反應(yīng)使所述稀釋血清與所述固相抗原結(jié)合形成固相抗原抗體復(fù)合物，洗滌去除固相載體上雜質(zhì)；c 二抗結(jié)合將酶標(biāo)二抗作等于2000倍的稀釋，得酶標(biāo)二抗稀釋液，將所述酶標(biāo)二抗稀釋液與所述固相抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，得抗原-抗體-二抗復(fù)合物；d顯色在步驟c所得抗原-抗體-二抗復(fù)合物加入色原底物避光顯色后，加入終止液終止反應(yīng)得顯色樣品液；e檢測(cè)并判定將步驟d所述顯色樣品液用酶標(biāo)儀測(cè)OD45tlnm值，所述OD45tlnm值> 0. 330為陽(yáng)性，所述OD450nm彡0. 330則為陰性。進(jìn)一步，步驟a中所述固相載體為酶標(biāo)板；進(jìn)一步，步驟a中所述的封閉液為體積濃度為1.0%的牛血清白蛋白；進(jìn)一步，步驟e中避光顯色的時(shí)間為30分鐘；進(jìn)一步，步驟a中所述重組UL55蛋白液、步驟b中所述稀釋血清及步驟c中所述酶標(biāo)二抗稀釋液的加入量為等體積且大于或等于100μ 1 ；進(jìn)一步，步驟c中所述酶標(biāo)二抗為羊抗鴨IgG-HRP ；進(jìn)一步，步驟d中所述色原底物為四甲基聯(lián)苯胺；進(jìn)一步，所述方法還包括空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)和陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明的有益效果在于本方法是基于純化的重組UL55蛋白建立的間接ELISA 法，其特異性好，對(duì)鴨病毒性肝炎病毒(DHV)、鴨疫里默氏菌(RA)、鴨大腸桿菌(E. coli), 鴨源沙門氏菌(Salmonella)、鴨腫頭性出血癥病毒和鴨源流感病毒的陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)， 結(jié)果均為陰性；該方法的對(duì)酶標(biāo)板內(nèi)或板間重復(fù)試驗(yàn)顯示變異系數(shù)均小于10%，能檢出經(jīng) 1 6400倍稀釋的DPV弱毒疫苗免疫鴨的陽(yáng)性血清


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，凡是涉及蛋白表達(dá)的均同時(shí)提供原始彩照和黑白照。圖中涉及標(biāo)記及含義如下圖I-A為DPV UL55基因的PCR擴(kuò)增M指Maker III相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1指以正常DEF基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2指以DPV CHv毒株基因組DNA為模板的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物(箭頭所示的是其分子量大小，約為799bp)；圖I-B為重組質(zhì)粒pMD18-UL55的雙酶切鑒定M1指相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)III，M2為DL2000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1指重組質(zhì)粒 PMD18-UL55用BamH I和Bio I雙酶切得到的兩個(gè)片段；2指UL55PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(箭頭所示小片段的分子量大小約為799bp)；圖I-C為重組表達(dá)載體pET3h-UL55的單酶切和雙酶切鑒定M1為DL2000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；M2指相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL15000 ；1是UL55基因的 PCR產(chǎn)物；2指重組表達(dá)載體pET3h-UL55用BamH I和Bio I雙酶切得到的兩個(gè)片段(箭頭所示小片段的分子量大小約為799bp) ；3指重組表達(dá)載體pET3h-UL55用BamH I單酶切后得到的線性質(zhì)粒。圖2-A為重組表達(dá)蛋白的SDS-PAGE鑒定M為蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1為以 BL21為表達(dá)宿主的pET3h空載加IPTG誘導(dǎo)；2、3分別為未加誘導(dǎo)劑的UL55表達(dá)產(chǎn)物的上清和包涵體；4、5分別為IPTG誘導(dǎo)所產(chǎn)生的上清和包涵體(箭頭所示的蛋白質(zhì)分子量大小約為40KD)；圖2-B為誘導(dǎo)劑IPTG不同終濃度誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果1_6的IPTG濃度分別為1. 0、 0. 8、、0· 6,0. 4,0. 2、禾口 0. lmmol/L ；圖 2-C 為不同溫度誘導(dǎo) pET3^i-UL55 表達(dá)結(jié)果:1_3 的溫度分別為37、30和25°C;圖2-D為不同時(shí)間誘導(dǎo)pET3h-UL55表達(dá)結(jié)果1_5的誘導(dǎo)時(shí)間分別為 4、5、6、7 和 8h。圖3為重組UL55蛋白純化效果和免疫原性的檢測(cè)A，SDS-PAGE分析M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)(KD) ；1為包涵體洗滌法純化后再經(jīng)透析復(fù)性的重組UL55蛋白；2為5次洗滌后的重組 UL55包涵體蛋白；Bjestern blotting分析箭頭所指是以兔抗DPV抗體為一抗檢測(cè)復(fù)性后的重組UL55蛋白(約為20KD)。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例1鴨瘟病毒UL55基因的克隆、原核表達(dá)及UL55蛋白的純化1、材料方法以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。1. 1菌株、質(zhì)粒和毒株質(zhì)粒pMD18-T，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；原核表達(dá)質(zhì)粒pET3h(+)，Novagen 公司產(chǎn)品；克隆宿主菌E. coli DH5a、表達(dá)宿主菌E. coli BL21(DE3)和DPV CHv強(qiáng)毒株，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究中心提供。1. 2試驗(yàn)鴨胚和血清10日齡鴨胚，其種鴨DPV和抗體均為陰性；兔抗DPV抗體，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究中心提供。1. 3主要試劑瓊脂糖、2X傻瓜PCR Mixture、DNA連接酶Mixture、限制性內(nèi)切酶BamH I和Xhol、 UltraPureTM質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒和UltraPure DNA回收試劑盒等分子生物學(xué)試劑及試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司、北京賽百盛基因技術(shù)有限公司、華美生物工程公司和Bio-Rad 公司；其它試劑均為分析純，購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司。2實(shí)驗(yàn)方法2. 1 DPV UL55 基因的克隆2. 1. 1引物設(shè)計(jì)利用Primer Premier5. 0 軟件，參考 UL55 基因序列(GenBank 登錄號(hào)EU071034)， 由寶生物生物技術(shù)有限公司合成。引物序列F :5，-GGATCCATGGCCGACGCGAAGGCGGT-3’ (劃線部分為 BamH I 位點(diǎn))；
R :5，-CTCGAGGCTTGGGTCTTTACTTTTTGCGCGGAAC-3’ (劃線部分為 Xho I 位點(diǎn))。合成后，以適量滅菌去離子水溶解，使其終濃度為20mmol/L，_20°C保存?zhèn)溆谩?. 1. 2DPV基因組DNA的提取2. 1. 2. IDEF的制作方法取IOd日齡健康鴨胚，分別用5%碘酒和75%酒精消毒蛋殼表面。無(wú)菌操作條件下將胚體取出并用PBS將胚體洗凈，剪去頭、翅、腿和內(nèi)臟，PBS沖洗后將胚體剪成Imm大小的小塊，加PBS適量，之后置于三角瓶?jī)?nèi)，加細(xì)胞分散劑(體積分?jǐn)?shù)為2.5%的胰蛋白酶)15(^1/胚，于371水浴中消化；31^11。立即將細(xì)胞懸液以4000r/ min離心5min，傾棄上清，細(xì)胞沉淀用適量的MEM懸浮后，用5層紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入 10%小牛血清和100IU/ml雙抗后，分裝于IOOml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，7ml/瓶，水平靜置于37°C 細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。2. 1. 2. 2 DPV增殖取剛剛長(zhǎng)成致密單層的DEF，棄生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液，用滅菌PBS清洗細(xì)胞表面2次后，加入DPV病毒液2 3ml覆蓋細(xì)胞表面進(jìn)行吸附，37°C吸附120min后棄病毒液，然后加含3%小牛血清和100IU/ml雙抗的MEM維持營(yíng)養(yǎng)液，之后37°C培養(yǎng)。同時(shí)做未接毒的DEF對(duì)照。2. 1. 2. 3 DNA提取方法直接從感染細(xì)胞中提取DPV基因組DNA的具體步驟如下 (1)選取用DPV種毒感染后細(xì)胞病變(CPE)達(dá)60% 70%的DEF (IOOml細(xì)胞瓶)；同時(shí)選取細(xì)胞形態(tài)正常的DEF作對(duì)照；(2)傾去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入500 μ 1的細(xì)胞裂解液，同時(shí)加蛋白酶K(10mg/ml)至終濃度為200 μ g/ml，輕輕混勻后，37°C孵育IOmin ； (3)將細(xì)胞懸浮液倒入EP離心管中，并用500μ 1的飽和酚洗滌殘存于細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的裂解物，倒入離心管中； (4)用飽和酚/氯仿及氯仿抽提2次，再用水飽和乙醚處理2次；(5)加1/10倍體積3mol/ L NaAC,混勻后，加入2倍體積冷無(wú)水乙醇，_20°C放置30 60min ； (6) 13000r/min離心 20min，沉淀用預(yù)冷的70%乙醇洗滌兩次；(7)真空抽干后，溶于適量TE緩沖液中，加入1 μ 1 RNA酶，37°C作用30min，_20°C保存?zhèn)溆谩?. 1. 3PCR 擴(kuò)增 DPV UL55 基因PCR反應(yīng)體系為
權(quán)利要求
1.基于重組UL55蛋白的鴨瘟病毒抗體檢測(cè)方法，其特征在于，具體步驟為a固相抗原的制備將包被濃度為0. 2mg/ml的重組UL55蛋白液固相載體連接，用封閉液封閉，洗滌去除未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)，得固相抗原；b —抗結(jié)合將待檢血清作160倍的稀釋，得稀釋血清，即一抗，通過(guò)保溫反應(yīng)使所述稀釋血清與所述固相抗原結(jié)合形成固相抗原抗體復(fù)合物，洗滌去除固相載體上雜質(zhì)；c 二抗結(jié)合將酶標(biāo)二抗作2000倍的稀釋，得酶標(biāo)二抗稀釋液，將所述酶標(biāo)二抗稀釋液與所述固相抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，得抗原-抗體-二抗復(fù)合物；d顯色在步驟c所得抗原-抗體-二抗復(fù)合物加入色原底物避光顯色后，加入終止液終止反應(yīng)得顯色樣品液；e檢測(cè)并判定將步驟d所述顯色樣品液用酶標(biāo)儀測(cè)OD45tlnm值，所述OD45tlnm值> 0. 330 為陽(yáng)性，所述OD45tlnm ( 0. 330則為陰性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨瘟病毒抗體檢測(cè)方法，其特征在于步驟a中所述固相載體為酶標(biāo)板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨瘟病毒抗體檢測(cè)方法，其特征在于步驟a中所述的封閉液為體積濃度為1.0%的牛血清白蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨瘟病毒抗體檢測(cè)方法，其特征在于步驟d中避光顯色的時(shí)間為30分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨瘟病毒抗體檢測(cè)方法，其特征在于步驟a中所述重組 UL55蛋白液、步驟b中所述稀釋血清及步驟c中所述酶標(biāo)二抗稀釋液的加入量為等體積且大于或等于100 μ 1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的方法，其特征在于步驟c中所述酶標(biāo)二抗為羊抗鴨IgG-HRP。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨瘟病毒抗體檢測(cè)方法，其特征在于步驟d中所述色原底物為四甲基聯(lián)苯胺。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨瘟病毒抗體檢測(cè)方法，其特征在于所述方法還包括空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)和陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及用于檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的方法，具體包括固相抗原的制備、一抗結(jié)合、二抗結(jié)合、顯色及檢測(cè)并判定等步驟，本方法是基于純化的重組UL55蛋白建立的間接ELISA法，其特異性好，對(duì)鴨病毒性肝炎病毒(DHV)、鴨疫里默氏菌(RA)、鴨大腸桿菌(E.coli)、鴨源沙門氏菌(Salmonella)、鴨腫頭性出血癥病毒和鴨源流感病毒的陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性；該方法的對(duì)酶標(biāo)板內(nèi)或板間重復(fù)試驗(yàn)顯示變異系數(shù)均小于10％，能檢出經(jīng)1∶6400倍稀釋的DPV弱毒疫苗免疫鴨的陽(yáng)性血清。
文檔編號(hào)G01N33/531GK102183658SQ20111004706
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月28日
發(fā)明者吳英, 汪銘書, 程安春, 陳孝躍 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工程技術(shù)中心