專利名稱：慢性乙型肝炎肝纖維化的蛋白標記物及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及生物醫(yī)學(xué)中診斷肝纖維化血清分子標記物，具體涉及一類非創(chuàng)傷性診斷慢性乙型肝炎肝纖維化的血清蛋白分子標記物。
背景技術(shù)：
長期以來，肝穿刺活檢一直是明確肝病病因、評價肝臟炎癥壞死及纖維化程度的金標準，對預(yù)后判斷、治療選擇及療效評估等具有重要臨床意義，但創(chuàng)傷性、取樣誤差、觀察者自身及觀察者間偏倚等不足給臨床應(yīng)用造成許多不便，目前臨床診療中迫切需要尋找便捷的非創(chuàng)傷性替代指標。近年來，以血清指標組合建立肝纖維化診斷模型成為世界性的研究熱點。在一系列肝纖維化非創(chuàng)傷性診斷模型中，較具代表性的包括采用慢性丙型肝炎病 毒(HCV)感染患者建模的Fibrotest、Forns指數(shù)、APRI指數(shù)和HepascoreL等。而針對慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的肝纖維化診斷模型仍研究較少，主要有上海市肝纖維化課題協(xié)作組(SLFG)所提出的Zeng模型M和我國香港的Hui模型。不過這些研究成果在我國慢性HBV感染患者中尚未得到有效驗證和臨床應(yīng)用。肝纖維化分期診斷的金標準目前國內(nèi)外采用肝活組織檢查+病理學(xué)診斷，屬于有創(chuàng)傷性的診斷方法，因此臨床應(yīng)用受局限。血清學(xué)檢測是臨床非創(chuàng)傷性肝纖維化診斷的有效方法，具有很好的應(yīng)用前景。目前創(chuàng)新性的血清肝纖維化診斷分子標記物研究方法包括蛋白和多肽組學(xué)、糖組學(xué)、miCToRNA芯片等技術(shù)；而以蛋白組學(xué)研究最為成熟。蛋白組學(xué)研究的優(yōu)點包括技術(shù)成熟和穩(wěn)定，篩選出的差異蛋白驗證簡便，血清蛋白檢測價廉，易與其他血清蛋白結(jié)合建立診斷模型提高診斷效力。然而，目前尚未有報道以本發(fā)明的血清蛋白作為慢性乙型肝炎肝纖維化程度的標記物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一類非創(chuàng)傷性診斷慢性乙型肝炎肝纖維化的血清蛋白分子標記物。本發(fā)明的血清蛋白分子標記物，作為一種非創(chuàng)傷性替代指標，能高效預(yù)測慢性乙型肝炎肝纖維化的程度，對預(yù)后判斷、治療選擇及療效評估等具有現(xiàn)實的臨床意義。本發(fā)明提供了一組慢性乙型肝炎肝纖維化的血清蛋白標記物，所述的蛋白標記物是下列蛋白中的一種或者幾種人血清糖基化脫鐵-轉(zhuǎn)鐵蛋白A鏈，糖蛋白HC復(fù)合結(jié)構(gòu)C鏈，人補體成份C3c，免疫球蛋白M Fe段，人血紅蛋白3鏈變異型Hb S尾跡，或者Ig Gl Fe段A鏈(Herceptin)的蛋白A模擬肽樹狀配體。所述的血清蛋白標記物可以包括人血清糖基化脫鐵-轉(zhuǎn)鐵蛋白A鏈、糖蛋白HC復(fù)合結(jié)構(gòu)C鏈、人補體成份C3c、免疫球蛋白M Fe段、人血紅蛋白3鏈變異型Hb S尾跡和IgGl Fe段A鏈(Herceptin)的蛋白A模擬肽樹狀配體。甚至于,所述的蛋白標記物就是由人血清糖基化脫鐵-轉(zhuǎn)鐵蛋白A鏈、糖蛋白HC復(fù)合結(jié)構(gòu)C鏈、人補體成份C3c、免疫球蛋白MFe段、人血紅蛋白P鏈變異型Hb S尾跡和Ig Gl Fe段A鏈(Here印tin)的蛋白A模擬肽樹狀配體組成。本發(fā)明的血清蛋白分子標記物，它含以下6種表達差異標志物
Chain A, Apo-Human Serum Transferrin (Glycosylated),人血清糖基化脫鐵-轉(zhuǎn)鐵蛋白A鏈；
complex-forming glycoprotein HC; Chain C,糖蛋白 HC 復(fù)合結(jié)構(gòu) C 鏈；
Human Complement Component C3c,人補體成份 C3c ;Ig M Fe，免疫球蛋白M Fe段；
hemoglobin beta chain variant Hb S-ffake [Homo sapiens],人血紅蛋白 ^ 鏈變異型Hb S尾跡；
Chain A, Fe Fragment of Iggl(Herceptin) With Protein-A Mimetic PeptideDendrimer Ligand, Ig Gl Fe段A鏈(Herceptin)的蛋白A模擬肽樹狀配體。上述6種蛋白具體介紹參考genbank數(shù)據(jù)庫(如從http://www. ncbi. nlm. nih.gov/ 登錄查詢)。如，Chain A, Apo-Human Serum Transferrin (Glycosylated)可參考PDB: 2HAV_A, GI: 110590599。complex-forming glycoprotein HC; Chain C 可以參考Swiss-Prot: P02760. I, GI:122801,UniProtKB: locus AMBP_HUMAN, accession P02760。Human Complement Component C3c 可以參考 Swiss-Prot: P01024. 2, GI: 119370332,UniProtKB: locus C03_HUMAN, accession P01024 ;也可以由上海博升生物技術(shù)有限公司購得，產(chǎn)品編號PR0-555。Ig M Fe 可以參考 PRF: 222978，genbank ACCESSION0308221A, GI:222978。 hemoglobin beta chain variant Hb S-ffake [Homo sapiens]可以參考GenBank: AANl 1320. I,GI: 23268449。Chain A, Fe Fragment of Iggl (Herceptin)With Protein-A Mimetic Peptide Dendrimer Ligand 可以參考 PDB: 3D6G_A,GI:240104304。本發(fā)明還提供了上述血清蛋白標記物的檢測方法，即抽取血清樣本，分離提純其中的蛋白，檢測上述的血清蛋白標記物的含量。檢測蛋白含量時，可以采用現(xiàn)有的常規(guī)操作方法，例如使用質(zhì)譜、ELISA或者雙向電泳，等。其中，ELISA即酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinked immunosorbent assay)。根據(jù)檢測獲得的上述血清蛋白標記物的含量可以判斷慢性乙型肝炎肝纖維化程度。例如，血清樣本中，人血清糖基化脫鐵-轉(zhuǎn)鐵蛋白A鏈、人補體成份C3c、免疫球蛋白M Fe段、人血紅蛋白P鏈變異型Hb S尾跡或者Ig Gl Fe段A鏈(Here印tin)的蛋白A模擬肽樹狀配體的含量為早期纖維化樣品中相應(yīng)蛋白的含量的2倍及以上的，相應(yīng)蛋白的表達量異常。又如，血清樣本中糖蛋白HC復(fù)合結(jié)構(gòu)C鏈的蛋白含量為早期纖維化樣品中糖蛋白HC復(fù)合結(jié)構(gòu)C鏈含量的50%及以下的，慢性乙型肝炎肝纖維化程度惡化，按照Scheuer分期為晚期纖維化組。相應(yīng)的，本發(fā)明還提供了含有上述血清蛋白標記物的慢性乙型肝炎肝纖維化的診斷試劑盒。該診斷試劑盒中含有上述的血清蛋白標記物。除此以外，該診斷試劑盒還通常含有標準樣品或者早期纖維化樣本，使用說明，等等。為了檢驗本發(fā)明的血清蛋白標記物，于本發(fā)明的血清蛋白分子標記物收集45例不同肝纖維化分期(Scheuer分期S0-S4期，每組平均10例病例)慢性乙型肝炎肝纖維化病例，均以肝活檢病理學(xué)診斷明確纖維化程度，將S0、SI期列為早期纖維化組，S3、S4期列為晚期纖維化組，留取血清樣本。所有血清樣本采用蛋白組學(xué)檢測技術(shù)(2DE-MS/ MALDI-ToFMS)檢測，電泳圖譜利用ImageMaster軟件分析得出早期纖維化組與晚期纖維化組表達差異2倍以上的血清蛋白，進而與本發(fā)明的血清蛋白分子標記物作比較。上述血清蛋白分子標記物與早期纖維化組相比，人血清糖基化脫鐵-轉(zhuǎn)鐵蛋白A鏈、人補體成份C3c、免疫球蛋白M Fe段、人血紅蛋白3鏈變異型Hb S尾跡、Ig Gl Fe段A鏈(Here印tin)的蛋白A模擬肽樹狀配體升高2倍以上；糖蛋白HC復(fù)合結(jié)構(gòu)C鏈降低2倍以上。本發(fā)明中,根據(jù)所涉及血清蛋白分子標記物、相關(guān)mRNA、MircoRNA等指標,預(yù)測慢性乙型肝炎肝纖維化的程度，對預(yù)后判斷、治療選擇及療效評估中的用途。 本發(fā)明中,根據(jù)所涉及血清蛋白分子標記物、相關(guān)mRNA、MircoRNA等指標,制備成不同的檢驗檢測用品，如制成診斷試劑盒、診斷試紙、診斷試劑；治療及預(yù)后評估相關(guān)試劑盒、試紙、試劑等。本發(fā)明所述的血清蛋白分子標記物可以采用動靜脈、外周采血、體液采集，漏出液或滲出液采集方式使用。本發(fā)明實驗證實所述的血清蛋白分子標記物，通過我們的實驗驗證可顯著提高慢性乙型肝炎肝纖維化非創(chuàng)傷性診斷的特異性及敏感性(特異性89%、敏感性87%)。作為一種非創(chuàng)傷性替代指標，能高效預(yù)測慢性乙型肝炎肝纖維化的程度，對預(yù)后判斷、治療選擇及療效評估等具有現(xiàn)實的臨床意義。
具體實施例方式實施例I :血清蛋白分子標記物診斷慢性乙型肝炎肝纖維化程度的驗證。本發(fā)明的血清蛋白分子標記物收集45例不同肝纖維化分期(Scheuer分期S0-S4期，每組平均10例病例)慢性乙型肝炎肝纖維化病例，均以肝活檢病理學(xué)診斷明確纖維化程度，將SO、SI期列為早期纖維化組，S3、S4期列為晚期纖維化組，留取血清樣本。所有血清樣本采用蛋白組學(xué)檢測技術(shù)(2DE-MS/ MALDI-ToF MS)檢測，電泳圖譜利用ImageMaster軟件分析。結(jié)果表明，本發(fā)明的血清蛋白標記物，在早期纖維化組與晚期纖維化組表達差異2倍以上。本發(fā)明的血清蛋白分子標記物，它含以下6種表達差異標志物
表I
權(quán)利要求
1.一組慢性乙型肝炎肝纖維化的血清蛋白標記物，其特征在于，所述的蛋白標記物是下列蛋白中的一種或者幾種人血清糖基化脫鐵-轉(zhuǎn)鐵蛋白A鏈，糖蛋白HC復(fù)合結(jié)構(gòu)C鏈，人補體成份C3c，免疫球蛋白M Fe段，人血紅蛋白3鏈變異型Hb S尾跡，或者Ig Gl Fe段A鏈的蛋白A模擬肽樹狀配體。
2.如權(quán)利要求I所述的血清蛋白標記物，其特征在于，所述的蛋白標記物包括人血清糖基化脫鐵-轉(zhuǎn)鐵蛋白A鏈、糖蛋白HC復(fù)合結(jié)構(gòu)C鏈、人補體成份C3c、免疫球蛋白M Fe段、人血紅蛋白P鏈變異型Hb S尾跡和Ig Gl Fe段A鏈的蛋白A模擬肽樹狀配體。
3.如權(quán)利要求I所述的血清蛋白標記物，其特征在于，所述的蛋白標記物是人血清糖基化脫鐵-轉(zhuǎn)鐵蛋白A鏈、糖蛋白HC復(fù)合結(jié)構(gòu)C鏈、人補體成份C3c、免疫球蛋白M Fe段、人血紅蛋白P鏈變異型Hb S尾跡和Ig Gl Fe段A鏈的蛋白A模擬肽樹狀配體。
4.權(quán)利要求I所述的血清蛋白標記物的檢測方法，其特征在于，取血清樣本，分離提純其中的蛋白，檢測權(quán)利要求I所述的血清蛋白標記物的含量。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，使用質(zhì)譜、ELISA或者雙向電泳檢測權(quán)利要求I所述的血清蛋白標記物的含量。
6.權(quán)利要求I所述的血清蛋白標記物的應(yīng)用，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求I所述的血清蛋白標記物的含量判斷慢性乙型肝炎肝纖維化程度。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，血清樣本中，人血清糖基化脫鐵-轉(zhuǎn)鐵蛋白A鏈、人補體成份C3c、免疫球蛋白M Fe段、人血紅蛋白3鏈變異型Hb S尾跡或者Ig GlFe段A鏈的蛋白A模擬肽樹狀配體的含量為早期纖維化樣品中相應(yīng)蛋白的含量的2倍及以上的，相應(yīng)蛋白的表達量異常。
8.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，血清樣本中糖蛋白HC復(fù)合結(jié)構(gòu)C鏈的蛋白含量為早期纖維化樣品中糖蛋白HC復(fù)合結(jié)構(gòu)C鏈含量的50%及以下的，慢性乙型肝炎肝纖維化程度惡化。
9.慢性乙型肝炎肝纖維化的診斷試劑盒，其特征在于，該診斷試劑盒中含有權(quán)利要求I所述的血清蛋白標記物。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一類非創(chuàng)傷性診斷慢性乙型肝炎肝纖維化的血清蛋白分子標記物。本發(fā)明的蛋白標記物是下列蛋白中的一種或者幾種人血清糖基化脫鐵-轉(zhuǎn)鐵蛋白A鏈，糖蛋白HC復(fù)合結(jié)構(gòu)C鏈，人補體成份C3c，免疫球蛋白MFc段，人血紅蛋白β鏈變異型HbS尾跡，或者IgG1Fc段A鏈(Herceptin)的蛋白A模擬肽樹狀配體。本發(fā)明還提供了上述血清蛋白標記物的檢測方法和應(yīng)用，以及根據(jù)上述血清蛋白標記物制成的試劑盒。本發(fā)明中血清蛋白分子標記物及相關(guān)mRNA、MircoRNA等指標可預(yù)測慢性乙型肝炎肝纖維化的程度，預(yù)測慢性乙型肝炎肝纖維化的程度，對預(yù)后判斷、治療選擇及療效評估中的用途。
文檔編號G01N33/68GK102654502SQ20111005013
公開日2012年9月5日 申請日期2011年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月2日
發(fā)明者徐銘益, 曲穎, 王燕, 董育瑋, 蔡曉波, 陸倫根 申請人:上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院