專利名稱：刺參體腔細(xì)胞吞噬活性的流式細(xì)胞檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種刺參體腔細(xì)胞吞噬活性的流式細(xì)胞檢測(cè)方法，屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于刺參市場(chǎng)需求量的逐年增加，傳統(tǒng)的捕撈業(yè)已不能滿足人們的需求，刺參養(yǎng)殖業(yè)應(yīng)運(yùn)而生，養(yǎng)殖面積和產(chǎn)量的迅速增加，為沿海地區(qū)創(chuàng)造了十分可觀的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。但近年來刺參病害不斷發(fā)生，自2003年冬季起，山東和遼寧沿海的養(yǎng)殖刺參先后出現(xiàn)了爛皮、腫嘴的大面積流行病、引發(fā)了 30%以上的大量死亡。免疫學(xué)研究，是了解機(jī)體免疫反應(yīng)特征、從而為疾病防治奠定基礎(chǔ)和提供方法的科學(xué)。然而，由于刺參大量養(yǎng)殖是近幾年的事，而病害的發(fā)生也非常急驟，所以免疫防御研究嚴(yán)重滯后。棘皮動(dòng)物的體腔細(xì)胞具有多種生理功能，包括自我和非自我識(shí)別、吞噬、細(xì)胞毒素反應(yīng)、細(xì)胞聚合、包囊、凝血以及產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)等。細(xì)胞吞噬作用是棘皮動(dòng)物免疫防御的主要效應(yīng)方式，對(duì)體內(nèi)沒有產(chǎn)生抗體機(jī)構(gòu)的棘皮動(dòng)物的免疫防御具有更為重要的意義， 這一指標(biāo)被廣泛的用于衡量機(jī)體的健康狀況及在環(huán)境脅迫或病原脅迫下的免疫防御能力。 目前有多種測(cè)定細(xì)胞吞噬的方法，如傳統(tǒng)的顯微鏡檢計(jì)數(shù)法、光密度法及流式細(xì)胞儀熒光檢測(cè)法等。其中，鏡檢法通過顯微鏡的觀察分析，適用于細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及單個(gè)細(xì)胞吞噬功能的定性研究，但由于該技術(shù)存在主觀性強(qiáng)和重復(fù)性差等缺點(diǎn)，其應(yīng)用在一定程度上受到了限制。流式細(xì)胞儀技術(shù)(Flow-cytometry，F(xiàn)CM)可利用不同的熒光標(biāo)記對(duì)細(xì)胞的吞噬功能進(jìn)行研究，具有準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，而且操作簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)，目前已成為研究脊椎動(dòng)物血細(xì)胞功能的常規(guī)手段，但其在棘皮動(dòng)物類中尚未得到廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是，解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速測(cè)定刺參體腔細(xì)胞吞噬活性的流式細(xì)胞檢測(cè)方法，該方法具有準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，而且操作簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)。本發(fā)明的技術(shù)方案是，首先制備刺參體腔液中的吞噬細(xì)胞，然后用熒光素異硫氰酸酯(FITC)標(biāo)記熱滅活后的酵母細(xì)胞，再將標(biāo)記后的酵母細(xì)胞與刺參吞噬細(xì)胞共孵育，最后利用流式細(xì)胞儀測(cè)定吞噬活性。具體包括以下步驟(1)制備刺參體腔液中的吞噬細(xì)胞無菌注射器抽取與抗凝劑等體積的刺參體腔液，放入無菌離心管中，再沿管壁緩慢加入與混合液體積相同的蔗糖緩沖液，在水平離心機(jī) 800-1200rpm離心5_10分鐘，收集位于體腔液、抗凝液混合物與蔗糖緩沖液之間的吞噬細(xì)胞，收集后用等滲緩沖液洗1-2次，加入含10%胎牛血清和雙抗的L-15培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度數(shù)量級(jí)為106cfu/mL。(2)FITC標(biāo)記酵母細(xì)胞將劃線分離的酵母細(xì)胞單克隆接種于YDP液體培養(yǎng)基，260C 48°C，振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)后，室溫5000-8000rpm離心10-20分鐘，收集酵母細(xì)胞， 并用PBS洗1-2次，再用PBS重懸定量至1 X 109cfu/mL,放入沸水浴中30-50分鐘殺死酵母細(xì)胞，然后用PBS沖洗2-3次，離心棄上清，PBS重懸，在37°C避光與FITC共同培養(yǎng)30-40 分鐘，濃度為O.OlmgFITC/lO9酵母細(xì)胞，其間不時(shí)搖勻，室溫離心收集標(biāo)記酵母細(xì)胞，PBS洗 2-3次至上清無色，然后懸浮于等滲緩沖液中，定量1 X 108cfu/mL,熒光顯微鏡觀察標(biāo)記情況，4°C避光貯存。(3)標(biāo)記后的酵母細(xì)胞與刺參吞噬細(xì)胞的共孵育加FITC標(biāo)記的酵母細(xì)胞于吞噬細(xì)胞培養(yǎng)液中，且標(biāo)記的酵母細(xì)胞與吞噬細(xì)胞的比例約為30-50 1，室溫，置于水平搖床上慢速搖動(dòng)30-120分鐘，取搖勻液800-1000rpm離心5_10分鐘，棄上清，PBS洗一次，70% 乙醇固定10-15分鐘，800-1000rpm離心5_10分鐘后棄上清，沉淀加入ImL濃度為0. 5 μ g/ mL 的 EB0(4)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)吞噬細(xì)胞體外吞噬活性所用流式細(xì)胞儀為BD公司生產(chǎn)的，型號(hào)為FACSCal ibur，設(shè)定儀器基本參數(shù)，前向角為460，側(cè)向角為399，起始電壓0，數(shù)據(jù)采用Log對(duì)數(shù)形式，上樣后先用Fk-H/Ssc-H圈定巨噬細(xì)胞，再采集紅色和綠色熒光強(qiáng)度， 并計(jì)算實(shí)際吞噬率，所得數(shù)據(jù)用CellQuestPro Software軟件分析。本發(fā)明所述的抗凝劑用以下方法制得先配置pH7. 6的濃度為0. 068mol/L的 Tris-HCl 緩沖液，然后加入 0. 02mol/L 的 EGTA，0. 34mol/L 的 NaCl, 0. 018mol/L 的 KCl，最后用0. 22 μ m的濾器過濾即可。本發(fā)明所述的蔗糖緩沖液用以下方法制得先配置pH7. 6的濃度為0. OOlmol/L的 Tris-HCl 緩沖液，然后加入 0. 8mol/L 的蔗糖，0. 34mol/L 的 NaCl，0. 001mol/L 的 EGTA，最后用0. 22 μ m的濾器過濾即可。本發(fā)明中，所述的等滲緩沖液用以下方法制得先配置pH7. 6的濃度為0. Olmol/ L 的 Tris-HCl 緩沖液，然后加入 0. 01mol/L 的 EGTA, 0. 34mol/L 的 NaCl，最后用 0. 22 μ m 的濾器過濾即可。本發(fā)明中，所述的雙抗內(nèi)含100IU/ml的青霉素及100 μ g/ml的鏈素。本發(fā)明中，所述的YDP液體培養(yǎng)基由1 %的酵母浸出汁，2 %蛋白胨，2 %的D-葡萄糖混合，然后滅菌制得。本發(fā)明的有益效果是，準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，而且操作簡(jiǎn)便快速，為探討刺參體腔細(xì)胞吞噬功能提供了方法依據(jù)。


圖1為標(biāo)記的酵母細(xì)胞圖；圖2為正常的刺參體腔吞噬細(xì)胞的吞噬結(jié)果圖；圖3為患病時(shí)的刺參體腔吞噬細(xì)胞結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不局限于以下所述的實(shí)施例。配置ρΗ7· 6的濃度為0. 068mol/L的Tris-HCl緩沖液，然后加入0. 02mol/L的EGTA，0. 34mol/L的NaCl, 0. 018mol/L的KC1，最后用0. 22 μ m的濾器過濾制得抗凝劑。配置pH7. 6的濃度為0. 001mol/L的Tris-HCl緩沖液，然后加入0. 8mol/L的蔗糖， 0. 34mol/L的NaCl，0. 001mol/L的EGTA，最后用0. 22 μ m的濾器過濾制得蔗糖緩沖液。配置pH7. 6的濃度為0. 01mol/L的Tris-HCl緩沖液，然后加入0. 01mol/L的EGTA， 0. 34mol/L的NaCl，最后用0. 22 μ m的濾器過濾制得等滲緩沖液。無菌注射器分別抽取與抗凝劑等體積的正常和患病刺參體腔液各2. 5ml，放入無菌離心管中，再沿管壁緩慢加入5. Oml的蔗糖緩沖液，水平離心機(jī)IOOOrpm離心5分鐘， 收集位于體腔液抗凝液混合物與蔗糖緩沖液之間的吞噬細(xì)胞，收集后用等滲緩沖液洗1-2 次，加入含10%胎牛血清和雙抗的L-15培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為106cfu/mL，所述的雙抗內(nèi)含100IU/ml的青霉素及100μ g/ml的鏈素。劃線分離的酵母細(xì)胞單個(gè)克隆接種于100ml的YDP液體培養(yǎng)基，溫度26°C，振蕩速度120轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)12小時(shí)后，IOOOOg室溫離心10分鐘，收集酵母細(xì)胞，并用PBS 洗1-2次，再用PBS重懸定量至lX109Cfu/mL，放入沸水浴中30分鐘致死酵母細(xì)胞，然后用PBS沖洗2-3次，離心棄上清，PBS重懸，在37°C避光與FITC共同培養(yǎng)30分鐘，濃度為 0. OlmgFITC/lO9酵母細(xì)胞，其間不時(shí)搖勻。室溫離心收集標(biāo)記酵母細(xì)胞，PBS洗2_3次至上清無色，然后懸浮于等滲緩沖液中，定量1 X 108cfU/mL，熒光顯微鏡觀察標(biāo)記情況，4°C避光貯存。標(biāo)記后的酵母細(xì)胞與刺參吞噬細(xì)胞的共孵育加FITC標(biāo)記的酵母細(xì)胞于吞噬細(xì)胞培養(yǎng)液中，標(biāo)記的酵母細(xì)胞與吞噬細(xì)胞的比例約為50 1，室溫，置于水平搖床上慢速搖動(dòng)60分鐘，取搖勻液IOOOrpm離心5分鐘，棄上清，PBS洗一次，70%乙醇固定10分鐘， IOOOrpm離心5分鐘后棄上清，沉淀加入ImL濃度為0. 5 μ g/mL的EB。流式細(xì)胞儀檢測(cè)吞噬細(xì)胞體外吞噬活性所用流式細(xì)胞儀為BD公司生產(chǎn)的，型號(hào)為FACSCalibur，設(shè)定儀器基本參數(shù)，前向角(FSC，反映細(xì)胞的體積大小)為460，側(cè)向角(SSC，反映細(xì)胞的顆粒含量)為399，起始電壓0，數(shù)據(jù)采用Log對(duì)數(shù)形式。上樣后先用 FSc-H/Ssc-H圈定巨噬細(xì)胞，再采集紅色和綠色熒光強(qiáng)度，并計(jì)算實(shí)際吞噬率，所得數(shù)據(jù)用 CellQuest Pro Software 軟件分析。計(jì)算結(jié)果如下所示
權(quán)利要求
1.刺參體腔細(xì)胞吞噬活性的流式細(xì)胞檢測(cè)方法，其特征在于，首先制備刺參體腔液中的吞噬細(xì)胞，然后用熒光素異硫氰酸酯FITC標(biāo)記熱滅活后的酵母細(xì)胞，再將標(biāo)記后的酵母細(xì)胞與刺參吞噬細(xì)胞共孵育，最后利用流式細(xì)胞儀測(cè)定吞噬活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的刺參體腔細(xì)胞吞噬活性的流式細(xì)胞檢測(cè)方法，其特征在于， 具體包括以下步驟(1)制備刺參體腔液中的吞噬細(xì)胞無菌注射器抽取與抗凝劑等體積的刺參體腔液， 放入無菌離心管中，再沿管壁緩慢加入與混合液體積相同的蔗糖緩沖液，在水平離心機(jī) 800-1200rpm離心5_10分鐘，收集位于體腔液、抗凝液混合物與蔗糖緩沖液之間的吞噬細(xì)胞，收集后用等滲緩沖液洗1-2次，加入含10%胎牛血清和1 %雙抗的L-15培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度數(shù)量級(jí)為IO6CfuAiL ；(2)FITC標(biāo)記酵母細(xì)胞將劃線分離的酵母細(xì)胞單克隆接種于YDP液體培養(yǎng)基，26°C或 280C，振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)后，室溫5000-8000rpm離心10-20分鐘，收集酵母細(xì)胞，并用PBS 洗1-2次，再用PBS重懸定量至1 X 109cfu/mL,放入沸水浴中30-50分鐘殺死酵母細(xì)胞，然后用PBS沖洗2-3次，離心棄上清，PBS重懸，在37°C避光與FITC共同培養(yǎng)30-40分鐘，濃度為0. OlmgFITC/lO9酵母細(xì)胞，其間不時(shí)搖勻，室溫離心收集標(biāo)記酵母細(xì)胞，PBS洗2_3次至上清無色，然后懸浮于等滲緩沖液中，定量1 X 108cfu/mL,熒光顯微鏡觀察標(biāo)記情況，40C 避光貯存；(3)標(biāo)記后的酵母細(xì)胞與刺參吞噬細(xì)胞的共孵育加FITC標(biāo)記的酵母細(xì)胞于吞噬細(xì)胞培養(yǎng)液中，且標(biāo)記的酵母細(xì)胞與吞噬細(xì)胞的比例為30-50 1，室溫，置于水平搖床上慢速搖動(dòng)30-120分鐘，取搖勻液800-1000rpm離心5_10分鐘，棄上清，PBS洗一次，70%乙醇固定10-15分鐘，800-1000rpm離心5-10分鐘后棄上清，沉淀加入ImL濃度為0. 5 μ g/mL的 EB ；(4)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)吞噬細(xì)胞體外吞噬活性所用流式細(xì)胞儀為BD公司生產(chǎn)的， 型號(hào)為FACSCalibur，設(shè)定儀器基本參數(shù)，前向角為460，側(cè)向角為399，起始電壓0，數(shù)據(jù)采用Log對(duì)數(shù)形式，上樣后先用FSc-H/Ssc-H圈定巨噬細(xì)胞，再采集紅色和綠色熒光強(qiáng)度，并計(jì)算實(shí)際吞噬率，所得數(shù)據(jù)用CellQuest Pro Software軟件分析。
3 根據(jù)權(quán)利要求2所述的刺參體腔細(xì)胞吞噬活性的流式細(xì)胞檢測(cè)方法，其特征在于， 所述的抗凝劑用以下方法制得先配置PH7. 6的濃度為0. 068mol/L的Tris-HCl緩沖液，然后加入 0. 02mol/L 的 EGTA，0. 34mol/L 的 NaCl，0. 018mol/L 的 KCl，最后用 0. 22 μ m 的濾器過濾即可。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的刺參體腔細(xì)胞吞噬活性的流式細(xì)胞檢測(cè)方法，其特征在于， 所述的蔗糖緩沖液用以下方法制得先配置PH7. 6的濃度為0. OOlmol/L的Tris-HCl緩沖液，然后加入 0. 8mol/L 的蔗糖，0. 34mol/L 的 NaCl, 0. 001mol/L 的 EGTA,最后用 0. 22 μ m 的濾器過濾即可。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的刺參體腔細(xì)胞吞噬活性的流式細(xì)胞檢測(cè)方法，其特征在于， 所述的等滲緩沖液用以下方法制得先配置PH7. 6的濃度為0. 01mol/L的Tris-HCl緩沖液，然后加入0. 01mol/L的EGTA，0. 34mol/L的NaCl，最后用0. 22 μ m的濾器過濾即可。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的刺參體腔細(xì)胞吞噬活性的流式細(xì)胞檢測(cè)方法，其特征在于， 所述的雙抗內(nèi)含100IU/ml的青霉素及100μ g/ml的鏈素。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的刺參體腔細(xì)胞吞噬活性的流式細(xì)胞檢測(cè)方法，其特征在于， 所述的YDP液體培養(yǎng)基由1 %的酵母浸出汁，2%蛋白胨，2%的D-葡萄糖混合，然后滅菌制得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種刺參體腔細(xì)胞吞噬活性的流式細(xì)胞檢測(cè)方法，屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，首先分離、制備刺參體腔液中的吞噬細(xì)胞，然后用熒光素異硫氰酸酯FITC標(biāo)記熱滅活后的酵母細(xì)胞，再將標(biāo)記后的酵母細(xì)胞與刺參吞噬細(xì)胞共孵育，最后利用流式細(xì)胞儀測(cè)定吞噬活性。本發(fā)明準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，而且操作簡(jiǎn)便快速，為探討刺參體腔細(xì)胞吞噬功能提供了方法依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N15/14GK102279147SQ20111006228
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月8日
發(fā)明者劉洪展, 孫修勤, 屈佩, 鄭風(fēng)榮 申請(qǐng)人:山東大學(xué)威海分校