專利名稱：一種用于檢測豬博卡病毒核苷酸片段的引物和探針序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物病原微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種用于檢測豬博卡病毒核苷酸 的引物和探針序列。
背景技術(shù)：
博卡病毒(Bocav irus)是細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒亞科、博卡病毒屬的成員。人博卡 病毒最早于2005年在患有下呼吸道疾病的瑞典兒童體內(nèi)被鑒定(Allander等Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, 102: 12891-12896)。其基因組大小為 5. 2kb 左右，為單股 線狀DNA。目前已有許多國家報道了人博卡病毒的流行(Allander，Human bocavirus. J. Clin. Virol, 2008, 41:29-33)。2009年，瑞典科學(xué)家利用隨機多重置換擴增方法在患有斷奶仔豬多系統(tǒng)衰 竭綜合征的豬淋巴結(jié)中擴增出了一段長1879 bp的核苷酸序列，該段序列與已知病毒序 列比較，發(fā)現(xiàn)其完整的NPl基因及部分VP1/VP2基因與人類博卡病毒相近，故將該病毒歸 類為細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒亞科、博卡病毒屬的豬博卡病毒(Porcine bocavirus, PBoV) (Blomstrom^ Detect ion of a novel porcine boca-like virus in the background of porcine circovirus type 2 induced postweaning multisystemic wasting syndrome. Virus Res. 2009, 146:125-129)。目前，豬博卡病毒在患病豬中被發(fā)現(xiàn)，而在健康豬體內(nèi)的檢出率較低，這表明該 病毒對斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的發(fā)生起著某種作用。2009年，在我國豬群中也發(fā)現(xiàn) 了豬博卡病毒，其感染率高達(dá)38%，表明豬博卡病毒在我國豬群中廣泛存在(Zhai等High prevalence of a novel porcine bocavirus in weanling piglets with respiratory tract symptoms in China. Arch Virol. 2010， 155:1313-1317)?，F(xiàn)如今，對豬博卡病毒檢測的方法只有普通PCR的方法，利用這種方法在患病豬 的組織中都檢測到了豬博卡病毒的感染，但是血清及精液等樣品中的檢出率顯著要低于組 織樣品，這就需要有一種更加敏感的檢測豬博卡病毒的方法。而熒光PCR方法技術(shù)則是在 普通PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，在擴增反應(yīng)體系中加入一對特異性引物的同時再加入一個特異性 的熒光探針，使用實時監(jiān)測的熒光PCR檢測儀來檢測靶核苷酸的技術(shù)，除了具有普通PCR的 優(yōu)點外，還具有更多的優(yōu)點其特異性更強，靈敏度更高；全封閉反應(yīng)，無需PCR產(chǎn)物的后處 理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠性；可實現(xiàn)單管雙檢或多檢；不接觸有毒試劑，操作安全； 有利于規(guī)?；⒆詣踊??；谝陨系难芯亢彤?dāng)前的需求，申請人根據(jù)豬博卡病毒的全基因組序列，設(shè)計了 用于檢測豬博卡病毒核苷酸片段的弓I物和探針。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測豬博卡病毒核苷酸片段的引物和探針序列。技術(shù)方案
本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
1、一種用于檢測豬博卡病毒核苷酸片段的引物對，其特征在于所述的引物對為由序 列為 TCGAGCTATACAACCGAAGAAGAGA 的上游引物 pNPF 和序列為 TGTTTCGGAGATGTCCTTGCT 的 下游引物PWR組成的引物對。2、一種用于檢測豬博卡病毒核苷酸片段的探針，其特征在于所述的探針PNPP序 列為 CAGCTCTTCGAATCGCCGCTCTCC。上述引物對和探針序列組合物用于檢測豬博卡病毒核苷酸片段的方法，包括
1)待測模板的制備取472.5 μ 1血清；或取100 mg組織樣品，加入1 ml PBS緩沖液 進(jìn)行充分研磨，_20°C反復(fù)凍融3次，8000 rpm離心10分鐘，取上清液472. 5 μ 1。加入10% SDS 25 μ 1,20 11^/1111蛋白酶1(2.5 μ 1，混合均勻后，置于37°C消化過夜或50°C水浴4小 時，加入等量的體積比為25:24:1的酚氯仿異戊醇抽提2次，取上清，加2倍體積預(yù)冷的 無水乙醇于_20°C放置1小時，12000 rpm離心10分鐘，棄去上清，沉淀于干燥箱干燥后用 20 μ 1超純水溶解，即為檢測用DNA模板；
2)豬博卡病毒實時熒光PCR反應(yīng)的擴增條件
組分用量/終濃度
IOXBufferIX
25mmol/L MgCl25mmol/L
dNTP Mixturelmmol/L
弓I物0. 5 μ mol/L each
探針0.4 μ mol/L
模板2 μ 1
Taq 酶5Unit
將加好樣品的PCR管放置熒光PCR儀中，按如下反應(yīng)程序進(jìn)行擴增，反應(yīng)程序為50°C， 2分鐘，熱啟動；95°C，5分鐘預(yù)變性；95°C，15秒，60°C，40秒，40個循環(huán)，試驗結(jié)果可實時監(jiān) 測；
3)豬博卡病毒實時熒光PCR的檢測結(jié)果判定經(jīng)檢測，若待檢樣品中含有豬博卡病毒 則顯示陽性擴增曲線，其檢測靈敏度可達(dá)30個拷貝/ml ；若待檢樣品中不含有豬博卡病毒 則無擴增信號。有益效果
本發(fā)明的具體原理是利用一對靶核苷酸序列的特異性引物和一個特異性熒光探針，采 用耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、核苷酸單體(dNTP)等成分，并應(yīng)用PCR技術(shù)實現(xiàn)靶核苷酸序 列的核酸片段擴增。所使用的探針為兩端分別標(biāo)記熒光報告基團(FAM)和熒光淬滅基團 (TAMRA)的寡核苷酸。在探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團所吸收，而在PCR 擴增過程中，Taq酶的5’端外切酶活性將特異性結(jié)合在靶核苷酸片段上的熒光探針酶切降 解，使熒光報告基團游離于反應(yīng)體系中，脫離了熒光淬滅基團的屏蔽作用，熒光報告基團的熒光信號就可以由儀器檢測到，熒光信號量的變化與擴增產(chǎn)物量成正比，從而判定待測樣 本中靶核苷酸序列的存在。本發(fā)明的優(yōu)點
1、本發(fā)明提供的引物和探針的檢測靈敏度可達(dá)30個拷貝/ml，說明其具有非常良 好的靈敏度；
2、本發(fā)明提供的引物和探針對于不含有豬博卡病毒的檢測樣品均無擴增信號，說明其 具有良好的特異性；
3、由于本發(fā)明對已知的豬博卡病毒基因組序列進(jìn)行比較分析，選擇無二級結(jié)構(gòu)且高度 保守的區(qū)段進(jìn)行引物和探針的設(shè)計，避免了假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。4、由于本發(fā)明采用熒光PCR技術(shù)作為檢測方法，整個反應(yīng)均在封閉的反應(yīng)管內(nèi)進(jìn) 行，避免了普通PCR檢測常出現(xiàn)假陽性結(jié)果的現(xiàn)象。由于對PCR產(chǎn)物進(jìn)行實時監(jiān)測，大大節(jié) 省了檢測時間，節(jié)約了人力物力。


圖1為利用引物對pNPF/pNPR和探針pNPP檢測豬博卡病毒陽性樣品的熒光PCR 擴增圖。
具體實施例方式1、引物和探針設(shè)計通過對豬博卡病毒基因組序列進(jìn)行比較分析，選擇無二級結(jié) 構(gòu)且高度保守的區(qū)段，設(shè)計多對引物和探針，引物長度一般為20-30個堿基左右，引物間和 引物內(nèi)無互補序列。最優(yōu)引物、探針序列組合如下
上游引物 PNPF TCGAGCTATACAACCGAAGAAGAGA 下游引物 PNPR TGTTTCGGAGATGTCCTTGCT 探針 pNPP CAGCTCTTCGAATCGCCGCTCTCC
2、反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化利用感染豬博卡病毒的患病豬的組織樣品為待檢樣品，用 常規(guī)方法提取病毒基因組DNA，分裝后儲存于_20°C備用。2. 1引物濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將豬博卡病毒的引 物濃度分別從0. 1 μ mol/L至2. 0 μ mol/L做連續(xù)倍比稀釋，通過實驗結(jié)果的分析比較，確定 最佳引物終濃度為0. 5 μ mol/L。2. 2鎂離子濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將MgCl2的濃度從 lmmol/L至IOmmol/L以lmmol/L遞增，經(jīng)過多次試驗最終確定5mmol/L為檢測體系中的鎂 離子濃度。2.3 Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的優(yōu)化通過比較Taq酶用量(以單位Unit計) 的優(yōu)化實驗結(jié)果，選定5U作為檢測體系中Taq酶的用量。2. 4 dNTP濃度的優(yōu)化通過使用不同濃度的dNTP進(jìn)行檢測，綜合評估后選lmmol/ L作為檢測體系中dNTP的使用量。2. 5探針濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將豬博卡病毒的探 針濃度分別從0. 1 μ mol/L至0. 5 μ mol/L作連續(xù)倍比稀釋后進(jìn)行檢測，通過試驗結(jié)果的分 析比較，確定最佳探針終濃度為0.4 μ mol/L。
利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的豬博卡病毒實時 熒光PCR反應(yīng)體系為25μ 1體系，所需各組分及相應(yīng)濃度見表1。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測豬博卡病毒核苷酸片段的引物對和探針序列，其特征在于 所述的引物對為由序列為TCGAGCTATACAACCGAAGAAGAGA的上游引物pNPF和序 列為TGTTTCGGAGATGTCCTTGCT的下游引物pNPR組成的引物對；探針pNPP序列為 CAGCTCTTCGAATCGCCGCTCTCC。
2.權(quán)利要求1所述引物對和探針序列用于檢測豬博卡病毒核苷酸片段的方法，包括 1)待測模板的制備取472. 5 μ 1血清；或取100 mg組織樣品，加入1 ml PBS緩沖液進(jìn)行充分研磨，-20°C反復(fù)凍融3次，8000 rpm離心10分鐘，取上清液472. 5 μ 1，加入10% SDS 25 μ 1,20 mg/ml蛋白酶K 2. 5 μ 1，混合均勻后置于37°C消化過夜或50°C水浴4小 時，加入等量的體積比為25:24:1的酚氯仿異戊醇抽提2次，取上清，加2倍體積預(yù)冷的 無水乙醇于_20°C放置1小時，12000 rpm離心10分鐘，棄去上清，沉淀于干燥箱干燥后用 20 μ 1超純水溶解，即為檢測用DNA模板；2)豬博卡病毒；實時熒光PCR反應(yīng)的擴增條件組分用量/終濃度IOXBufferIX25mmol/L MgCl2 5mmol/LdNTP Mixturelmmol/L引物0. 5 μ mol/L探針0. 4 μ mol/L模板10 μ 1iTaq 酶5Unit將加好樣品的PCR管放置熒光PCR儀中，按下列反應(yīng)程序進(jìn)行擴增，反應(yīng)程序為50°C， 2分鐘，熱啟動；95°C，5分鐘預(yù)變性；95°C，15秒，60°C，40秒，40個循環(huán)，試驗結(jié)果實時監(jiān) 測；3)豬博卡病毒實時熒光PCR的檢測結(jié)果判定經(jīng)檢測，若待檢樣品中含有豬博卡病毒 則顯示陽性擴增曲線；若待檢樣品中不含有豬博卡病毒則無擴增信號。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測豬博卡病毒核苷酸片段的引物和探針序列，屬于動物病原微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。引物對包括由序列為TCGAGCTATACAACCGAAGAAGAGA的上游引物pNPF和序列為TGTTTCGGAGATGTCCTTGCT的下游引物pNPR組成的引物對。探針pNPP序列為CAGCTCTTCGAATCGCCGCTCTCC。該套引物和探針序列根據(jù)GenBank上豬博卡病毒全基因組序列(HQ223038)設(shè)計，具有較高的靈敏度和特異性。
文檔編號G01N21/64GK102140545SQ20111006328
公開日2011年8月3日 申請日期2011年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月16日
發(fā)明者何孔旺, 倪艷秀, 張雪寒, 李彬, 毛立, 溫立斌 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院