專(zhuān)利名稱(chēng)：一種定量檢測(cè)血漿中益母草堿含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)血漿中益母草堿含量的方法，具體涉及一種液質(zhì)聯(lián)用(高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù))定量檢測(cè)血漿中益母草堿含量的方法。
背景技術(shù)：
中藥益母草為唇形科植物益母草(Leonurus helerophyllus sweet)的干燥全草，功效活血、祛痕，調(diào)經(jīng)、消水、清熱解毒，常用于治療月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、產(chǎn)后腹痛、跌打傷痛、水腫等。最近研究表明益母草具有多種生物活性，如研究報(bào)道益母草堿的提取物具有改善心肌缺血、增加冠脈血流量，提高心功能，抑制血小板聚集，抗凝、抗血栓形成以及改善大腦缺血等藥理作用。式(I )的益母草堿(leonurine，4_胍基-n_ 丁?；∠闼狨?，是益母草生物堿提取物中主要有效成分，文獻(xiàn)報(bào)道益母草堿具有子宮收縮，抗血小板聚集以及抑制血管平滑肌收縮作用。有研究表明，在現(xiàn)有基礎(chǔ)上改良化學(xué)合成了益母草堿單體，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)所述的化合物在離體和整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)缺血心肌都有良好的保護(hù)作用，并推論這可能與其抗氧化抗凋亡的作用相關(guān)，因此益母草堿將是一個(gè)非常有前景的心血管活性藥物。目前，益母草堿還處于臨床前期研究階段，要研究其藥物代謝動(dòng)力學(xué)，必須建立測(cè)定生物樣本中益母草堿的含量的方法。而現(xiàn)有文獻(xiàn)所報(bào)道的主要是應(yīng)用反向高效液相色譜法(HPLC)或者超高壓液相色譜(UPLC)測(cè)定益母草的原材料或者中成藥制劑中益母草堿的含量；有報(bào)道應(yīng)用HPLC法測(cè)定大鼠血漿中益母草堿血藥濃度，計(jì)算益母草堿靜脈注射后其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，但該方法的靈敏度很低，檢測(cè)限約為0. 25ug/mL ;有研究在預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，如果改用口服給藥后，應(yīng)用上述方法無(wú)法檢測(cè)到益母草堿，說(shuō)明口服給藥后益母草堿血藥濃度低于此方法的檢測(cè)限；所以需要建立靈敏度更高，更快速敏捷的方法。因此，建立可靠靈敏的檢測(cè)血漿中益母草堿含量的方法，尤其是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)定量檢測(cè)血漿中益母草堿含量的方法，能夠?yàn)橐婺覆輭A口服給藥后藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本發(fā)明中所述的益母草堿分子式為C14H21N3O5,分子量為311，結(jié)構(gòu)式為
權(quán)利要求
1.ー種定量檢測(cè)血漿中益母草堿含量的方法，其特征在于，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，用苯甲酰精氨酸こ酯作為檢測(cè)物的內(nèi)標(biāo)，用高氯酸沉淀蛋白方法預(yù)處理血漿樣品，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積，計(jì)算血漿中益母草堿血藥濃度； 所述的益母草堿分子式為C14H21N3O5，分子量為311，結(jié)構(gòu)式為
2.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的液相色譜液相色譜采用安捷倫Zorbax SB-C18柱為固定相，こ腈/こ酸銨緩沖液混合液為流動(dòng)相，等度洗脫，質(zhì)譜采用電噴霧電離源，用多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)對(duì)益母草堿定量。
3.按權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟ー樣品預(yù)處理 采用沉淀血漿蛋白作為血漿預(yù)處理方法，用10%高氯酸作為沉淀劑； 步驟ニ液相分離 (1)流動(dòng)相由體積比為25%的こ腈與75%的こ酸銨緩沖液組成； (2)色譜柱采用安捷倫ZorbaxSB-C18柱,色譜柱內(nèi)徑2. Imm,填料粒徑5 μ m,色譜柱長(zhǎng)度150mm ； (3)洗脫方法采用等度洗脫，流速O.2mL/min，色譜柱溫度為27°C ； 步驟三質(zhì)譜檢測(cè) 采用正離子電噴霧電離源模式，用多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)，離子選擇通道益母草堿(m/z) +312. 2/181. 1，內(nèi)標(biāo)為(m/z)+ 307. 3/105. 0，離子通道范圍為 ± I. Oamu ; 步驟四濃度檢測(cè)方法和檢測(cè)限 按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算血中益母草堿的含量；其中，最低定量限為4ng/mL，定量范圍為4-256ng/mL，線性相關(guān)系數(shù)在O. 995以上，定量下限精密度小于20%，其余質(zhì)控批內(nèi)、批間精密度均小于15%，準(zhǔn)確度85%-115%。
4.按權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述步驟ニ中75%的こ酸銨緩沖液含IOmMこ酸銨、O. 6%こ酸。
5.按權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述步驟三中的內(nèi)標(biāo)是苯甲酰精氨酸こ酷。
6.權(quán)利要求I的定量檢測(cè)血漿中益母草堿含量的方法在計(jì)算血漿中益母草堿血藥濃度中的用途。
7.按權(quán)利要求I用途，其特征在于，所述血漿中益母草堿含量是大鼠血漿中益母草堿的含量。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種定量檢測(cè)血漿中益母草堿含量的方法。本方法采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，用苯甲酰精氨酸乙酯作為檢測(cè)物的內(nèi)標(biāo)，用高氯酸沉淀蛋白方法預(yù)處理血漿樣品，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積，計(jì)算血漿中益母草堿血藥濃度；其中，液相色譜采用安捷倫ZorbaxSB-C18柱為固定相，乙腈/乙酸銨緩沖液混合液為流動(dòng)相，進(jìn)行等度洗脫，質(zhì)譜采用電噴霧電離源，用多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)對(duì)益母草堿定量；本方法中的益母草堿的最低定量限達(dá)4ng/mL。本發(fā)明對(duì)樣品檢測(cè)的專(zhuān)一性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，各項(xiàng)方法學(xué)考證指標(biāo)均能達(dá)到中國(guó)藥典的相關(guān)技術(shù)要求，可用于益母草堿口服給藥后藥代動(dòng)力學(xué)研究。
文檔編號(hào)G01N30/36GK102680620SQ20111006343
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2011年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月16日
發(fā)明者朱依諄, 朱清 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)