專利名稱：快速測定草酸濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于草酸的濃度測量技術(shù)領(lǐng)域，是利用不溶性草酸氧化酶分解草酸消耗氧，用氧電極測定氧的消耗量的變化從而快速測定草酸濃度的方法。
背景技術(shù)：
草酸廣泛存在于細(xì)胞中，是一種有害的二元羧酸。人體中草酸積累會導(dǎo)致代謝紊亂和尿結(jié)石，測定尿液中草酸含量對預(yù)防尿結(jié)石病的珍斷有參考價(jià)值，食品加工、造紙和畜牧業(yè)也需要對原料的草酸含量進(jìn)行測定。因此，不少研究者試圖建立需要快速、準(zhǔn)確、低成本測定草酸濃度的方法。目前文獻(xiàn)報(bào)道的草酸濃度測定方法有以下幾種(1)滴定法，(2) 色譜法，(3)酶法，(4)其它方法。其中，滴定法對樣品的處理時間較長，需3天才能得到檢測結(jié)果；色譜法需要色譜純標(biāo)準(zhǔn)樣品，待測樣品的前處理和測定流程復(fù)雜；酶法是通過草酸氧化酶分解草酸，生成 CO2和H2O2，通過測定氧、CO2或H2A的量來確定樣品中草酸濃度。其中，(X)2的測定需要較大的反應(yīng)體系，測定精度較低；H2A的測定需采用辣根過氧化物酶偶聯(lián)，偶聯(lián)反應(yīng)影響測定的精度；通過測定反應(yīng)體系中氧的變化量，是直接測定反應(yīng)底物氧的減少，不需要偶聯(lián)反應(yīng)， 提高了測定的可靠性，可在短時間內(nèi)測算出樣品的草酸濃度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服已有的測定方法的不足，提供一種短時間內(nèi)準(zhǔn)確測定草酸濃度的方法。本發(fā)明是利用不溶性草酸氧化酶分解草酸，通過測定氧電極氧的減少量來快速測定草酸濃度的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的(1)制備不溶性草酸氧化酶研磨大麥麩皮，研磨粒度控制在60 100 μ m，然后經(jīng) 200目過篩；過篩物按1 1的固液比加入0. lmol/L pH3. 8的琥珀酸/NaOH緩沖液，60 70°C保溫30 60分鐘，5000 8000g離心5分鐘，去除析出的粘稠物，沉淀在50°C的溫度下烘干，按1 1的固液比在沉淀中加入1. 5mol/LNaCl溶液，38°C保溫2小時，5000 SOOOg離心5分鐘，去除析出的粘稠物，用蒸餾水淋洗沉淀至0. lmol/L的AgNO3檢測結(jié)果為陰性，5000 SOOOg離心5分鐘收集沉淀，按沉淀纖維素酶為50 1的比例加入纖維素酶，再按固液比1 1加入0. lmol/L ρΗ7· 8的磷酸緩沖液，30°C保溫1小時，5000g離心沉淀，用10倍沉淀的蒸餾水淋洗沉淀，離心收集沉淀，500C的溫度下烘干沉淀，研磨成粉狀， 得到不溶性草酸氧化酶。(2)將已知草酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品加入到0. 05mol/LpH3. 8的琥珀酸/NaOH緩沖液中，加入不溶性草酸氧化酶，設(shè)置氧電極攪拌子轉(zhuǎn)速50 100轉(zhuǎn)/分鐘，測定單位時間內(nèi)氧的減少量，作出已知草酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品的單位時間內(nèi)氧的減少量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)將未知草酸濃度的樣品加入到0. 05mol/L pH3. 8的琥珀酸/NaOH緩沖液中，加入不溶性草酸氧化酶，設(shè)置氧電極攪拌子轉(zhuǎn)速50 100轉(zhuǎn)/分鐘，測定單位時間內(nèi)氧的減少量，與步驟O)的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得到樣品中的草酸濃度。本發(fā)明快速測定草酸濃度的方法的效果是(1)抗干擾能力強(qiáng)，0. 1 0. 5mmol/L的NOf禾Π 5 30mmol/L的Cr對不溶性草酸氧化酶的活性影響低于10% ；(2)測定速度快，測定未知草酸濃度的樣品耗時短；(3)測定靈敏度較高，反應(yīng)體系最低可檢測的草酸終濃度為0. lmmol/L ；(4)反應(yīng)體系簡單，不需要加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)，減少了測定誤差；(5)不需要還原性的顯色劑，檢測試劑可在常溫下保存。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例先制備不溶性草酸氧化酶取50g大麥麩皮，研磨后200目過篩，過篩物按1 1的固液比加入0. lmol/L ρΗ3· 8的琥珀酸/Na0H，70°C保溫30分鐘，5000g離心5 分鐘除析出的粘稠物，沉淀在50°C的溫度下烘干，按1 1的固液比在沉淀中加入1.5mol/ L NaCl溶液，38°C保溫2小時，5000g離心5分鐘，去除析出的粘稠物，用蒸餾水淋洗沉淀至0. lmol/L的AgNO3檢測結(jié)果為陰性，5000g離心5分鐘收集沉淀，按沉淀纖維素酶為 50 1的比例加入纖維素酶，再按固液比1 1加入0. lmol/L pH7. 8的磷酸緩沖液，30°C 保溫1小時，5000g離心沉淀，用10倍沉淀的蒸餾水淋洗沉淀，離心收集沉淀，在50°C的溫度下烘干沉淀，研磨成粉狀，得到不溶性草酸氧化酶。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:2ml 0. 05mol/L ρΗ3· 8的琥珀酸/NaOH緩沖液中分別含0. 1 0. 8mmol/L終濃度的草酸，加入30 μ g不溶性草酸氧化酶，氧電極攪拌子轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘， 測定1 5分鐘氧的減少量，做出草酸濃度在0. 1 0. 8mmol/L的氧檢測信號減少量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定未知草酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品將50 μ 1未知濃度的草酸鈉加入至1. 95ml 0. 05mol/LpH3. 8的琥珀酸/NaOH緩沖液中，加入30 μ g不溶性草酸氧化酶，氧電極攪拌子轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘，測定1 5分鐘氧的減少量，根據(jù)氧檢測信號的減少量對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中草酸濃度。
權(quán)利要求
1. 一種快速測定草酸濃度的方法，其特征在于，包括以下步驟⑴研磨大麥麩皮，研磨粒度控制在60 100 μ m，然后經(jīng)200目過蹄，過篩物按1 1 的固液比加入0. lmol/L pH3. 8的琥珀酸/NaOH緩沖液，60 70 °C保溫30 60分鐘， 5000 SOOOg離心5分鐘，去除析出的粘稠物，沉淀在50°C的溫度下烘干，按1 1的固液比在沉淀中加入1. 5mol/L NaCl溶液，38°C保溫2小時，5000 8000g離心5分鐘，去除析出的粘稠物，用蒸餾水淋洗沉淀至0. lmol/L的AgNO3檢測結(jié)果為陰性，5000 SOOOg離心 5分鐘收集沉淀，按沉淀纖維素酶為50 1的比例加入纖維素酶，再按固液比1 1加入 0. lmol/LpH7. 8的磷酸緩沖液，30°C保溫1小時，5000g離心沉淀，用10倍沉淀的蒸餾水淋洗沉淀，離心收集沉淀，500C的溫度下烘干沉淀，研磨成粉狀，得到不溶性草酸氧化酶；(2)將已知草酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品加入到0.05mol/L pH3. 8的琥珀酸/NaOH緩沖液中，加入不溶性草酸氧化酶，設(shè)置氧電極攪拌子轉(zhuǎn)速50 100轉(zhuǎn)/分鐘，測定單位時間內(nèi)氧的減少量，作出已知草酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品的單位時間內(nèi)氧的減少量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)將未知草酸濃度的樣品加入到0.05mol/L pH3. 8的琥珀酸/NaOH緩沖液中，加入不溶性草酸氧化酶，設(shè)置氧電極攪拌子轉(zhuǎn)速50 100轉(zhuǎn)/分鐘，測定單位時間內(nèi)氧的減少量， 與步驟O)的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得到樣品中的草酸濃度。
全文摘要
本發(fā)明屬于草酸濃度測量的技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速測定草酸濃度的方法，它包括以下步驟制備不溶性草酸氧化酶研磨大麥麥麩，過篩，在琥珀酸緩沖液中60～70℃保溫，離心收集沉淀，沉淀中加入NaCl保溫，水洗沉淀，加入纖維素酶保溫，水洗沉淀，離心收集沉淀，烘干得到不溶性草酸氧化酶；用不溶性草酸氧化酶在琥珀酸緩沖液中測定標(biāo)準(zhǔn)草酸樣品的單位時間內(nèi)氧的減少量，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線；用不溶性草酸氧化酶在琥珀酸緩沖液中測定未知濃度草酸樣品的單位時間內(nèi)氧的減少量，對比標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到未知濃度草酸樣品的濃度。采用本發(fā)明測定樣品的草酸濃度，具有檢測速度快，抗干擾能力強(qiáng)，檢測靈敏度高，反應(yīng)體系簡單，檢測試劑能在常溫下保存的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N27/26GK102183556SQ20111006516
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者張夢成, 胡一鴻 申請人:湖南人文科技學(xué)院