專利名稱：一種微小隱孢子蟲免疫膠體金檢測(cè)試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種微小隱孢子蟲免疫膠體金檢測(cè)試紙條，用于人隱孢子蟲及微小隱孢子蟲的檢測(cè)，本發(fā)明還公開了上述試紙條的制備方法，屬于寄生蟲檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隱孢子蟲是普遍存在的胃腸道寄生性原蟲，能引起人與家畜的群體腹瀉。含有隱孢子蟲卵囊的人、家畜、寵物和野生動(dòng)物的糞便，直接威脅飲用水安全，導(dǎo)致隱孢子蟲病呈水源性大規(guī)模暴發(fā)。分子流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，大多數(shù)人隱孢子蟲病是由人隱孢子蟲和微小隱孢子蟲引起的。所有人隱孢子蟲和微小隱孢子蟲中均含有微小隱孢子蟲病毒，呈球形，直徑約 31 nm，為 dsRNA 病毒，含 larger dsRNA(L-dsRNA)和 smaller dsRNA(S-dsRNA) 兩種核酸，而隱孢子蟲屬其他種不含該病毒。其中S-dsRNA只有一個(gè)開放閱讀框架，編碼衣殼蛋白。S-dsRNA核酸有望作為對(duì)人具有感染性的隱孢子蟲(人隱孢子蟲和微小隱孢子蟲) 與其他種類隱孢子蟲鑒別的一個(gè)分子標(biāo)記，和含病毒蟲株的分離與鑒定的依據(jù)。傳統(tǒng)的微小隱孢子蟲檢測(cè)方法如糞便濃集、改良抗酸染色和免疫熒光染色法等， 步驟繁瑣，敏感性低；動(dòng)物感染試驗(yàn)可以檢測(cè)隱孢子蟲的活性，但試驗(yàn)周期長和過程繁瑣； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR，若引物的特異性不高，容易受其他DNA的干擾，重現(xiàn)性不高。ELISA方法存在靈敏度低、操作程序復(fù)雜、費(fèi)時(shí)等問題。因此，為了控制本病的流行與診斷，建立一種科學(xué)、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)和診斷方法是非常必要的。免疫膠體金技術(shù)自問世以來，得到了迅速發(fā)展。已廣泛應(yīng)用于免疫組織(或細(xì)胞)化學(xué)檢測(cè)和免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，特別是膠體金免疫層析技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速靈敏、結(jié)果清楚，易于判斷和保存，且無需特殊儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，適合于臨床的快速診斷和基層、農(nóng)村等流行病學(xué)調(diào)查大規(guī)模應(yīng)用。經(jīng)檢索未見有公開的利用微小隱孢子蟲病毒衣殼蛋白制備免疫膠體金檢測(cè)試紙條的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開一種微小隱孢子蟲免疫膠體金檢測(cè)試紙條，目的是解決當(dāng)前人隱孢子蟲和微小隱孢子蟲檢測(cè)特異性低，不準(zhǔn)確、誤差多、靈敏度低的缺點(diǎn)。本發(fā)明還提供了微小隱孢子蟲免疫膠體金檢測(cè)試紙條的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下用膠體金標(biāo)記純化的單克隆抗體技術(shù)制作金標(biāo)墊， 用純化的單克隆抗體包被硝酸纖維膜作為檢測(cè)線(T線)；用羊抗鼠IgG作為質(zhì)控線(C)，即得檢測(cè)試紙。本發(fā)明提供的微小隱孢子蟲免疫膠體金檢測(cè)試紙條，包括樣品墊、金標(biāo)墊、吸收墊、硝酸纖維素膜組成，其特征在于金標(biāo)墊包被有CSpV-S蛋白單克隆抗體膠體金偶聯(lián)標(biāo)記物，檢測(cè)線包被有純化的單克隆抗體，質(zhì)控線包被有羊抗鼠IgG抗體，質(zhì)控線側(cè)貼有吸收墊。本發(fā)明微小隱孢子蟲免疫膠體金檢測(cè)試紙條的制備方法的具體步驟包括
(1)CSpV-S蛋白的原核表達(dá)與純化以C. parvum總RNA的cDNA為模板，擴(kuò)增CSpV-S 基因片段，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pETjSa (+)-S，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，利用Ni-NTA樹脂親和層析法純化表達(dá)的蛋白；
(2)CSpV-S蛋白單克隆抗體的制備將純化的CSpV-S蛋白分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑等比例混合乳化后作為免疫原，免疫BALB/c小鼠，待抗體效價(jià)達(dá)到IO5時(shí)，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，篩選出能穩(wěn)定分泌抗CSpV-S蛋白抗體的雜交瘤陽性細(xì)胞株，并進(jìn)行單克隆抗體的大量制備，利用HiTrap Protein G HP純化單克隆抗體；
(3)膠體金溶液及金標(biāo)蛋白的制備采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，確定膠體金與CSpV-S蛋白單克隆抗體用量比例，制備金標(biāo)CSpV-S蛋白的單克隆抗體偶聯(lián)標(biāo)記物，采用低溫超速離心法純化金標(biāo)CSpV-S蛋白單克隆抗體；
(4)試紙條的組裝將金標(biāo)CSpV-S蛋白單克隆抗體用噴點(diǎn)儀噴點(diǎn)玻璃纖維素膜， CSpV-S蛋白單克隆抗體和羊抗鼠IgG抗體分別噴涂于硝酸纖維膜檢測(cè)線和質(zhì)控線上，將處理好的硝酸纖維膜、玻璃纖維膜、樣品墊、吸水墊等材料按順序進(jìn)行粘貼、組裝、切條、密封， 4°C保存。本發(fā)明的積極效果在于將酶聯(lián)免疫原理和膠體金層析技術(shù)結(jié)合，制備檢測(cè) C. parvum的膠體金試紙條，并應(yīng)用于臨床，提高C/^rra 的防治能力，具有操作簡(jiǎn)單快速、 檢測(cè)結(jié)果清楚易于判斷、特異性強(qiáng)、敏感性高、無須儀器設(shè)備或只需簡(jiǎn)單的儀器等優(yōu)點(diǎn)，因此非常適于發(fā)病現(xiàn)場(chǎng)、門診以及實(shí)驗(yàn)條件不具備的場(chǎng)所等臨床樣品檢測(cè)使用。


圖1為本發(fā)明CSpV-S蛋白純化其中，M為低分子量蛋白標(biāo)志物；1為純化的重組蛋白。圖2為本發(fā)明CSpV-S蛋白單克隆抗體純化其中，M為蛋白標(biāo)志物(117，90，49，34，25，19 KDa) ； 1為純化的腹水；2為未純化的腹水。圖3為本發(fā)明膠體金溶液制備圖。圖4為本發(fā)明試紙條靈敏度測(cè)試其中，1為陰性對(duì)照；2為微小隱孢子蟲糞便研磨濾過液檢測(cè)結(jié)果。圖5為本發(fā)明試紙條初步應(yīng)用圖。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說明，而不是限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對(duì)本發(fā)明的任何平行改變和改動(dòng)都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。實(shí)施例1
一、微小隱孢子蟲病毒衣殼蛋白基因S-dsRNA的克隆、表達(dá)及蛋白的純化 1、材料與方法
4(1)菌株及質(zhì)粒
pET-28a ( + )載體由本室保存；大腸桿菌Dffia感受態(tài)和大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒PMD18-T為日本TaKaRa公司；微小隱孢子蟲總 RNA WcDNA由本室保存。(2)相關(guān)分子生物學(xué)操作
PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒重組和轉(zhuǎn)化等操作按《分子克隆》所述方法進(jìn)行；細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取、 DNA的回收純化按照試劑盒說明書進(jìn)行；DNA測(cè)序由生物工程公司完成。基因的擴(kuò)增及克隆
根據(jù)GenBank中微小隱孢子蟲病毒S_dsRNA基因序列(登錄號(hào)為EU183404)，采用 Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物
SF :5，-ctggatccATGATTACAAGTTTT GAATCAA, SR :5’ -aagtcgac CTAATGGGAGCGATCTGCGC TA,
引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以微小隱孢子蟲總RNA的cDNA為模板，進(jìn)行 PCR。反應(yīng)條件為95 "C 5 min ；95 "C 1 min，58 "C 1 min，72 "C lmin，共 41 個(gè)循環(huán)；72 V 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳回收。將PCR產(chǎn)物與pMD18_T載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒PMD18-T-S。(4)重組質(zhì)粒pET48a(+)-S的構(gòu)建
將pMD18-T-S質(zhì)粒和pET-28a ( + )質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行I和Sal I雙酶切，回收目的片段與pET-28a (+)載體并連接，從而構(gòu)成重組質(zhì)粒pET-28a (+) -S。(5 )蛋白的SDS-PAGE分析及純化
將鑒定正確的表達(dá)質(zhì)粒pET48a(+)-S轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)，同時(shí)設(shè) pET-28a(+)空質(zhì)粒作為陰性對(duì)照，挑取單個(gè)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)過夜。按 1 %的比例接種于5 mL LB培養(yǎng)基中，37 °C振蕩培養(yǎng)至菌液OD6tltlnm值為0. 4 0. 6，加入 IPTG至終濃度1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集1 mL誘導(dǎo)、未誘導(dǎo)和陰性對(duì)照的菌液，進(jìn)行 SDS-PAGE分析。按照Ni-NTA說明書進(jìn)行目的蛋白的純化。用含有8，6，4，2，0 mol/L尿素，0.5 mol/L L-Arg的PBS溶液進(jìn)行梯度透析復(fù)性，用BCA蛋白含量分析試劑盒測(cè)定蛋白濃度。2、結(jié)果
純化的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，可見在37 KDa處有一條單一的蛋白帶，參見附圖1。二、微小隱孢子蟲病毒衣殼蛋白單克隆抗體的制備 1、材料及方法
(1)雌性BALB/c小鼠購自長春生物制品所；SP2/0骨髓瘤細(xì)胞本室保存；單克隆抗體亞類鑒定試劑盒和液體石蠟均為美國Sigma公司產(chǎn)品；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基為美國 Invitrogen Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清為杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)瓶與96孔細(xì)胞培養(yǎng)板均為美國Corning公司產(chǎn)品；BCA蛋白含量分析試劑盒為美國Thermo 公司產(chǎn)品。(2)免疫動(dòng)物
以純化的重組蛋白S為抗原腹腔免疫3只6、周齡的BALB/c小鼠(100 Pg/只)，免疫三次，每次間隔兩周?？贵w效價(jià)達(dá)到IO5后便可用于細(xì)胞融合，然后于融合前三天加強(qiáng)免疫。融合前，摘除眼球采血，分離血清，作為陽性血清。(3)細(xì)胞融合
將免疫后的BALB/c健康小鼠摘除眼球放血，引頸處死后，放入75%酒精中消毒5min， 帶入生物安全柜。取出脾臟放在無菌平皿中，除去脂肪及結(jié)締組織，用不完全1640培養(yǎng)基沖洗，放在無菌的200目銅網(wǎng)上，用無菌5mL注射器的活塞研磨，吸出上清，靜置5min，1000 r/min離心5 min，沉淀即為制備好的脾細(xì)胞。然后將SP2/0細(xì)胞吹起，1000 r/min離心 5 min。用不完全1640培養(yǎng)基重懸脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞并混合，1000 r/min離心5 min, 去上清。緩慢加入液體PEG lmL，在Imin內(nèi)勻速加完。靜置aiiin，再加入不完全1640培養(yǎng)基，在第Imin加完2mL，第anin加完3mL，第!Bmin加完4mL，靜置5min。1000 r/min離心 5 min，去上清。用HAT選擇培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，每孔加2滴細(xì)胞懸液至鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)板，最后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。次日每孔補(bǔ)加1滴HAT選擇培養(yǎng)基，之后每隔兩天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行半數(shù)換液。(4)雜交瘤陽性細(xì)胞株的篩選及克隆
待單克隆細(xì)胞長滿1/3 1/2孔后，用已建立的間接ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清中抗體分泌情況。選擇兩次OD49tlnm值都較高的孔進(jìn)行克隆，一般采用有限稀釋法克隆3次。將陽性雜交瘤細(xì)胞株克隆至所有克隆孔均為陽性為止，同時(shí)將每次克隆陽性細(xì)胞孔進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)， 再進(jìn)行凍存。(5)單克隆抗體的鑒定
單克隆抗體的鑒定包括雜交瘤陽性細(xì)胞株染色體數(shù)目分析，Western Blotting鑒定， 單克隆抗體亞型鑒定和間接免疫熒光試驗(yàn)等。(6)單克隆抗體的大量制備及純化
小鼠腹腔接種石蠟0.5mL/只，10天后每只小鼠腹腔接種lX106/0.2mL雜交瘤細(xì)胞。 間隔7天后，每天觀察小鼠腹部膨大情況。若見小鼠腹部明顯增大，即可用20mL注射器的針頭采取腹水，3500r/min離心lOmin，去除細(xì)胞成分和其他的沉淀物，取上清，分裝，-80°C 凍存?zhèn)溆?。按照HiTrap Protein G HP說明書進(jìn)行操作。SDS-PAGE分析純化抗體的純度。 將純化的抗體加入透析袋，用透析液PBS 4°C透析他以上，最后用BCA蛋白含量分析試劑盒測(cè)定抗體濃度。2、結(jié)果
純化后的腹水經(jīng)SDS-PAGE分析，可見清晰兩條帶，一條為輕鏈，另一條為重鏈；未純化的腹水雜蛋白條帶較多，說明該種抗體純化方法純化效果較好，能得到較純的單克隆抗體， 參見附圖2。三、微小隱孢子蟲病毒衣殼蛋白的膠體金免疫層析試紙的組裝及測(cè)試 1、材料及方法
(1)羊抗鼠IgG購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；2992、903、8964型樣品墊(sample pad)、Ahlstrom 8964 型玻璃纖維膜(conjugate release membrane)、Sartorius CN140、 AE99 和 PRIMA60 型硝酸纖維素膜(nitrocellulose membrane),470 和 2727 型吸水墊 (absorbent pad)、6cmX 30cm、8cmX 30cm型PVC底板均為上海金標(biāo)生物科技有限公司產(chǎn)品。
(2)膠體金的制備
本發(fā)明采用檸檬酸三鈉制備膠體金，取硅化過的250mL三角瓶一個(gè)，加IOOmL去離子及 ImL 1%氯金酸，電爐加熱沸騰；取不同體積的1%檸檬酸三鈉迅速加入上述溶液中，混勻。持續(xù)加熱可觀察到溶液很快變成灰色，黑色，最后逐漸穩(wěn)定成紅色，繼續(xù)煮沸5 min，冷卻后用去離子水補(bǔ)足體積至100mL。電鏡下觀察膠體金顆粒的平均直徑、分散程度及均勻度。(3)膠體金標(biāo)記單克隆抗體的最適pH與最佳濃度的確定
分別取1 mL膠體金加至1.5 mL離心管，用0. lmol/L K2CO3結(jié)合精密pH試紙分別調(diào)節(jié)pH至6. 0,7. 0,7. 5,8. 0,8. 5,9. 0 ；再加入適量單克隆抗體至終濃度同為50μ g/ml，迅速混勻，振蕩20min，室溫靜止放置IOmin ；然后分別加入100 μ L 10% NaCl溶液，振蕩混合20 min后，室溫靜止放置IOmin ；保持紅色的最低pH值，即為最佳pH值。調(diào)節(jié)膠體金溶液至最適pH值，分別取500 μ L加至1. 5 mL離心管，分別加入單克隆抗體至終濃度為 10 μ g/mL, 15 μ g/mL, 20 μ g/mL, 25 μ g/mL, 30 μ g/mL, 35 μ g/mL, 40 μ g/ mL，迅速混勻，振蕩20min，室溫靜止放置IOmin ；然后分別加入100 μ L 10% NaCl溶液，振蕩混合20 min后，室溫靜止放置IOmin ；保持紅色的最低pH值，即為最佳pH值。然后按上述最適pH值和最佳濃度標(biāo)記單克隆抗體制備膠體金探針。(4)金標(biāo)墊的制備
將玻璃纖維素膜切割成0. 55cm左右寬的長條，長度依需要而定，浸泡于膠體金探針溶液，4°C放置4h，在低溫條件下風(fēng)干，即為金標(biāo)墊，觀察其色澤、均一性、穩(wěn)定性。 (5) T線及C線的點(diǎn)膜方法
將純化的單克隆抗體和羊抗鼠IgG用最佳緩沖液分別稀釋至最佳濃度。將稀釋好的單克隆抗體溶液裝入BIODOT劃膜機(jī)噴頭2，固定在距硝酸纖維膜下邊緣1.1cm的位置上， 稀釋好的羊抗鼠IgG裝入BIODOT劃膜機(jī)噴頭1，固定在距硝酸纖維膜下邊緣1.6cm的位置上。檢測(cè)線和質(zhì)控線間的距離為5. 0mm，參數(shù)均為1. (^L/cm噴在硝酸纖維膜上。將已噴好的硝酸纖維膜4°C放置待風(fēng)干后備用。(6) T線及C線條件的優(yōu)化
設(shè)置幾組不同的抗體濃度對(duì)硝酸纖維膜的T線和C線進(jìn)行優(yōu)化，選出最優(yōu)的一組包被于T線和C線，并對(duì)T線和C線噴膜量、噴膜速度等因素進(jìn)行優(yōu)化。(7)試紙條的組裝
按照底板上劃定的樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜及吸水紙的尺寸，裁定符合要求的材料和制備相關(guān)的金標(biāo)墊。將包被好的硝酸纖維膜粘到PVC底板上，小心抹平膜面。將金標(biāo)墊緊靠硝酸纖維膜下邊緣粘到PVC底板上。將樣品墊一部分重迭在金標(biāo)墊上一起粘到PVC 底板上，并對(duì)齊抹平。將吸水紙緊一部分重迭在硝酸纖維膜下邊緣粘到PVC底板上，并對(duì)齊抹平。用切條機(jī)切成3. 5mm寬的試紙，在裝配區(qū)將切好的試紙放入裝有干燥劑的包裝袋內(nèi)。2、結(jié)果
(1)膠體金溶液呈橙紅色，透光性良好，參見附圖3。(2)取含有微小隱孢子蟲的糞便2 g，加入5 mL含0. 1% Tween-20及2 mmol/L EDTA的PBS研磨后過濾，取50μ 濾過液滴加在試紙條的加樣區(qū)，樣品開始在硝酸纖維素膜上擴(kuò)散，待金標(biāo)墊釋放完全后，硝酸纖維素膜上出現(xiàn)了清晰的T線和C線，參見附圖4。實(shí)驗(yàn)例1膠體金免疫層析試紙條性能的測(cè)定及實(shí)踐
1、微小隱孢子蟲病毒衣殼蛋白的膠體金免疫層析試紙的特異性
同法處理含安氏隱孢子蟲，藍(lán)氏賈第蟲，柔嫩艾美爾球蟲和微小隱孢子蟲糞便，各取50μ 濾過液滴加在試紙條上進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，該試紙條對(duì)安氏隱孢子蟲，藍(lán)氏賈第蟲和柔嫩艾美爾球蟲檢測(cè)呈陰性，對(duì)微小隱孢子蟲檢測(cè)呈陽性，說明特異性良好。2、微小隱孢子蟲病毒衣殼蛋白的膠體金免疫層析試紙的敏感性
將濾過液稀釋40倍，膠體金試紙條檢測(cè)呈陽性結(jié)果，濾過液稀釋度超過80倍時(shí)，試紙條檢測(cè)呈陰性。膠體金試紙條的敏感性符合本發(fā)明的要求。3、微小隱孢子蟲病毒衣殼蛋白的膠體金免疫層析試紙的重復(fù)性
試紙條批內(nèi)、批間檢測(cè)微小隱孢子蟲的結(jié)果沒有明顯差別，且檢測(cè)線和質(zhì)控線條帶清晰，說明重復(fù)性良好。4、微小隱孢子蟲病毒衣殼蛋白的膠體金免疫層析試紙的穩(wěn)定性
應(yīng)用4 ！保存的膠體金免疫層析試紙定期檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)陽性樣本，結(jié)果顯示，4°C保存60 天后試紙條仍均呈穩(wěn)定的陽性反應(yīng)，達(dá)到本發(fā)明的目的。5、微小隱孢子蟲病毒衣殼蛋白的膠體金免疫層析試紙的初步應(yīng)用
模擬樣品試驗(yàn)取10個(gè)人工感染隱孢子蟲小鼠樣品進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果均為陽性，參見附圖5。
權(quán)利要求
1.一種微小隱孢子蟲免疫膠體金檢測(cè)試紙條，包括樣品墊、金標(biāo)墊、吸收墊、硝酸纖維素膜組成，其特征在于金標(biāo)墊包被有CSpV-S蛋白單克隆抗體膠體金偶聯(lián)標(biāo)記物，檢測(cè)線包被有純化的單克隆抗體，質(zhì)控線包被有羊抗鼠IgG抗體，質(zhì)控線側(cè)貼有吸收墊。
2.權(quán)利要求1所述微小隱孢子蟲免疫膠體金檢測(cè)試紙條的制備方法，包括下述步驟(1)CSpV-S蛋白的原核表達(dá)與純化以C. parvum總RNA的cDNA為模板，擴(kuò)增CSpV-S 基因片段，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET48a(+)-S，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，利用Ni-NTA樹脂親和層析法純化表達(dá)的蛋白；(2)CSpV-S蛋白單克隆抗體的制備將純化的CSpV-S蛋白分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑等比例混合乳化后作為免疫原，免疫BALB/c小鼠，待抗體效價(jià)達(dá)到IO5時(shí)，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，篩選出能穩(wěn)定分泌抗CSpV-S蛋白抗體的雜交瘤陽性細(xì)胞株，并進(jìn)行單克隆抗體的大量制備，利用HiTrap Protein G HP純化單克隆抗體；(3)膠體金溶液及金標(biāo)蛋白的制備采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，確定膠體金與CSpV-S蛋白單克隆抗體用量比例，制備金標(biāo)CSpV-S蛋白的單克隆抗體偶聯(lián)標(biāo)記物，采用低溫超速離心法純化金標(biāo)CSpV-S蛋白單克隆抗體；(4)試紙條的組裝將金標(biāo)CSpV-S蛋白單克隆抗體用噴點(diǎn)儀噴點(diǎn)玻璃纖維素膜， CSpV-S蛋白單克隆抗體和羊抗鼠IgG抗體分別噴涂于硝酸纖維膜檢測(cè)線和質(zhì)控線上，將處理好的硝酸纖維膜、玻璃纖維膜、樣品墊、吸水墊等材料按順序進(jìn)行粘貼、組裝、切條、密封， 4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明提供一種微小隱孢子蟲免疫膠體金檢測(cè)試紙條及其制備方法，它包含硝酸纖維素膜及其兩端的金標(biāo)墊和吸收墊，金標(biāo)墊上端為樣品墊，金標(biāo)墊包被有純化的CSpV-S蛋白單克隆抗體膠體金偶聯(lián)標(biāo)記物，檢測(cè)線包被有純化的單克隆抗體，質(zhì)控線包被有羊抗鼠IgG抗體，質(zhì)控線側(cè)貼有吸收墊。本研究將酶聯(lián)免疫原理和膠體金層析技術(shù)結(jié)合，制備檢測(cè)C.parvum的膠體金試紙條，并擬應(yīng)用于臨床，提高C.parvum的防治能力，具有操作簡(jiǎn)單快速、檢測(cè)結(jié)果清楚易于判斷、特異性強(qiáng)、敏感性高、無須儀器設(shè)備或只需簡(jiǎn)單的儀器等優(yōu)點(diǎn)，因此非常適于發(fā)病現(xiàn)場(chǎng)、門診以及實(shí)驗(yàn)條件不具備的場(chǎng)所等臨床樣品檢測(cè)使用。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102183653SQ20111006704
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月21日
發(fā)明者刁玉梅, 宮鵬濤, 張國才, 張楠, 張西臣, 李建華, 李 赫, 楊舉, 邢沈陽 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)