專利名稱：一種畜禽肉中己烯雌酚的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及雌激素檢測技術領域，尤其涉及一種畜禽肉中己烯雌酚的顯微共焦拉曼光 譜檢測方法。
背景技術：
動物性食品存在于人們日常生活中，其安全性檢測非常重要。己烯雌酚 (Diethylstilbestrol，DES)是一種人工合成的非留體雌激素，因其具有增加蛋自質沉積 和減少脂肪沉積的作用而作為促生長劑廣泛應用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)，后經研究發(fā)現(xiàn)DES殘留對 生物體具有刺激性早熟及潛在的致畸致癌等危害，因此動物性食品中己烯雌酚的殘留檢測 問題受到國內外的高度重視。2003年中華人民共和國農業(yè)部發(fā)布《2003年度動物性產品中 獸藥殘留監(jiān)控計劃》(農牧發(fā)[2003]6號)，對DES在動物性食品中要求不得檢出。從市場 的調查結果可知，盡管大部分國家已經規(guī)定在飼料中禁止添加DES，然而受到強大經濟利益 的驅使，濫用DES現(xiàn)象仍然存在，動物性食品中殘留的DES仍然威脅著食用者的健康，因此， 必須建立方便有效的DES殘留檢測方法以確保動物性食品的安全。現(xiàn)有的己烯雌酚殘留檢測方法主要有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、 氣相色譜-質譜聯(lián)機法(GC/MQ、液相色譜-質譜聯(lián)機法(LC/MQ、放射免疫法(RIA)和 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。中華人民共和國國家標準《畜禽肉中己烯雌酚的測定》(GB/ T 5009. 108-2003)中采用高效液相色譜法方法，其敏度較高，重復性較好，定量精度較高， 但容易受到雜質的干擾，需要用適宜的填料柱，容量小，流動相消耗大；農業(yè)部1163號公 告-1-2009《動物性食品中己烯雌酚殘留檢測酶聯(lián)免疫吸附測定法》中酶聯(lián)免疫吸附法檢 測限及穩(wěn)定性均達到要求，但DES試劑盒主要依靠國外進口，價格偏高；氣相色譜-質譜 法雖能獲得較低的檢測限，但與氣象色譜法一樣，都必須要進行繁瑣的衍生化處理；液相 色譜-質譜聯(lián)機法靈敏度高，檢測限低，但價格昂貴，難以在國內基層檢測部門普及；放射 免疫法由于抗原抗體的特異性反應，存在交叉反應、假陽性反應的結果，組織樣品處理較繁 瑣、需要有同位素防護設備，對操作人員有一定的危害等?？芍?，己烯雌酚的常規(guī)化學分析 方法都存在一些不足，例如操作步驟繁瑣、消耗化學藥品、需制備試樣等。為更好的保證人們日常生活中動物性食品安全，有必要尋找一種快速簡便的己烯 雌酚檢測方法。目前，拉曼光譜技術已廣泛應用于石油化工、生物醫(yī)學、地質考占、刑事司法、寶石 鑒定等領域。與常規(guī)化學分析技術相比，拉曼光譜技術具有無損、快速、環(huán)保、操作簡便、無 需消耗化學試劑、所需樣品量少等特點，且可獲得樣品的物理化學及深層結構信息，此外對 水等極性物質極其不敏感，使其在食品安全檢測方面具有良好的應用前景。拉曼光譜檢測 技術在食品安全檢測中的關鍵技術主要有降低熒光背景影響、熱效應的消除、拉曼標準譜 圖庫的建立和低成本便攜式拉曼光譜儀的開發(fā)等。國外應用拉曼光譜技術檢測了在糧食、 蔬菜、水果中普遍使用的殺蟲劑和殺菌劑等，已取得一定進展，但己烯雌酚標準拉曼圖譜及 應用拉曼光譜技術檢測動物性食品中己烯雌酚的方法在國內外都尚未見報道。發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，采用顯微共聚焦拉曼光譜檢測技術，建立己 烯雌酚的標準拉曼譜圖數(shù)據庫，而設計出一種快速簡便的檢測畜禽肉中己烯雌酚方法。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的
一種畜禽肉中己烯雌酚的檢測方法，它包括以下具體步驟
(1)測定己烯雌酚標準拉曼譜圖
將己烯雌酚標準品粉末用顯微共焦拉曼光譜檢測儀檢測，激光發(fā)射波長為785·， 激光輸出功率W為0 < W < 300mff,工作環(huán)境溫度為10 40°C，掃描參數(shù)積分時間 (Integration)為0 120s，掃描次數(shù)平均值(Average)為1 10，濾波器平滑參數(shù) (Boxcar)為1，尋找最大信號，得到己烯雌酚標準拉曼譜(2)制備畜禽肉樣品提取液
將畜禽肉樣于絞肉器中攪成肉糜，稱取5. 00 20. OOg絞碎肉樣放入50mL具塞離心管 中，加入10. 00 40. OOmL甲醇，在渦流混勻器上劇烈混合成勻漿，超聲萃取20min，置振蕩 器中震蕩5min，于4500r/min離心lOmin，用尖嘴吸液管吸出上清液，殘渣再重復萃取一次， 合并上清液至蒸發(fā)瓶中，置于水浴旋轉蒸發(fā)儀上蒸干，然后加入10. 00 40. OOmL正己烷和 5. 00 20. OOmL乙腈，移至于漩渦振蕩器上震蕩lmin，棄去上層正己烷相，取下層乙腈相過 0. 2Mm有機膜，最后再水浴旋轉蒸發(fā)至近干，用乙腈0. 50 2. OOmL定容，于通風櫥中將提取 液同點多次點樣至單凹載玻片上揮發(fā)至干，備用；
(3)制備其它樣品提取液
按步驟(2)制備不含己烯雌酚的肉樣提取液樣品，作空白對照； 按步驟(2)制備含10. 00μδ/5. OOg比例的己烯雌酚/空白畜禽肉的提取液樣品，作加 標對照；
按步驟(2)制備含10. 00μδ/5. OOg比例的己烯雌酚/待測畜禽肉的提取液樣品，作加 標樣品；
(4)對樣品的拉曼光譜檢測
顯微共焦拉曼光譜檢測，激光輸出功率W為0 < W < 300mW，關閉室內照明設備并在檢 測過程始終保持黑暗環(huán)境，單擊暗掃描(Dark Scan)采集參考暗點，保存暗流噪音，設置掃 描參數(shù)積分時間為0 120s，掃描次數(shù)平均值為1 10，濾波器平滑參數(shù)為1，依次將上述 各樣品置于顯微拉曼探頭下，選擇顯微鏡下視頻模式手動調節(jié)焦距找到測量點，單擊單詞 掃描采集樣品頻譜測量值，每點重復檢測3次，保存數(shù)據及圖像，然后分析樣品拉曼圖譜。所述標準拉曼譜圖測得己烯雌酚特征峰頻率為0 MOOcnT1，主要特征峰頻率為 635 cm-1, 814 cm-1, 1112 cm-1, 1259 cnT1，1636CHT1。所述提取液同點多次點樣采用0. 50 2. 00mL。所述顯微共焦拉曼光譜檢測為Microscope \Video Mode中，手動調節(jié)焦距找測量
點ο所述用 Rairnn Application Center 軟件分析處理為 Hot Pixel DisablecUAuto Baseline、Manual Baseline、MBL Normalized、Peak Search、Plot Editor 。所述水浴旋轉蒸發(fā)儀蒸干為水浴溫度低于63°C時的負壓蒸發(fā)。拉曼圖譜中拉曼峰出現(xiàn)為峰強大于背景噪聲強度的3倍，即信噪比>3。拉曼圖譜中拉曼峰相同為拉曼位移相差妄6 cm—1。
所述分析樣品拉曼圖譜是指畜禽肉樣出現(xiàn)DES主要特征峰，而空白對照樣未出 現(xiàn)DES主要特征峰，為不合格；畜禽肉樣未出現(xiàn)DES主要特征峰，而加標對照樣出現(xiàn)DES主 要特征峰，為合格；但加標樣中出現(xiàn)DES主要特征峰比加標對照樣出現(xiàn)DES主要特征峰強， 為可疑。本發(fā)明與現(xiàn)有的己烯雌酚檢測方法相比，利用拉曼光譜檢測法簡便、快速、無損以 及“指紋鑒定”的特點，采用顯微共焦拉曼光譜檢測方法，首次獲得了己烯雌酚的標準拉曼 譜圖及相關信息，建立了一種檢測畜禽肉中己烯雌酚的方法。首先，此方法有效靈敏，能夠 通過與標準圖譜中特征峰比對分析能對樣品中己烯雌酚進行檢測判斷，所需樣品量少；其 次，此方法快速簡便，檢測過程操作簡單，掃描時間為幾秒至幾十秒，一般十分鐘就能對譜 圖分析得出結果，避免了常規(guī)化學分析操作步驟繁瑣、成本高、耗時長等不足。


圖1為己烯雌酚標準拉曼圖譜
具體實施例方式
本發(fā)明采用歐普圖斯光學納米科技有限公司出品的RamTracer-200-WF-B多功能拉曼 光譜檢測儀，光學分辨率仂側1 ；波長:785nm ；光譜范圍:250 2400cm—1 ；功率范圍0 300mff ；主要特點有生化物品的光譜指紋辨識，實時非侵入與非破壞性檢測，高探測靈敏 度，便攜小型化系統(tǒng)，快速檢測，無消耗性化學廢棄物，簡便操作。同時采用Raman Application Center軟件進行系統(tǒng)參數(shù)設定和譜圖分析通過掃 描參數(shù)的設定，尋找最優(yōu)化檢測條件，選擇htegration=20S、Average=2、BOXCar=l，能自動 預掃描扣除背景值降低干擾，操作簡單；通過水平基線，突出峰型，便于特征峰的比對判斷； 利用軟件開放式標準圖庫，添加己烯雌酚標準拉曼譜圖進庫，在實際樣品檢測中進行比對 判定。樣品預處理方法勻漿、超聲萃取、分離提純、濃縮凈化、多次點樣，其中，多次點樣 中選用單凹磨邊載玻片，制樣后用于顯微共焦拉曼光譜檢測。參閱圖1，主要特征峰有635 cm-1, 814 cm-1, 1112 cm-1, 1259 cnT1，1636CHT1 ；據張 明生在激光光散射譜學中報道，結合己烯雌酚化學結構分析比對，拉曼譜圖主要特征峰表 征基團
權利要求
1.一種畜禽肉中己烯雌酚的檢測方法，其特征在于該方法包括以下具體步驟(1)測定己烯雌酚標準拉曼譜圖將己烯雌酚標準品粉末用顯微共焦拉曼光譜檢測儀檢測，激光發(fā)射波長為785nm，激光 輸出功率W為0 <W< 300mW，工作環(huán)境溫度為10 40°C，掃描參數(shù)積分時間為0 120s， 掃描次數(shù)平均值為1 10，濾波器平滑參數(shù)為1，尋找最大信號，得到己烯雌酚標準拉曼譜 圖；(2)制備畜禽肉樣品提取液將畜禽肉樣于絞肉器中攪成肉糜，稱取5. 00 20. OOg絞碎肉樣放入50mL具塞離心管 中，加入10. 00 40. OOmL甲醇，在渦流混勻器上劇烈混合成勻漿，超聲萃取20min，置振蕩 器中震蕩5min，于4500r/min離心lOmin，用尖嘴吸液管吸出上清液，殘渣再重復萃取一次， 合并上清液至蒸發(fā)瓶中，置于水浴旋轉蒸發(fā)儀上蒸干，然后加入10. 00 40. OOmL正己烷和 5. 00 20. OOmL乙腈，移至于漩渦振蕩器上震蕩lmin，棄去上層正己烷相，取下層乙腈相過 0. 2Mm有機膜，最后再水浴旋轉蒸發(fā)至近干，用乙腈0. 50 2. OOmL定容，于通風櫥中將提取 液同點多次點樣至單凹載玻片上揮發(fā)至干，備用；(3)制備其它樣品提取液按步驟(2)制備不含己烯雌酚的肉樣提取液樣品，作空白對照；按步驟(2)制備含10. 00μδ/5. OOg比例的己烯雌酚/空白畜禽肉的提取液樣品，作加 標對照；按步驟(2)制備含10. 00μδ/5. OOg比例的己烯雌酚/待測畜禽肉的提取液樣品，作加 標樣品；(4)對樣品的拉曼光譜檢測顯微共焦拉曼光譜檢測，激光輸出功率W為O < W < 300mW，關閉室內照明設備并在檢 測過程始終保持黑暗環(huán)境，單擊暗掃描采集參考暗點，保存暗流噪音，設置掃描參數(shù)積分時 間為O 120s，掃描次數(shù)平均值為1 10，濾波器平滑參數(shù)為1，依次將上述各樣品置于顯 微拉曼探頭下，選擇顯微鏡下視頻模式手動調節(jié)焦距找到測量點，單擊單詞掃描采集樣品 頻譜測量值，每點重復檢測3次，保存數(shù)據及圖像，然后分析樣品拉曼圖譜。
2.如權利要求1所述的畜禽肉中己烯雌酚的檢測方法，其特征在于所述標準拉曼譜 圖測得己烯雌酚特征峰頻率為O 2400CHT1，主要特征峰頻率為635 cm—1，814 cm—1，1112 cm 1J 1259 cm \ 1636cm \
3.如權利要求1所述的畜禽肉中己烯雌酚的檢測方法，其特征在于所述提取液同點多 次點樣采用0. 50 2. OOmL0
4.如權利要求1所述的畜禽肉中己烯雌酚的檢測方法，其特征在于所述分析樣品拉曼 圖譜是指畜禽肉樣出現(xiàn)己烯雌酚主要特征峰，而空白對照樣未出現(xiàn)己烯雌酚主要特征峰， 為不合格；畜禽肉樣未出現(xiàn)己烯雌酚主要特征峰，而加標對照樣出現(xiàn)己烯雌酚主要特征峰， 為合格；加標樣中出現(xiàn)己烯雌酚主要特征峰比加標對照樣出現(xiàn)己烯雌酚主要特征峰強，為 可疑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種畜禽肉中己烯雌酚的檢測方法，該方法包括測定己烯雌酚標準拉曼譜圖、制備畜禽肉樣品提取液、制備其它樣品提取液、對樣品的拉曼光譜檢測及分析樣品拉曼圖譜等步驟；本發(fā)明采用顯微共焦拉曼光譜檢測方法獲得了己烯雌酚的標準拉曼譜圖及相關信息，建立了一種檢測畜禽肉中己烯雌酚的方法，該方法有效靈敏，能夠通過與標準圖譜中特征峰比對分析能對樣品中己烯雌酚進行檢測判斷，所需樣品量少；快速簡便，檢測過程操作簡單，掃描時間為幾秒至幾十秒，一般十分鐘就能對譜圖分析得出結果，避免了常規(guī)化學分析操作步驟繁瑣、成本高、耗時長等不足。
文檔編號G01N21/65GK102147369SQ20111006716
公開日2011年8月10日 申請日期2011年3月21日 優(yōu)先權日2011年3月21日
發(fā)明者張金萍, 徐亞同, 朱文杰, 楊潔 申請人:華東師范大學