專利名稱：一種檢測乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移特征蛋白的質(zhì)譜試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移蛋白的檢測試劑，特別是用質(zhì)譜檢測乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移特征蛋白的試劑。
背景技術(shù)：
乳腺癌的發(fā)生是一個多基因突變導(dǎo)致抑癌基因失活、癌基因活化的過程。基因組學(xué)研究由于自身的限制難以完全闡明基因與蛋白質(zhì)參與過程及其具體作用，而近年來蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展為人們從整體上了解惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展提供了較為理想的技術(shù)平臺。目前臨床上對惡性腫瘤預(yù)后評估主要依賴于臨床表現(xiàn)、病理學(xué)及傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志(tumormarker)，但腫瘤早期復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移時常常無明顯臨床表現(xiàn)，而病理學(xué)證據(jù)很難得到且重復(fù)性差。乳腺癌在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率都比較高，在美國每年的新發(fā)乳腺癌病人占女性各種惡 性腫瘤的1/3。在我國乳腺癌發(fā)病率也已居女性各種惡性腫瘤前列。雖然對于乳腺癌的治療已經(jīng)取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，預(yù)防和早期發(fā)現(xiàn)仍是降低乳腺癌死亡率的有效途徑和提高患者成活率的關(guān)鍵。但目前的檢測方法敏感性和特異性均較低，已成為乳腺癌早期檢測的一個瓶頸。乳腺癌的高發(fā)病率和高死亡率使得人們不斷地尋求一種有效的早期檢測方法，臨床上僅以CA153 —種蛋白作為血清學(xué)檢測指標(biāo)在敏感性和特異性上是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足的，而影象學(xué)檢測一旦發(fā)現(xiàn)占位病變則已經(jīng)不是很早期了。能夠使疾病在發(fā)生的極早期就能夠得已發(fā)現(xiàn)，并得到控制和治療，進(jìn)而大大提高治愈率或明顯改善病人的預(yù)后和生活質(zhì)量。近年來隨著臨床蛋白質(zhì)組學(xué)的開展，使得乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)成為可能。蛋白質(zhì)的分離技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用分離技術(shù)有兩個目的。第一、通過將蛋白質(zhì)的混合物分離成單一蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)小組以簡化復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物；第二、通過標(biāo)記的方法可以比較兩個蛋白質(zhì)的混合物樣品中蛋白質(zhì)的不同表現(xiàn)。其中主要的技術(shù)有雙向電泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)、高效液相層析(high-performanceliquid chromatography, HPLC)> 毛細(xì)管電泳(capillaryelectrophoresis, CE)、親和層析(affinity choromatography)、蛋白芯片(proteinmicroarray)、磁性微球(magneticbeads,簡稱磁珠)和免疫組等。特別是蛋白芯片和磁珠兩項(xiàng)新的蛋白指紋圖譜技術(shù)克服了以往技術(shù)的缺點(diǎn)，具有高靈敏度、高通量、結(jié)果重復(fù)性好、可機(jī)械化操作和方法靈活等特點(diǎn)。待測樣品來源廣泛，不需作特殊前處理，可以直接點(diǎn)樣檢測，如血清、尿液及組織液等；檢測快速，一般一例標(biāo)本的檢測時間僅需約5分鐘，從標(biāo)本制備到出結(jié)果全過程僅約I小時。蛋白芯片和磁珠兩項(xiàng)新的蛋白指紋圖譜技術(shù)有可能在體液中潛在生物標(biāo)志(biomarker)檢測方面創(chuàng)造革命性突破(許洋，蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)在實(shí)驗(yàn)診斷與臨床醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，27 :134-142 ;Wang QT, etal.Constructionof a multiple myeloma diagnostic model by magnetic bead-basedMALDI-T0F massspectrometry of serum and pattern recognition software.AnatRec (Hoboken). 2009 :292 :604-610)。二維電泳2_DE最先被用于臨床蛋白組學(xué)研究，但其對疏水性、強(qiáng)酸性和強(qiáng)鹼性蛋白的分辯率不夠，而且不能檢測低豐度蛋白，故實(shí)用價值受限。近來，蛋白芯片與質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合，已被成功地用于腫瘤研究；但由于磁珠表面的結(jié)合面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蛋白芯片，從而磁珠的靈敏性比蛋白芯片更高(劉建棟等，血液蛋白質(zhì)組與質(zhì)譜儀檢測流程標(biāo)準(zhǔn)化初探?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007,27 :193-197)。磁珠具有優(yōu)于二維電泳、蛋白芯片和其他質(zhì)譜方法的特點(diǎn)，已被廣泛地用于腫瘤等生物標(biāo)志的篩查等研究(屠世良等，癌胚抗原陰性結(jié)直腸癌的檢測和結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)生物標(biāo)志，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007 ;顏懷軍等，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對脂肪肝患者血清標(biāo)志物的篩選.世界華人消化雜志2008，16 =3904-3909)。該技術(shù)具有操作簡便、無需離心樣品、可直接分析原始生物樣本(如血清、尿液等)、樣本用量小等特點(diǎn)，同時適合多樣品平行檢測和直接進(jìn)行蛋白質(zhì)全景式的搜索和分析，特別是對小分子量蛋白和低豐度蛋白具有較高的捕獲效果，可以與其他蛋白質(zhì)組學(xué)方法互補(bǔ)，目前已被廣泛地用于腫瘤標(biāo)志的篩查和臨床檢測，并均已獲得很好的結(jié)果。但國內(nèi)迄今尚無采用磁珠與液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(liquid chromatographymassspectrometry, LC-MS)獲得檢測乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移血清特征蛋白的報道。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的優(yōu)勢為測定蛋白的質(zhì)荷比m/z的精確度要比激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)高，質(zhì)荷比 m/z 誤差< 0. 001%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的檢測乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的方法和試劑，通過建立檢測乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移特征蛋白的優(yōu)化質(zhì)譜模型，提供用質(zhì)譜法檢測乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移特征蛋白的試劑。本發(fā)明通過能與蛋白質(zhì)結(jié)合的磁珠基質(zhì)去捕獲生物標(biāo)志，并用有定量控制的質(zhì)譜分析來檢測乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移生物標(biāo)志。本發(fā)明建立了一種檢測乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的血清蛋白質(zhì)譜模型，其特征在于包括選自51個特征蛋白中任意兩個或兩個以上蛋白；所述特征蛋白質(zhì)荷比m/z和臨界峰值均值 K 分別為 m/z = 5643, K ^ 5. 84 ；m/z = 4651, K ^ 11. 28 ；m/z = 2377, K > 6. 19 ；m/z =2240，K > 9. 35 ；m/z誤差< 0. 001 %，臨界峰值均值K的變異系數(shù)CV < 5 10%。從血清中篩選出51蛋白作為特征蛋白；選取上述51個特征蛋白中的任意兩個或兩個以上的蛋白，根據(jù)各蛋白質(zhì)峰的質(zhì)荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值K，建立了乳腺癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和乳腺癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者兩兩鑒別的血清特征蛋白檢測質(zhì)譜模型。上述質(zhì)譜模型是采用以下步驟制備而得的1)4°C條件下2小時內(nèi)收集乳腺癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和乳腺癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的血清兩組血清標(biāo)本，在-80°C低溫冷凍備用；2)采用WCX陰離子基質(zhì)磁珠或C8及C18疏水基質(zhì)磁珠對所述兩組血清標(biāo)本的蛋白進(jìn)行吸附；3)用電噴霧電離已洗脫的血清蛋白后用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對結(jié)合在表面的WCX陰離子基質(zhì)磁珠或C8及C18疏水基質(zhì)磁珠上的兩組血清蛋白進(jìn)行讀取，由此獲得兩組蛋白質(zhì)譜圖譜；4)在每次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集前，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白及質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控0型血清校正儀器，使蛋白質(zhì)分子量誤差< 0. 001%和臨界峰值均值K的變異系數(shù)CV < 5 10%，并精確地、定量地收集乳腺癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和乳腺癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者優(yōu)化的血清質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)；5)對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，根據(jù)乳腺癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和乳腺癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清之間蛋白峰的差異，檢測出2組血清蛋白質(zhì)譜圖譜之間有51個穩(wěn)定的差異蛋白及其臨界峰值；將所述51個差異蛋白作為乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)譜模型的特征蛋白；6)選取所述51個特征蛋白中任意兩個或兩個以上的蛋白，以各蛋白質(zhì)峰的質(zhì)荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值K構(gòu)成用于檢測乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移血清特征蛋白質(zhì)譜模型；其中所述的特異蛋白質(zhì)所述特征蛋白質(zhì)荷比m/z和臨界峰值均值K分別為m/z =5643，K ^ 5. 84 ；m/z = 4651，K ( 11. 28 ；m/z = 2377，K > 6. 19 ；m/z = 2240，K > 9. 35 ；m/z誤差< 0. 001 %，臨界峰值均值K的變異系數(shù)CV < 5 10%。具體操作步驟如下
1)4°C條件下2小時內(nèi)收集經(jīng)病理明確診斷的乳腺癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清及經(jīng)病理確定為乳腺癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的血清作為兩組血清標(biāo)本，進(jìn)行_80°C低溫冷凍備用；病人血清樣本隨后被分成兩組一組為訓(xùn)練集，另一組為盲測組；2)采用陰離子基質(zhì)磁珠或C8及C18疏水基質(zhì)磁珠對所述乳腺癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和乳腺癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的兩組血清標(biāo)本的蛋白進(jìn)行吸附；3)用電噴霧電離已洗脫的生物標(biāo)志后，用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對結(jié)合在表面的WCX陰離子基質(zhì)磁珠或C8及C18疏水基質(zhì)磁珠上的兩組血清蛋白進(jìn)行讀取，設(shè)定最高檢測分子量為30kDa，優(yōu)化分子量范圍1000 17000Da，最佳聚集中心9000Da，數(shù)據(jù)采集參數(shù)范圍20 80，激光強(qiáng)度150 180，檢測敏感度為7 8，收集總數(shù)為100次，由此獲得兩組蛋白質(zhì)譜圖譜；4)在每次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集前，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白及質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控0型血清校正儀器，用2746±lDa、5909±lDa、6634±lDa標(biāo)準(zhǔn)峰為質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)定性(分子量)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，使m/z誤差< 0. 001%，從而獲得的精確的蛋白質(zhì)譜圖譜；5)定量性質(zhì)譜調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634. ODa等強(qiáng)度調(diào)至50%信號強(qiáng)度的最大值，使臨界峰值均值K的變異系數(shù)CV < 5 10%，并收集精確的質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)；6)對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行Mann-Whitney U檢驗(yàn)統(tǒng)計學(xué)處理，根據(jù)乳腺癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和乳腺癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清之間蛋白峰值的差異(認(rèn)定P值小于0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義)，檢測出2組血清蛋白指紋質(zhì)譜圖譜之間有51個穩(wěn)定的差異蛋白，見表I :表I乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和對照組的51個差異峰
權(quán)利要求
1.一種用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的方法檢測人體血清樣品中特異蛋白的試劑，其特征在干特異蛋白是乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的蛋白，含有能與特異蛋白質(zhì)結(jié)合的磁珠基質(zhì)，所述磁珠是可吸附樣品中蛋白質(zhì)的WCX陰尚子基質(zhì)磁珠或C8及C18疏水基質(zhì)磁珠。
2.一種檢測試劑盒，其特征在于含有試劑盒操作方法的說明書； 含有陽性對照與陰性對照，所述對照可用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析； 將待檢樣品中相應(yīng)蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比及該蛋白的臨界峰值均值K與所述選自51個特征蛋白中任意兩個或兩個以上蛋白逐一進(jìn)行對比分析，所述特征蛋白質(zhì)荷比m/z和臨界峰值均值 K 分別為 m/z = 5643，K ≤ 5. 84 ；m/z = 4651，K ^ 11. 28 ；m/z = 2377，K > 6. 19 ；m/z = 2240，K > 9. 35 ;質(zhì)荷比m/z誤差< O. 001 %，臨界峰值均值K的變異系數(shù)CV < 5 10%。
3.人體血清樣品中特異蛋白的試劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)4°C條件下2小時內(nèi)收集乳腺癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和乳腺癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的兩組血清祥品，在-80°C低溫冷凍備用； 2)采用WCX陰離子基質(zhì)磁珠或C8及C18疏水基質(zhì)磁珠對所述兩組血清樣品的蛋白進(jìn)行吸附； 3)用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對結(jié)合在表面的WCX陰離子基質(zhì)磁珠或C8及C18疏水基質(zhì)磁珠上的兩組血清蛋白進(jìn)行讀取，由此獲得兩組蛋白質(zhì)譜圖譜； 4)在毎次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集前，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白及質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控O型血清樣品校正儀器，使質(zhì)荷比m/z誤差< O. 001%和臨界峰值均值K的變異系數(shù)CV < 5 10%，并精確地、定量地收集乳腺癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和乳腺癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者優(yōu)化的血清質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)； 5)對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，根據(jù)乳腺癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和乳腺癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者兩組血清樣品之間蛋白峰的差異，檢測出兩組血清蛋白質(zhì)譜圖譜之間有51個穩(wěn)定的差異蛋白及其臨界峰值； 6)將待檢樣品中相應(yīng)蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比及該蛋白的臨界峰值均值K與所述選自51個特征蛋白中任意兩個或兩個以上蛋白逐一進(jìn)行對比分析，所述特征蛋白質(zhì)荷比m/z和臨界峰值均值 K 分別為 m/z = 5643，K 彡 5. 84 ；m/z = 4651，K ^ 11. 28 ；m/z = 2377，K > 6. 19 ；m/z = 2240，K > 9. 35 ;質(zhì)荷比m/z誤差< O. 001%，臨界峰值均值K的變異系數(shù)CV < 5 10%。
4.權(quán)利要求3所述的人體血清樣品中特異蛋白的試劑的制備方法，其特征在于將待檢樣品中相應(yīng)蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比及該蛋白的臨界峰值均值K與所述選自51個特征蛋白中任意兩個或兩個以上蛋白逐一進(jìn)行對比分析。
5.權(quán)利要求4所述的人體血清樣品中特異蛋白的試劑的制備方法，其特征在于所述待檢樣品中相應(yīng)蛋白是質(zhì)荷比為5643、4651、2377、2240的特征蛋白。
全文摘要
本發(fā)明建立了一種檢測乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的血清蛋白質(zhì)譜模型，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的血清蛋白中具有51個特征蛋白，選取其中任意兩個或兩個以上蛋白，并用質(zhì)譜分析，可檢測乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本發(fā)明根據(jù)所述質(zhì)譜模型，開發(fā)了用質(zhì)譜方法檢測血清中特異蛋白的試劑和試劑盒。
文檔編號G01N30/72GK102692471SQ201110068949
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月22日
發(fā)明者徐建華, 毛偉敏, 許洋 申請人:許洋