專(zhuān)利名稱(chēng)：二氧化碳結(jié)合力的檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種二氧化碳結(jié)合力的檢測(cè)方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
二氧化碳結(jié)合力指血漿中碳酸氫根所含的二氧化碳的含量。血清或血漿中二氧化碳結(jié)合力含量測(cè)定是臨床生化檢驗(yàn)的常規(guī)項(xiàng)目，測(cè)定二氧化碳結(jié)合力可以了解人體內(nèi)酸堿平衡的情況。呼吸性酸中毒，(肺氣腫、肺纖維化)、呼吸肌麻痹、支氣管擴(kuò)張、氣胸及呼吸道阻塞；代謝性堿中毒，例如嘔吐、腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)、缺鉀及服用堿性藥物過(guò)多等都會(huì)引起酸堿中毒，從而使二氧化碳結(jié)合力增高；代謝性酸中毒，例如尿毒癥、休克、糖尿酮癥、嚴(yán)重腹瀉及脫水；呼吸性堿中毒，例如呼吸中樞及呼吸加快等會(huì)引起二氧化碳結(jié)合力降低。因此，測(cè)定血清或血漿中的二氧化碳結(jié)合力含量，是輸液療法糾正失衡的重要指標(biāo)，對(duì)治療有重要意義。目前，測(cè)定二氧化碳結(jié)合力的方法包括PH電極測(cè)定法、酸堿清空法和量壓法等， 量壓法主要是采用瓦式呼吸機(jī)進(jìn)行測(cè)定，即根據(jù)樣品中的碳酸氫根與乳酸作用生成二氧化碳，在密閉的環(huán)境下，測(cè)定出二氧化碳的體積從而測(cè)算出碳酸氫根的含量，從而得到二氧化碳結(jié)合力。但是，上述方法測(cè)定操作誤差較大，測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度不高，很難作為醫(yī)院常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目開(kāi)展。隨著各種半、全自動(dòng)生化分析儀的普遍應(yīng)用，近年來(lái)普遍采用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)偶聯(lián)的速率法(簡(jiǎn)稱(chēng)PEPC法)測(cè)定二氧化碳結(jié)合力。其反應(yīng)原理為碳酸氫根與磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用下生成草酰乙酸和磷酸；草酰乙酸與還原型輔酶在蘋(píng)果酸脫氫酶的作用下生成蘋(píng)果酸和氧化型輔酶。在PEPC法中，通過(guò)測(cè)定還原型輔酶的用量，測(cè)定碳酸氫根的含量，從而得到二氧化碳結(jié)合力。但是，空氣中二氧化碳會(huì)與還原型輔酶發(fā)生反應(yīng)，從而造成還原型輔酶下降； 此外，待檢測(cè)樣品中內(nèi)源性物質(zhì)的增高，例如某些疾病會(huì)使血乳酸增高，從而使樣品中乳酸脫氫酶含量增加，由于乳酸脫氫酶的作用，使還原型輔酶下降，影響檢測(cè)二氧化碳結(jié)合力的準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種二氧化碳結(jié)合力的檢測(cè)方法和試劑盒，該檢測(cè)方法能夠準(zhǔn)確檢測(cè)二氧化碳結(jié)合力。本發(fā)明提供了一種二氧化碳結(jié)合力的檢測(cè)方法，包括步驟a)提供二氧化碳結(jié)合力的待檢測(cè)樣品；步驟b)將所述待檢測(cè)樣品與檢測(cè)液混合，反應(yīng)，得到反應(yīng)液，所述檢測(cè)液包括PH 值為4. 8 5. 2的Tris-HCl緩沖液、氯化鈉、碳酸酐酶和顯色劑；
步驟c)檢測(cè)步驟b)得到的反應(yīng)液在540 550nm波長(zhǎng)下的吸光度值，計(jì)算得到
二氧化碳結(jié)合力。優(yōu)選的，所述待檢測(cè)樣品為血 清或肝素抗凝血漿。優(yōu)選的，所述Tris-HCl緩沖液的濃度為10 50mmol/L。優(yōu)選的，所述檢測(cè)液中氯化鈉的濃度為150 160mmol/L。優(yōu)選的，所述檢測(cè)液中碳酸酐酶的濃度為3000 5000U/L。優(yōu)選的，所述檢測(cè)液中顯色劑的濃度為120 500mg/L。優(yōu)選的，所述檢測(cè)液還包括聚乙二醇6000、白蛋白和氯化鈉。本發(fā)明還提供一種試劑盒，包括pH值為4. 8 5. 2的Tris-HCl緩沖液、氯化鈉、碳酸酐酶和顯色劑。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述碳酸酐酶的濃度為3500 4500U/L。優(yōu)選的，還包括標(biāo)準(zhǔn)液，所述標(biāo)準(zhǔn)液為40g/L的牛血白蛋白和26mmol/L的碳酸氫鈉。從上述的技術(shù)方案可以看出，本發(fā)明提供一種二氧化碳結(jié)合力的檢測(cè)方法和試劑盒，該檢測(cè)方法包括將二氧化碳結(jié)合力的待檢測(cè)樣品與檢測(cè)液混合，反應(yīng)，得到反應(yīng)液，所述檢測(cè)液包括PH值為4. 8 5. 2的Tris-HCl緩沖液、氯化鈉、碳酸酐酶和顯色劑；檢測(cè)所述反應(yīng)液在540 550nm波長(zhǎng)下的吸光度值，計(jì)算得到二氧化碳結(jié)合力。在檢測(cè)過(guò)程中，所述待檢測(cè)樣品中的二氧化碳在碳酸酐酶的作用下生成碳酸氫根，從而使反應(yīng)液的PH值升高，顯色劑顯色，然后通過(guò)檢測(cè)所述反應(yīng)液的吸光度值，計(jì)算得到二氧化碳結(jié)合力。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用顯色反應(yīng)，無(wú)需使用還原型輔酶，檢測(cè)的二氧化碳結(jié)合力具有很好的準(zhǔn)確性。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明提供一種二氧化碳結(jié)合力的檢測(cè)方法，包括步驟a)提供二氧化碳結(jié)合力的待檢測(cè)樣品；步驟b)將所述待檢測(cè)樣品與檢測(cè)液混合，反應(yīng)，得到反應(yīng)液，所述檢測(cè)液包括PH 值為4. 8 5. 2的Tris-HCl緩沖液、氯化鈉、碳酸酐酶和顯色劑；步驟c)檢測(cè)步驟b)得到的反應(yīng)液在540 550nm波長(zhǎng)下的吸光度值，計(jì)算得到
二氧化碳結(jié)合力。本發(fā)明中，所述Tris-HCl緩沖液的濃度優(yōu)選為10 50mmol/L，更優(yōu)選為20 30mmol/L，最優(yōu)選為30mmol/L。所述檢測(cè)液中氯化鈉的濃度優(yōu)選為150 160mmol/L，更優(yōu)選為152 158mmol/L，更優(yōu)選為154mmol/L。所述檢測(cè)液中碳酸酐酶的濃度優(yōu)選為3000 5000U/L，更優(yōu)選為3800 4200U/L，最優(yōu)選為3900 4100U/L。所述檢測(cè)液中顯色劑的濃度優(yōu)選為120 500mg/L，更優(yōu)選為150 300mg/L，最優(yōu)選為180 250mg/L。本發(fā)明采用的顯色劑優(yōu)選為質(zhì)量比為7 3 10的酚紅、溴百里香酚藍(lán)和氯化鈉的混合物。所述檢測(cè)液還包括穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑的濃度優(yōu)選為10 14g/L，更優(yōu)選為11 13g/L，最優(yōu)選為11 12g/L。本發(fā)明所述穩(wěn)定劑優(yōu)選為質(zhì)量比為1 1 10的聚乙二醇6000、白蛋白和氯化鈉的混合物。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法采用的標(biāo)準(zhǔn)液優(yōu)選為40g/L的牛血白蛋白和 26mmol/L的碳酸氫鈉。本發(fā)明提供的二氧化碳結(jié)合力的檢測(cè)方法為碳酸酐酶比色法，通過(guò)待檢測(cè)樣品與試劑盒混合發(fā)生的反應(yīng)，引起PH變化，顯色劑顯色，然后利用紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀，檢測(cè)所述反應(yīng)液在540 550nm波長(zhǎng)下的吸光度值，計(jì)算得到二氧化碳結(jié)合力。本發(fā)明提供的二氧化碳結(jié)合力的檢測(cè)方法測(cè)定速度快，并且，由于所述檢測(cè)液呈弱酸性，不易吸收空氣中的二氧化碳，抗干擾能力強(qiáng)。此外，即使所述試劑盒吸收了少量空氣中的二氧化碳，本發(fā)明可以通過(guò)對(duì)檢測(cè)液的空白測(cè)定，避免對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，保證了測(cè)定準(zhǔn)確度；并且，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法無(wú)需反復(fù)定標(biāo)，使用方便。本發(fā)明提供的二氧化碳結(jié)合力的檢測(cè)方法的檢測(cè)原理為本發(fā)明所述待檢測(cè)樣品優(yōu)選為無(wú)溶血、無(wú)乳糜的血清或肝素抗凝血漿。由于所述待檢測(cè)樣品中的堿度主要是碳酸鹽緩沖系統(tǒng)，其中以碳酸氫根為主，其次是碳酸和碳酸根，在PH為5左右的弱酸性介質(zhì)中， 碳酸和碳酸根轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水。利用本發(fā)明提供的二氧化碳結(jié)合力的檢測(cè)方法檢測(cè)待檢測(cè)樣品中的二氧化碳結(jié)合力時(shí)，待檢測(cè)樣品中的二氧化碳在碳酸酐酶的作用下生成碳酸氫根，生成的碳酸氫根使反應(yīng)液的PH值升高，顯色劑顯色。原試劑盒在pH值5以下時(shí)為黃色，由于碳酸氫根含量越高顯色就越深，當(dāng)PH值升高時(shí)反應(yīng)液由黃色變?yōu)樽霞t色。所述反應(yīng)液的最佳吸收波長(zhǎng)為540 550nm，優(yōu)選為546nm。將最終反應(yīng)液置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，在540 550nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值大小。通過(guò)吸光度值與碳酸氫根含量的正比關(guān)系，測(cè)算得到二氧化碳結(jié)合力的含量。檢測(cè)原理具體為碳酸+氫氧根一水+ 二氧化碳二氧化碳和水在碳酸酐酶作用下生成氫離子和碳酸氫根本發(fā)明還公開(kāi)一種試劑盒，包括pH值為4. 8 5. 2的Tris-HCl緩沖液、氯化鈉、碳酸酐酶和顯色劑。本發(fā)明中，所述Tris-HCl緩沖液的濃度優(yōu)選為10 50mmol/L，更優(yōu)選為20 30mmol/L，最優(yōu)選為30mmol/L。所述氯化鈉的濃度優(yōu)選為150 160mmol/L，更優(yōu)選為 152 158mmol/L，更優(yōu)選為154mmol/L。所述碳酸酐酶的濃度優(yōu)選為3000 5000U/L，更優(yōu)選為3800 4200U/L，最優(yōu)選為3900 4100U/L。所述顯色劑的濃度優(yōu)選為120 500mg/ L，更優(yōu)選為150 300mg/L，最優(yōu)選為180 250mg/L。本發(fā)明采用的顯色劑優(yōu)選為質(zhì)量比為7 3 10的酚紅、溴百里香酚藍(lán)和氯化鈉的混合物。所述檢測(cè)液還包括穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑的濃度優(yōu)選為10 14g/L，更優(yōu)選為11 13g/L，最優(yōu)選為11 12g/L。本發(fā)明所述穩(wěn)定劑優(yōu)選為質(zhì)量比為1 1 10的聚乙二醇6000、白蛋白和氯化鈉的混合物。按照本發(fā)明，還包括標(biāo)準(zhǔn)液，所述標(biāo)準(zhǔn)液為40g/L的牛血白蛋白和^mmol/L的碳酸氫鈉。本發(fā)明提供的試劑盒可以為單一試劑，也可以為雙試劑。例如，將Tris-HCl緩沖液、氯化鈉溶液、碳酸酐酶和顯色劑制成單一試劑；或者，將Tris-HCl緩沖液和氯化鈉制成第一試劑，將碳酸酐酶、顯色劑、穩(wěn)定劑制成第二試劑，在利用該試劑盒檢測(cè)二氧化碳結(jié)合力時(shí)，將第一試劑與第二試劑混合，從而檢測(cè)待檢測(cè)樣品中的二氧化碳結(jié)合力。
本發(fā)明提供的試劑盒優(yōu)選按照如下方法制備按30mmol/L稱(chēng)取Tris加蒸餾水溶解，用IN的HCl調(diào)pH至4. 8 5. 2，加入氯化鈉、碳酸酐酶及顯色劑，混合。將得到的混合溶液分裝入瓶。本發(fā)明可以通過(guò)對(duì)所述分裝入瓶的混合溶液進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑， 所述干粉試劑在使用前需用蒸餾水復(fù)溶；可以直接制備得到液體試劑，便于直接使用。為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，這些描述只是為進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)，而不是對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求的限制。實(shí)施例1試劑盒的配制按30mmol/L稱(chēng)取Tris加蒸餾水溶解，用IN的HCl調(diào)pH至4. 8 5. 2，分別加入氯化鈉、碳酸酐酶和顯色劑，得到混合溶液，將所述混合溶液分裝入瓶，冷凍干燥，得到干粉試劑，所述混合溶液中包括以下成分
Tris-HCl 緩沖液30mmol/L
氯化鈉154mmol/L
碳酸酐酶5000U/L
質(zhì)量比為7: 3: 10的酚紅、溴百里香酚藍(lán)和氯化鈉200mg/L將40g/L的牛血白蛋白和^mmol/L的碳酸氫鈉混合，得到標(biāo)準(zhǔn)液。實(shí)施例2將實(shí)施例1制備的試劑盒與蒸餾水混合，靜置10分鐘，得到檢測(cè)試劑；將血清、實(shí)施例1制備的標(biāo)準(zhǔn)液與上述制備的檢測(cè)試劑分別置于全自動(dòng)生化分析儀的樣品盤(pán)和試劑盤(pán)中，儀器自動(dòng)按設(shè)定參數(shù)8μ 1樣品和240 μ 1檢測(cè)試劑取樣，混合，反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液，在37°c下，孵育時(shí)間為300秒，檢測(cè)546nm波長(zhǎng)下的吸光度值，根據(jù)計(jì)算公式C#=A#/AfeXCfe(26mmol/L)，測(cè)算出二氧化碳結(jié)合力的濃度大小，其中C#為被測(cè)樣本濃度；A#為樣本吸光度值；Cfe為標(biāo)準(zhǔn)液濃度(已知)為標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值。實(shí)施例3試劑盒的配制制備第一試劑按30mmol/L稱(chēng)取Tris加蒸餾水溶解，用IN的HCl調(diào)pH至4. 8 5. 2，加入氯化鈉，得到第一試劑。制備第二試劑用4%的牛血白蛋白溶液溶解碳酸酐酶，用50%甲醇溶解顯色劑，然后加入蒸餾水和穩(wěn)定劑，得到第二試劑。所述第一液體試劑與所示第二液體試劑中成分如下Tris-HCl 緩沖液30mmol/L
氯化鈉154mmol/L
碳酸酐酶5000U/L
質(zhì)量比為7: 3: 10的酚紅、溴百里香酚藍(lán)和氯化鈉 200mg/L 質(zhì)量比為1: 1: 10的聚乙二醇6000、白蛋白和氯化鈉 12g/L制備標(biāo)準(zhǔn)液將40g/L的牛血白蛋白和26mmol/L的碳酸氫鈉混合，得到標(biāo)準(zhǔn)液。實(shí)施例4將肝素抗凝血漿、實(shí)施例3制備的標(biāo)準(zhǔn)液、第一試劑、第二試劑分別置于全自動(dòng)生化分析儀的樣品盤(pán)和試劑盤(pán)中，儀器自動(dòng)按設(shè)定參數(shù)8μ 1樣品和200 μ 1第一試劑、40 μ 1 第二試劑取樣，混合，反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液，在37°C下，孵育時(shí)間為300秒，檢測(cè)546nm波長(zhǎng)下的吸光度值，根據(jù)計(jì)算公式C#=A#/Afe XCfe，從而測(cè)算出二氧化碳結(jié)合力的濃度大小，其中工#為被測(cè)樣本濃度；A#為樣本吸光度值為標(biāo)準(zhǔn)液濃度為標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值。如表1所示，為本發(fā)明檢測(cè)二氧化碳結(jié)合力的測(cè)定參數(shù)。表1碳酸酐酶比色法測(cè)定參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種二氧化碳結(jié)合力的檢測(cè)方法，其特征在于，包括 步驟a)提供二氧化碳結(jié)合力的待檢測(cè)樣品；步驟b)將所述待檢測(cè)樣品與檢測(cè)液混合，反應(yīng)，得到反應(yīng)液，所述檢測(cè)液包括PH值為 4. 8 5. 2的Tris-HCl緩沖液、氯化鈉、碳酸酐酶和顯色劑；步驟c)檢測(cè)步驟b)得到的反應(yīng)液在540 550nm波長(zhǎng)下的吸光度值，計(jì)算得到二氧化碳結(jié)合力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述待檢測(cè)樣品為血清或肝素抗凝血漿。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述Tris-HCl緩沖液的濃度為10 50mmol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)液中氯化鈉的濃度為150 160mmol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)液中碳酸酐酶的濃度為 3000 5000U/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)液中顯色劑的濃度為120 500mg/Lo
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)液還包括聚乙二醇6000、白蛋白和氯化鈉。
8.一種試劑盒，其特征在于，包括PH值為4. 8 5. 2的Tris-HCl緩沖液、氯化鈉、碳酸酐酶和顯色劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述碳酸酐酶的濃度為3500 4500U/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括標(biāo)準(zhǔn)液，所述標(biāo)準(zhǔn)液為40g/L的牛血白蛋白和^mmol/L的碳酸氫鈉。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種二氧化碳結(jié)合力的檢測(cè)方法和試劑盒，該檢測(cè)方法包括將二氧化碳結(jié)合力的待檢測(cè)樣品與檢測(cè)液混合，反應(yīng)，得到反應(yīng)液，所述檢測(cè)液包括pH值為4.8～5.2的Tris-HCl緩沖液、氯化鈉、碳酸酐酶和顯色劑；檢測(cè)所述反應(yīng)液在540～550nm波長(zhǎng)下的吸光度值，計(jì)算得到二氧化碳結(jié)合力。在檢測(cè)過(guò)程中，所述待檢測(cè)樣品中的二氧化碳在碳酸酐酶的作用下生成碳酸氫根，從而使反應(yīng)液的pH值升高，顯色劑顯色，然后通過(guò)檢測(cè)所述反應(yīng)液的吸光度值，計(jì)算得到二氧化碳結(jié)合力。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用顯色反應(yīng)，無(wú)需使用還原型輔酶，檢測(cè)的二氧化碳結(jié)合力具有很好的準(zhǔn)確性。
文檔編號(hào)G01N21/78GK102156126SQ20111007223
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者董理 申請(qǐng)人:董理