專利名稱：檢測(cè)慢性乙肝肝纖維化血清n-糖組峰標(biāo)記的方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及肝纖維化血清N-糖組峰標(biāo)記，具體涉及檢測(cè)慢性乙肝肝纖維化血清N-糖組峰標(biāo)記的方法及其用途。
背景技術(shù)：
長期以來，肝穿刺活檢一直是明確肝病病因、評(píng)價(jià)肝臟炎癥壞死及纖維化程度的金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)預(yù)后判斷、治療選擇及療效評(píng)估等具有重要臨床意義，但創(chuàng)傷性、取樣誤差、觀察者自身及觀察者間偏倚等不足給臨床應(yīng)用造成許多不便。目前臨床診療中迫切需要尋找便捷的非創(chuàng)傷性替代指標(biāo)。近年來，以血清指標(biāo)組合建立肝纖維化診斷模型成為世界性的研 究熱點(diǎn)。在一系列肝纖維化非創(chuàng)傷性診斷模型中，較具代表性的包括采用慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染患者建模的Fibrotest、Forns指數(shù)、APRI指數(shù)和IfepascoreL等。目前針對(duì)慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的肝纖維化診斷模型仍研究較少，主要有上海市肝纖維化課題協(xié)作組(SLFG)所提出的Zeng模型M和我國香港的Hui模型。然而上述研究結(jié)果在我國慢性HBV感染患者中尚未得到有效驗(yàn)證和臨床應(yīng)用。目前國內(nèi)外采用肝活組織檢查+病理學(xué)診斷結(jié)果作為肝纖維化分期診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，屬于有創(chuàng)傷性的診斷方法，因此其臨床應(yīng)用受局限。研究報(bào)道，血清學(xué)檢測(cè)方法漸成為臨床非創(chuàng)傷性肝纖維化診斷的有效方法之一，具有較好的應(yīng)用前景。目前血清肝纖維化診斷峰標(biāo)記研究方法主要包括蛋白和多肽組學(xué)、糖組學(xué)、miCToRNA芯片等技術(shù)。類似蛋白組學(xué)，“糖組學(xué)”指對(duì)糖組的全面分析研究，其對(duì)象主要針對(duì)糖蛋白。糖蛋白由多肽和糖通過糖肽鍵連接而成，根據(jù)連接方式的不同，可分為N-糖苷鍵和0-糖苷鍵等。已知肝細(xì)胞是除漿細(xì)胞外血清中糖蛋白的主要來源，肝臟還具有清除體內(nèi)異常糖基化蛋白的功能，因此，肝臟病變可以引起血清糖蛋白譜的變化，但聚糖結(jié)構(gòu)上高度的復(fù)雜性等因素給研究帶來很多困難。2001年Callewaert等提出了基于DNA測(cè)序儀的熒光糖電泳(DSA-FACE)技術(shù)，使對(duì)樣本的N-糖鏈進(jìn)行系統(tǒng)而快速的分析成為可能。該技術(shù)已被證實(shí)可用于肝硬化和肝細(xì)胞癌的診斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種檢測(cè)慢性乙型肝炎肝纖維化血清N-糖組峰標(biāo)記的方法，尤其涉及一種非創(chuàng)傷性檢測(cè)慢性乙肝肝纖維化血清N-糖組峰標(biāo)記的方法及其用途。本發(fā)明采用基于DNA測(cè)序儀的熒光糖電泳(DSA-FACE)技術(shù)檢測(cè)慢性HBV感染患者的N-糖組圖譜，分析其與肝纖維化的相關(guān)性并評(píng)價(jià)其診斷價(jià)值；所述的血清N-糖組峰標(biāo)記，作為一種非創(chuàng)傷性替代指標(biāo)，能高效預(yù)測(cè)慢性乙型肝炎肝纖維化的程度，對(duì)預(yù)后判斷、治療選擇及療效評(píng)估等具有現(xiàn)實(shí)的臨床意義。具體而言，本發(fā)明的檢測(cè)慢性乙肝肝纖維化血清N-糖組峰標(biāo)記的方法，其特征在于，采用DSA-FACE技術(shù)檢測(cè)慢性HBV感染患者血清樣本測(cè)得具有峰值的糖組圖譜，將峰值量化后，采用內(nèi)參校正后的數(shù)據(jù)，獲得非創(chuàng)傷性慢性乙型肝炎肝纖維化血清N-糖組峰標(biāo)記。本發(fā)明方法包括下述步驟
1)采集檢測(cè)血清樣本
入選條件有乙型肝炎或HBsAg陽性史超過6個(gè)月，現(xiàn)HBsAg和(或)HBVDNA仍為陽性
者；
以肝活檢病理學(xué)診斷明確纖維化程度，其中，so、SI期列為早期纖維化組，S3、S4期列為晚期纖維化組；
2)寡糖的釋放
2u I血清加入含有2iil緩沖液(10mmol/L NH4HC03)和3yl水的PCR反應(yīng)管中，95°C 加熱 5min 后 4°C放置 15min，加入 I PNGase F (2. 2U/U 1，pH8. 3,3. 33% NP40) 37°C孵育3h，4°C冷浴后加入100 ill水，標(biāo)記為D管；
3)寡糖的標(biāo)記
從D管吸取6 ii I溶液加入一新的PCR管中，開蓋60°C烘干60min,加入2 y I標(biāo)記溶液(20mmol/L 的 APTS 與 lmol/L 的 NaBH3CN 之比為 1:1)，37。。孵育 16h，加 200 水終止反應(yīng)，標(biāo)記為L管；
4)去唾液酸
從L管取2 ill溶液加入一新的P C R管中，加入3iU 0. 25mU去唾液酸酶在37°C孵育過夜，加160 u I水振蕩混勻，標(biāo)記為DE管；
5)片段分析
取DE管10 Ul溶液用ABI3130測(cè)序儀進(jìn)行片段分析，數(shù)據(jù)經(jīng)GeneScan軟件分析。6)將測(cè)得的具有峰值的糖組圖譜峰值量化，采用內(nèi)參校正后的數(shù)據(jù)，獲得慢性乙肝肝纖維化血清N-糖組峰標(biāo)記。本發(fā)明中，檢測(cè)的血清樣本選自2002年至2007年篩選行肝活檢的慢性HBV感染患者，入選條件按中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《慢性乙型肝炎防治指南》所規(guī)定的慢性HBV感染診斷標(biāo)準(zhǔn)，有乙型肝炎或HBsAg陽性史超過6個(gè)月，現(xiàn)HBsAg和(或)HBVDNA仍為陽性者；排除條件艾滋病毒或慢性丙肝病毒感染，飲酒量大于30g每日，代謝性或其它類型的肝損，患者已接受肝病治療，肝活檢組織不符合標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明中，符合標(biāo)準(zhǔn)的血清樣本病例為不同肝纖維化分期(Scheuer分期S0-S4期，每組平均10例病例)的慢性乙型肝炎肝纖維化病例，以肝活檢病理學(xué)診斷明確纖維化程度，將S0、SI期列為早期纖維化組，S3、S4期列為晚期纖維化組；
本發(fā)明中，所有檢測(cè)的血清樣本遵循Callewaert等制定的DSA-FACE技術(shù)規(guī)范，數(shù)據(jù)經(jīng)GeneScan軟件分析。本發(fā)明中，所述的N-糖組峰標(biāo)記血清標(biāo)本可采用動(dòng)靜脈、外周采血，或體液采集，漏出液或滲出液采集方式使用。本發(fā)明中，每份血清標(biāo)本均可測(cè)得具有10個(gè)峰左右的糖組圖譜，將峰值量化，最終采用內(nèi)參校正后的數(shù)據(jù)。本發(fā)明中，按患者為輕度纖維化組(S0-1)和明顯纖維化組(S2-4)，兩組血清N-糖組峰標(biāo)記圖譜峰各峰的均值比較，結(jié)果顯示，纖維化組第1、2、3、4、10峰的峰值升高，第5、8、11峰的峰值降低，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(如表I所示)。本發(fā)明中檢測(cè)個(gè)體的慢性乙型肝炎肝纖維化病例血清樣本的測(cè)得具有峰值的糖組圖譜，以此預(yù)測(cè)該個(gè)體的慢性乙型肝炎肝纖維化的程度，進(jìn)一步對(duì)預(yù)后判斷、治療選擇及療效評(píng)估提供參考依據(jù)。在一個(gè)優(yōu)選例中，利用N-糖組檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)肝纖維化程度，參與本實(shí)驗(yàn)受試者工作曲線(ROC)可以比較各峰在不同分組情況下的診斷價(jià)值
當(dāng)用于預(yù)測(cè)是否有明顯肝纖維化(S2-4)時(shí)，ROC曲線下面積(AUROC)較高的峰依次為第8峰0. 648，第10峰0. 640，第I峰0. 624，第2峰0. 609 (如圖I所示)。用于預(yù)測(cè)是否有重度肝纖維化(S3-4)時(shí)，AUROC較高的峰依次為第2峰0.702，第10峰0. 687，第I峰0. 682，第8峰0. 672 (如圖2所示)。用于預(yù)測(cè)是否有早期肝硬化(S4)時(shí)，AUROC較高的峰依次為第2峰0. 740，第8 峰0. 705，第I峰0. 689，第10峰0. 653 (如圖3所示)。本發(fā)明所述的血清N-糖組峰標(biāo)記可顯著提高慢性乙型肝炎肝纖維化非創(chuàng)傷性診斷的特異性及敏感性，作為一種非創(chuàng)傷性替代指標(biāo)，能高效預(yù)測(cè)慢性乙型肝炎肝纖維化的程度，對(duì)預(yù)后判斷、治療選擇及療效評(píng)估等具有現(xiàn)實(shí)的臨床意義；
本發(fā)明提供了血清N-糖組峰標(biāo)記相關(guān)修飾指標(biāo)mRNA、MircoRNA ;所述的血清N-糖組峰標(biāo)記相關(guān)修飾指標(biāo)，可用于制備成不同的檢驗(yàn)檢測(cè)用品，如制成診斷試劑盒、診斷試紙、診斷試劑，和治療及預(yù)后評(píng)估相關(guān)試劑盒、試紙、試劑等，并可預(yù)測(cè)慢性乙型肝炎肝纖維化的程度，可用于預(yù)后判斷、治療選擇及療效評(píng)估。


圖I是本發(fā)明中糖組圖譜各峰預(yù)測(cè)是否有明顯肝纖維化(S2-4)時(shí)的ROC曲線，其中，AUROC等于I. 0為理想的診斷試驗(yàn)，AUROC等于或小于0. 5為無效的診斷試驗(yàn)；Log(peak2/peak8)為 0. 675,第 8 峰為 0. 648,第 10 峰為 0. 640,第 I 峰為 0. 624,第 2 峰為0. 609 o圖2是本發(fā)明中糖組圖譜各峰預(yù)測(cè)是否有重度肝纖維化(S3-4)時(shí)的ROC曲線，其中，Log(peak2/peak8)為 0. 736，第 2 峰為 0. 702，第 10 峰為 0. 687，第 I 峰為 0. 682，第 8 峰為 0. 672。圖3是本發(fā)明中糖組圖譜各峰預(yù)測(cè)是否有早期肝硬化(S4)時(shí)的ROC曲線，其中，Log(peak2/peak8)為 0. 754，第 2 峰為 0. 740，第 8 峰為 0. 705，第 I 峰為 0. 689，第 10 峰為0. 653 ;在第1、2、8、10各峰的兩兩組合中，以第2和第8峰組合的指標(biāo)Log(peak2/peak8)具有最優(yōu)的曲線下面積(AUR0C)，分別為0. 675,0. 736,0. 754 ;表明Log (peak2/peak8)可有效的預(yù)測(cè)有無重度纖維化或肝硬化，但其對(duì)輕度纖維化的區(qū)分能力較弱。圖4是本發(fā)明中纖維化各分期下Log(peak2/peak8)值分布箱圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I采用DSA-FACE技術(shù)檢測(cè)慢性HBV感染患者血清標(biāo)本，制得具有峰值的N-糖組圖譜
采集2002年至2007年篩選行肝活檢的符合標(biāo)準(zhǔn)的慢性HBV感染患者血清標(biāo)本146例，入選條件按中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《慢性乙型肝炎防治指南》所規(guī)定的慢性HBV感染診斷標(biāo)準(zhǔn)，有乙型肝炎或HBsAg陽性史超過6個(gè)月，現(xiàn)HBsAg和(或)HBVDNA仍為陽性者；
排除條件艾滋病毒或慢性丙肝病毒感染，飲酒量大于30g每日，代謝性或其它類型的肝損，患者已接受肝病治療，肝活檢組織不符合標(biāo)準(zhǔn)；
以肝活檢病理學(xué)診斷明確纖維化程度，將S0、S1期列為早期纖維化組，S3、S4期列為晚期纖維化組，留取血清樣本，按下述步驟檢測(cè)，獲得慢性乙肝肝纖維化血清N-糖組峰標(biāo)記圖譜
1)寡糖的釋放
2u I血清加入含有2iil緩沖液(10mmol/L NH4HC03)和3yl水的PCR反應(yīng)管中，95°C加熱 5min 后 4°C放置 15min，加入 I PNGase F (2. 2U/U 1，pH8. 3,3. 33% NP40) 37°C孵 育3h，4°C冷浴后加入100 ill水，標(biāo)記為D管；
2)寡糖的標(biāo)記
從D管吸取6 ii I溶液加入一新的PCR管中，開蓋60°C烘干60min,加入2 y I標(biāo)記溶液(20mmol/L 的 APTS 與 lmol/L 的 NaBH3CN 之比為 1:1)，37。。孵育 16h，加 200 U I 水終止反應(yīng)，標(biāo)記為L管；
3)去唾液酸
從L管取2 ill溶液加入一新的P C R管中，加入3iU 0. 25mU去唾液酸酶在37°C孵育過夜，加160 u I水振蕩混勻，標(biāo)記為DE管；
4)片段分析
取DE管10 Ul溶液用ABI3130測(cè)序儀進(jìn)行片段分析，數(shù)據(jù)經(jīng)GeneScan軟件分析。5)將測(cè)得的具有峰值的糖組圖譜峰值量化，采用內(nèi)參校正后的數(shù)據(jù)。上述的血清樣本采用患者血清中的N-糖組圖譜檢測(cè)遵循Callewaert等制定的DSA-FACE技術(shù)規(guī)范，數(shù)據(jù)經(jīng)GeneScan軟件分析；每份血清標(biāo)本均可測(cè)得具有10個(gè)峰左右的糖組圖譜，將峰值量化，最終采用內(nèi)參校正后的數(shù)據(jù)，得到非創(chuàng)傷性慢性乙型肝炎肝纖維化診斷血清N-糖組峰標(biāo)記。
實(shí)施例2利用N-糖組檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)肝纖維化程度
按實(shí)施例I的血清樣本檢測(cè)方法，獲得受試者血清的具有峰值的糖組圖譜，參與本實(shí)驗(yàn)受試者工作曲線(ROC)可比較各峰在不同分組情況下的診斷價(jià)值，預(yù)測(cè)慢性乙型肝炎肝纖維化的程度或預(yù)測(cè)是否有早期肝硬化；
當(dāng)用于預(yù)測(cè)是否有明顯肝纖維化(S2-4)時(shí)，ROC曲線下面積(AUROC)較高的峰依次為第8峰為0. 648，第10峰為0. 640，第I峰為0. 624，第2峰為0. 609 (如圖I所示)；
用于預(yù)測(cè)是否有重度肝纖維化(S3-4)時(shí)，AUROC較高的峰依次為第2峰為0. 702，第10峰為0. 687，第I峰為0. 682，第8峰為0. 672 (如圖2所示)；
用于預(yù)測(cè)是否有早期肝硬化(S4)時(shí)，AUROC較高的峰依次為第2峰為0. 740，第8峰為0. 705，第I峰為0. 689，第10峰為0. 653 (如圖3所示)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所述的血清N-糖組峰標(biāo)記可顯著提高慢性乙型肝炎肝纖維化非創(chuàng)傷性診斷的特異性及敏感性，作為一種非創(chuàng)傷性替代指標(biāo)，能高效預(yù)測(cè)慢性乙型肝炎肝纖維化的程度，對(duì)預(yù)后判斷、治療選擇及療效評(píng)估等具有現(xiàn)實(shí)的臨床意義；所述的血清N-糖組峰標(biāo)記可米用動(dòng)靜脈、夕卜周米血、體液米集，漏出液或滲出液米集
方式使用。本發(fā)明進(jìn)一步比較了各N-糖組峰與纖維化各個(gè)分期間的關(guān)系。結(jié)果顯示，第1、2、
8、10峰均能較好的區(qū)分不同程度的肝纖維化，在有無明顯纖維化(S2-4)、有無重度纖維化
(S3-4)、有無早期肝硬化(S4)這三種分組下的組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
表I是N-糖組圖譜各峰在輕度纖維化和明顯纖維化組間的差異。表2是N-糖組圖譜各峰與纖維化各個(gè)分期間的關(guān)系。表I
權(quán)利要求
1.檢測(cè)慢性乙型肝炎肝纖維化血清N-糖組峰標(biāo)記的方法，其特征在于，采用DSA-FACE技術(shù)檢測(cè)慢性HBV感染患者血清樣本測(cè)得具有峰值的糖組圖譜，將峰值量化后，采用內(nèi)參校正后的數(shù)據(jù)，獲得非創(chuàng)傷性慢性乙型肝炎肝纖維化血清N-糖組峰標(biāo)記。
2.按權(quán)利要求I的方法，其特征在于，其包括下述步驟 1)采集檢測(cè)血清樣本， 2)寡糖的釋放， 血清加入含有NH4HC03緩沖液和水的PCR反應(yīng)管中，95°C加熱后4°C放置，加入PNGaseF37°C孵育，4°C冷浴后加水，標(biāo)記為D管； 3)寡糖的標(biāo)記， 從D管吸取溶液加入新的PCR管中，開蓋60°C烘干，加入標(biāo)記溶液，37°C孵育，加水終止反應(yīng)，標(biāo)記為L管； 4)去唾液酸， 從L管取溶液加入新的P C R管中，加入去唾液酸酶在37°C孵育過夜，加水振蕩混勻，標(biāo)記為DE管； 5)片段分析 取DE管溶液用ABI3130測(cè)序儀進(jìn)行片段分析，數(shù)據(jù)經(jīng)GeneScan軟件分析； 6)將測(cè)得的具有峰值的糖組圖譜峰值量化，采用內(nèi)參校正后的數(shù)據(jù)，獲得慢性乙肝肝纖維化血清N-糖組峰標(biāo)記及其相關(guān)修飾指標(biāo)mRNA、MircoRNA。
3.按權(quán)利要求2的方法，其特征在于，所述步驟2)的PNGaseF中2. 2U/y I, pH8. 3，3.33% NP40。
4.按權(quán)利要求2的方法，其特征在于，所述步驟3)的標(biāo)記溶液中，20mmol/L的APTS與lmol/L 的 NaBH3CN 比為 1:1。
5.按權(quán)利要求2的方法，其特征在于，所述步驟6)的糖組圖譜峰值包括早期纖維化組與晚期纖維化組的4種血清N-糖組峰值。
6.按權(quán)利要求5的方法，其特征在于，所述慢性乙型肝炎肝纖維化血清N-糖組峰標(biāo)記，以肝活檢病理學(xué)診斷明確纖維化程度，其中S0、S1期列為早期纖維化組，S3、S4期列為晚期纖維化組。
7.權(quán)利要求I的檢測(cè)慢性乙型肝炎肝纖維化血清N-糖組峰標(biāo)記的方法在制備預(yù)測(cè)慢性乙型肝炎肝纖維化的程度制劑中的用途。
8.權(quán)利要求I的檢測(cè)慢性乙型肝炎肝纖維化血清N-糖組峰標(biāo)記的方法在制備慢性乙型肝炎肝纖維化診斷試劑盒或診斷試劑中的用途。
9.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的N-糖組峰標(biāo)記相關(guān)指標(biāo)mRNA、MircoRNA在制備慢性乙型肝炎肝纖維化診斷試劑盒或試紙或試劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及肝纖維化血清N-糖組峰標(biāo)記，具體涉及檢測(cè)慢性乙肝肝纖維化血清N-糖組峰標(biāo)記的方法及其用途。本發(fā)明采用DSA-FACE技術(shù)檢測(cè)慢性HBV感染患者血清樣本測(cè)得具有峰值的糖組圖譜，將峰值量化后，采用內(nèi)參校正后的數(shù)據(jù)，獲得非創(chuàng)傷性慢性乙型肝炎肝纖維化血清N-糖組峰標(biāo)記。本發(fā)明的方法可顯著提高慢性乙型肝炎肝纖維化非創(chuàng)傷性診斷的特異性及敏感性，作為一種非創(chuàng)傷性替代指標(biāo)，能高效預(yù)測(cè)慢性乙型肝炎肝纖維化的程度，對(duì)預(yù)后判斷、治療選擇及療效評(píng)估等具有現(xiàn)實(shí)的臨床意義。
文檔編號(hào)G01N33/66GK102707062SQ201110074008
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2011年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月27日
發(fā)明者周錕, 徐銘益, 曲穎, 陸倫根, 高春芳 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院