專利名稱：呋喃它酮代謝物檢測(cè)試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)免疫方法的測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種利用膠體金免疫層析技術(shù)制作的一種呋喃它酮代謝物檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
硝基呋喃類藥物為一種光譜抗生素，主要是指呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林，具有很好的抗菌作用，被廣泛應(yīng)用于飼料添加劑和治療藥物，用于預(yù)防和治療由沙門氏菌和埃希氏桿菌引起的豬、牛、家禽及蜜蜂的胃腸道疾病。他們對(duì)人類健康有惡性影響，有致癌性。歐盟出于食品安全的考慮，在96/23/EC法規(guī)中將硝基呋喃類抗生素列為A類禁用·藥，決定從1997年I月I日起，禁止在動(dòng)物飼料中添加任何硝基呋喃類抗生素。我國(guó)也于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令。歐盟委員會(huì)于2003年通過了 2003/181/EC委員會(huì)決議，建立了用于檢測(cè)禽肉產(chǎn)品和水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物的代謝物的各種方法的最小要求性能限值為Iu g/kg。目前，歐盟、美國(guó)及其他國(guó)家都對(duì)進(jìn)口動(dòng)物性食品中硝基呋喃類抗生素殘留做了非常嚴(yán)格的限制，要求4種硝基呋喃代謝物殘留不得超過I U g/kg。為了人和動(dòng)物的安全很有必要對(duì)水源和食品(如肉)進(jìn)行抗生素殘留檢測(cè)。呋喃類藥物本身的檢測(cè)很難，因?yàn)樵谑橙脒@些藥物后會(huì)很快地發(fā)生代謝。這些代謝產(chǎn)物會(huì)在組織中存在很長(zhǎng)時(shí)間。AMOZ是呋喃它酮的代謝物，在一般的烹調(diào)中不易分解，在溫和的酸性條件下可以從組織中釋放出來。因此可以用來做檢測(cè)使用。目前，檢測(cè)呋喃它酮代謝物AMOZ的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)。這些方法靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，但是具有需要昂貴的儀器，檢測(cè)繁瑣、費(fèi)時(shí)，檢測(cè)人員需要一定的專業(yè)培訓(xùn)等缺點(diǎn)。本發(fā)明采用膠體金免疫層析技術(shù)制備了一種呋喃它酮代謝物檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、靈敏度高、無需復(fù)雜儀器等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單、快捷、靈敏度高、成本低的呋喃它酮代謝物檢測(cè)試劑盒及其制備方法。一種呋喃它酮代謝物檢測(cè)試劑盒，包括樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊和PVC支撐板，在PVC支撐板上依次緊密粘附有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊。所述樣品墊為玻璃纖維；所述膠體金墊為膠體金標(biāo)記的AMOZ衍生物多克隆抗體聚酯膜；所述硝酸纖維素膜上依次包被有檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，其中檢測(cè)線(T線)上包被了 AMOZ衍生物偶聯(lián)載體蛋白，質(zhì)控線(C線)上包被了羊抗兔IgG抗體；所述吸樣墊為吸水紙。偶聯(lián)呋喃它酮代謝物的載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(0VA)。
本發(fā)明采用納米膠體金技術(shù)及抗原抗體特異性反應(yīng)，應(yīng)用免疫競(jìng)爭(zhēng)抑制反應(yīng)的原理制備而成，通過待檢樣本中可能含有的AMOZ衍生物與硝酸纖維素膜上檢測(cè)線(T線)包被的AMOZ衍生物偶聯(lián)載體蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合膠體金標(biāo)記的AMOZ衍生物抗體的反應(yīng)，使T線顯現(xiàn)肉眼可見紅色條帶用于判定待檢樣本中是否含有AM0Z。本發(fā)明提供了一種呋喃它酮代謝物檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括以下步驟(I)制備AMOZ衍生物偶聯(lián)載體蛋白呋喃它酮是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才能具有免疫原性。將AMOZ和間羧基苯丙醛在水中反應(yīng)進(jìn)行衍生化得到AMOZ衍生物半抗原。采用NHS活性酯法將AMOZ衍生物半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到AMOZ衍生物偶聯(lián)載體蛋白作為免疫原和包被原。其中載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(0VA)。 (2)制備AMOZ衍生物多克隆抗體采用AMOZ衍生物偶聯(lián)載體蛋白作為免疫原免疫白兔，制備抗AMOZ衍生物多克隆抗體。(3)制備膠體金取0.01%的氯金酸水溶液，加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入I %枸櫞酸三鈉水溶液Iml,繼續(xù)煮沸約5min,出現(xiàn)橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒的大小為20_40nm。(4)制備膠體金墊取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液，用0. 2mol/L K2CO3將膠體金溶液的pH值調(diào)至7. 0-9. 0，室溫放置30分鐘；在上述溶液中加入AMOZ衍生物多克隆抗體，使AMOZ衍生物多克隆抗體的濃度為10-40 ii g/ml膠體金,混合均勻后，室溫放置30分鐘；然后加入10-80 u I/ml膠體金的10%的牛血清白蛋白(BSA)溶液，混合均勻，室溫放置10分鐘；上述溶液于12000轉(zhuǎn)離心30分鐘，仔細(xì)吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用30-70%初始膠體金體積的膠體金復(fù)溶液溶解，得到AMOZ衍生物多克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；將AMOZ衍生物多克隆抗體-膠體金標(biāo)記物按15-35 iil/cm2的比例均勻的鋪在聚酯膜上，放入45°C干燥箱干燥
2.5-3小時(shí)，制成膠體金墊。上述膠體金復(fù)溶液為含0. 30% 的 Tris，5%蔗糖，0. 50% PVP，0. 30% Casein-Na,pH值7. 0-9. 0的溶液。 (5)包被AMOZ衍生物偶聯(lián)載體蛋白、羊抗兔IgG抗體將NC膜粘貼在PVC板上，吸水紙貼到PVC板上壓住膜1-1. 5mm。打開劃膜儀，按清洗鍵清洗劃膜儀，設(shè)置劃膜儀參數(shù)為C線I. 0 i! 1/cm, T線I. 0 i! 1/cm。將貼好的PVC板放在劃膜儀上，用C、T線包被液在NC膜上分別劃C、T線。劃膜不合格的用紅記號(hào)筆標(biāo)出，將包被板置干燥箱設(shè)置45°C，干燥1-1. 5小時(shí)。其中，T線包被液為0. 8-3. 5mg/ml的AMOZ衍生物偶聯(lián)載體蛋白；C線包被液為
0.6-2. Omg/ml的羊抗兔IgG抗體。(6)樣品墊的處理將玻璃纖維浸泡于0. OlM pH 7. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中20_40min，其中磷酸鹽緩沖溶液中含0. 5-1. 5% BSA, 0. 5-1.0% Tweeen-20，于烘干箱中38°C烘干，保存，備用(7)組裝試劑盒
取上述制備好的膠體金墊、PVC板及樣品墊，將膠體金墊切成寬度為IOmm的條型，然后膠體金墊貼于PVC板上NC膜的靠近T線端，壓NC膜1-1. 5_，樣品墊貼于膠體金墊的上方，露出金墊2-3mm(如圖I所示)。打開切條機(jī)，按產(chǎn)品要求設(shè)置裁切寬度，將上述組裝好的PVC板放于切條機(jī)上，按設(shè)置寬度進(jìn)行切條，得到所述用于檢測(cè)呋喃它酮代謝物的試紙條；試紙條可以裝入塑料卡內(nèi)，組裝成檢測(cè)卡。本發(fā)明所述試劑盒的檢測(cè)方法為將被檢樣品平衡至室溫；取出呋喃它酮代謝物檢測(cè)試劑盒，水平放置；在樣品墊中加入2-3滴樣品，5-10分鐘時(shí)觀察并記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測(cè)結(jié)果；或?qū)⑦秽x物檢測(cè)試紙條樣品墊末端浸入被測(cè)樣品溶液中約10秒鐘后，水平放置；5-10分鐘時(shí)觀察并記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明所述的試劑盒采用膠體金免疫層析技術(shù)測(cè)定AM0Z，因AMOZ的分子量較小，屬于小分子物質(zhì)，抗體不能捕獲游離的AM0Z，因此需要檢測(cè)其衍生物。檢測(cè)樣品時(shí)，因毛細(xì)作用樣品溶液的沿試紙條向吸樣墊一端層析，若被測(cè)樣品中含有AMOZ衍生物，它們將和檢測(cè)線(T線)上包被的AMOZ衍生物偶聯(lián)載體蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合膠體金標(biāo)記的AMOZ衍生物多克 隆抗體上有限的抗體結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)樣品中的AMOZ衍生物達(dá)到一定濃度時(shí)，與膠體金標(biāo)記的AMOZ衍生物多克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)并完全飽和，此時(shí)膠體金復(fù)合物已無空余的位點(diǎn)和檢測(cè)線上包被的AMOZ衍生物偶聯(lián)載體蛋白結(jié)合，此時(shí)T線不顯色，此為陽(yáng)性結(jié)果；若被測(cè)樣品中不含AMOZ衍生物，標(biāo)記了 AMOZ衍生物多克隆抗體的膠體金顆粒將隨同樣品層析至T線位置后，與T線上包被的AMOZ衍生物偶聯(lián)載體蛋白發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)，膠體金顆粒在T線位置堆積使得T線呈現(xiàn)出一條肉眼可見的紅色條帶，此為陰性結(jié)果。無論被測(cè)樣品中是否含有呋喃它酮，膠體金標(biāo)記物均會(huì)與C線包被的羊抗兔IgG反應(yīng)形成一條肉眼可見的紅色條帶，C線顯色與否，是判定是否有足夠樣本，層析過程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也作為試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。


圖I呋喃它酮代謝物檢測(cè)試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖；附圖符號(hào)說明I :樣品墊；2 :膠體金墊(膠體金標(biāo)記AMOZ衍生物多克隆抗體的聚酯膜)3 :硝酸纖維素膜(T :包被了 AMOZ衍生物偶聯(lián)載體蛋白的檢測(cè)線；C :包被了羊抗兔IgG多克隆抗體的質(zhì)控線)；4 :吸樣墊；5 =PVC 支撐板；圖2本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)結(jié)果示意圖。自左至右依次為C線一條線陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果；T、C兩條線陰性檢測(cè)結(jié)果；無效。實(shí)施例I :呋喃它酮代謝物檢測(cè)試劑盒的制備I.制備AMOZ衍生物偶聯(lián)牛血清白蛋白將AMOZ和間羧基苯丙醛在水中反應(yīng)進(jìn)行衍生化得到AMOZ衍生物半抗原。采用NHS活性酯法將AMOZ衍生物半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)得到AMOZ衍生物偶聯(lián)牛血清白蛋白作為免疫原和包被原。
2.制備AMOZ衍生物多克隆抗體AMOZ衍生物偶聯(lián)牛血清白蛋白作為免疫原免疫白兔，制備抗AMOZ衍生物多克隆抗體。3.制備膠體金取0.01%的氯金酸水溶液，加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入I %枸櫞酸三鈉水溶液Iml,繼續(xù)煮沸約5min,出現(xiàn)橙紅色。這樣制成的膠體 金顆粒的大小為20_40nm。4.制備膠體金墊取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液5ml，用0. 2mol/L K2CO3將膠體金溶液的pH值調(diào)至8. 0，室溫放置30分鐘；在上述溶液中加入70 u I濃度為3. 5mg/ml的AMOZ衍生物多克隆抗體，混合均勻后，室溫放置30分鐘；然后加入125 ill 10%的牛血清白蛋白(BSA)溶液，混合均勻，室溫放置10分鐘；上述溶液于12000轉(zhuǎn)離心30分鐘，仔細(xì)吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用2. 5ml的膠體金復(fù)溶液溶解，得到AMOZ衍生物多克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；將AMOZ衍生物多克隆抗體-膠體金標(biāo)記物按20 u I/cm2的比例均勻的鋪在聚酯膜上，放入45°C干燥箱干燥3小時(shí)，制成膠體金墊。上述膠體金復(fù)溶液為含0. 30% 的 Tris，5%蔗糖，0. 50% PVP，0. 30% Casein-Na,pH值8.0的溶液。5.包被AMOZ衍生物偶聯(lián)牛血清白蛋白、羊抗兔IgG抗體 將NC膜粘貼在PVC板上，吸水紙貼到PVC板上壓住膜1-1. 5mm。打開劃膜儀，按清洗鍵清洗劃膜儀，設(shè)置劃膜儀參數(shù)為C線I. 0 i! 1/cm, T線I. 0 i! 1/cm。將貼好的PVC板放在劃膜儀上，用C、T線包被液在NC膜上分別劃C、T線。劃膜不合格的用紅記號(hào)筆標(biāo)出，將包被板置干燥箱設(shè)置45°C，干燥I. 5小時(shí)。其中，T線包被液為I. Omg/ml的AMOZ衍生物偶聯(lián)牛血清白蛋白；C線包被液為I. Omg/ml的羊抗兔IgG抗體。6.樣品墊的處理將玻璃纖維浸泡于0. OlM pH 8. O的磷酸鹽緩沖溶液中20_40min，其中磷酸鹽緩沖溶液中含I. 0% BSA, 0. 5% Tweeen-20，于烘干箱中38°C烘干，保存，備用7.組裝試劑盒取上述制備好的膠體金墊、PVC板及樣品墊，將膠體金墊切成寬度為IOmm的條型，然后膠體金墊貼于PVC板上NC膜的靠近T線端，壓NC膜1-1. 5_，樣品墊貼于膠體金墊的上方，露出金墊2-3mm(如圖I所示)。打開切條機(jī)，設(shè)置裁切寬度為3. 8mm，將上述組裝好的PVC板放于切條機(jī)上，按設(shè)置寬度進(jìn)行切條，得到所述用于檢測(cè)呋喃它酮代謝物的試紙條；試紙條可以裝入塑料卡內(nèi)，組裝成檢測(cè)卡。實(shí)施例2 :呋喃它酮代謝物檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)I.樣品的處理取Ig組織樣品組織樣品搗碎后，加入5ml蒸餾水，IM的HCl 0. 5ml和0. OlM的苯甲醛(乙醇溶液)100 U 1，充分振蕩，置于60°C過夜。然后加入IM的K2HP045ml，IM的NaOH
0.4ml以及5ml的乙酸乙酯,劇烈振蕩30秒。室溫下4000rpm離心10分鐘,然后取2. 5ml乙酸乙酯上清液轉(zhuǎn)移到新容器中。在45°C下用氮?dú)鈱⑵浯蹈桑缓笥谜和橹匦氯芙夂笈cIml 的 0. OlM PBST (pH 7. 4,0. 05% Tween-20)混勻。室溫下 4000rpm 離心 10 分鐘，最后取底部水相測(cè)定。2 檢測(cè)方法取出呋喃它酮代謝物檢測(cè)試劑盒，水平放置；在樣品墊上滴入3滴樣品，10分鐘后觀察并記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測(cè)結(jié)果。3.結(jié)果判定陽(yáng)性T線不顯色，僅C線顯色，判定為陽(yáng)性結(jié)果；陰性T線、C線均顯色，判定為陰性結(jié)果；無效C線不顯色，說明不正確操作或試劑盒已經(jīng)變質(zhì)損壞。權(quán)利要求
1.一種呋喃它酮代謝物檢測(cè)試劑盒及其制備方法，其特征在于由樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊和PVC支撐板組成，在PVC支撐板上依次緊密粘附有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊。所述樣品墊為玻璃纖維；所述膠體金墊為膠體金標(biāo)記的AMOZ衍生物多克隆抗體聚酯膜；所述硝酸纖維素膜上依次包被有檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，其中檢測(cè)線(T線)上包被了 AMOZ衍生物偶聯(lián)載體蛋白，質(zhì)控線(C線)上包被了羊抗兔IgG抗體；所述吸樣墊為吸水紙。
2.—種權(quán)利要求I所述的呋喃它酮代謝物檢測(cè)試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的AMOZ衍生物偶聯(lián)載體蛋白為AMOZ衍生物偶聯(lián)牛血清白蛋白或卵清白蛋白；所述的AMOZ衍生物多克隆抗體由AMOZ衍生物偶聯(lián)載體蛋白作為免疫原免疫白兔獲得。
3.—種權(quán)利要求I所述的呋喃它酮代謝物檢測(cè)試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑枸櫞酸三鈉作用下制成大小為20-40nm的膠體金顆 粒。
4.一種權(quán)利要求I所述的呋喃它酮代謝物檢測(cè)試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的膠體金墊的制備方法為取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液，用0. 2mol/L K2CO3將膠體金溶液的PH值調(diào)至7. 0-9. 0，室溫放置30分鐘；在上述溶液中加入AMOZ衍生物多克隆抗體，使AMOZ衍生物多克隆抗體的濃度為10-40 u g/ml膠體金，混合均勻后，室溫放置30分鐘；然后加入10-80 iil/ml膠體金的10%的牛血清白蛋白(BSA)溶液，混合均勻，室溫放置10分鐘；上述溶液于12000轉(zhuǎn)離心30分鐘，仔細(xì)吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用30-70%初始膠體金體積的膠體金復(fù)溶液溶解，得到AMOZ衍生物多克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；將AMOZ衍生物多克隆抗體-膠體金標(biāo)記物按15-35 iil/cm2的比例均勻的鋪在聚酯膜上，放入45°C干燥箱干燥2. 5-3小時(shí)，制成膠體金墊。
5.一種權(quán)利要求I所述的呋喃它酮代謝物檢測(cè)試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的膠體金復(fù)溶液為含0. 30%的Tris，5%蔗糖，0. 50% PVP, 0. 30% Casein-Na, pH值7.0-9. 0的溶液。
6.一種權(quán)利要求I所述的呋喃它酮代謝物檢測(cè)試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的硝酸纖維素膜上T、C線的包被方法為將NC膜粘貼在PVC板上，吸水紙貼到PVC板上壓住膜1-1. 5mm。打開劃膜儀，按清洗鍵清洗劃膜儀，設(shè)置劃膜儀參數(shù)為C線I. 0 y 1/cm, T線l.Ou 1/cm ;將貼好的PVC板放在劃膜儀上，用C、T線包被液在NC膜上分別劃C、T線。劃膜不合格的用紅記號(hào)筆標(biāo)出，將包被板置干燥箱設(shè)置45°C，干燥1-1. 5小時(shí)。其中，T線包被液為0. 8-3. 5mg/ml的AMOZ衍生物偶聯(lián)載體蛋白；C線包被液為0. 6-2. Omg/ml的羊抗兔IgG抗體。
全文摘要
呋喃它酮代謝物檢測(cè)試劑盒及其制備方法，本發(fā)明涉及生物學(xué)免疫方法的測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒由樣品墊(1)、膠體金墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸樣墊(4)和PVC支撐板(5)組成，在PVC支撐板上依次連續(xù)粘附有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊。膠體金墊為膠體金標(biāo)記的AMOZ衍生物多克隆抗體聚酯膜，硝酸纖維素膜上依次包被了AMOZ衍生物偶聯(lián)載體蛋白作為檢測(cè)線(T線)，羊抗兔IgG抗體作為質(zhì)控線(C線)。本發(fā)明利用膠體金免疫層析技術(shù)，運(yùn)用被測(cè)樣品中可能含有的AMOZ衍生物與硝酸纖維素膜上包被的AMOZ衍生物偶聯(lián)載體蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合膠體金標(biāo)記的AMOZ衍生物多克隆抗體的原理檢測(cè)樣品中是否含有AMOZ。
文檔編號(hào)G01N33/532GK102721805SQ201110076459
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2011年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月29日
發(fā)明者李峰, 楊利, 陳立柱 申請(qǐng)人:寶瑞源生物技術(shù)(北京)有限公司