專利名稱：一種熒光檢測植物木聚糖分布的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及用熒光檢測植物木聚糖分布的方法。
背景技術(shù)：
木聚糖(xylan)是一種以P _D_1，4木糖苷鍵形成主鏈的多聚五碳糖，常帶有阿魏糖，阿拉伯糖等側(cè)鏈。是主要的半纖維素成分，廣泛分布在植物細(xì)胞中，是一種豐富的生物質(zhì)資源，約占植物細(xì)胞干重的35%。木聚糖可以作為飼料，食品添加劑和生物質(zhì)能源的原 料。因此檢測木聚糖在植物中的分布與含量，已經(jīng)成為木聚糖研究的重要指標(biāo)?，F(xiàn)有檢測木聚糖分布的方法中，通常采用免疫熒光法和底物染料法。底物染料法是以木聚糖為基質(zhì)，用交聯(lián)方式連接和包裹特定的染料做成切片。底物染料法因?yàn)槿玖弦兹苡谒魇В瑢?dǎo)致染色結(jié)果可重復(fù)性差，而且染料顆粒大，不適合高精度觀測。免疫熒光法是近年發(fā)展起來的一種新型檢測技術(shù)，先用重組木聚糖結(jié)合蛋白與植物切片中木聚糖集合，再用抗組氨酸標(biāo)記的抗體與重組蛋白中的組氨酸標(biāo)記結(jié)合，最后與帶熒光集團(tuán)的第二抗體結(jié)合，從而標(biāo)記出木聚糖的位置，在熒光顯微鏡下觀察植物切片中木聚糖的分布。該方法中使用的抗組氨酸標(biāo)記的抗體常會出現(xiàn)效價不高，特異性不強(qiáng)而使得木聚糖熒光信號弱，背景熒光信號過強(qiáng)，干擾檢測結(jié)果。另外，抗體孵育時間長，會對植物切片造成破損，木聚糖分布顯示會不完整?？贵w成本高，特別是帶熒光標(biāo)記的第二抗體，直接增加耗材成本。不同批次的抗體之間的差別也導(dǎo)致熒光結(jié)果可比較性低。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的要解決的技術(shù)問題有兩個方面，一個是克服現(xiàn)有技術(shù)的弊端，提供一種適用于植物木聚糖檢測的方法，另一方面是，提供基于該方法在木聚糖檢測試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案檢測植物木聚糖的分布I)制備重組蛋白將目的蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。離心收獲細(xì)胞，超聲波破碎細(xì)胞。之后過鎮(zhèn)柱洗脫該重組蛋白。透析后，蛋白溶液制備完成。2)制備植物切片將植物材料用石蠟包埋成方塊。用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)切成薄片，粘在載玻片上。用二甲苯脫蠟，經(jīng)酒精溶液置換入水中。用蓋玻片封好備用。3)檢測植物切片木聚糖的分布用制備的重組蛋白溶液浸泡有植物切片的載玻片30min,沖洗3 4次,濾紙吸干后放置在倒置熒光顯微鏡下檢測綠色熒光的分布，即為植物切片中的木聚糖分布。在本發(fā)明的另一方面，提供了基于上述方法在木聚糖分布檢測試劑盒中應(yīng)用，所述木聚糖分布檢測試劑盒至少包含重組蛋白溶液和使用說明書。所述木聚糖分布檢測試劑盒，還可以包含木聚糖酶，陽性對照的植物切片，石蠟，二甲苯，無水乙醇等試劑。由于采用上述的技術(shù)方案，本發(fā)明中的結(jié)合熒光定量的木聚糖分布檢測方法，克服了以往檢測方法的弊端(I)避免使用各種抗體，節(jié)省抗體成本和抗體保存費(fèi)用，操作的相關(guān)耗材成本和操作時間；(2)本方法避免抗體帶來的結(jié)果重復(fù)性差，熒光信號不強(qiáng)，背景過強(qiáng)；(3)本方法避免抗體孵育過程中對植物樣品的損壞，使得切片結(jié)構(gòu)更完整；(4)本方法使用的木聚糖結(jié)合蛋白特異性強(qiáng)，不與植物材料中其他成分結(jié)合；(5)本方法不受抗體量的限制，容易放大，容易實(shí)現(xiàn)高通量操作。

綜上所述，本發(fā)明具有特異性強(qiáng)，熒光信號強(qiáng)，背景信號弱，操作簡單，快捷，容易放大，消耗更少等特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。需要指出的是，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，科學(xué)出版社2002 [美]J.薩姆布魯克，D. W拉塞爾著，黃培堂等譯)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例II)制備重組蛋白擴(kuò)增與木聚糖特異性結(jié)合的多糖結(jié)合蛋白的基因片段，轉(zhuǎn)入含有綠色熒光蛋白基因片段的PMV261載體中，使兩個蛋白進(jìn)行重組共表達(dá)。將該重組蛋白的質(zhì)粒2 Ul加入50 u I的大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞BL21的溶液中，冰浴30min，轉(zhuǎn)入42°C水浴鍋中靜止放置lmin，取出放在冰浴中Imin。用移液器吸出，轉(zhuǎn)入鋪有LB瓊脂培養(yǎng)基和50 u g/ml卡那霉素的玻璃培養(yǎng)皿中，用涂布器涂抹均勻，倒置放在37°C培養(yǎng)箱中16小時。取出培養(yǎng)皿，挑取一個單克隆菌苔，轉(zhuǎn)入有50 ii g/ml卡那霉素的100ml LB培養(yǎng)基溶液中，在37°C恒溫振蕩器中培養(yǎng)至OD6tltl為0.6，加入終濃度為0.2 ii M IPT6誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。繼續(xù)培養(yǎng)16個小時之后，離心收獲細(xì)胞，用50mM Tris,200mM NaCl，pH 8. 0緩沖溶液懸浮細(xì)胞，在冰浴中用超聲波破碎細(xì)胞。之后高速低溫離心得到細(xì)胞上清，過鎳柱除去細(xì)胞上清中的雜蛋白，用50mM Tris,200mM NaCl，IOOmM咪唑，pH 8. 0緩沖液洗脫該重組蛋白。透析除去咪唑后，蛋白溶液制備完成，4°C保存。2)制備植物切片將I立方厘米見方的植物材料在90%酒精中浸泡I小時，依次換入酒精與二甲苯的I : 1,1 : 3的混合溶液中各30min,最后轉(zhuǎn)入純二甲苯溶液30min。用52°C的石臘浸染30min，再用52°C的石蠟包埋成方塊。用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)切成薄片，粘在載玻片上。在30°C放置I小時烘干，用二甲苯脫蠟，經(jīng)酒精溶液從100%，90%，70%，50%，30%依次置換，之后轉(zhuǎn)入水中。用蓋玻片封好備用。3)檢測植物切片木聚糖的分布用制備的重組蛋白溶液浸泡有植物切片的載玻片30min，取出載玻片，用50mMTris,pH 8. 0緩沖液沖洗3次，用濾紙吸干多余的緩沖液，放置在倒置熒光顯微鏡下檢測綠色熒光的分布，即為植物切片中的木聚糖分布。實(shí)施例2I)制備重組蛋白擴(kuò)增與木聚糖特異性結(jié)合的多糖結(jié)合蛋白的基因片段，轉(zhuǎn)入含有綠色熒光蛋白基因片段的PMV261載體中，使兩個蛋白進(jìn)行重組共表達(dá)。將該重組蛋白的質(zhì)粒I 加入50 u I的大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞BL21的溶液中，冰浴30min，轉(zhuǎn)入42°C水浴鍋中靜止放置lmin，取出放在冰浴中l(wèi)min。用移液器吸出，轉(zhuǎn)入鋪有LB瓊脂培養(yǎng)基和50 y g/ml卡那霉素的玻璃培養(yǎng)皿中，用涂布器涂抹均勻，倒置放在37°C培養(yǎng)箱中16小時。取出培養(yǎng)皿，挑取一個單克隆菌苔，轉(zhuǎn)入有50 ii g/ml卡那霉素的100ml LB培養(yǎng)基溶液中，在37°C恒溫振蕩器中培養(yǎng)至0D_為0.6，加入終濃度為0.2 ii M IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。繼續(xù)培養(yǎng)16個小時 之后，離心收獲細(xì)胞，用50mM Tris,200mM NaCl, pH 8. 0緩沖溶液懸浮細(xì)胞，在冰浴中用超聲波破碎細(xì)胞。之后用高速低溫離心機(jī)得到細(xì)胞上清，過鎳柱除去細(xì)胞上清中的雜蛋白，用50mM Tris,200mM NaCl，IOOmM咪唑，pH 8. 0緩沖液洗脫該重組蛋白。透析除去咪唑后，蛋白溶液制備完成，4°C保存。2)制備植物切片將I立方厘米見方的植物材料在90%酒精中浸泡2小時，依次換入酒精與二甲苯的I : 1,1 : 3的混合溶液中各30min,最后轉(zhuǎn)入純二甲苯溶液30min。用52°C的石臘浸染30min，再用52°C的石蠟包埋成方塊。用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)切成薄片，粘在載玻片上。在37°C放置I小時烘干，用二甲苯脫蠟，經(jīng)酒精溶液從100%，95%，75%，50%，30%依次置換，之后轉(zhuǎn)入水中。用蓋玻片封好備用。3)檢測植物切片木聚糖的分布用制備的重組蛋白溶液浸泡有植物切片的載玻片30min，用50mM Tris,pH 8. 0緩沖液沖洗4次，用濾紙吸干多余的緩沖液，放置在倒置熒光顯微鏡下檢測綠色熒光的分布，即為植物切片中的木聚糖分布。
權(quán)利要求
1.一種熒光檢測植物木聚糖分布的方法，其特征在于該方法包括以下步驟 1)制備重組蛋白 將目的蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。離心收獲細(xì)胞，超聲波破碎細(xì)胞。之后過鎮(zhèn)柱洗脫該重組蛋白。透析后，蛋白溶液制備完成。
2)制備植物切片 將植物材料用石蠟包埋成方塊。用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)切成薄片，粘在載玻片上。用二甲苯脫蠟，經(jīng)酒精溶液置換入水中。用蓋玻片封好備用。
3)檢測植物切片木聚糖的分布 用制備的重組蛋白溶液浸泡有植物切片的載玻片30min，沖洗3 4次，濾紙吸干后放置在倒置熒光顯微鏡下檢測綠色熒光的分布，即為植物切片中的木聚糖分布。
2.一種基于權(quán)利要求I所述方法的木聚糖檢測試劑盒，其特征在于所述木聚糖檢測試劑盒至少包括重組蛋白溶液和使用說明書。
3.權(quán)利要求2所述木聚糖檢測試劑盒，還可以包括木聚糖酶，陽性對照的植物切片，石蠟，二甲苯，無水乙醇等試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種熒光檢測植物木聚糖分布的方法，它包括制備重組蛋白，制備植物切片，熒光檢測木聚糖分布等步驟。本發(fā)明還公開了基于該辦法制備木聚糖檢測試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明的方法使用有熒光蛋白標(biāo)記的木聚糖結(jié)合蛋白與木聚糖結(jié)合發(fā)出熒光來檢測木聚糖分布的原理代替以往的免疫熒光法，即降低了檢測時間，又降低了耗材的費(fèi)用，提高了檢測的靈敏度和穩(wěn)定性，提高了檢測效率，容易放大操作。
文檔編號G01N21/64GK102735660SQ201110082780
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月1日
發(fā)明者鄭紅俊 申請人:鄭紅俊