專利名稱：熒光強(qiáng)度校正方法、熒光強(qiáng)度計算方法及計算裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熒光強(qiáng)度校正方法、熒光強(qiáng)度計算方法、以及熒光強(qiáng)度計算裝置。更具體地，本發(fā)明涉及一種熒光強(qiáng)度校正方法、一種熒光強(qiáng)度計算方法、以及一種熒光強(qiáng)度計算裝置(calculating apparatus)，其各自分別能夠精確地計算由多個(多種，plural)熒光染料產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度，其中微粒(微小粒子，microparticle)用該多個熒光染料進(jìn)行多重標(biāo)記。
背景技術(shù)：
迄今為止，已使用儀器(如流式細(xì)胞儀)來標(biāo)記微粒，如用熒光染料(熒光色素， fluorescent dye)來標(biāo)記細(xì)胞，并測量由通過對微利照射激光束而激發(fā)的熒光染料產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度或模式，由此測量該微粒的特性。近年來，已進(jìn)行了多色測量(multicolor measurement)以更加精細(xì)地分析細(xì)胞等的特性。在這種情況下，多色測量是這樣的測量，其中微粒用多個熒光染料標(biāo)記，并且通過使用分別對應(yīng)于不同的接收光波長帶的多個光檢測器(如PMT)來測量由各個熒光染料產(chǎn)生的光。在多色測量中，選擇和使用熒光波長與各個光檢測器的接收光波長帶一致的熒光染料。在另一方面，熒光染料(如FITC、藻紅蛋白(PE)以及別藻藍(lán)蛋白(APC))的熒光中心波長彼此靠近。因而，存在其中熒光光譜彼此重疊的波長帶。因此，在基于這些熒光染料的組合進(jìn)行多色測量的情況下，即使當(dāng)通過利用濾光器將由各個熒光染料產(chǎn)生的熒光彼此通過波長帶分開時，由不同于目標(biāo)熒光染料的熒光染料產(chǎn)生的熒光在某些情況下仍然會泄漏到光檢測器。當(dāng)發(fā)生熒光的泄漏時，通過各個光檢測器測得的熒光強(qiáng)度變得大于由目標(biāo)熒光染料產(chǎn)生的熒光的真實強(qiáng)度，因而發(fā)生數(shù)據(jù)上的錯配。為了校正數(shù)據(jù)上的錯配，進(jìn)行了熒光校正(補(bǔ)償)從通過光檢測器測得的熒光強(qiáng)度減去泄漏的熒光強(qiáng)度。熒光校正是使得將電或數(shù)學(xué)校正加入專用回路上的脈沖，以使通過光檢測器測得的熒光強(qiáng)度變成由目標(biāo)熒光染料產(chǎn)生的熒光的真實強(qiáng)度。一種以向量形式表示通過各個光檢測器測得的熒光強(qiáng)度，并使之前設(shè)置的泄漏矩陣(leakage matrix)的逆矩陣(inversion matrix)作用于該向量，從而計算由目標(biāo)熒光染料產(chǎn)生的熒光的真實強(qiáng)度的方法稱作算術(shù)地進(jìn)行熒光校正的方法。在日本專利臨時公開No. 2003-83894中描述了這種方法(參照

圖10和11)。通過分析用熒光染料單個標(biāo)記 (single-labeled)的微粒的熒光波長分布而產(chǎn)生泄漏矩陣，并且以列向量的形式排列熒光染料的熒光波長分布。另外，泄漏矩陣的逆矩陣也稱作“校正矩陣(correction matrix)”。

發(fā)明內(nèi)容
由于在利用校正矩陣的熒光強(qiáng)度校正方法下，使得泄漏矩陣的逆矩陣作用于具有通過各個光檢測器測得的熒光強(qiáng)度作為其要素的向量，所以必要的是，泄漏矩陣是方矩陣。泄漏矩陣的矩陣大小取決于使用的熒光染料的數(shù)量和使用的光檢測器的數(shù)量。因此，為了使校正矩陣可以是方矩陣，必要的是，使用的熒光染料的數(shù)量和使用的光檢測器的數(shù)量彼此相等。圖IOA至IOC以及圖11例舉了通過利用5種熒光染料(FITC、PE、E⑶、PC5、 以及PC7)和5個光檢測器進(jìn)行五色測量的情形。最近，為了滿足用戶的需要期望增加可用的熒光染料的數(shù)量以精細(xì)地分析細(xì)胞等的特性，也已開發(fā)了其中增加光檢測器的數(shù)量的裝置。在這樣的設(shè)置有大量光檢測器的裝置中，測量中使用的光檢測器的數(shù)量在某些情況下可能大于標(biāo)記微粒所使用的熒光染料的數(shù)量。在這樣的情況下，為了有效地應(yīng)用利用校正矩陣的熒光校正，必要的是，使用的熒光染料的數(shù)量和使用的光檢測器的數(shù)量彼此相等。因此，通過適當(dāng)選擇光檢測器(其數(shù)量與熒光染料的數(shù)量一致)來利用測量數(shù)據(jù)，而沒有利用從所有光檢測器獲得的測量數(shù)據(jù) (measured data)。為此，引起以下問題沒有有效地利用所獲得的測量數(shù)據(jù)。為了解決上述問題，形成了本發(fā)明，并因此期望提供一種熒光強(qiáng)度校正方法、一種熒光強(qiáng)度計算方法、以及一種熒光強(qiáng)度計算裝置，在通過多個光檢測器對標(biāo)記有多個熒光染料的微粒進(jìn)行多色測量的情況下，它們各自能夠有效地利用從所有光檢測器獲得的測量數(shù)據(jù)而不取決(依賴)于熒光染料的數(shù)量，從而精確地計算由各個熒光染料產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。為了實現(xiàn)上述期望，根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，提供了一種熒光強(qiáng)度校正方法， 包括以下步驟通過光檢測器來接收熒光，該熒光由通過對用多個熒光染料多重標(biāo)記的微粒照射光而激發(fā)的所述多個熒光染料產(chǎn)生，其中該多個熒光染料具有彼此重疊的熒光波長帶，并且光檢測器分別對應(yīng)于不同的接收光波長帶，并且光檢測器的數(shù)量大于熒光染料的數(shù)量；以及基于從用熒光染料單個標(biāo)記(單獨標(biāo)記，individually labeled)的微粒而獲得的單染色光譜的線性總和，對通過從多個光檢測器收集的檢測值獲得的測定光譜(測得的光譜，measured spectra)進(jìn)行近似(approximate)。在以上描述的熒光強(qiáng)度校正方法中，基于單染色光譜的線性總和的測定光譜的近似可以通過利用最小二乘法來進(jìn)行。另外，這時，當(dāng)檢測值中包含無效值時，可以排除無效的檢測值，因而可以基于單染色光譜的線性總和來近似測定光譜。通過排除無效的檢測值， 增強(qiáng)了熒光強(qiáng)度的校正精度。具體地，在以上描述的熒光強(qiáng)度校正方法中，通過使用法方程(正規(guī)方程，normal equation)或奇異值分角軍(singular value decomposition),獲得參數(shù) ak(k = 1 至 m),在該參數(shù)4下，由以下表達(dá)式表示的評價函數(shù)得到最小值，從而使得有可能分別計算產(chǎn)生自熒光染料的熒光強(qiáng)度
權(quán)利要求
1.一種熒光強(qiáng)度校正方法，包括以下步驟通過光檢測器來接收熒光，所述熒光由通過對用多個熒光染料多重標(biāo)記的微粒照射光而激發(fā)的所述多個熒光染料產(chǎn)生，其中所述多個熒光染料具有彼此重疊的熒光波長帶，并且其中所述光檢測器分別對應(yīng)于不同的接收光波長帶，并且所述光檢測器的數(shù)量大于所述熒光染料的數(shù)量；以及基于從用所述熒光染料單個標(biāo)記的微粒獲得的單染色光譜的線性總和，對通過從所述多個光檢測器收集檢測值而獲得的測定光譜進(jìn)行近似。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光強(qiáng)度校正方法，其中，基于所述單染色光譜的線性總和的所述測定光譜的近似通過利用最小二乘法進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熒光強(qiáng)度校正方法，其中，獲得參數(shù)％&=1至m)，從而分別計算由所述熒光染料產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度，在所述參數(shù)4下，由以下表達(dá)式表示的評價函數(shù)得到最小值其中，A(Xi)表示在第k個熒光染料的單染色光譜中的來自第i個光檢測器的檢測值， Yi表示在所述測定光譜中的來自第i個光檢測器的檢測值，而σ i表示來自第i個光檢測器的測量值的權(quán)重的倒數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的熒光強(qiáng)度校正方法，其中，通過利用法方程或奇異值分解而獲得所述參數(shù)4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光強(qiáng)度校正方法，其中，當(dāng)所述檢測值中包含無效值時，排除所述無效值，并通過利用最小二乘法進(jìn)行基于所述單染色光譜的線性總和的所述測定光譜的近似。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的熒光強(qiáng)度校正方法，其中，獲得參數(shù)\&=1至m)，從而計算由各個熒光染料產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度，在所述參數(shù)4下，由以下表達(dá)式表示的評價函數(shù)得到最小值其中，A(Xi)表示在第k個熒光染料的單染色光譜中的來自第i個光檢測器的檢測值， Yi表示在所述測定光譜中的來自第i個光檢測器的檢測值，σ i表示來自第i個光檢測器的測量值的權(quán)重的倒數(shù)，無效檢測值被取為Yi (i =“Ni+r’至N)，而有效檢測值被取為yi(i = 1 至 N1)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的熒光強(qiáng)度校正方法，其中，獲得參數(shù)％&= 1至m)，從而計算由各個熒光染料產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度，在所述參數(shù)4下，由以下表達(dá)式表示的評價函數(shù)得頁到最小值X' k(Xi) = Xk(Xi) (Ii=I-Ma = I-N1) X' k(x,) = 0(k = 1 Μ、i = Νι+1 N)其中，A(Xi)表示在第k個熒光染料的單染色光譜中的來自第i個光檢測器的檢測值， Yi表示在所述測定光譜中的來自第i個光檢測器的檢測值，σ i表示來自第i個光檢測器的測量值的權(quán)重的倒數(shù)，無效檢測值取為Yi (i =“&+1”至沁，而有效檢測值取為71(1 = 1至 N)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光強(qiáng)度校正方法，其中，所述微粒是細(xì)胞。
9.一種熒光強(qiáng)度計算方法，包括以下步驟通過光檢測器來接收熒光，所述熒光由通過對用多個熒光染料多重標(biāo)記的微粒照射光而激發(fā)的所述多個熒光染料產(chǎn)生，并通過從所述光檢測器收集檢測值而獲得測定光譜，其中所述多個熒光染料具有彼此重疊的熒光波長帶，并且其中所述光檢測器分別對應(yīng)于不同的接收光波長帶，并且所述光檢測器的數(shù)量大于所述熒光染料的數(shù)量；以及基于從用所述熒光染料單個標(biāo)記的微粒獲得的單染色光譜的線性總和，對所述測定光譜進(jìn)行近似，從而分別計算從所述熒光染料產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度。
10.一種熒光強(qiáng)度計算裝置，包括測量裝置，用于通過光檢測器來接收熒光，所述熒光由通過對用多個熒光染料多重標(biāo)記的微粒照射光而激發(fā)的所述多個熒光染料產(chǎn)生，并通過從所述光檢測器收集檢測值而獲得測定光譜，其中所述多個熒光染料具有彼此重疊的熒光波長帶，并且其中所述光檢測器分別對應(yīng)于不同的接收光波長帶，并且所述光檢測器的數(shù)量大于所述熒光染料的數(shù)目；以及計算裝置，用于基于從用所述熒光染料單個標(biāo)記的微粒獲得的單染色光譜的線性總和，對所述測定光譜進(jìn)行近似，從而分別計算從所述熒光染料產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度。
11.一種熒光強(qiáng)度計算裝置，包括測量部，所述測量部被構(gòu)造成通過光檢測器來接收熒光，所述熒光由通過對用多個熒光染料多重標(biāo)記的微粒照射光而激發(fā)的所述多個熒光染料產(chǎn)生，并通過從所述光檢測器收集檢測值而獲得測定光譜，其中所述多個熒光染料具有彼此重疊的熒光波長帶，并且其中所述光檢測器分別對應(yīng)于不同的接收光波長帶，并且所述光檢測器的數(shù)量大于所述熒光染料的數(shù)量；以及計算部，所述計算部被構(gòu)造成基于從用所述熒光染料單個標(biāo)記的微粒獲得的單染色光譜的線性總和，對所述測定光譜進(jìn)行近似，從而分別計算從所述熒光染料產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度。
全文摘要
本文提供了熒光強(qiáng)度校正方法、熒光強(qiáng)度計算方法及計算裝置。更具體地，提供了一種熒光強(qiáng)度計算裝置，包括測量部，該測量部被構(gòu)造成通過光檢測器接收由通過對用多個熒光染料多重標(biāo)記的微粒照射光而激發(fā)的多個熒光染料產(chǎn)生的熒光，然后通過從光檢測器收集檢測值來獲得測定光譜；以及計算部，該計算部被構(gòu)造成基于從用熒光染料單個標(biāo)記的微粒獲得的單染色光譜的線性總和來近似測定光譜，從而分別計算由熒光染料產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度，其中該多個熒光染料具有彼此重疊的熒光波長帶，并且其中該光檢測器分別對應(yīng)于不同的接收光波長帶，并且該光檢測器的數(shù)量大于熒光染料的數(shù)量。
文檔編號G01N21/64GK102235976SQ20111010115
公開日2011年11月9日 申請日期2011年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日
發(fā)明者加藤泰信, 酒井啟嗣 申請人:索尼公司