專利名稱：一種基于代謝組學技術(shù)的中藥制劑制備工藝的評價方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制藥生產(chǎn)領(lǐng)域，具體涉及中藥制劑或天然藥物制劑的制備工藝評價、質(zhì)量評價及質(zhì)量標準的建立。
背景技術(shù)：
中藥制劑是以臨床應(yīng)用效果良好的中藥處方為基礎(chǔ)研制而成的，因其具有多靶點多效應(yīng)的作用而被廣泛使用，如復方丹參滴丸、復方丹參片、葛根素注射液、步長腦心痛、脈絡(luò)寧注射液等。長期以來，中藥制劑在滿足臨床需求、促進中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展方面發(fā)揮了重要作用，但是也存在發(fā)展不平衡的現(xiàn)象，如基礎(chǔ)性研究缺乏、制劑質(zhì)量監(jiān)管體制落后、制劑質(zhì)量不穩(wěn)定、制備工藝落后、缺乏系統(tǒng)性評價等問題。因此，在醫(yī)療實踐中，發(fā)生了較多由中藥 制劑所引發(fā)的嚴重不良反應(yīng)，如過敏性休克、抽搐昏迷、呼吸困難等。特別針對中藥注射劑，近年來不良反應(yīng)在數(shù)量上增幅較大、品種也較多。這使得中藥制劑陷入了患者質(zhì)疑、醫(yī)院停用、病例增多的現(xiàn)狀。制劑制備工藝不夠合理、質(zhì)量標準不夠完善是中藥制劑目前最突出的問題。中藥制劑與單一成分的化學藥物不同，中藥制劑是將中藥材經(jīng)過提取純化而制成的具有一定規(guī)格，直接用于防病治病的多成分混合的藥品，成分復雜不確定。其質(zhì)量的影響因素很多，在處方確定之后，從原料藥材的生長、采收、貯藏，到原藥材的粉碎、浸提、分離，再到浸提液的濃縮、干燥與成劑型，每個環(huán)節(jié)的改變都會使中藥制劑的質(zhì)量發(fā)生變化。早期中藥制劑的質(zhì)量評價只是經(jīng)過感官的檢驗。50年代開始將中藥制劑的質(zhì)量管理納入法制化、規(guī)范化的軌道。90年代，隨著色譜技術(shù)的廣泛發(fā)展，中藥制劑的質(zhì)量評價開始從最初的植物形態(tài)學檢查、物理化學方法檢查發(fā)展到利用高效液相色譜法、液相串聯(lián)質(zhì)譜法對多個指標性成分檢測。2000年8月國家食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)了《中藥指紋圖譜研究技術(shù)指導原則(試行)》，這種指紋圖譜形式的評價手段更為靈敏、專屬性更強、更客觀、科學。但是，中藥制劑特別是復方制劑，其藥效成分不明確、雜質(zhì)多、存在未知成分、作用復雜(如山楂在制劑中以健胃消食為主治功效，需測定有機酸含量；如以心血管疾病為主治功效，需測定黃酮類成分)，僅通過指紋圖譜色譜峰的相似性來評價中藥制劑的質(zhì)量并不合理，同時也不能支持工藝改進。指紋圖譜中色譜峰的歸屬、歸屬成分的定量檢測及綜合的統(tǒng)計學意義上的評價是今后研究發(fā)展的必然趨勢和要求。近年來，國內(nèi)外均開始重視(生物)系統(tǒng)的組學研究，這給我們中藥制劑的質(zhì)量評價帶來新的思路和借鑒。代謝組學是一種通過組群指標的高通量定量檢測，進行數(shù)據(jù)處理，從而研究系統(tǒng)的特征和變化的技術(shù)?？傮w來說，代謝組學技術(shù)分成兩個步驟1)利用現(xiàn)代分析技術(shù)對系統(tǒng)中的成分組群定性定量檢測；2)通過統(tǒng)計軟件對組群成分的定量分析數(shù)據(jù)進行多變量統(tǒng)計分析如PCA、PLS-DA等。結(jié)合高分辨的質(zhì)譜分析手段，代謝組學技術(shù)對完善中藥制劑的質(zhì)量評價體系和改進提高中藥制劑的制備工藝具有重要意義。借助多變量的統(tǒng)計分析方法，分析歸納總結(jié)并預測制劑及制劑中間產(chǎn)物中多組分的綜合效用；借助液相串聯(lián)高分辨質(zhì)譜儀，能夠高通量的定性和定量中藥制劑中多組分；其高準確度的精確質(zhì)量數(shù)測定和對化合物的誘導碎裂的特點提供了豐富而精確的化合物結(jié)構(gòu)信息，對鑒定制劑及制劑中間產(chǎn)物復雜的成分結(jié)構(gòu)具有突出優(yōu)勢；同時其高通量、高靈敏度、寬動態(tài)范圍的分析平臺為復雜的化學成分定量提供便利。基于此的制劑及制劑中間產(chǎn)物的代謝組學評價方法更為科學、合理。鑒于此，本發(fā)明應(yīng)用代謝組學技術(shù)建立了一種整合的中藥、天然藥物制劑及制劑中間產(chǎn)物的評價方法，對中藥制劑的質(zhì)量標準建立和制劑制備工藝的改進具有重要意義和普遍使用性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是利用代謝組學技術(shù)，跟蹤中藥制劑制備過程中藥材歸屬性成分的變化，得到的數(shù)據(jù)采用多變量統(tǒng)計分析建立數(shù)學模型，以表征不同制備工藝對中藥制劑制品最終質(zhì)量的影響。
為解決上述問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案，步驟包括a:明確影響中藥制劑質(zhì)量的因素，通過平行對照實驗設(shè)計或正交實驗設(shè)計制備不同工藝的中藥制劑制品，為保證準確性，每種工藝平行制備6個以上的批次；制劑過程中影響最終制劑質(zhì)量的因素包括中藥材的產(chǎn)地、中藥材的投料配比、中藥材粉碎粒度、中藥材的提取溶劑、中藥材提取的溫度、中藥材提取的時間、中藥材提取次數(shù)、所用的助溶劑、所用吸附沉淀劑。b:根據(jù)中藥制劑所含化學成分的理化性質(zhì)和檢測方法的需要，選擇適宜的方法對中藥制劑制品進行處理，獲得中藥制劑特征性總成分提取物；處理方法包括液液萃取、固相萃取、過濾，其中液液萃取溶劑包括正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、苯、正己烷；固相萃取包括各種型號的固相小柱；過濾包括各種型號的濾膜。c :應(yīng)用液相串聯(lián)高分辨質(zhì)譜聯(lián)儀，在一定的色譜分離條件下，對不同制備工藝的中藥制劑進行分析，獲取特征性的總離子流色譜圖；所用的高分辨質(zhì)譜儀必須為同時具有高準確度的離子精確質(zhì)量數(shù)測定功能和離子碎裂功能的各種高分辨質(zhì)譜儀；其中串聯(lián)的液相色譜儀包括高效液相色譜儀(HPLC)以及超高效液相色譜儀(UPLC)。d :運用質(zhì)量虧損策略，篩選譜圖中中藥制劑藥材歸屬性的成分；e:依靠高分辨質(zhì)譜儀產(chǎn)生的高準確度的精確質(zhì)量數(shù)測定值預測各成分的分子式，結(jié)合誘導碰撞裂解產(chǎn)生的碎片信息，進行數(shù)據(jù)庫比對，確定所有歸屬性成分的化學結(jié)構(gòu)；f :在不進行誘導碰撞裂解的質(zhì)譜條件下，對所有樣品進行定量分析；定量分析方法包括依賴于標準品的絕對定量方法和不依賴于標準品的半定量方法，其中不依賴于標準品的半定量方法包括用峰面積或峰高進行定量分析的方法。g:通過代謝組學相關(guān)軟件，建立數(shù)學模型，從多維空間數(shù)學模型中提取參數(shù)，計算各樣品之間的相對距離，表征其在含量上的差異，數(shù)學模型的建立應(yīng)根據(jù)6個批次以上的供試品的測定結(jié)果來計算；基于代謝組學技術(shù)的多變量統(tǒng)計分析，包括利用各種代謝組學數(shù)據(jù)處理軟件進行的主成份分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)、偏最小二乘分析(PLS)、正交偏最小二乘分析(OPLS)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)、非線性映射(Nonlinemapping, NLM)、熱圖分析(Heat map)或聚類分析(HCA);其中所述軟件具體為SPSS、Metlab 或 Simca-P。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點I本發(fā)明提出的質(zhì)量虧損策略，可以快速的篩選并歸屬中藥制劑中藥材歸屬性成分，其具有普適性，避免了煩瑣的數(shù)據(jù)處理和歸納。與常規(guī)的單指標或多指標成分含量測定的評價相比，其能夠整體性的反應(yīng)中藥制劑在生產(chǎn)過程中的變化；與指紋圖譜技術(shù)相比，該方法立足于對藥材歸屬性成分的測定和比較，并且對歸屬性成分進行初步的結(jié)構(gòu)推測，其專屬性更強，能夠排除雜質(zhì)成分對評價的干擾。2體內(nèi)藥物的代謝產(chǎn)物亦具有相似的母核結(jié)構(gòu)，因此本發(fā)明提出的質(zhì)量虧損策略可以延伸于體內(nèi)藥物代謝產(chǎn)物的篩選。3本發(fā)明中運用的液相串聯(lián)高分辨質(zhì)譜可以同時獲得中藥制劑藥材歸屬性組分的結(jié)構(gòu)信息和含量變化信息。通過高分辨質(zhì)譜儀提供的離子精確質(zhì)量數(shù)測定和離子的碎裂信息，能夠快速的鑒定出未知組分的分子結(jié)構(gòu)式。
4利用代謝組學技術(shù)可以綜合而全面的量化反映不同制備工藝的制劑中所有組 分(包括未知組分和已知組分)的含量變化，相對于傳統(tǒng)的單一指標的評價形式，該方法不依賴于標準化合物，適用廣泛、評價標準客觀且準確。5本發(fā)明運用的多變量統(tǒng)計方法能夠科學的闡明所有組分的變化趨勢，提供綜合的評價指標。其具有客觀的統(tǒng)計學意義，更具科學性和準確性，避免了一些人為主觀的判斷。


圖I為改法評價不同制備工藝的中藥制劑的技術(shù)路線。圖2為利用質(zhì)量虧損策略篩選麥冬皂苷和麥冬黃酮歸屬性的成分。依據(jù)質(zhì)量虧損的原理，可以推測出麥冬黃酮類組分的質(zhì)量虧損值范圍為(.0510 .1653)，麥冬皂苷類組分的質(zhì)量虧損值范圍為(.3382 .6223)。在該范圍內(nèi)，篩選出36個麥冬黃酮歸屬性成分和63個麥冬皂苷歸屬性成分。圖3為麥冬皂苷和麥冬黃酮的總離子流色譜圖。a)麥冬黃酮總離子流色譜圖；b)麥冬皂苷總離子流色譜圖；根據(jù)質(zhì)量虧損策略，共篩選出36個麥冬黃酮類成分和63個麥冬阜苷類成分(6號峰為定量麥冬黃酮的內(nèi)標，62號峰為定量麥冬阜苷的內(nèi)標)圖4為根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)和碎裂信息推測出來的麥冬黃酮的結(jié)構(gòu)，共推測出19個麥冬黃酮歸屬性成分的化學結(jié)構(gòu)圖5為根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)和碎裂信息推測出來的麥冬皂苷的結(jié)構(gòu)，共推測出48個麥冬皂苷歸屬性成分的化學結(jié)構(gòu)圖6為四種不同工藝的麥冬提取物在PLS-DA模型中的得分圖。根據(jù)PLS-DA模型的得分圖可以直觀的看出各個樣品在多維空間模型中的相對位置，圖中的每個表示一個樣品所有成分含量的綜合信息，從該得分圖可以明顯的觀測到四種不同的麥冬提取物存在差
巳圖7為四種不同工藝的麥冬提取物所有樣品的熱圖。該圖中的一個方塊表示一個樣品所對應(yīng)的一個成分的含量，顏色越紅表示該樣品中該成分的含量多，顏色越綠則表示含量少。從圖中可以看出麥冬黃酮類成分在90%或75%的乙醇提取物中含量較高，麥冬皂苷類則在55%或35%乙醇提取物中含量較高。
具體實施例方式實施例I :對不同提取溶劑制備得到的麥冬提取物進行評價a :制備不同工藝的麥冬提取物市售的麥冬藥材粉碎過篩，取Ig粉碎藥材分別用35%、55%、75%和90%的乙醇水混合溶劑200ml進行回流提取2次，2次提取液合并，合并的提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮儀在55攝氏度的條件下濃縮，濃縮浸膏IOOml甲醇復溶，5um濾膜過濾。為了考察實驗的準確度，各提取工藝重復8個批次。b :所有待測樣品進行固相萃取處理各樣品經(jīng)過濾后，采用固相萃取技術(shù)進行除雜處理。固相萃取小柱(C18，500mg/3ml, United ChemicalTechnologies Inc)在上樣前分別用 2ml 的甲醇和 2ml 去離子水活化各兩次，后取200ul樣品上樣，用2ml去離子水沖洗并吹干，再用2ml甲醇洗脫，洗脫液濃縮蒸干，用200ul甲醇溶解，18000rmp離心,取上清，5ul進樣。c :采用高效液相-離子阱-飛行時間質(zhì)譜儀對供試樣品進行負離子全掃描得到總離子流色譜圖，并設(shè)定在數(shù)據(jù)采集過程中，將豐度超過一定標準的離子自動進行二級碎裂。儀器及工作站軟件高效液相-離子阱-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀(島津，日本)，LCsolution 3. O。
麥冬皂苷和麥冬黃酮的系列組分的色譜分離參數(shù)一致，其條件如下色譜柱phenomenexLuna (C18, 5 u m, 2. l*150mm I. D.);柱溫35°C;流速0. 2ml/min;采用梯度洗脫方式，流動相水相(A)為含0.02%甲酸的水溶液，有機相(B)為含0. 02%甲酸的乙腈，梯度洗脫程序如下0 5min(B 25%- 25% )5 50min(B 25 %— 75% ) ;50 53min(B :75%—75%) ;53 55min(B :75%—25% ) ;55 60min (B :25%—25% );進樣量5ul。麥冬皂苷系列組分的質(zhì)譜參數(shù)如下離子化方式電噴霧離子化(ESI-);掃描范圍MS1 m/z 500-1500，MS2 m/z100-1000 ;多級MS碰撞能量設(shè)為100%;檢測電壓1. 60kV，霧化氣流速(N2) :1. 5L/min，干燥氣流速(N2) 5L/min,曲型脫溶劑裝置(OTL)和加熱塊(block)溫度200°C;碰撞氣為高 純氬氣，TOF真空度1. 5 X10_4Pa，離子阱真空度I. 7 X 10_2Pa，離子累積時間30ms，精確質(zhì)量數(shù)用三氟醋酸鈉校準，分子式的推斷由Formula Predictorsoftware (Shimadzu, Japan)分子式預測軟件完成。麥冬黃酮系列組分的質(zhì)譜參數(shù)如下離子化方式電噴霧離子化(ESI-);掃描范圍WS1 m/z 200-450，MS2 m/z50-300 ;多級MS碰撞能量設(shè)為100% ;檢測電壓1.60kV，霧化氣流速(N2) :1.5L/min，干燥氣流速(N2) 5L/min,曲型脫溶劑裝置(OTL)和加熱塊(block)溫度200°C;碰撞氣為高純氬氣，TOF真空度1. 5 X10_4Pa，離子阱真空度I. 7 X 10_2Pa，離子累積時間30ms，精確質(zhì)量數(shù)用三氟醋酸鈉校準，分子式的推斷由Formula Predictorsoftware (Shimadzu, Japan)分子式預測軟件完成。以上條件下，全掃描得到麥冬提取物在負離子模式下的總離子流色譜圖分別如圖2所示。d :應(yīng)用質(zhì)量7損策略,快速篩選麥冬阜苷和麥冬黃酮系列組分歸屬的成分質(zhì)量虧損值是化合物的固有性質(zhì)，它表示的是化合物的精確質(zhì)量數(shù)與整數(shù)質(zhì)量之間的差值。具有類似結(jié)構(gòu)的化合物，它們的質(zhì)量虧損值相接近，且質(zhì)量虧損范圍可預測。依據(jù)這個原理，可以推測出中藥系列成分的質(zhì)量虧損范圍。分別提取麥冬皂苷和麥冬黃酮的公共骨架，并計算公共骨架的質(zhì)量虧損值。分別給麥冬皂苷和麥冬黃酮的公共骨架賦值取代基，使產(chǎn)生最大和最小的質(zhì)量虧損，從而得到麥冬皂苷和麥冬黃酮系列化合物可預測的質(zhì)量虧損范圍(如圖I所示)。根據(jù)得到的質(zhì)量虧損范圍，從質(zhì)譜數(shù)據(jù)中篩選質(zhì)量虧損范圍內(nèi)的離子。
e :根據(jù)高效液相串聯(lián)離子阱-飛行時間質(zhì)譜儀所檢測到的離子精確質(zhì)量數(shù)，在一定的誤差范圍內(nèi)推測各成分的分子式，并針對其多級碎裂信息，從SciFinder Sholar 2007數(shù)據(jù)庫中找尋匹配的結(jié)構(gòu)式。基于該步驟，推斷獲得的麥冬皂苷和麥冬黃酮的結(jié)構(gòu)如圖3和圖4。f:對所有的樣品中麥冬皂苷和麥冬黃酮歸屬的成分，用峰面積與內(nèi)標峰面積的比值進行定量分析，由于難以獲得麥冬皂苷和麥冬黃酮的標準品，因此采用相對定量方法，樣品中麥冬阜苷和麥冬黃酮歸屬性成分的相對含量用各峰峰面積與內(nèi)標峰面積(槲皮素作為黃酮類成分的內(nèi)標，地高辛作為皂苷類成分的內(nèi)標)的比值來表示。g :對上述的定量分析數(shù)據(jù)進行多變量的主成份分析上述獲得數(shù)據(jù)調(diào)入多元數(shù)據(jù)分析軟件Simca-Pll軟件(Umetrics AB, Umea,瑞典)中，利用數(shù)據(jù)內(nèi)在關(guān)系投影偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)計算數(shù)學模型，確定得到的模型的主成份數(shù)目為2，該數(shù)學模型即為一個二維空間模型，每個樣品都是此空間中的一個點，其位置由X和y坐標參數(shù)決定。由上述模型可以得到各個樣品在此模型的平面坐標中的分布，如圖6。將上述定量分析數(shù)據(jù)導入軟件(Heat map builder I. lversion),產(chǎn)生熱圖。熱圖是一種表述多變量的圖解表示方法。圖中每個方塊表示一個樣品的一個成分的含量，其顏色的深淺表示含量的多少，如圖7。
權(quán)利要求
1.一種基于代謝組學技術(shù)的中藥制劑制備工藝的評價方法，其特征在于由以下幾個步驟組成 a:明確影響中藥制劑質(zhì)量的因素，通過平行對照實驗設(shè)計或正交實驗設(shè)計制備不同工藝的中藥制劑制品，為保證準確性，每種工藝平行進行6次以上； b :根據(jù)中藥制劑所含化學成分的理化性質(zhì)和檢測方法的需要，選擇適宜的方法對中藥制劑制品進行處理，獲得中藥制劑特征性總成分提取物； c :運用液相串聯(lián)高分辨質(zhì)譜聯(lián)儀，在一定的色譜質(zhì)譜分離條件下，對中藥制劑制品進行分析，獲取特征性的總離子流色譜圖； d :運用質(zhì)量虧損策略，篩選譜圖中各藥材歸屬性的成分； e :依靠高分辨質(zhì)譜儀產(chǎn)生的高準確度的精確質(zhì)量數(shù)測定值預測各成分的分子式，結(jié)合誘導碰撞裂解產(chǎn)生的碎片信息，進行數(shù)據(jù)庫比對，確定所有歸屬性成分的化學結(jié)構(gòu)；f :在不進行誘導碰撞裂解的質(zhì)譜條件下，對所有樣品進行定量分析；g :通過代謝組學相關(guān)軟件，建立數(shù)學模型，從多維空間數(shù)學模型中提取參數(shù)，計算各樣品之間的相對距離，表征其在含量上的差異，數(shù)學模型的建立應(yīng)根據(jù)6個批次以上的供試品的測定結(jié)果來計算。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的中藥制劑為以中醫(yī)藥理論為指導，可供臨床防病治病使用的單方、復方制劑。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述制劑的劑型具體為片劑、注射劑、顆粒齊U、丸劑、散劑或膏劑。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟a的制劑過程中影響最終制劑質(zhì)量的因素包括中藥材的產(chǎn)地、復方中中藥材的投料配比、中藥材粉碎粒度、中藥材的提取溶齊U、中藥材提取的溫度、中藥材提取的時間、中藥材提取次數(shù)、所用的助溶劑或所用吸附沉淀劑。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟b中對樣品進行處理方法包括液液萃取、固相萃取和過濾；其中液液萃取溶劑包括正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、苯或正己烷；固相萃取包括各種型號的固相小柱；過濾包括各種型號的濾膜。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟c所述的高分辨質(zhì)譜儀為同時具有高準確度的離子精確質(zhì)量數(shù)測定功能和離子碎裂功能的各種高分辨質(zhì)譜儀；其中與之相串聯(lián)的液相色譜儀包括高效液相色譜儀(HPLC)以及超高效液相色譜儀(UPLC)。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟f中所述的定量分析方法包括依賴于標準品的絕對定量方法和不依賴于標準品的半定量方法，其中不依賴于標準品的半定量方法包括用峰面積或峰高進行定量分析的方法。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟g所述的基于代謝組學技術(shù)的多變量 統(tǒng)計分析，包括利用各種代謝組學數(shù)據(jù)處理軟件進行的主成份分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)、偏最小二乘分析(PLS)、正交偏最小二乘分析(OPLS)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)、非線性映射(Nonlinemapping, NLM)、熱圖分析(Heat map)或聚類分析(HCA);其中所述軟件具體為SPSS、Metlab或Simca-P。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于代謝組學技術(shù)的中藥制劑制備工藝的評價方法，主要技術(shù)路線包括1.通過正交實驗設(shè)計或平行對照實驗設(shè)計獲取不同制備工藝的中藥制劑制品；2.對制備得各制品進行樣品前處理；3.應(yīng)用液相串聯(lián)高分辨質(zhì)譜儀，獲得中藥制劑制品的色譜圖；4.根據(jù)質(zhì)量虧損策略，在色譜圖中找尋中藥材歸屬性的成分；5.依據(jù)測定的精確質(zhì)量數(shù)和源內(nèi)誘導碰撞碎裂所得的碎片信息，推斷各成分結(jié)構(gòu)；6.定量分析各制品中所有歸屬性成分的含量；7.通過多變量的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法整體評價制備工藝對制劑的影響。該方法準確、靈敏、不依賴于標準化合物，從整體上跟蹤制劑制品中藥材歸屬性成分的變化，可廣泛適用于中藥制劑的制備工藝評價。
文檔編號G01N30/88GK102749409SQ20111010128
公開日2012年10月24日 申請日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日
發(fā)明者劉林生, 康安, 戴琛, 梁艷, 王廣基, 謝彤, 謝林, 鄭嘯, 郝海平, 龔平 申請人:中國藥科大學