專利名稱：一種牛奶和奶粉中生物素的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物素的檢測方法，尤其涉及一種用于牛奶和奶粉制品中生物素的檢測方法。
背景技術：
目前，國內外關于生物素的檢測方法都比較復雜，一般有微生物法、高效液相法和酶聯(lián)免疫法。酶聯(lián)免疫法檢測結果與實際數(shù)值出入較大，高效液相法檢測的下限較微生物法要高出很多。微生物法檢測乳品中生物素是利用植物乳桿菌ATCC 8014對生物素的特異性，在含有生物素樣品中生長產(chǎn)生的酸度和形成的光密度來測定生物素的含量。現(xiàn)有的微生物法檢測生物素需要經(jīng)過制備測試菌液、加入緩沖液和水水解，加入鹽酸調整PH值進行樣品前 處理、制作標準曲線、滅菌、接種、培養(yǎng)、使用風光光度計測定。但是檢測過程復雜，使用分光管妒忌需將每個樣品放入比色皿，操作繁瑣；容易造成交叉污染，結果重現(xiàn)性不好?；谏鲜鰡栴}，開發(fā)一種操作簡單、重現(xiàn)性好、結果穩(wěn)定的生物素檢測方法就尤為重要。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種牛奶和奶粉中生物素的檢測方法，其操作簡單、重現(xiàn)性好、結果穩(wěn)定。本發(fā)明提供了一種牛奶和奶粉中生物素的檢測方法，包括
a、將牛奶或奶粉定容混勻得到溶解液；
b、將溶解液殺菌，得到滅菌液，存儲滅菌液；
C、配制生物素的培養(yǎng)基液，將培養(yǎng)基液殺菌得到殺菌基液，存儲殺菌基液；
d、配制不同生物素濃度的標準品溶液；
e、分別將殺菌基液、滅菌液、植物乳桿菌和標準品溶液加入微孔板條的相應微孔中，孵育得到測試液；
f、處理測試液，使微生物懸濁其中，用酶標儀讀取它們的混濁度；
g、繪制與標準品溶液相對應的測試液中生物素的濃度與測試液混濁度的標準曲線；
h、將溶解液相對應的測試液的混濁度代入標準曲線中，換算得到牛奶或奶粉中生物素的濃度。一種牛奶和奶粉中生物素的檢測方法，操作過程簡單，且微孔板均為一次性使用，避免了測試中的交叉干擾，結果重現(xiàn)性好。在一種牛奶和奶粉中生物素的檢測方法的再一種示意性的實施方式中，步驟a為取牛奶lmL，放入50mL的離心管中用蒸餾水或純水定容并漩渦混勻得到溶解液。在一種牛奶和奶粉中生物素的檢測方法的另一種示意性的實施方式中，步驟a為取奶粉lg，放入50mL的離心管中用蒸餾水或純水定容并漩渦混勻得到溶解液。在一種牛奶和奶粉中生物素的檢測方法的又一種示意性的實施方式中，步驟b中溶解液在超凈臺用0.2 iim或0. 22iim無菌濾膜過濾殺菌，得到滅菌液，將滅菌液存儲于
I.5mL或2. OmL無菌試管中。在一種牛奶和奶粉中生物素的檢測方法的又一種示意性的實施方式中，步驟c中加入IOmL無菌水至生物素培養(yǎng)基中，蓋好瓶蓋，搖勻，得到培養(yǎng)基液，將培養(yǎng)基液在90-100°C水浴中加熱至少5分鐘，其 間振蕩至少2次，迅速冷卻至室溫，使用0. 2 iim或
0.22 um無菌濾膜過濾殺菌培養(yǎng)基液得到殺菌基液，將殺菌基液存儲于15mL無菌離心管中。在一種牛奶和奶粉中生物素的檢測方法的又一種示意性的實施方式中，步驟d中配制了生物素濃度分別為0、0. 08,0. 24,0. 40,0. 56,0. 72mg/100g的標準品溶液，且標準品溶液的配制方法為加入I. 8-2. 2mL無菌水至生物素標準品瓶中得到生物素標準品，用移液器溶解生物素標準品，得到標準品濃縮液，使用標準品濃縮液配制得到不同濃度的標準品溶液。在一種牛奶和奶粉中生物素的檢測方法的又一種示意性的實施方式中，步驟e中取與標準品溶液和溶解液份數(shù)對應的微孔板條，分別用移液器吸取150 u L殺菌基液至板條的微孔中，分別用移液器吸取150y L標準品溶液和滅菌液至指定的全部微孔中，分別用移液器吸取植物乳桿菌至板條的微孔中，用粘合箔蓋住微孔板條的微孔，在37°C 土1°C黑暗條件下孵育44-48小吋。在一種牛奶和奶粉中生物素的檢測方法的又一種示意性的實施方式中，步驟f中將微孔板在漩渦混合器上振蕩，使微生物懸濁在測試液中，破壞測試液表面所有的泡沫，用酶標儀在610-630nm或540_550nm條件下分別讀取測試液的混濁度。在一種牛奶和奶粉中生物素的檢測方法的又一種示意性的實施方式中，步驟h中將與溶解液相對應的測試液的混濁度代入標準曲線方程中得到其生物素濃度，將與溶解液相對應的測試液的生物素濃度換算得到牛奶或奶粉中生物素的濃度。下文將以明確易懂的方式，結合實施例，對ー種牛奶和奶粉中生物素的檢測方法的上述特性、技術特征、優(yōu)點及其實現(xiàn)方式予以進ー步說明。
具體實施例方式I檢測原理
生物素是植物乳桿菌(Lactobacillus pi ant arum), ATCC 8014生長所必需的營養(yǎng)素。在待測樣品處理后，使其中只含有植物乳桿菌，植物乳桿菌的生長響應與待測樣品中生物素含量呈線性關系。用比濁法測定待測樣品中細菌増殖后的混濁度，通過與標準曲線相比較計算出待測樣品中生物素的含量。2儀器設備與試劑 2.1儀器設備
水浴鍋(能達到95 °C)，酶標儀(610-630或540-550nm)，微孔板，超凈工作臺，培養(yǎng)箱 37°C ±l°C，0.2iim 或 0.22iim 無菌濾膜。可調移液器器 0. 5-10 y L、20_200 y L 和100-1000 u L,移液器頭20-200 y L和100-1000 u L (需滅菌)，50mL離心管，15mL離心管(需滅菌)，I. 5mL或2. OmL離心管(需滅菌)，標準品瓶，5mL或IOmL —次性無菌注射器，生物素標準品瓶。
2.2 試劑
所用試劑如下
(1)植物乳桿菌(Lactobacilluspi ant arum), ATCC 8014,市售;
(2)生物素粉末標準品，市售，容納生物素標準品的瓶子即為生物素標準品瓶；
(3)生物素培養(yǎng)基，其中含有除生物素外，植物乳桿菌生長所需要的其他物質，自制；
(4)蒸餾水或純水，自制。
實施例I
I、牛奶處理方法如下
加入ImL牛奶樣品至50mL離心管中，準確加入蒸餾水或純水39mL，漩渦混勻得到溶解液。在超凈臺中用O. 2 μ m無菌濾膜過濾殺菌得到滅菌液，將滅菌液存儲至I. 5mL無菌試管中。其中，可以根據(jù)需要使用O. 22 μ m無菌濾膜，與O. 2 μ m無菌濾膜相比兩者并不產(chǎn)生使用效果上的差別；同時可以根據(jù)需要使用2. OmL無菌試管，與I. 5mL無菌試管相比兩者并不產(chǎn)生使用效果上的差別。本方法的檢出限是O. 08 μ g/100g,檢測范圍是O. 08-0. 72 μ g/100g。2、培養(yǎng)基處理方法如下
本步驟中所有操作需在超凈臺內進行。加入IOmL無菌水至生物素培養(yǎng)基中，蓋好瓶蓋，搖勻得到培養(yǎng)基液。將培養(yǎng)基液在90°C水浴中加熱5分鐘，其間振蕩至少2次(保證瓶子封閉)，迅速冷卻至室溫(低于30°C )。使用0. 2 μ m無菌濾膜過濾殺菌得到殺菌基液，將殺菌基液存儲至15mL無菌離心管中。3、配制不同生物素濃度的標準品溶液如下
本步驟中所有操作需在超凈臺內進行。加入I. SmL無菌水至生物素標準品瓶中，用移液器溶解生物素標準品，為了使生物素標準品充分溶解，還可以用標準品瓶中的溶液沖洗移液器尖，得到標準品濃縮液，取6個I. 5mL無菌管，使用無菌水和標準品濃縮液配制生物素濃度分別為0、0. 08,0. 24,0. 40、
0.56,0. 72mg/100g的標準品溶液。4、測試液的制備過程如下
本步驟中所有操作需在超凈臺內進行。(I)取微孔板條并在板上固定，其中微孔板上微孔的數(shù)量為七個，它們分別可用來盛放六個生物素濃度的標準品溶液，以及牛奶配制得到的滅菌液，未使用的微孔板條立即放回原來的箔袋中，并與干燥劑一起重新封好，儲存在2-8°C條件下；
(2)分別用移液器吸取150μ L殺菌基液至每一個微孔中；
(3)分別用移液器吸取150μ L不同生物素濃度的標準品溶液(0、0.08、0. 24、0. 40、
0.56,0. 72mg/100g)和滅菌液至指定的微孔中，即吸取標準品溶液至微孔板上的六個微孔中，吸取滅菌液至剩下的一個微孔中；
(4)分別用移液器吸取植物乳桿菌5μ L菌液至板條的微孔中；
(5)用粘合箔蓋住微孔，除去粘合箔上的保護層，將其平放在微孔條上，用手或壓舌板將粘合箔平壓，使其充分封閉微孔板條，保證粘合箔和微孔的封閉性，特別注意微孔的邊緣部分。(6)在36°C黑暗條件下(可用孵育器)孵育44小時，得到七份測試液。5、使用酶標儀測量測試液
再次向下擠壓粘合箔，將微孔板向上放置在桌面上，在漩渦混合器上振蕩，使微生物分別懸濁于測試液中，沿對角揭去粘合箔。用移液器槍頭破壞微孔內測試液表面所有的泡沫。使用酶標儀在610-630nm條件下分別讀取七份測試液的混濁度。6、數(shù)據(jù)處理
繪制酶標儀混濁度與六個標準品溶液相對應的測試液中生物素濃度之間的曲線，其中縱坐標為酶標儀混濁度，橫坐標為測試液中生物素濃度，擬合得到曲線的方程。
將于溶解液對應的測試液的混濁度數(shù)據(jù)代入擬合得到的方程中，計算得到測試液中生物素濃度，根據(jù)牛奶到溶解液到測試液的稀釋關系，換算出牛奶中生物素的濃度。一種牛奶中生物素的檢測方法，操作過程簡單，且微孔板均為一次性使用，避免了測試中的交叉干擾，結果重現(xiàn)性好。實施例2
I、牛奶處理方法如下
加入ImL奶粉至50mL離心管中，準確加入蒸餾水或純水39mL，漩渦混勻得到溶解液。在超凈臺中用0. 22 U m無菌濾膜過濾殺菌得到滅菌液，將滅菌液存儲至2. OmL無菌試管中。本方法的檢出限是0. 08 U g/100g,檢測范圍是0. 08-0. 72 U g/100g。2、培養(yǎng)基處理方法如下
本步驟中所有操作需在超凈臺內進行。加入IOmL無菌水至生物素培養(yǎng)基中，蓋好瓶蓋，搖勻得到培養(yǎng)基液。將培養(yǎng)基液在100°C水浴中加熱10分鐘，其間振蕩至少2次(保證瓶子封閉)，迅速冷卻至室溫(低于30°C)。使用0. 22 iim無菌濾膜過濾殺菌得到殺菌基液，將殺菌基液存儲至15mL無菌離心管中。3、配制不同生物素濃度的標準品溶液如下
本步驟中所有操作需在超凈臺內進行。加入2. 2mL無菌水至生物素標準品瓶中，用移液器溶解生物素標準品，用標準品瓶中的溶液沖洗移液器尖，得到標準品濃縮液，取6個I. 5mL無菌管，使用無菌水和標準品濃縮液配制生物素濃度分別為0、0. 08,0. 24,0. 40,0. 56,0. 72mg/100g的標準品溶液。4、測試液的制備過程如下
本步驟中所有操作需在超凈臺內進行。(I)取微孔板條并在板上固定，其中微孔板上微孔的數(shù)量為七個，它們分別可用來盛放六個生物素濃度的標準品溶液，以及牛奶配制得到的滅菌液，未使用的微孔板條立即放回原來的箔袋中，并與干燥劑一起重新封好，儲存在2-8°C條件下；
(2)分別用移液器吸取150y L殺菌基液至每ー個微孔中；
(3)分別用移液器吸取150ii L不同生物素濃度的標準品溶液(0、0.08、0. 24,0. 40,
0.56,0. 72 u g/100g)和滅菌液至指定的微孔中，即吸取標準品溶液至微孔板上的六個微孔中，吸取滅菌液至剩下的一個微孔中；
(4)分別用移液器吸取植物乳桿菌5u L菌液至板條的微孔中；(5)用粘合箔蓋住微孔，除去粘合箔上的保護層，將其平放在微孔條上，用手或壓舌板將粘合箔平壓，使其充分封閉微孔板條，保證粘合箔和微孔的封閉性，特別注意微孔的邊緣部分。(6)在38°C黑暗條件下(可用孵育器)孵育48小時，得到七份測試液。5、使用酶標儀 測量測試液
再次向下擠壓粘合箔，將微孔板向上放置在桌面上，在漩渦混合器上振蕩，使微生物分別懸濁于測試液中，沿對角揭去粘合箔。用移液器槍頭破壞微孔內測試液表面所有的泡沫。使用酶標儀在540-550nm條件下分別讀取七份測試液的混濁度。6、數(shù)據(jù)處理
繪制酶標儀混濁度與六個標準品溶液相對應的測試液中生物素濃度之間的曲線，其中縱坐標為酶標儀混濁度，橫坐標為測試液中生物素濃度，擬合得到曲線的方程。將于溶解液對應的測試液的混濁度數(shù)據(jù)代入擬合得到的方程中，計算得到測試液中生物素濃度，根據(jù)牛奶到溶解液到測試液的稀釋關系，換算出牛奶中生物素的濃度。實施例3
I、奶粉處理方法如下
加入Ig奶粉至50mL離心管中，準確加入蒸餾水或純水39mL，漩渦混勻得到溶解液。在超凈臺中用O. 22 μ m無菌濾膜過濾殺菌得到滅菌液，將滅菌液存儲至2. OmL無菌試管中。本方法的檢出限是O. 08 μ g/100g,檢測范圍是O. 08-0. 72 μ g/100g。2、培養(yǎng)基處理方法如下
本步驟中所有操作需在超凈臺內進行。加入IOmL無菌水至生物素培養(yǎng)基中，蓋好瓶蓋，搖勻得到培養(yǎng)基液。將培養(yǎng)基液在100°C水浴中加熱20分鐘，其間振蕩至少2次(保證瓶子封閉)，迅速冷卻至室溫(低于30°C)。使用O. 22 μ m無菌濾膜過濾殺菌得到殺菌基液，將殺菌基液存儲至15mL無菌離心管中。3、配制不同生物素濃度的標準品溶液如下
本步驟中所有操作需在超凈臺內進行。加入2. 2mL無菌水至生物素標準品瓶中，用移液器溶解生物素標準品，用標準品瓶中的溶液沖洗移液器尖，得到標準品濃縮液，取6個I. 5mL無菌管，使用無菌水和標準品濃縮液配制生物素濃度分別為0、0. 08,0. 24,0. 40,0. 56,0. 72mg/100g的標準品溶液。4、測試液的制備過程如下
本步驟中所有操作需在超凈臺內進行。(I)取微孔板條并在板上固定，其中微孔板上微孔的數(shù)量為七個，它們分別可用來盛放六個生物素濃度的標準品溶液，以及奶粉配制得到的滅菌液，未使用的微孔板條立即放回原來的箔袋中，并與干燥劑一起重新封好，儲存在2-8°C條件下；
(2)分別用移液器吸取150μ L殺菌基液至每一個微孔中；
(3)分別用移液器吸取150μ L不同生物素濃度的標準品溶液(0、0.08、0. 24、0. 40、
O.56,0. 72mg/100g)和滅菌液至指定的微孔中，即吸取標準品溶液至微孔板上的六個微孔中，吸取滅菌液至剩下的一個微孔中；
(4)分別用移液器吸取植物乳桿菌5μ L菌液至板條的微孔中；(5)用粘合箔蓋住微孔，除去粘合箔上的保護層，將其平放在微孔條上，用手或壓舌板將粘合箔平壓，使其充分封閉微孔板條，保證粘合箔和微孔的封閉性，特別注意微孔的邊緣部分。(6)在37°C黑暗條件下(可用孵育器)孵育48小時，得到七份測試液。5、使用酶標儀測量測試液
再次向下擠壓粘合箔，將微孔板向上放置在桌面上，在漩渦混合器上振蕩，使微生物分別懸濁于測試液中，沿對角揭去粘合箔。用移液器槍頭破壞微孔內測試液表面所有的泡沫。使用酶標儀在540-550nm條件下分別讀取七份測試液的混濁度。6、數(shù)據(jù)處理
繪制酶標儀混濁度與六個標準品溶液相對應的測試液中生物素濃度之間的曲線，其中縱坐標為酶標儀混濁度，橫坐標為測試液中生物素濃度，擬合得到曲線的方程。將于溶解液對應的測試液的混濁度數(shù)據(jù)代入擬合得到的方程中，計算得到測試液中生物素濃度，根據(jù)奶粉到溶解液到測試液的稀釋關系，換算出奶粉中生物素的濃度。在本文中，“示意性”表示“充當實例、例子或說明”，不應將在本文中被描述為“示意性”的任何圖示、實施方式解釋為ー種更優(yōu)選的或更具優(yōu)點的技術方案。應當理解，雖然本說明書是按照各個實施例描述的，但并非每個實施例僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為ー個整體，各實施例中的技術方案也可以經(jīng)適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。上文所列出的一系列的詳細說明僅僅是針對本發(fā)明的可行性實施例的具體說明，它們并非用以限制本發(fā)明的保護范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實施例或變更均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。權利要求
1.一種牛奶或奶粉中生物素的檢測方法，其包括 a、將牛奶或奶粉定容混勻得到溶解液； b、將所述溶解液殺菌，得到滅菌液，存儲所述滅菌液； C、配制生物素的培養(yǎng)基液，將所述培養(yǎng)基液殺菌得到殺菌基液，存儲所述殺菌基液； d、配制不同生物素濃度的標準品溶液； e、分別將所述殺菌基液、所述滅菌液、植物乳桿菌和所述標準品溶液加入微孔板條的相應微孔中，孵育得到測試液； f、處理所述測試液，使微生物懸濁其中，用酶標儀讀取它們的混濁度； g、繪制與所述標準品溶液相對應的所述測試液中生物素的濃度與所述測試液混濁度的標準曲線； h、將所述溶解液相對應的所述測試液的混濁度代入所述標準曲線中，換算得到所述牛奶或奶粉中生物素的濃度。
2.如權利要求I所述的檢測方法，其中步驟a為取所述牛奶lmL，放入50mL的離心管中用蒸餾水或純水定容并漩渦混勻得到所述溶解液。
3.如權利要求I所述的檢測方法，其中步驟a為取所述奶粉lg，放入50mL的離心管中用蒸餾水或純水定容并漩渦混勻得到所述溶解液。
4.如權利要求I所述的檢測方法，其中步驟b中所述溶解液在超凈臺用0.2或0.22 um無菌濾膜過濾殺菌，得到所述滅菌液，將所述滅菌液存儲于I. 5mL或2. OmL無菌試管中。
5.如權利要求I所述的檢測方法，其中步驟c中加入IOmL無菌水至生物素培養(yǎng)基中，蓋好瓶蓋，搖勻，得到所述培養(yǎng)基液，將所述培養(yǎng)基液在90-100°C水浴中加熱至少5分鐘，其間振蕩至少2次，迅速冷卻至室溫，使用0.2 或0.22 無菌濾膜過濾殺菌所述培養(yǎng)基液得到所述殺菌基液，將所述殺菌基液存儲于15mL無菌離心管中。
6.如權利要求I所述的檢測方法，其中步驟d中配制了生物素濃度分別為0、0.08、0.24,0. 40,0. 56,0. 72mg/100g的所述標準品溶液，且所述標準品溶液的配制方法為加入1.8-2. 2mL無菌水至生物素標準品瓶中得到生物素標準品，用移液器溶解生物素標準品得到標準品濃縮液，使用所述標準品濃縮液配制得到不同濃度的所述標準品溶液。
7.如權利要求I所述的檢測方法，其中步驟e中取與所述標準品溶液和所述溶解液份數(shù)對應的微孔板條，分別用移液器吸取150 y L所述殺菌基液至板條的全部微孔中，分別用移液器吸取150 u L所述標準品溶液和所述溶解液至指定的微孔中，分別用移液器吸取植物乳桿菌至板條的微孔中，用粘合箔蓋住微孔板條的微孔，在37°C 土TC黑暗條件下孵育44-48小時。
8.如權利要求I所述的檢測方法，其中步驟f中將所述微孔板在漩渦混合器上振蕩，使微生物懸池在所述測試液中，破壞所述測試液表面所有的泡沫，用酶標儀在610_630nm或540-550nm條件下分別讀取所述測試液的混濁度。
9.如權利要求I所述的檢測方法，其中步驟h中將與所述溶解液相對應的測試液的混濁度代入標準曲線方程中得到其生物素濃度，將與所述溶解液相對應的測試液的生物素濃度換算得到所述牛奶或奶粉中生物素的濃度。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種牛奶和奶粉中生物素的檢測方法包括步驟a、將牛奶或奶粉原樣定容混勻得到溶解液；b、將溶解液殺菌，得到滅菌液，存儲滅菌液；c、配制生物素的培養(yǎng)基液，將培養(yǎng)基液殺菌得到殺菌基液，存儲殺菌基液；d、配制不同生物素濃度的標準品溶液；e、分別將殺菌基液、溶解液和標準品溶液加入微孔板條的相應微孔中，孵育得到測試液；f、處理測試液，使微生物懸濁其中，用酶標儀讀取它們的混濁度；g、繪制與標準品溶液相對應的測試液中，測試液中生物素的濃度與測試液混濁度的標準曲線；h、將溶解液相對應的測試液的混濁度代入標準曲線中，換算得到牛奶或奶粉中生物素的濃度。本發(fā)明操作過程簡單，微孔板為一次性使用，避免了測試中交叉干擾，結果重現(xiàn)性好。
文檔編號G01N21/75GK102759522SQ20111010825
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月28日 優(yōu)先權日2011年4月28日
發(fā)明者劉衛(wèi)星, 劉志楠, 劉曉川, 喻東威, 李梅, 杜麗, 薛志清, 趙源 申請人:內蒙古蒙牛乳業(yè)(集團)股份有限公司